Briakinumab

摘要：除了效力之外，良好的可开发性特性是生物药物的一个关键属性。在药物开发过程的早期选择和筛选这些属性可以节省资源并避免昂贵的后期失败。在这里，我们回顾了可以为生物制剂早期评估的一些最重要的可开发性属性。这些包括生物制剂来源的影响、其生物物理和药代动力学特性，以及它可以被重组表达的程度。我们进一步介绍了可以在发现过程的不同阶段利用的计算、体外和体内方法和技术，以识别具有潜在缺陷的分子，从而促进选择最优化的药物领先分子。最后，我们反思了注射用与口服生物制剂最相关的可开发性参数，并展望了生物制剂开发中预期出现的一般趋势。 引言 将生物制剂从早期发现带到市场化产品是一项极其昂贵的努力，平均投资因临床开发中的高淘汰率而进一步增加。虽然生物制剂的临床成功最终取决于其在人类患者中的安全性和有效性，但这些终点的潜在属性包括从药物效力、特异性、免疫原性、药代动力学到体内和储存期间的生物物理行为等各个方面。此外，随着更先进的生物制剂，如双特异性抗体和抗体-药物偶联物在管线中，化学、制造和控制（CMC）以及监管方面可能成为商业成功的关键，当生物制剂必须以一致的高质量重复生产时。这些性能指标通常被称为生物制剂的“可开发性”。在这篇综述中，将介绍生物制剂的不同可开发性参数，并讨论如何使用计算、体外和体内方法来评估和优化这些参数（见图1）。当这些方法得到最佳应用时，可开发性属性的评估和改进可以降低淘汰率，同时提高可制造性，使生产更高质量、成本更低的生物制剂成为可能，从而造福全球患者。 图1. 生物制剂开发过程中用于评估可开发性属性的抗体来源、发现策略、体外测定和计算方法的示意图概述。抗体可以是天然或合成来源，通常使用各种展示技术或免疫策略，或这些的组合来发现。此外，抗体也可以从患者群体中获得。在抗体开发过程中，可以应用各种体外测定结合计算方法，用于机器学习和分子动力学，以评估抗体的可开发性属性，并选择具有最佳可开发性概况的候选物。 抗体来源 抗体和抗体片段构成了最大的生物制剂群体。抗体通常来源于血浆、杂交瘤、或重组细胞系，并源自天然（动物或人类）或合成序列。来源和起源都可能影响抗体的可开发性概况。天然抗体是从天然、非工程化序列中衍生的，通常来源于（免疫的）动物或患者群体，到目前为止是最常见的抗体来源。这些抗体天生具有从生物体衍生的好处，并且已经经历了体内的亲和成熟和自我耐受，这通常导致良好的可开发性概况。然而，在临床使用方面，人类和动物来源的抗体存在明显差异。前者构成了具有低免疫原性风险的抗体，而非人类来源的抗体可能会在患者中引起严重的免疫反应，这取决于它们源自哪种动物。可以通过几种方式降低免疫原性风险。例如，可以对抗体进行人源化，或者使用转基因动物进行人类免疫球蛋白（例如，兔子或小鼠）进行免疫。免疫活动来源的抗体的一个潜在限制是，它们主要针对抗原的最免疫原性表位。这可能限制了表位多样性，并可能阻止发现对重要但低或非免疫原性抗原表位的结合剂。此外，不适当的免疫策略可能会阻止发现针对与免疫宿主内表达的目标高度同源的目标的抗体，因为自我耐受。 为了避免这些限制，其他类型的抗体越来越受欢迎，即合成抗体，因为它们允许发现针对任何目标的结合剂。这些抗体可能来自合理设计的重组抗体库，通常通过体外展示技术发现。使用这种方法可以对抗体库进行大量控制。例如，可以移除已知对结合相互作用有害的某些氨基酸残基，可以调整可变区域的长度，可以尝试新格式，并且可以创建超越自然的可变性的抗体库。结果，这允许它们用于更大的目标空间。然而，合成抗体通常有一个缺点，即没有经过体内成熟，并且来源于自然起源。因此，它们可能潜在地携带意外的可开发性问题，例如不希望的多反应性、免疫原性、聚集倾向和差的表达概况。尽管如此，结合复杂的展示技术和先进的计算工具，这些风险可以最小化。 展示技术的进步 在过去的几十年中，展示技术允许创建大型和多样化的抗体和其他蛋白质和肽群体，从中可以分离出具有期望目标结合特性的个体变体。然而，产生抗体药物的要求不仅仅围绕抗体的结合特异性或亲和力。其他因素可以影响领先候选抗体能否被开发成有效、可制造、安全和稳定药物的可能性。例如，抗体在高浓度配方时聚集的倾向、非特异性相互作用的程度以及抗体的药代动力学可能导致领先分子在开发过程中失败。 在使用展示技术时，可以从人类和非人类供体的B细胞中重排抗体基因产生抗体群体，从合成抗体基因构建，其中在寡核苷酸合成期间引入了变异，或两者的结合。可开发性问题可能不论起始来源而出现，甚至“自然”，免疫衍生的抗体也可能遭受生物物理负债。还表明，专注于提高亲和力的领先抗体的工程可以产生具有较差生物物理属性的亲和力增强变体。例如，Buchanan等人。鉴定了一个未配对的半胱氨酸，Dobson等人。使用氢氘交换来鉴定在聚合前初始二聚化中被保护的疏水残基（VH互补决定区（CDR）1中的W30和F31，以及VH CDR2中的L56）。或者，可以使用结构（或结构模型）来鉴定用作Bethea等人（VH CDR3中的F99、H100和W100a）和Dyson等人（VH CDR2中的S52、F54和R57）的疏水或带正电荷的斑块。基于这些方法，可以生产和评估具有改善生物物理特性的个体变体。在某些情况下，通过鉴定问题区域（例如，疏水斑块），生产个体变体，并评估这些变体以改善生物物理特性，可以解决克隆的可开发性问题。 历史上，在最初的发现、亲和性优化和选择抗体药物领先分子用于临床前开发之后，才会考虑可开发性问题。越来越多地，药物开发者在发现过程中更早地评估生物物理特性，意识到这将避免后期时间和金钱的损失。与其等待筛选数十到数百个输出克隆体的生物物理特性，不如能够创建大型展示变体库，并直接选择具有良好生物物理特性的克隆体，这将极大地促进寻找具有最佳属性的抗体变体。 选择技术的力量，最好的例子是噬菌体展示，已被应用于选择具有更高热稳定性的克隆体，通过将克隆体库暴露于高温下，并选择保留与蛋白A或蛋白L的结合，这需要正确的折叠。其他人则将抗体库置于酸性条件下，以再次识别结合热力学稳定性和抗聚集展开状态的克隆体。 虽然选择低热稳定性的克隆体将有助于识别聚集倾向，但可能有一些具有正常熔解温度的克隆体，其生物物理问题仅在抗体被浓缩时才显现出来（例如，为了皮下给药而需要的10-100毫克/毫升）。因此，需要额外的选择方法。噬菌体展示的基本原理（将编码基因与其展示产品耦合）也已被应用于使用杆状病毒、核糖体、 酵母、以及更高真核生物，如哺乳动物细胞的展示系统。特别是哺乳动物展示似乎提供了比其他系统更多的优势。 使用哺乳动物展示系统表明，具有不同生物物理特性的密切相关的克隆体可以根据展示水平被区分。首先由Parthiban等人描述的基础哺乳动物展示系统，通过将抗体基因整合到单一基因组位点来实现转录标准化。因此，展示水平由抗体本身的属性决定，而不是可变的转录活性。与基于分泌的系统相比，表达的抗体通过跨膜域保留在细胞表面，并在内质网或细胞表面达到高局部浓度。因此，抗体暴露于高浓度下，具有较差生物物理属性的克隆体可能会在如此高的表面浓度下聚集，聚集体可能被细胞的质量控制机制去除。反过来，这导致这种容易聚集或“粘性”克隆体的展示水平较低。 然后，通过哺乳动物展示检测生物物理属性的能力允许从变体库中选择具有改善的可开发性概况的克隆体。在实践中，创建了库，并选择了展示水平最高的克隆体。多参数流式细胞术允许同时筛选最佳生物物理属性，同时保留抗原结合，从而允许解决参与目标结合的旁位残基，以改善生物物理属性，同时保留目标结合。这样一个系统的力量通过创建具有优越生物物理属性和与亲本抗体（bococizumab）相比降低的免疫原性的抗PCSK9抗体变体得到了证明。这些和其他实验因此展示了如何对体外展示技术进行微调，以从头开始发现具有改善的可开发性概况的抗体。 生物物理特性表征 无论使用哪种策略进行抗体发现，通常有多个早期阶段的候选物，从数十个到数千个不等，这些必须减少到只有一个候选物用于细胞系开发和制造。为了选择最佳候选物，除了它们的功能属性外，越来越注重治疗性抗体的生物物理特性表征，这使得可以在药物开发过程的早期去除具有较差可开发性属性的抗体。有多种可开发性测定方法可以促进这种选择，这些方法已被报告在不同程度上与临床阶段抗体的淘汰率相关。 抗体药物的一个关键特性是它们的高特异性，由高目标结合和低非目标和非特异性结合定义，这对降低异常药代动力学和快速抗体清除的风险很重要。为了评估非特异性结合，通常使用酶联免疫吸附测定（ELISA），这通常涉及与多个非目标的结合，如单链DNA、双链DNA、脂多糖（LPS）、胰岛素和扇贝血蓝蛋白（KLH）。为了提高灵敏度，可以使用多特异性粒子（PSP）测定38，该测定涉及通过流式细胞术检测复杂抗原混合物（例如，来自中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的可溶性膜蛋白）或定义的蛋白质试剂（例如，卵清蛋白）与固定在蛋白A包被的珠子上的抗体的结合。类似于PSP测定，其他测定也使用复杂抗原混合物，包括杆状病毒粒子、整个细胞和细胞裂解物（多特异性试剂，PSR）。PSR已被证明与交叉相互作用色谱（CIC）相当相关。因此，研究非特异性相互作用的另一种方法是色谱法。在CIC中，通过它们的相对保留时间检测非特异性蛋白质相互作用。一种相关的色谱法，即站立单层色谱法（SMAC），则检测单克隆抗体与柱子之间的非特异性相互作用。例如，肝素色谱法被描述用于通过增加的细胞表面相互作用来识别具有异常药代动力学的抗体，导致过度的胞吞作用。除了特异性外，SMAC测量还识别了增加的沉淀和聚集可能性的抗体。非特异性结合也可以由表面疏水性引起，通常使用疏水相互作用色谱法（HIC）进行量化。 另一个关键特性是抗体药物的高胶体稳定性和低自相关和聚集倾向，这对于用于皮下注射的浓缩液体配方尤其重要。已经报告了几种用于评估抗体自相关性的测定方法，包括静态和动态光散射。虽然这些测定方法已被证明非常有价值，但由于它们需要高浓度和纯度的抗体，因此它们与早期开发不兼容。因此，已经开发了替代测定方法，包括自相互作用色谱法（SIC）、交叉相互作用色谱法（CIC）、以及通过生物层干涉测量法的克隆自相互作用，后者已被证明与SIC和CIC相关。为了实现更高的通量和使用低浓度的抗体，已经报告了两种基于纳米粒子的测定方法，亲和捕获自相互作用纳米粒子光谱法（AC-SINS）和电荷稳定的自相互作用纳米粒子光谱法（CS-SINS）。AC-SINS通常在模拟生理条件的溶液中进行（pH 7.4，磷酸盐缓冲盐水），其测量结果通常与药代动力学属性相关，尽管它也已用于配方应用。CS-SINS在常见的配方条件下进行（pH 6，10 mM组氨酸）并已报告用于识别在浓缩抗体配方中具有低粘度和乳光度的抗体。 治疗性抗体的第三个关键特性是它们高折叠稳定性。考虑到配方抗体的保质期为几年的目标，获得实时稳定性数据非常耗时。为了加速稳定性分析，通常使用各种压力条件。热稳定性通常使用差示扫描量热法或差示扫描荧光法测量。除了温度，表面介导的压力可以用来评估抗体稳定性。例如，最近描述的疏水纳米粒子表面压力测定法被用于14种抗体变体，这些变体跨越了一系列溶解度值，以识别在存在空气-水界面的搅拌中高度不稳定的变体。此外，这种表面介导的压力测定法对聚集的评估与其他评估生物物理属性的方法（如温度诱导的聚集和AC-SINS）相关性很好。综合这些和其他体外测定方法，药物开发者可以选择具有可取的可开发性特性组合的抗体。然而，所有体外测定方法都需要表达抗体，有时包括纯化和配方，然后在实验室进行实验。为了能够筛选更多的抗体，降低成本、人工劳动以及对抗体蛋白的需求，计算方法现在越来越受到关注，并且存在多种计算策略来解决可开发性问题，并且还在快速发展中。 大数据、机器学习和可开发性的计算评估 在生物治疗药物发现的早期阶段，计算评估在评估生物制剂的可开发性方面发挥着重要作用，通常在这个阶段几乎没有实验数据可用。例如，应用计算评估的理想阶段是在从免疫或展示实验中获得的抗体结合剂的片段可变区（Fvs）测序后，需要选择一部分结合剂进行进一步实验（见图2）。这种选择的典型策略包括根据VH-VL亲本线对的多样性和表位/副位多样性对抗体进行聚类。在这个阶段包括可开发性评估很重要，以确保集中使用可用的实验资源，因为免疫活动通常会产生数千个潜在的命中序列。编码的抗体的大部分可能在随后的确认实验中不结合或显示出多种可开发性挑战。通过计算分析标记这些抗体有助于优先考虑实验测试的抗体（见图2）。在这个阶段的可开发性评估可以包括基于序列和结构的方法或两者的组合。 图2. 基于知识的方法和基于物理的方法用于表征抗体的生物物理属性。左图，基于知识的方法：概述了从数千个潜在命中序列中基于序列的计算预测生物物理属性的关键步骤。右图，基于物理的方法：A) 抗体结合界面以一系列构象存在，包括有结合能力以及无结合状态。部分解链的构象也以较低的概率存在。B) 不同构象表现出不同的属性，其中部分解链的构象可能聚集导致进一步解链。在C)和D)中，使用局部水合自由能将TNF-α结合抗体戈利木单抗的两种不同构象的疏水性轮廓映射在其分子表面上。两种构象显示出明显改变的疏水性轮廓，因此很可能与其他疏水分子的相互作用不同。 可开发性评估的典型组成部分应包括检测化学降解的基序，如氧化、去酰胺化、天冬氨酸异构化，以及糖基化基序和非典型半胱氨酸残基的存在。人类化百分比（或“自然性”）、潜在的聚集倾向区域和MHC II类结合免疫表位也可以使用基于序列的方法预测。近年来在抗体可变区结构预测方面的进展使得定期快速可靠的高通量建模成为可能。尽管如此，对CDR-H3的构象行为及其预测的理解的最新贡献表明，仍然需要更好的模型。现在可以利用适度的计算资源对数百甚至数千个抗体结构进行建模。这些Fv模型可以用来计算几种物理化学描述符，如等电点（pI）、电荷、疏水不平衡、VH-VL界面处的埋藏表面积以及分子表面斑块。这些描述符描述了抗体的静电和疏水属性以及它们的构象稳定性。 抗体的等电点是一个重要属性，可能以多种方式影响可开发性。它可以影响各个方面，包括与抗体纯化、配方（例如稳定性和粘度）、药代动力学属性相关的方面。通常，治疗性抗体的等电点在6到9之间。然而，一些具有相对较低（pI <6.5-7）或较高（pI >8.5-9）等电点的抗体已报告存在各种可开发性挑战。例如，Bailly等人发现，将人源化抗体的初始低pI（pI 6.3-6.7）增加到更高的值（pI >7）可以提高它们的纯化产量并减少它们的聚集倾向。此外，抗体的pI影响药代动力学、组织分布和与FcRn的结合，从而影响抗体的半衰期。通过比较新发现的确认结合剂的计算属性与临床或市场上现有抗体的属性，可以分析命中药物的类似性。 在被选为实验测试的抗体中，计算可开发性评估可以帮助识别具有最佳功能和物理化学属性组合的潜在领先分子。然而，根据个别药物发现项目的特殊情况，这些领先分子可能需要经过亲和力成熟、人源化、新型分子结构的格式化，并进一步优化以适应开发平台。这就需要使用计算蛋白工程工具来优化领先分子。如果领先分子的最终分子格式是单克隆IgG抗体，那么针对改善可开发性属性的可变区的计算工程更有可能转化为实验上可验证的结果，并且令人惊讶的是，只有少数几个突变就可以在药物候选物的CMC属性上取得实质性的改进。 一旦选择了一个或几个最佳领先分子，发现项目随后进入早期开发阶段。在这个阶段，优化的领先候选物被评估其与开发平台的适应性。计算可开发性评估现在应涉及建模全长抗体结构，以更准确地描述计算属性及其与涉及更大量材料和更大样品体积的标准开发实验的一致性。在这些阶段使用多尺度分子模拟和机器学习模型可以帮助识别早期配方过程挑战，如聚集、扩散相互作用、粘度和溶解度、物理化学降解、以及免疫原性。具体来说，使用显式溶剂分子动力学（MD）模拟可能为分子对热和其他压力的响应提供分子级别的理解。将这些模拟的范围扩大到包括配方缓冲液、盐、pH和辅料的考虑，将为生物制剂的计算配方开发铺平道路。最后，虽然大多数序列和可开发性报告都是基于生物物理模型，但正在开发从抗体序列中推断可开发性参数的机器学习方法，而无需进行结构建模。 虽然上述讨论的机器学习方法是区分任务（例如，预测变量X），但深度学习还允许“生成性机器学习”的可能性，它包括学习具有特定属性的训练数据集的抗体序列的基本特征，然后生成新的抗体序列，与训练数据集不同，但具有类似的属性（也称为特征），其中特征可能包括可开发性参数、结合参数或两者都有。有趣的是，使用模拟框架，最近表明生成学习可以探索新的结合和可开发性空间。然而，生成学习的程度以及实现此任务所需的训练数据量还有待确定。此外，到目前为止，还不存在允许生成具有多个预指定特征的抗体的抗体聚焦生成方法。大规模模拟可能有助于理解这些任务所需的最小数据复杂性。总结起来，计算在评估生物制剂的可开发性方面发挥着重要作用。 从结构和分子动力学看生物制剂的生物物理属性 抗体的结构和动态特性是工程属性（如化学修饰、抗原识别和受体结合）的先决条件。蛋白质，特别是抗体的三维结构不是静态的，而是不断波动。这些波动可能发生在不同的时间尺度上，从低纳秒时间尺度到秒。即使是罕见的构象，如果它们导致不可逆的修饰或单向平衡的一部分，例如在聚集或化学修饰中，也可能相关。此外，有几项研究使用分子动力学模拟估计抗体的热稳定性。例如，从高温模拟计算的本地接触分数已被证明与实验熔化温度相关。 为了阐明抗体的功能和属性，单一静态结构并不总是足够，因此，抗体的副位可能更适合被描述为溶液中的构象集合。这些副位集合已被描述为CDR环的协同运动和域间及肘角的重新排列。这种高灵活性和抗原结合位点，特别是CDR-H3环的构象多样性，对抗体结构预测提出了挑战。尽管在抗体结构预测方面取得了实质性进展，但在进一步处理之前，仔细评估结构模型至关重要，因为一些模型可能包含结构不准确之处，严重恶化生物物理表面属性预测。在基于apo X射线结构预测抗体结构时，需要特别注意，这些结构可能因晶体堆积效应而扭曲，因此与主要的溶液结构不对应。 通过将抗体视为溶液中的构象集合，不仅可以促进结构预测，还可以指导工程工作流程，促进可开发性负债的识别和优化生物物理属性。例如，已经表明，抗体的聚集是由低群体状态加速的（见图2A-B），这些状态在接近疏水表面和相界时变得更加频繁。与表面的疏水相互作用导致构象向更疏水的构象转变，这些构象反过来更容易聚集（见图2A-B）。同样，高温将集合转向易聚集的构象。这种效应在实验上被看作是不可逆的聚集。因此，有必要将抗体属性描述为结构的集合。分子动力学模拟提供了溶液中的这样一个集合，从而增加了负责疏水或聚集行为的构象被包含的可能性（见图2C-D）。有几项研究研究了构象集合对疏水性的影响。虽然基于疏水性尺度的更粗糙方法通常对结构差异不太敏感，但基于显式溶剂热力学的研究发现输入结构和侧链取向的关键影响。 已经表明，抗体的结合和生物物理属性可能依赖于电荷。然而，蛋白质中氨基酸的pKa值预测仍然非常具有挑战性。与蛋白质pKa计算的实证方法不同，它为单一结构分配质子化状态，恒定pH分子动力学允许在结构采样中纳入质子化变化。捕捉质子化的变化对于设计pH响应性抗体尤其重要，例如针对酸性肿瘤微环境。 因此，我们强烈建议将抗体视为溶液中的构象集合，这可以改善结构预测，并允许评估有助于开发抗体治疗的生物物理属性。 细胞试验用于可开发性评估 对于患者的免疫系统来说，治疗性生物制剂是外来分子，因此它们可能是免疫原性的。由结构特性和配方引起的免疫原性可能引发急性和长期问题，例如先天和适应性免疫激活、急性细胞因子风暴或抗药物抗体（ADA）的产生，导致药物中和和治疗效力丧失。ADA与生物制剂形成的复合物可能对患者产生有害影响，这可能与导致抗原呈递、炎症细胞因子分泌以及T细胞和B细胞激活的先天免疫反应有关。根据参与的免疫细胞类型，免疫激活可能导致或不导致ADAs。抗体免疫原性的主要驱动因素是T细胞激活和随后的细胞因子释放。这可以通过使用免疫细胞激活试验在体外解决，其中将外周血单核细胞暴露于候选生物制剂中，以揭示激活T细胞表位的存在。这些试验的一般原理如图3所示。这种类型的试验已被证明通过揭示增加的T细胞增殖和释放促炎细胞因子如IL-2和IFN-γ，与单克隆IgG抗体的临床免疫原性相关，并且已被欧洲药品管理局和美国食品药品监督管理局强调为重要工具。尽管这些工具通常用于降低临床前开发的风险，但由于药物递送的差异、给定生物制剂使用的治疗环境以及人类免疫谱系的复杂性，包括人类白细胞抗原的个体单倍型，生物制剂在患者中的免疫原性仍然难以预测。 图3. 外周血单核细胞（PBMC）免疫原性测定的示意图。A) 从健康供体中分离PBMC。B) 将分离的细胞在添加了候选生物制剂的细胞培养基中培养。C) 候选生物制剂被抗原呈递细胞（APCs）摄取并在培养中呈递给T细胞。如果生物制剂是免疫原性的，这可能导致T细胞激活和同时分泌细胞因子。D) 然后可以通过对用候选生物制剂刺激后的T细胞进行表型分析，并在培养上清中测量细胞因子水平来评估免疫原性。 IgG抗体和基于白蛋白的生物制剂在屏障内和跨屏障都具有有利的运输特性，使它们在人类中平均具有长达三周的长血浆半衰期。这是因为它们能够结合到新生儿Fc受体（FcRn），该受体主要位于多种非造血和造血细胞类型的酸性内体中。在这里，FcRn在配体通过液相胞饮作用进入细胞后遇到它们，并以pH依赖的方式与它们结合，在酸性pH下发生结合，而在中性pH下不发生结合或释放。这指导了细胞循环或转运，因此，FcRn的参与使配体免于细胞内降解，从而实现高血浓度和长的血浆半衰期。不同生物制剂经历这一过程的效率对它们的药代动力学特性和生物分布有巨大影响。这促进了建立生物物理方法来确定对FcRn的pH依赖性结合动力学，例如使用表面等离子共振、微量热泳和亲和色谱技术，目标是预测FcRn介导的运输效率。尽管这些可用的高通量生物物理方法可以提供有关在给定pH条件下的结合信息，它们通常不揭示分子如何在pH梯度中结合FcRn，因此不直接模拟细胞环境。然而，pH梯度可以通过分析FcRn亲和色谱模拟，其中使用逐渐增加的pH来解决FcRn靶向分子从与基质结合的受体的解离。尽管这些研究可以揭示有价值的信息，但应谨慎，因为它们没有考虑到FcRn嵌入在带负电的细胞膜中，并遵循涉及不同内体结构的运输途径。此外，它们没有考虑到不同类型的细胞使用FcRn进行配体运输和抗原呈递以及与Fcγ受体协同处理免疫复合物的多样性。此外，FcRn在细胞环境中与IgG和白蛋白复合物的化学计量比复杂且远未完全理解。因此，需要可靠的试验，可以用于剖析IgG和基于白蛋白的格式在FcRn独立和依赖方式下的细胞处理决定因素。这种类型的见解可以通过在发现过程中早期识别所谓的“红旗”，包括多反应性、稳定性和不利的药代动力学，来指导领先选择。这些特性来自生物物理属性，如表面电荷、电荷斑块、等电点和疏水性，影响FcRn结合、细胞运输和体内表现。因此，模拟这些特性的细胞试验至关重要，可能为计算分析提供必要的数据输入。 实际上，针对FcRn介导的细胞循环和转运的细胞试验已经存在，并被用来揭示FcRn参与格式如何被摄取和排序的见解。这些试验进一步被用来预测体内特性，例如细胞运输特性与血浆半衰期或清除率之间的相关性。试验可以包括先进的活细胞成像来追踪受体及其配体，从而获得有价值的机制见解。然而，尽管成像有用且分辨率高，但成像依赖于蛋白质标记，这可能影响整体稳定性以及FcRn结合和运输。尽管许多报告侧重于测量从细胞中运输出或穿过细胞的分子量，但也应该考虑细胞内积累和降解的速率。考虑这些参数的重要性由使用基于人类内皮细胞的循环试验（HERA）所证明，其中细胞过表达人类FcRn。HERA可以用于筛选FcRn靶向分子被摄取的能力，然后是它们从细胞内积累和/或降解中的挽救（见图4A）。值得注意的是，HERA只需要少量蛋白质，并且不需要标记，因为参数可以通过收集样品上的ELISA设置来测量。此外，试验允许操纵pH并阻断配体结合位点，以及调节受体表达水平，这使得可以根据特定需求和问题定制试验（见图4B）。这提供了广泛的用途，并且细胞读数与体内数据相关。例如，HERA筛选具有不同FcRn结合动力学的IgG1 Fc工程变体，揭示了它们在人类FcRn转基因小鼠中的血浆半衰期的预测相关性（见图4C）。在最近的一项研究中，HERA被用来解决不同IgG1 Fc含量生物制剂经历细胞循环的效率，结合转基因小鼠模型的研究，暗示了观察到的IgG1 Fc融合蛋白与具有相应特异性的单克隆IgG1抗体相比半衰期短的潜在原因。重要的是，研究还解决了循环和转运之间的差异，这可能通过将循环试验与跨孔研究相结合来揭示。后者允许量化FcRn介导的转运运输，与循环相比，这与增加的清除率相关。 图4. 人类内皮细胞循环测定法（HERA）作为体外药代动力学评估和解决FcRn靶向策略的工具。A) 通用HERA协议。(1) 稳定转染FcRn的人类微血管内皮细胞（HMEC）-1被播种，然后(2) 向两个并行的细胞板中添加结合FcRn的候选生物制剂。经过一段孵育期后，(3) 从一块板上的细胞被溶解以获得摄取样本。对于另一块板，培养基被更换为循环培养基，经过另一段孵育期后，(4) 培养基被收集作为循环样本，并且(5) 细胞被溶解以获得残留样本。所有样本中的候选生物制剂通过定制的ELISA进行定量，该ELISA专为特定检测被评估的生物制剂。B) HERA协议的变体，能够分析FcRn依赖性和非依赖性的摄取、细胞积累和FcRn依赖性循环。变体包括(1) 在温和酸性的细胞外pH下执行摄取步骤，有效地通过阻止FcRn介导的循环来促进生物制剂的细胞内积累，(2) 操纵FcRn表达或阻断与FcRn的结合以分析FcRn依赖性和非依赖性细胞积累，以及(3) 引入对FcRn结合的竞争，以反映FcRn配体结合位点上的内源性竞争及其对FcRn结合生物制剂细胞运输的影响。C) HERA数据可以用来解决候选生物制剂的结构设计对FcRn介导的细胞运输和非特异性细胞积累的影响。对于某些候选生物制剂，HERA数据可能允许计算一个与人类FcRn转基因小鼠的血浆半衰期相关的分数。 为了充分利用上述描述的细胞试验，需要考虑生物制剂的生物物理属性。例如，Fc融合结构的表面电荷可能会以FcRn依赖和非依赖的方式影响生物制剂的细胞处理。例如，抗体briakinumab和ustekinumab结合相同的目标，即IL12/23的p40亚基，但它们不同的电荷轮廓赋予了它们在人类中截然不同的半衰期。具体来说，briakinumab Fv的电荷改变了其与FcRn的相互作用。细胞研究表明，这导致briakinumab的FcRn非依赖性细胞积累，这解释了它较短的半衰期。有趣的是，同一研究发现，通过Fc工程可以改善briakinumab的半衰期，这证明了调节Fc与FcRn的核心结合可以调整Fc融合结构的不利生物物理特性。它还证明了定制细胞试验可能揭示的复杂性。这些只是许多现有示例中的一些，说明远端结构特征如何影响Fc与FcRn的结合。此外，HERA和其他细胞试验也可用于研究基于白蛋白的分子的运输，这反映了它们在体内的药代动力学特性以及穿越极化粘膜上皮细胞表面的能力。 在小鼠中进行临床前药代动力学评估 虽然细胞试验可以指导选择和设计一组有限的领先生物制剂候选物，但随后必须在可靠的动物模型中评估药物候选物的体内行为。虽然非人灵长类动物在生物学上与人类非常相似，但由于成本、可获得性和伦理问题，它们在早期开发中的使用受到限制。因此，更倾向于使用较小的动物，如小鼠。然而，这些研究应该仔细计划，并考虑到小鼠和人类之间的交叉物种结合和表达差异，例如基于抗体的生物制剂的靶标识别。例如，虽然在人类中是一种有效的血管内皮生长因子（VEGF）阻断剂，但广泛使用的抗VEGF人类IgG1 bevacizumab不能阻断小鼠VEGF，这意味着在它的开发中不能使用小鼠。此外，我们对FcRn生物学的理解揭示了在使用常规小鼠时必须考虑的主要差异。这是由于小鼠和人类FcRn的配体结合存在巨大差异，其中小鼠IgG与人类形式的结合非常弱，而人类IgG与小鼠FcRn的结合比与人类对应物更强。尽管有关野生型人类IgG1变体在常规小鼠和人类中的药代动力学相关性的报告，但经过Fc工程改造以增强与人类FcRn结合和延长半衰期的IgG1变体由于丧失pH依赖性结合，无法有效结合小鼠FcRn，导致血浆半衰期短。这些跨物种差异促使开发了转基因小鼠，这些小鼠表达人类FcRn并缺乏小鼠FcRn。这些转基因小鼠现在是评估基于人类IgG的生物制剂药代动力学的黄金标准，并且重要的是，它们产生的数据与非人灵长类动物和临床观察的数据相关。 在小鼠中进行抗体药代动力学研究的一个重要且常被忽视的方面是它们异常低的内源性IgG水平，这是由于实验动物设施需要无病原体住房所致。当然，注射的IgG和基于白蛋白的治疗剂将在存在大量IgG和白蛋白的情况下竞争与FcRn结合，它们的浓度分别约为12和40 mg/mL。这给FcRn的配体结合位点带来了竞争压力，调节了注射IgG和白蛋白的血浆半衰期。缺乏这种压力可能掩盖了候选生物制剂之间的相关差异，因此应该考虑到这一点，以便准确预测药代动力学特性。这可以通过预先注射高浓度的静脉注射IgG（IVIg）来实现。此外，最近通过创建同时表达人类IgG1-Fc的人类FcRn转基因小鼠，在小鼠中提供相关竞争环境方面取得了进展。 同样，不同物种之间白蛋白结合也存在巨大差异。例如，小鼠FcRn与人类白蛋白的结合很差，这有效地阻止了基于人类白蛋白的格式免受细胞内降解。在这些条件下，白蛋白的血浆半衰期降至与大小超过阈值的无关蛋白质相似的水平。使用人类FcRn转基因小鼠可能会纠正这个问题。此外，这些小鼠持续产生大量的内源性白蛋白，有效地为人类白蛋白引入了竞争环境。事实上，人类FcRn与小鼠白蛋白的结合比与人类对应物更有效，这增加了基于人类白蛋白的生物制剂在这些小鼠中面临的竞争压力。提供更生物学相关环境的替代品包括使用表达人类FcRn的小鼠，这些小鼠缺乏内源性白蛋白，并像研究IgG时引入IVIg一样预加载人类白蛋白，或者使用小鼠白蛋白被人类对应物替换的转基因小鼠。 生物制剂的细胞系开发和生产 大多数生物制剂是昂贵的治疗剂，直接注入患者体内。因此，它们以高效、安全和可复制的方式生产至关重要。使用哺乳动物细胞生产市场上的抗体治疗剂最为常见（www.antibodysociety.org/antibody-therapeutics-product-data），但生物制剂也可以在细菌、酵母和无细胞表达系统中生产。哺乳动物细胞培养生产通常涉及数十亿活细胞，控制和可靠地复制所涉及的复杂生物过程在大规模上是具有挑战性的。因此，大量工作投入到开发理想的生产细胞系中，这些细胞系能够稳定地表达产品超过60代，以高产量和一致的产品质量进行高度可复制的过程。由于这些努力，过去几十年生产细胞系的开发已经得到改善，从随机整合表达蛋白基因然后广泛筛选高产克隆到更有针对性方法，包括目标基因整合以实现可复制的生长和产量和插入更大的遗传元素以获得强大的高产细胞系，并结合众多细胞工程策略以获得一致的产品质量。 尽管过去几十年中，高产和稳健的细胞系开发方法已取得显著进步，但生物制剂的有效生产仍是一个持续的挑战。其中一个问题是生物制剂的复杂性不断增加，例如异源蛋白可能会给细胞带来额外的压力，甚至可能导致细胞死亡。另一个挑战是生物制剂在早期研究阶段和后期细胞系开发阶段之间经常发生的表达系统变化。早期通常更倾向于使用瞬时人类表达系统，因为它们能够轻松快速地生产出可用的产品数量，而稳定的CHO细胞系则更受商业生产的欢迎。这种变化可能导致产品产量和质量（例如糖基化、聚集、蛋白质折叠）的显著差异，这意味着在商业制造之前，需要在新的表达系统中对产品进行彻底的重新表征。在细胞系开发过程中，经常遇到产量低和产品质量变化等问题，这些问题可能会影响效力、质量和患者安全。 在药物开发过程中，越早考虑细胞系开发，成功生产的可能性就越大。众多研究表明，诸如聚集倾向等不良的生物物理特性通常与稳定细胞系中的低效生产有关，这强调了使用生物物理特性预测工具作为早期可制造性指标的重要性。通过使用稳健且灵活的细胞系开发平台，结合早期产品评估和稳定细胞系的生成，也可以增加成功生产的机会。具有可预测高产量的目标整合平台在这方面具有很大的潜力，其中生物制剂可以在相同的细胞系中从发现到商业制造。通过拥有不同糖工程细胞系的库，可以增加灵活性，从中可以研究和选择决定生物制剂稳定性、血浆半衰期和免疫原性的所需糖基化概况。然后可以直接使用提供产品所需糖基化概况的细胞系进行大规模生产。 用于口服应用的抗体 迄今为止，大多数获批的生物制剂都是作为注射剂交付的，因此这些分子进入循环系统并在其中或组织中发挥作用。然而，人们正在探索替代方法，特别是用于对抗胃肠道（GI）感染。对于这类生物制剂，可开发性方面同样重要，就像注射分子一样。然而，虽然血浆半衰期和免疫原性是静脉注射生物制剂的关键因素，但对于在GI道中发挥作用的口服可用生物制剂来说，稳定性和保质期等其他方面更为重要。此外，不同的质量参数，如产品纯度和是否存在其他蛋白质，对于口服生物制剂可能不那么重要，因为GI道通常会遇到广泛的大分子。作为如何为口服途径优化生物制剂的一个例子，Fiil等人为饲料应用设计了一个高度生物物理稳定的同二价VHH结构，并证明了它在抑制仔猪中的肠毒素大肠杆菌（ETEC）增殖方面的功能性。他们在早期设计中的关键因素是选择一个连接体，与之前用作其他口服蛋白质连接体的IgG3的更自然的铰链区相比，它在GI条件下的稳定性令人惊讶地更高。类似地，Virdi等人尝试了其他格式，如IgA样分子，这些分子也被证明在抑制仔猪GI道中的ETEC增殖方面有效。在这种情况下，推测Fc区域的结合将增加在GI道中的滞留时间，这在概念上类似于延长半衰期。 在某些情况下，可以在发现过程中或通过随后的蛋白质工程努力进一步优化生物制剂的生物物理稳定性。在纳米体的情况下，一种方法涉及细胞内选择，已被证明可以选择出更稳定的纳米体。这可以跟随实验，在筛选过程之前将纳米体暴露于高温，使具有更高再折叠能力的纳米体被识别出来，以及蛋白质工程努力，通过在相对的β链之间引入额外的二硫键，进一步稳定纳米体以抵抗高温和蛋白酶。 最后，当生物制剂需要口服时，可能会考虑使用替代表达系统，如微生物发酵、使用藻类或转基因植物，甚至通过工程细胞进行原位生产。这些系统可能会降低生物制剂的生产成本和时间，从而扩大这些分子的应用范围。 结语 最近，在生物制剂的发现和开发中发生了转变，从主要关注高亲和力和特异性结合目标、击中正确的表位并传递所需的功能，到现在也考虑可开发性方面。这种扩大的发现和多维工程思维可能会产生更好的药物候选物，并减少药物开发过程中晚期失败的数量。然而，在许多情况下，特别是对于完全新型的生物制剂，尚不清楚什么构成了良好的可开发性概况，尽管一些这样的概况（例如，上市药物类似性和治疗性抗体分析器）开始出现。随着更多的序列信息和生物物理数据公开可用，建立可开发性指导原则的任务变得更加可行。在这个领域，我们预计在发现过程的早期，计算预测将发挥越来越大的作用，因为它们允许在低（建立后）成本下进行非常高通量的分析。然而，使用计算模型可能存在一些固有的不确定性，因为现有数据集的偏差，重新评估算法以及扩展现有和构建新数据集将继续很重要。在生成这些数据集时，可能有利于包括并探索可能不被预测具有优越可开发性概况的分子。 另一个复杂性是，一些生物物理属性本质上是动态的，例如聚集和部分解链，这可能很重要，计算方法能够将其纳入预测。例如，由于结构模型并不总是准确的，考虑到这一点的模拟可能需要作为稳态模型的补充，以提高生物物理预测的准确性和可靠性。为了进一步改进计算方法，开发最优生物制剂，既需要基于知识的方法，也需要基于物理的方法。开发可靠计算模型的另一个障碍是缺乏来自在相似条件下使用相似协议和仪器对大量分子进行实验获得的自我一致和可复制的数据。生物制药行业的持续数字化转型预计将改善这一困难，并促进改进人工智能和机器学习方法的产生。最后，在行业和学术界的前竞争空间中形成协作联盟，使自我一致和可复制的数据可供机器学习使用，将是改进计算方法和模型的另一个巨大进步。 除了计算方法，我们预计生物物理方法将继续发挥作用，以评估可开发性措施。自动化、微型化和数字化是药物开发中的关键趋势。结合新的体外测定，这可能使在发现过程的早期进行更强大的和智能的筛选和表征。然而，这个领域仍然存在挑战。虽然拥有强大的发现引擎对于开发新的生物制剂可能是一个重大优势，但建立这种能力并教育人员使用先进的系统既复杂又昂贵。此外，随着药物越来越定制化和个性化，大型发现平台的多功能性和模块化需要改进，以便它们不仅优化了针对单一类型的适应症的模态。 另一个将有助于生物制剂开发的途径是产生和使用更好地反映临床环境以及生物制剂在人体中表现的动物模型。在这方面，一些重要方面包括药代动力学、免疫原性、效力和效应功能的作用。 由于生物制剂通常是复杂的分子来制造，因此表达系统和纯化方法的优化至关重要，以实现高质量材料的重复、可复制生产。这涉及到产量、折叠、翻译后修饰（如糖基化）的优化，以及宿主细胞蛋白的减少。在这里，预计糖工程将继续发挥重要作用，我们预计在发现过程的早期考虑糖基化模式（和其他翻译后修饰）可能会提高许多基于蛋白质的生物制剂的成功率。然而，在这个领域，仍然有许多未知之处，更好地建立知识和指导方针，不仅如何设计生物制剂以具有类似人类的翻译后修饰，而且具有甚至比相应的人类更好的修饰，将是重要的。 作为最后的评论，值得提及的是，迄今为止大多数生物制剂都是作为注射剂来管理的。在未来，预计更多的生物制剂将通过口服、肺途径或其他途径交付。这无疑将影响新生物制剂的开发和配方方式，并可能允许使用全新的生产系统。

来源：小药说药 前言 人类基因组的破译加上生物技术的进步，特别是单克隆抗体（mAbs）的里程碑式发现，使得生物治疗极大地改善了病人的生存时间和生存状态。目前，已经有超过300种生物疗法获得美国食品和药物管理局（FDA）批准，其中许多被批准用于治疗免疫和炎症性疾病。 2022年全球TOP100畅销药合计实现了4868亿美元的销售收入，自免疾病领域已经是仅次于肿瘤的第二大药物市场。跻身TOP100榜单的自免产品共18款，总金额达861.7亿美元。如今，自免领域已成为重磅炸弹的密集诞生地，也成为各大制药巨头业绩贡献的主要来源。 治疗靶点与开发药物 下表列出了经FDA批准用于自身免疫疾病适应症，以及处于关键3期临床试验或阳性的2期临床试验中的生物疗法。 白细胞介素-1 IL-1α和IL-1β定位于对无菌状态下和微生物介导的炎症反应的迅速响应。当上皮细胞、内皮细胞和血小板对组织损伤作出反应时，IL-1α作为一种报警素发挥作用。相反，髓系来源的亚型IL-1β是作为一种非活性蛋白合成的，需要炎症小体驱动的蛋白水解过程才能发挥活性。IL-1α/β属于较大的IL-1细胞因子家族，它利用IL-1受体辅蛋白（IL-1RAcP）与IL-1R1亚基配对产生MyD88依赖性信号。IL-1α/β功能也受天然拮抗剂IL-1Ra、sIL-1RAcp和诱饵受体IL-1R2的调控。IL-1α/β表达失调与以发热、皮疹、关节炎和器官特异性炎症为特征的多种全身性自身炎症性疾病（SAID）有关。 FDA已经批准了三种不同性质的生物疗法，但都是针对IL-1的。Anakinra是一种天然拮抗剂IL-1Ra的改良版本，它同时抑制IL-1α和IL-1β。Anakinra被批准用于治疗RA和CAPS，其半衰期短，为5-6小时，因此需要每天皮下注射。Anakinra对痛风也有效，尿酸单钠晶体刺激NLRP3激活和IL-1β产生。Canakinumab是一种IL-1β中和抗体，每4-8周皮下给药一次，被批准用于治疗全身性青少年特发性关节炎（SJIA）和SAIDs。Rilonacept编码IL-1R和IL-1AcP的胞外结构域，与IgG的Fc部分相连，优先中和IL-1β，批准用于SAIDs的每周皮下给药。 白细胞介素-6 IL-6是gp130细胞因子家族的一员，是许多稳态和炎症过程的中心组成部分。IL-6最初被鉴定为促进B细胞分化的T细胞衍生因子，现在因其在适应性免疫中的多效性活性而受到重视。它有助于Th17和T滤泡辅助细胞（Tfh）的分化，驱动髓样细胞分化，并与Th2细胞因子协同促进巨噬细胞极化为促纤维化表型。IL-6在肝脏急性期反应中起重要作用，增加包括C反应蛋白（CRP）在内的炎症蛋白，增强补体与病原体或死亡细胞的结合，对内皮细胞功能和上皮细胞完整性也有重要影响。 IL-6的广泛生物活性源于其调节多个细胞靶点的复杂性质。IL-6由多种细胞合成，并通过三种不同的细胞表面信号机制（即经典信号、反式信号和反式呈递）激活靶细胞，最终产生JAK/STAT信号。 Tocilizumab和sarilumab是FDA批准的两种IL-6R阻断性单抗，许多其他药物正在临床开发中。Tocilizumab和sarilumab被FDA批准用于治疗中重度RA，其中受影响关节滑液中IL-6水平升高，血清IL-6水平与疾病活动相关。这两种药物都能改善RA患者的炎症症状并减少影像学进展。 细胞因子释放综合征（CRS）是一种急性全身炎症性疾病，与许多基于抗体的治疗、化疗和T细胞参与的免疫治疗（如CAR-T细胞）以及严重感染相关。与T细胞参与疗法相关的CRS被认为是由活化的T细胞产生TNF-α，进而触发单核细胞和活化的巨噬细胞产生IL-6和IL-1β。CRS症状（例如发烧和低血压）的缓解通常在单剂量的Tocilizumab后实现。给药tocilizumab似乎并不影响T细胞参与疗法的抗肿瘤效果。 肿瘤坏死因子 TNF-α主要由免疫细胞和内皮细胞产生，并通过促炎信号和细菌产物显著上调；TNF-β(LTα)主要由淋巴细胞产生。TNF-α以三聚体膜结合形式（mTNF）表达并经历蛋白水解裂解产生可溶性三聚体sTNF。TNFR1广泛表达，而TNFR2主要表达于神经元、免疫细胞和内皮细胞。TNF-α具有多效性功能。TNF-α对病原体的最佳防御、淋巴器官的正常发育以及在神经元再髓鞘化、心脏重塑和软骨再生中的重要修复作用都是必需的。 目前有五种TNF抑制剂被FDA批准用于临床，全部都靶向TNF-α，其中依那西普另外抑制TNF-β。肿瘤坏死因子拮抗剂的分子类型反映了近二十年来生物治疗药物的发展。依那西普（TNFR2-Fc）是FDA批准的第一个Fc融合蛋白；infliximab是第一代嵌合单抗；adalimumab是来源于噬菌体展示的人源单抗；golimumab是来源于表达人IgG的转基因小鼠的人源单抗；certolizumab-pegol是一种从小鼠杂交瘤中分离的人源化Fab片段，经聚乙二醇化可延长其体内半衰期。 大多数肿瘤坏死因子拮抗剂显示出共同的临床疗效。然而，依那西普在克罗恩病（CD）的随机双盲安慰剂对照试验中无效，可能反映了TNF抑制剂治疗机制的差异。除了中和sTNF-α外，抗TNF抗体和certolizumab-pegol(而不是依那西普)可通过结合mTNF或阻断抗凋亡信号诱导固有层T细胞凋亡。此外，抗TNF单抗（而非依那西普或certolizumab-pegol）可通过Fc依赖机制诱导M2型创伤愈合巨噬细胞应答。因此，TNF拮抗剂之间的机制差异可能是导致其在CD中不同临床效果的原因。 CD20 CD20是一种B细胞标志物，其表达始于早期的前B细胞，但在向浆细胞的终末分化过程中丢失。它是一种四肽蛋白，是B细胞发挥最佳功能和免疫反应所必需的。 Rituximab是一种嵌合单抗，是FDA批准的第一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤的抗CD20单抗。基于其在肿瘤学中令人惊讶的良好安全性，研究人员开始探索其在严重自身免疫性疾病患者中的应用。Rituximab目前被FDA批准用于治疗多种自身免疫性疾病。由于CD20既不在HSC上表达，也不在终末分化的浆细胞上表达，因此抗CD20单抗选择性靶向CD20+B细胞与先天性B细胞缺乏具有不同的免疫学后果。例如，用抗CD20抗体治疗后，血清IgG水平没有显著影响，而严重的X连锁无丙种球蛋白血症（其中B细胞不发育）则观察到缺乏免疫球蛋白。 最近的一项2期研究使用了obinutuzumab，一种具有增强ADCC和诱导B细胞凋亡能力的II型抗CD20单抗，已报道狼疮性肾炎患者的临床获益（NCT 02550652）。需要对obinutuzumab进行进一步的研究，以确认额外的B细胞消耗是否对狼疮性肾炎有益。 BAFF/APRIL肿瘤坏死因子超家族成员 BAFF和APRIL是TNF配体超家族的两种II型跨膜蛋白，它们的受体BAFFR、BCMA和TACI在B系细胞的存活和成熟以及功能中起着重要作用。 血清BAFF和APRIL水平在许多自身免疫性疾病中升高，包括SLE、Sjögren综合征和RA。Belimumab是一种人IgG1λ单抗，被批准用于治疗活动性自身抗体阳性的SLE。它抑制sBAFF三聚体，但不与mBAFF或APRIL结合。在关键的临床试验中，与SOC组相比，belimumab在SLE应答指数和健康相关生活质量终点方面有更大的改善。此外，belimumab降低了循环中原始B细胞、活化B细胞和浆细胞的数量；抗dsDNA水平降低，补体水平正常化。与对循环记忆B和T细胞缺乏影响一致，治疗一年后，先前存在的抗肺炎、破伤风和甲型流感抗体没有受到影响。 Atacicept是融合TACI胞外区的Fc融合蛋白，结合BAFF、APRIL和BAFF/APRIL异源聚体。在系统性红斑狼疮患者中应用Atacicept治疗后，血清IgM（∼70%）、IgG（∼30–40%）和IgA（∼50–60%）迅速下降，抗双链DNA抗体下降了∼40%。终止治疗后，抗体和自身抗体水平恢复到预处理水平。 整合素家族 整合素通过调节白细胞与血管的粘附来调节免疫细胞的运输，并促进白细胞向组织中的外渗。整合素异二聚体由18个α亚单位和8个β亚单位之间的配对组成，形成24种不同的受体复合物，它们在表达模式、配体特异性和功能上存在差异。 在MS中，α4β1（CD49d/CD29，VLA4）在T和B细胞上表达，并通过VCAM1与血脑屏障内皮细胞的结合促进淋巴细胞向中枢神经系统（CNS）的外渗。在胃肠道中，表达于T细胞上的α4β7可与Peyer氏斑高内皮小静脉和固有层小静脉上的MADCAM-1结合，促进炎症性肠病（IBD）致病性T细胞的外渗。 Natalizumab是一种α4阻断性单抗，被批准用于治疗CD和RMS患者。然而，RMS抑制淋巴细胞进入中枢神经系统的有效性的机制基础也为进展性多灶性白质脑病（PML）的罕见病例的发展提供了基础。第二代抗体，包括vedolizumab（对α4β7复合物有选择性）和etrolizumab（抗β7），通过针对IBD的肠道特异性整合素降低PML的可能性。Vedolizumab可诱导临床反应和缓解，FDA已批准用于溃疡性结肠炎（UC）和CD。除了阻断α4β7:MADCAM1相互作用外，etrolizumab还干扰E-钙粘蛋白+肠上皮细胞对αEβ7+IELs的保留。在一项2期临床试验中，与对照组相比，对UC患者使用etrolizumab治疗导致临床病情缓解的可能性更大。由于αEβ7+IELs是UC患者炎症细胞因子的重要贡献者，因此阻断α4β7和αEβ7整合素可能有额外的临床益处。 抗αL抗体Efalizumab阻断T细胞和B细胞表达的αLβ2（LFA1）与ICAM1的相互作用。除了阻断整合素外，Efalizumab还下调LFA-1的表达，LFA-1是T细胞与抗原呈递细胞（APC）形成突触所必需的。Efalizumab被FDA批准用于治疗中度至重度斑块型银屑病。然而，4名使用Efalizumab治疗3年以上的患者出现了PML，该药物已退出市场。 白细胞介素-12和-23及其下游效应物 IL-12和IL-23是两种密切相关的APC衍生的异二聚体细胞因子，分别由p35和p19亚单位组成，它们与一个共同的p40亚单位配对。这两种细胞因子，主要的应答细胞是T细胞和固有淋巴细胞（ILCs），在不同的细胞类型中，IL-12上调Th1主转录因子T-bet的表达并诱导IFN-γ的产生。以类似的方式，IL-23刺激诱导转录因子RORγt的表达和下游细胞因子IL-17A、IL-17F、IL-22和GM-CSF的表达。疾病的临床前模型和全基因组关联研究表明IL-12/23通路参与炎症性肠病和银屑病。 设计用于干扰IL-12/23通路各种成分的多种疗法已进入临床。两种单抗（ustekinumab和briakinumab）靶向p40亚单位，从而中和IL-12和IL-23。最近，效应细胞因子的IL-17家族引起了广泛关注，有5种单抗选择性中和IL-17A；2种单抗中和IL-17A和F；brodalumab靶向IL-17RA，一种IL-17A、B、C、E和F成员的共同受体。然而，虽然IL-17B-E的不同功能已被描述，但这些细胞因子不受IL-23的调节，它们在人类疾病中的作用仍未被充分研究。 此外，对阻断IL-22（fezakinumab）、IFN-γ（fontolizumab）和GM-CSF（namilumab和mavrilimumab）治疗的研究将提供进一步的见解，尽管它们还处于早期研究。 自免疾病的全球和中国市场 经统计，全球自身免疫疾病治疗药物处于稳定增长的趋势。弗若斯特沙利文数据显示，全球自身免疫疾病药物市场预计将由2021年的1,277亿美元，增长至2030年的1760亿美元，复合年增长率为3.6%。2021年，自身免疫疾病生物制剂市场规模为891亿美元，预计到2030年将增至1421亿美元，分别占2021年及2030年全球自身免疫疾病药物市场的69.8%及80.8%。 来源：弗若斯特沙利文报告 鉴于中国庞大的患者群体及自身免疫疾病创新疗法的进步，中国自身免疫疾病药物市场有望快速增长，由2017年的17亿美元增长至2021年的30亿美元，复合年增长率为15.2%，估计2030年将达到231亿美元，2021年至2030年复合年增长率为25.5%。估计生物药在中国自身免疫疾病中的份额将由2021年的32.9%增加至2030年的71.8%。 来源：弗若斯特沙利文报告 虽然中国的自免市场在快速增长，但潜力仍未完全发掘。一方面是由于中国自免药物市场仍以传统小分子为主导，而进口自免新药已进入中国，但众多的自免患者由于分布在经济欠发达地区，支付能力仍有限。另一方面，则由于自免疾病作为慢性病并不致死，导致患者认知程度不高，因此，该领域许多疾病的诊断和治疗率一直很低。 不过，随着治疗手段的升级，疗效更好的生物制剂逐渐将被医生和患者所接受。而中国创新药的崛起也将凭借价格优势覆盖更广泛的患者群体。此外，银屑病、特应性皮炎、系统性红斑狼疮等自免疾病主要影响年轻群体，这类新生代人群更注重个人生活品质的提高，对身体、形象的受损容忍度低，因此有更强的支付意愿。多种有利因素将促进中国自免市场规模的快速增长。 参考文献： 1.30 Years of Biotherapeutics Development-What Have We Learned? Annu Rev Immunol. 2020 Apr 26;38:249-287     2. 弗若斯特沙利文报告