Cambridge Antibody Technology

2024医美与器械创新前沿华西论坛，与您共探药企转型之道，解锁消费医疗市场新机遇。10月12日，成都等您来！ 从Humira到Keytruda，不少畅销产品尽管机制、赛道不尽相同，但它们之所以成功，都能从开发策略上找到重合点——“药丸管线”（pipeline-in-a-pill，PiP）。 简言之，PiP战略指的是将一种药物用于多项适应症：它更多关注临床执行，而非寻找下一个“重磅炸弹”。通过将资源集中在少数产品上，药企一旦获得深入的数据支撑，该模式便会带来巨额回报（2023年Keytruda卖出了250.11亿美元）。 纵观近年的一些资产并购，也证明了PiP模式的吸引力。 例如2020年，BMS以131亿美元收购Myokardia，主要看中了后者心血管药物mavacamten；吉利德以49亿美元收购Forty Seven，也一度打算把CD47单抗magrolimab用于多种癌症治疗；强生65亿美元收购Momenta获得的FcRn抗体nipocalimab，目前正寻求上市批准。 考虑到MNC的“专利悬崖”危机，接下来，或许有更多的交易围绕PiP资产展开。然而，正如吉利德在magrolimab上的反复受挫一样，这种策略的挑战不可小觑。 他山之石，可以攻玉。本文将重点介绍9款PiP药物，以回应走上这条进攻型道路所需要的成功经验。 此外，如果PiP模式是一种风险与收益同样大的选择，那药企有什么其他方法，帮助天平向“重磅炸弹”一端倾斜？也就是说，除了药企可以同时准备哪些防守性的手牌，增加赢面？ 1 如何开发PiP药物？ 本文选择的9个案例，包括Soliris、Keytruda、Humira、Avastin、Rituxan、Avacopan、Advair、Neupogen和Revlimid。 整体上，它们能成为PiP药物，离不开几方面原因： • 广泛的作用机制（MoA）通常针对涉及多种途径和疾病的靶点——这或许是PiP药物最重要的特征，还可提供组合疗法潜力。 • 不同的剂量和给药方式，使药物在不同环境下治疗患者。例如，甲氨蝶呤在肿瘤中的应用（高剂量）和狼疮/类风湿性关节炎中的应用（低剂量）。 • 一个由基因决定的靶点，以降低临床项目的风险。这是所有药物开发人员的偏好。 • 长期安全性研究和更有效的试验设计，以便更快开展新的关键研究。 01 Soliris Soliris（依库珠单抗）是一种抗体补体抑制剂，它改变了罕见病患者的生活，使Alexion成为一家明星Biotech。 作为PiP药物，过去20多年间，Soliris有过4次大规模成功，也出现9次失败。 2007年，在4次暂停试验后，Soliris获批用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）；2011年，FDA批准Soliris治疗非典型溶血性尿毒症综合征（aHUS）。在这两种极为罕见的适应症，Soliris都是首款疗法。 随着时间推移，Soliris后来还获批用于治疗成年全身性重症肌无力（MG）和视神经脊髓炎（NMO）患者。 Alexion在PiP模式之上，叠加了投资组合战略——开发其他补体抑制剂，同时仍尝试扩大Soliris在更多适应症中的使用。Soliris成功的核心是它专注于补体，而补体是许多免疫疾病的病理基础。 Alexion创始人不仅是验证超罕见病商业模式的先驱，还为如何将一种药物定位PiP树立了典范：通过专注在治疗质量低下或没有标准治疗的超罕见疾病，并在FDA的支持下进行更有效的临床试验，Alexion得以建立特许经营权。 02 Keytruda PD-1抗体Keytruda（帕博利珠单抗）是如今肿瘤免疫疗法当之无愧的代表，截至今年上半年，它在美国被用于40项适应症。 Keytruda最初由Organon无意中开发。2003年，该公司希望找到一种PD-1激动剂，用来治疗自身免疫性疾病。发现PD-1抑制剂后，因为另一种肿瘤免疫药物CTLA-4抑制剂备受关注，Organon决定将注意力转向癌症。 2007年，Organon被先灵葆雅收购，而先灵葆雅又于2009年被默沙东收购。经过两次交接，Keytruda被默沙东列入了出售名单。 直到2010年，BMS披露CTLA-4抑制剂Yervoy在难治性转移性黑色素瘤治疗中的III期阳性数据。有消息称，BMS开发的PD-1抑制剂Opdivo也显示出良好效果，因此，默沙东打消转让Keytruda的念头，并于2011年开始首次临床试验。 意识到在PD-1抑制剂研发方面落后于BMS约5年，默沙东做出一些关键决定，最终使Keytruda取得巨大成功： • 使用生物标记物。默沙东利用肿瘤中的PD-L1表达，来提高Keytruda的有效率。尽管生物标记物减少了可治疗的患者总数，并使开具处方变得更加困难，但默沙东还是选择采用这种方式，弥补失去的开发时间。 • 突破性疗法认定。2012年，FDA实施突破性疗法认定，增加药企与该机构会面的频率。默沙东利用这一监管变化，并为Keytruda获得该认定。 • 扩展I期临床试验。当观察到黑色素瘤患者对Keytruda反应良好时，I期临床被扩展，以增加更多晚期黑色素瘤和肺癌患者。该试验最终招募了上千名患者，成为有史以来规模最大的癌症I期研究。 • 专注于黑色素瘤。Keytruda针对黑色素瘤领域的早期研发，是由Yervoy在该适应症上的初步成功推动的。默沙东对晚期黑色素瘤患者的关注不仅是基于数据，而且希望避免可能拖慢临床试验进度的对照研究。 2014年，Keytruda获得FDA批准，用于治疗携带BRAF突变的晚期黑色素瘤患者。此后，它接连在其他癌肿取得成功。截至2023年，Keytruda为默沙东带来1016.7亿美元的收入。 03 Humira 从累计销量上看，Humira（阿达木单抗）目前是有史以来最畅销的药物——20余年间，共卖了超过2000亿美元，治疗范围覆盖类风湿性关节炎、克罗恩病、银屑病等多种自身免疫性疾病。 Humira的发现最早可追溯到20世纪90年代，得益于Cambridge Antibody Technology（CAT）的噬菌体展示技术——2018年，该公司创始人Gregory Winter还因此获得诺贝尔奖。从Knoll Pharmaceuticals筹集到资金后，CAT在两年内便找到一种候选药物。2000年，相关III期关键临床启动，雅培以69亿美元收购案强势入局。 2002年，FDA批准Humira用于治疗类风湿性关节炎。光是2003年底，该药就治疗了5万多名患者。尽管Humira是市场上第3种TNF-α靶向抗体，但它的给药时间更合理，耐受性更好。2006年，Humira自用注射器获得批准，优势进一步凸显。 凭借广泛的MoA，雅培看到Humira治疗更多疾病的价值。在每次新适应症批准推动下，Humira收入迅速增加。2013年，雅培将其药品业务分拆为艾伯维，Humira很快占据该公司一半以上的营收。 虽然Humira的核心美国专利于2016年到期，但因为生物仿制药的开发门槛较高，且艾伯维通过一系列外围专利布局和谈判，将Humira的生命周期大大延长。 Humira之所以能够成为一种PiP产品，原因如下： • 瞄准TNF这个对多种自身免疫性疾病有广泛影响的靶点。 • 与竞品相比，拥有更好的给药方案。 • 使用Humira自用注射器，更方便患者自行给药。 • 投资长期临床试验（为期8年的研究），全面衡量毒性和其他副作用。特别是对于TNF抑制剂，副作用是一个主要考虑因素，甚至可以对冲专利到期。 04 Avastin Avastin（贝伐单抗）是一种抗VEGF-A抗体，由基因泰克开发，获批用于治疗多种实体瘤，也可治疗湿性AMD。 1989年，在一个心血管疾病研究项目中，Napoleone Ferrara他及其在基因泰克的研究团队率先克隆出VEGF，该因子对血管生成（即新血管生长）至关重要。在基因泰克“科学至上”的文化熏陶下，他们开始探索抑制血管生成的抗癌作用。 过去的研究发现，血管发育与肿瘤生长之间存在联系。其中一个重要主题是，该团队将新技术（克隆和抗体）用于解决老问题（血管生成）。 1993年，他们发现一种抑制VEGF的抗体，后者可以减少小鼠模型中肿瘤的生长。该抗体的人源化版本研制成功后，Avastin就进入临床试验。 由于Avastin具有如此广泛的MoA，基因泰克开始将它用来测试多种癌症。2002年，该药在一项三线乳腺癌III期试验中未能达到主要终点。另一项针对转移性结直肠癌的关键III期试验显示，与标准疗法相比，Avastin可将无进展生存期延长5个月。2004年，即首次克隆出VEGF的15年后，该药获得治疗该疾病的批准。 基因泰克继续探索抑制血管生成在更多癌症中的应用，随后十余年，Avastin又多次获得新适应症批准。 Avastin成为一款PiP产品，主要有两个原因：其一，通过VEGF介导的广泛MoA，与多种实体瘤甚至眼疾有关。先发优势无疑也为基因泰克提供了帮助。其二，利用新技术探索老问题：血管形成在癌症生长中的作用。 05 Rituxan 作为首个获准用于癌症治疗的抗体疗法，Rituxan（利妥昔单抗）是基因泰克旗下另一个PiP产品的代表。 Rituxan靶向CD20，可治疗非霍奇金淋巴瘤（NHL）、慢性淋巴细胞白血病、类风湿性关节炎、肉芽肿伴多血管炎、显微镜下多血管炎和寻常天疱疮患者。该药还经常在标签外，用于治疗原发性血小板减少症等多种疾病。 大约1975年，斯坦福大学教授Ronald Levy参与了一个项目，针对淋巴瘤细胞上的患者特异性表面抗体（Ig）开发疗法。1981年，从该项目中发现的抗体被用于治疗首例淋巴瘤患者，此后又治疗约50名患者。1985年，IDEC Pharmaceuticals成立，旨在将这项研究商业化。然而，该公司无法找到一种经济有效的方法来扩大个性化治疗，因此转向CD20这种更普遍的B细胞靶点。 随后，IDEC发现一种候选抗体（C2B8）。1992年，IDEC提交IND，并在1994年的I期试验中获得积极数据。然而，IDEC在筹集更多资金以开展临床试验方面举步维艰。它当时正在开发一种全新的模态——单克隆抗体，其适应症被认为是一个小市场，NHL每年发病约为4万例。 1995年，IDEC与基因泰克达成交易，为研究找到后续资金。经过成功的关键性试验，Rituxan在1997年首次获得FDA批准用于治疗NHL。随后的临床研究显示，Rituxan与化疗联合使用效果更佳，因此被用作一线疗法。 即使在开始首次试验近30年后的今天，Rituxan作为一种单一疗法、联合疗法和维持疗法，每年仍能为约50万患者提供治疗。 可以看到，Rituxan的成功，离不开以下几点： • 使用当时的新技术（单克隆抗体）比标准治疗方法更精确地治疗疾病。细胞疗法、基因疗法的机会现在相当。 • 追求进展相对较慢的适应症。这使Rituxan可用于维持治疗，并有更多机会与其他疗法相结合。 • B细胞耗竭对癌症和自身免疫都有相当广泛的影响，通过设计首个针对B细胞的抗体，Rituxan拥有了市场定位，可以观察其对由B细胞驱动的任何疾病的影响。 06 Avacopan 一个更近的有望成就PiP产品的案例，来自Chemo Centryx开发的Avacopan。2021年，该药物最先在日本获得批准，用于治疗肉芽肿性血管炎（GPA）和显微镜下多血管炎（MPA）。 作为一种补体受体C5aR拮抗剂，目前，Avacopan还在进行C3肾小球病和化脓性汗腺炎的临床试验。Avacopan的机制与Alexion的Soliris相似，具有治疗多种补体驱动疾病的潜力。 07 Advair Advair（沙美特罗替卡松）由GSK开发，是氟替卡松（类固醇）和沙美特罗（支气管扩张剂）的组合，用于治疗COPD和哮喘。该药物的作用是放松支气管平滑肌并减少整体炎症。GSK投入巨资进行试验以扩大Advair的使用范围，并且在标签外使用方面非常积极。 08 Neupogen 安进开发的Neupogen（非格司亭）也可被纳入PiP产品之列。 该药物是一种重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF），1991年首次获批用于治疗化疗引起的中性粒细胞减少症，十多年来，该药物在再生障碍性贫血、骨髓移植等治疗领域也取得进展。 化疗和其他癌症治疗过程中，患者的免疫系统基本上被破坏，而Neupogen有助于刺激免疫细胞的生长，从而降低治疗期间感染导致的死亡率。在首次临床试验中，安进确定了Neupogen的安全性和强大的中性粒细胞恢复能力。这使该药物成为化疗患者的标准治疗药物。 09 Revlimid Revlimid（来那度胺）是另一个PiP模式案例。 在Celgene的推动下，2005年Revlimid首次获批用于治疗骨髓增生异常综合征。随后，Revlimid开启了PiP之路：2006年，获批用于治疗多发性骨髓瘤；2013年，获批用于治疗复发/难治性套细胞淋巴瘤；2019年，获批用于治疗滤泡性或边缘区淋巴瘤。 该药源自Celgene在1990年代的免疫调节药物研究；有趣的是，Revlimid是从表型筛选中发现的，获批后才发现该药物能与E3连接酶结合，选择性降解IKZF1/3转录因子。 2 防守战略作为后手 上述9款药物，并非PiP战略的全部案例，却足以说明所能达到的业务规模。并且，药企还可以将该策略应用于其他适应症，例如神经退行性疾病、衰老和与年龄相关的疾病，以及呼吸系统疾病。 但本质上，这种将大部分资源押注在少数产品的选择，也埋下巨大的风险。所以，药企通常会做其他布局进行平衡。 与PiP战略互相补充的，可以是建立资产组合或平台——前者侧重于以多样化的产品组合作为护城河，后者侧重于以技术作为护城河。它们区别于PiP战略，即以临床成功的药物作为护城河。 如果说PiP战略是进攻，那么资产组合战略就是防守。 在特定的适应症中，一个跨越不同疾病阶段的药物组合，可以帮助公司在有新药进入的情况下，保持稳定的销售额。要建立药物组合，必须在研发和临床开发方面进行大量投资。从另一个角度看，一些公司的成立就是为了匹配这些产品组合，并在适当时候被收购。 对于渤健，公司通过合作、并购和内部开发，建立了以多发性硬化症为中心的产品组合。辉瑞在JAK抑制剂方面也采取了类似的做法：除了推出托法替尼（tofacitinib），还开发了具有不同剂量、配方和PK/PD特性的其他候选药物，以使公司的管线多样化。 总之，产品组合战略使药企能够更容易地适应不断变化的市场条件，并将产品与特定的患者群体相匹配。 至于平台技术战略，则是以新技术和科学专长为核心。 这种防守选择的主要优势，在于能够吸引合作机会，降低公司的融资成本，而且技术的稀缺性可以帮助公司获得更有利的交易条件，尤其是当合作伙伴认为自己在技术革命中被抛在后面时。 然而，药物开发仍然十分复杂，因此平台技术受限于我们对生物学和疾病的基本认识。 平台技术公司历来也很难长期保持相关性；但也有少数例外，如Adimab和再生元。临床概念验证数据是平台技术公司的一个重要里程碑，可以验证平台产生更有前途的候选药物的能力。在此过程中，平台技术公司能跟拥有更多资本和商业资源的巨头达成许可协议。 平台技术的例子，包括AAV、RNAi、mRNA、ADC和细胞疗法。打造平台技术公司的前提，是创建一个模板，生成一系列药物。从历史上看，专注于疾病遗传驱动因素的平台表现最好。 Seattle Genetics就是一个执行“攻守皆备”战略的例子，该公司不仅有机会推进PiP产品，而且拥有领先的ADC平台。 而Alnylam是RNAi领域的领导者，利用其平台开发了几种已获批准的药物，并且还有更多药物在研。RNAi尤其是ASO，适合作为平台技术，因为在设计和验证化学主链后，可以轻松互换目标序列。因此，ASO开发的前期投资可以在更多试验中分摊。 3 小结：各取所需 PiP战略，以及产品组合战略、平台技术战略，综观这三种选择，PiP战略通常会获得最大的收益成果。它降低临床成本，最大限度地发挥商业潜力，同时提高了商业化效率。 不过，基因组学、机器学习和合成生物学等新工具，也可以使药物设计更具可预测性，从而带来更大的赢面。 对于公司创始人来说，这些战略创造了三条主要路径：第一，开发具有PiP潜力的资产；第二，建立一家公司，以便被收购并整合到更大的投资组合中；第三，利用一个平台来开展合作，推动药物开发。 很少有公司能够找到一种方法来同时完成这三项工作。因此，药企必须根据自身背景，做出合适的选择。 参考文献： 1.Drugs that are their own pipelines；Life sciences strategy 2.当默沙东要跳出阴影；同写意 3.The Startling History Behind Merck's New Cancer Blockbuster；Forbes 同写意媒体矩阵，欢迎关注↓↓↓

摘要：单克隆抗体（mAbs）及其衍生物已成为近几十年来最重要的生物治疗药物类别之一。mAb的成功归因于其高度多功能性、高目标特异性、卓越的临床安全性和有效性。抗体发现，作为抗体开发流程的最上游阶段，在决定mAb产品的临床结果中起着关键作用。噬菌体展示技术最初是为肽定向进化而开发的，由于其前所未有的优势，已被广泛应用于全人源抗体的发现。噬菌体展示技术的价值已通过多项获批的mAbs得到证明，包括一些来自该技术的顶级畅销mAb药物。自从30多年前首次建立抗体噬菌体展示以来，噬菌体展示平台已经被开发出来，用于生成针对难以靶向的抗原的mAbs，并解决体内抗体发现方法中存在的问题。最近，新一代噬菌体展示库已经针对发现具有“药物样”属性的mAbs进行了优化。本综述将总结抗体噬菌体展示的原理和三代抗体噬菌体展示库的设计。 1.引言 单克隆抗体（mAbs）及其衍生物1代表了一类主要的治疗药物，并且近年来已成为美国最畅销的药物。全球mAb市场规模在2020年达到了约1500亿美元，并预计在未来五年内翻一番。迄今为止，获批的全人源治疗性抗体是通过体内动物免疫（包括人源化小鼠和恢复期人类供体）或体外噬菌体展示技术发现的。对于体内动物免疫，通过重复免疫目标兴趣物来产生抗体。在免疫反应的发展过程中，选择具有高亲和力和可开发性的抗体。然而，这一过程耗时且需要抗原具有免疫原性和无毒性。此外，由于选择完全在体内完成，对特异性和表位等属性的控制有限。作为另一种方法，噬菌体展示技术通过提供高度多功能的方法，克服了体内抗体生成技术中存在的许多缺点，极大推进了治疗性mAb的发现过程。由于完全体外选择系统，噬菌体展示通过使抗体能够针对几乎任何目标或表位进行发现，包括那些对动物免疫有毒或无免疫原性的目标，从而超越了体内发现方法。此外，由于完全控制的选择条件，噬菌体展示可以量身定制，以选择无法通过体内方法实现的所需属性，例如，选择特定的表位识别，pH依赖性结合，抗体内化， 甚至催化活性。此外，噬菌体展示库已成功地用于针对最具挑战性的目标或表位的抗体发现，例如流感血凝素的茎区，G蛋白偶联受体（GPCRs），以及离子通道的特定构象。最近开发的具有蛋白质质量控制步骤的新一代噬菌体库将进一步完善体内和体外衍生抗体的可开发性差距。此外，人们越来越考虑到，基于抗体的亲和试剂和治疗剂的开发应该从基于动物的方法转向体外方法，以保护动物。 尽管迄今为止大多数获批的治疗性mAbs是通过动物免疫发现的，但近年来噬菌体衍生抗体的数量有所增加，包括一些畅销药物，如Humira®、Lucentis®和Tecentriq®（表1）。截至2022年11月，已有17种噬菌体衍生的mAbs获得批准，并且许多正在临床试验中积极评估（表1）。由于技术的不断发展以及相关关键专利的到期，预计未来将有越来越多的噬菌体衍生mAbs进入临床试验和市场。 噬菌体展示的成功主要依赖于库的质量和选择（也称为“淘选”）策略。两种最广泛使用的淘选策略是固相和液相淘选。在固相淘选中，目标被固定在微孔板上，特定的噬菌体结合物被捕获。通过在大肠杆菌宿主细胞中的洗脱和扩增，特异性噬菌体命中被放大。经过迭代淘选循环后，目标特异性噬菌体被富集（图1）。在液相淘选中，生物素标记的目标与抗体噬菌体库一起孵育，并被短暂地通过链霉亲和素包被的磁性珠拉下来捕获结合的噬菌体。可以通过替代淘选策略或整合其他技术实现表位定向抗体选择，例如竞争淘选和位点特异性光交联。一些其他的淘选策略，例如基于细胞的和基于纳米盘的淘选，已经被开发用于具有挑战性的目标，例如多跨膜蛋白。此外，功能性选择可以直接集成在选择过程中。尽管已经开发了各种淘选策略以满足不同的抗体发现目标，但选择程序通常是确立和标准化的。然而，库设计高度可变，在基于噬菌体展示的抗体发现中起着核心作用。在这篇综述中，我们将简要总结抗体噬菌体展示和噬菌体工程的原理。这篇综述将重点讨论三代噬菌体展示库的设计原理，以及几个特别设计的库。 图1. 抗体噬菌体展示库的类型（左上角面板）、库构建（左下角面板）和抗体选择（右侧面板）。根据多样性的来源，抗体噬菌体展示库可以分为三种类型：天然库、合成库和半合成库。在一个典型的噬菌体载体系统中，从天然免疫球蛋白储备库中克隆或在体外设计并合成的轻链和重链的可变区被克隆到噬菌体展示载体（噬菌体载体）中，其中一个链与噬菌体的pIII基因融合以展示。然后将库池转化到大肠杆菌宿主细胞中。通过辅助噬菌体感染，提供噬菌体生产的所有组分，生成噬菌体库。以固相淘选为例，噬菌体库与固定化的抗原一起孵育。洗涤后，非特异性噬菌体被去除，抗原特异性噬菌体留在抗原上。然后通过多种方法将结合的噬菌体从抗原上解离，例如，低pH洗脱、酶解。最后，洗脱的噬菌体在大肠杆菌宿主细胞中进行扩增。经过几轮迭代淘选后，富集了抗原特异性克隆。通常，来自淘选中后期的输出噬菌体进行测序和结合特性分析，以分别获得序列多样性和高亲和力。图注：三种类型的抗体噬菌体展示库，包括天然、合成和半合成库。构建抗体噬菌体库包括生成抗体可变区片段、克隆、转化和噬菌体产生。抗体选择包括抗原固定、噬菌体结合、洗涤、洗脱和噬菌体扩增。 2.噬菌体展示 在1985年，George P. Smith首次描述了在不影响噬菌体感染的情况下在噬菌体表面展示外来肽。从那时起，噬菌体展示技术已被广泛应用于各种应用，例如蛋白质进化（也称为定向进化）、表位确定、酶底物的识别和药物发现。由于在噬菌体展示系统中表型和基因型在物理上是链接的，因此可以通过淘选快速选择具有所需属性的蛋白质变体，并且可以轻松提取遗传信息。在噬菌体展示系统中，构建了一个在噬菌体表面展示多样化肽或蛋白质变体的库（通常为1010 − 1012的多样性）。在迭代选择循环期间，具有有利属性的变体被富集。然后可以筛选出独特的序列以供进一步应用。虽然噬菌体展示的成功已在广泛领域得到证明，但这篇综述将重点讨论其在治疗性抗体发现中的应用。 抗体噬菌体展示最初在三个研究所开发：德国癌症研究中心的细胞与肿瘤生物学研究所（德国），英国医学研究委员会分子生物学实验室和美国斯克里普斯研究所。从那时起，各种抗体片段格式已常用于噬菌体展示，如单链可变片段（scFv），抗原结合片段（Fab），单域抗体（VHH），和双特异性抗体片段。尽管也有报道在噬菌体上展示全长IgG，但这个平台并未广泛使用，可能由于展示不稳定、展示水平低和噬菌体传播偏差，导致库的功能多样性有限。然而，已报道了在噬菌体淘选后对全长IgG格式进行功能性筛选的策略，例如双宿主载体，供体-受体系统，高通量重格式化，和哺乳动物表达噬菌体衍生抗体。尽管如此，全长抗体的展示可以通过真核展示平台轻松实现，如酵母和哺乳动物细胞展示。展示格式的选择取决于最终将在应用中使用的格式。由于重新格式化有时会导致抗体属性的实质性变化，例如亲和力和稳定性，因此从库到最终产品保持格式一致被认为是“经验法则”。因此，噬菌体展示提供了一个高度多功能的平台，关于抗体格式的选择。 在几种被充分研究的丝状细菌噬菌体（Ff）中，包括f1、M13和fd，M13是最广泛用于噬菌体展示的。Ff噬菌体通过宿主F菌毛和噬菌体次要衣壳蛋白pIII之间的特定相互作用感染大肠杆菌宿主细胞。Ff噬菌体基因组编码11种蛋白质，其中5种是衣壳蛋白（pIII、pVI、pVII、pVIII和pIX）。尽管所有五种衣壳蛋白都被证明可以用于蛋白质展示，pIII作为噬菌体展示平台上的抗体融合伙伴最广泛使用，因为它可以容纳大蛋白，对噬菌体功能干扰最小，并且与单价噬菌体展示兼容。抗体-pIII融合通常通过遗传融合实现，但也可以通过其他结合方法实现，如亮氨酸拉链二聚体化，合成Fc结合ZZ结构域，等。 在早期展示系统中，感兴趣的肽与噬菌体基因组中的pIII框架内融合。因此，肽在噬菌体表面所有pIII副本上展示，这可能导致噬菌体感染力下降。此外，可以高效展示的肽的大小限于12个氨基酸。在基于phagemid的系统中，抗体-pIII融合在单独的质粒中编码（指定为phagemid），并且需要与辅助噬菌体共感染以提供噬菌体增殖的所有蛋白质。结果是，每个噬菌体颗粒包含野生型和抗体融合pIII蛋白质。这个系统的关键优势是可以实现单克隆展示，这有助于通过避免淘选过程中的亲和力效应，选择高亲和力克隆。同时，由于野生型pIII的存在，噬菌体感染力得到最大程度的保留。系统的一个缺点是野生型pIII在噬菌体颗粒中更有效地组装，导致群体中只有一小部分（<10%）的抗体展示噬菌体颗粒。因此，由于过多的野生型噬菌体背景，淘选效率或任何噬菌体介导的结合测定的灵敏度可能会受到严重影响。一种策略是增加展示的多重性，这可以通过不同的方法实现，如pVIII/pVII展示系统，适配器导向展示，并使用抗体-pIII融合基因的诱导性启动子。为了最大化展示价，通过生成一个在pIII供应大肠杆菌宿主中具有pIII基因缺陷型和野生型感染力表型的辅助噬菌体，开发了hyperphage。因此，在常规phagemid系统中使用hyperphage，产生了只展示抗体-pIII融合蛋白的噬菌体颗粒。这不仅大大提高了噬菌体ELISA的灵敏度，而且显著提高了淘选效率。 pIII蛋白由N1和N2结构域组成，这些结构域对噬菌体感染是必需的，以及一个C末端结构域（CT）用于pIII组装。在另一项努力中，通过在基因组中删除N1和N2结构域，产生了一种突变辅助噬菌体，称为CT辅助噬菌体。与hyperphage系统类似，CT辅助噬菌体的感染力通过在异质表达完整pIII基因的大肠杆菌宿主中传播来恢复。因此，使用CT辅助噬菌体可以显著提高淘选效率，因为只有结合了抗体-pIII融合的噬菌体才具有感染力。还报告了其他一些pIII缺陷辅助噬菌体系统，例如ex-phage，phaberge，和用低N1表达工程化的辅助噬菌体。值得注意的是，由于这些辅助噬菌体变体采用多价展示，它们导致噬菌体产量减少或噬菌体感染力下降。因此，它们可能不是噬菌体库构建的理想选择。为了平衡展示水平和噬菌体功能，开发了XP5辅助噬菌体，通过在pIII基因中引入多个稀有密码子和改变核糖体结合位点间距，减少WT pIII的产生。 3.三代抗体噬菌体展示库 通用抗体噬菌体展示库，通常包含超过一百亿个独特序列，已成为发现针对任何类型目标的mAbs的宝贵来源。根据多样性的来源，抗体噬菌体库可以分为天然、全合成和半合成库（图1）。在天然库中，多样性完全来自自然储备库，可以是健康、自身免疫或免疫接种的供体（分别称为天然、非免疫和免疫库）。从理论上讲，一个大型天然库可以用来分离针对任何目标的抗体，但是，如果库是从免疫接种的供体构建的，多样性将高度偏向于特定目标。对于从人类储备库构建的免疫库，它可以是从接种疫苗的供体或从感染或疾病中恢复的供体构建的。在全合成库中，抗体框架通常从表现良好且具有优越可开发性的人类抗体种系中选择。互补决定区（CDRs）基于抗体结构和应用目的设计。用于创建CDR多样性的合成DNA的质量在决定合成库的功能大小时起着关键作用。通过使用单核苷酸或三核苷酸膦酰胺（TRIM技术）作为构建块，可以在高通量方式下合成多样化的CDRs，如基于阵列的寡核苷酸合成和Slonomics。在TRIM技术中，每个氨基酸由一个定义的密码子编码。因此，可以在所需位置精确定义氨基酸分布。此外，由于每个氨基酸的密码子被选择以获得最佳抗体表达，功能库的大小增加了。在自然抗体储备库中，除了CDRH3外，CDRs的多样性是展示典型结构的确定序列集合。与传统的基于列的DNA合成方法（每列产生一个单一基因）相比，高通量DNA合成技术允许在基于硅的芯片上的同一足迹上并行合成大量预定序列。这不仅去除了影响可开发性的不良基序，而且精确模仿了自然抗体多样性。因此，半合成库结合了合成CDRs（通常是三个轻链CDRs和重链CDR1和CDR2）和来自自然储备库的重链CDR3。噬菌体库可以为抗体发现或工程而设计。后者的设计基于一个亲本抗体，并针对一个特定目标量身定制。这篇综述将重点讨论为抗体发现而设计的三代通用抗体噬菌体展示库（表2）。 3.1.第一代库 1989年首次描述了通用抗体噬菌体库的生成及其在淘选中的成功应用。由小鼠抗体储备库的可变区放大构建的Fab库包含2.5×107个菌落形成单位（PFUs）。不久之后，使用类似程序创建了一个免疫scFv噬菌体库。尽管库大小很小（2×105），但命中率显著提高（两轮淘选后>90%）。天然库在体外抗体发现方面的成功已在不同机构得到证明。这些天然库的一个共同特征是轻链和重链是随机结合的，因此这些被称为组合库。由于重链和轻链的重组，库的多样性显著增加。例如，如果一个天然抗体储备库包含106的多样性（即106个独特的轻链和重链对），经过完全的轻链和重链重组后，多样性将达到1012。一个显著的优势是这种方法可以产生自然储备库中不存在的特异性，这使得能够发现针对任何给定抗原的抗体，包括自身抗原。相比之下，由于免疫耐受（一种免疫系统不对自身抗原反应的保护机制），对于天然配对的抗体来说，针对自身抗原的发现可能具有挑战性。此外，一个大的天然库包含了大多数种系基因，这进一步由于多样的框架结构增加了库的结构复杂性。尽管天然库中的种系基因分布通常与自然储备库中的一致，但观察到选择后某些家族的种系基因使用是有偏差的，例如，重链的VH1–69、VH1–46（Kabat命名法）和/或IGHV3–30（IMGT命名法）。对于轻链，Vλ1-c、Vλ2-2a（Kabat命名法）和/或IGLV1–47、IGKV1–12、IGKV1-D33（IMGT命名法）在选择后被富集。与此同时，在1990年代初生成了几个合成和半合成抗体库。尽管由于库大小小（107-108），只分离出了低亲和力（微摩尔范围）的抗体，但这些库证明了可以体外生成人工抗体。后来的研究表明，通过生成更大尺寸的天然库（1010-1012），可以直接分离出低至亚纳摩尔亲和力的抗体。值得注意的是，由Cambridge Antibody Technology开发的大型天然库及相关噬菌体展示技术已导致六种mAbs获批：adalimumab, belimumab,moxetumomab pasudotox,raxibacumab, emapalumab,和 tralokinumab.另一个例子是n-CoDeR库，其中重链和轻链CDR片段分别使用针对VH3–23和VL1–47种系的引物放大。然后六个CDR在单个轻链和重链框架中重新组装，该框架在人类储备库中表达良好，在细菌宿主细胞中表达良好。这种策略克服了传统天然抗体噬菌体库的缺点，其中由于某些种系基因在原核系统中表达和/或展示水平低，可能会丢失部分多样性。n-CoDeR库被用于发现五个mAbs及其衍生物，这些进入临床试验。根据我们的经验，可以从内部构建的大型天然库（库大小=1012）中轻松实现高命中率（>90%），并且可以常规分离出高亲和力（低纳摩尔）的抗体。根据目标，筛选的总序列中有10-20%是独特的。 综上所述，第一代噬菌体库证明了抗体发现可以完全在体外进行，并且可以直接从噬菌体库中分离出高亲和力和序列多样性的抗体。 3.2.第二代库 在第二代库的设计中，以几个半合成和全合成库为代表，基于对自然抗体结构和抗体-抗原相互作用的了解，仔细选择了氨基酸分布和多样化的位置。通过利用TRIM技术，使用预合成的三核苷酸作为寡核苷酸合成的构建块，可以精确定制CDR氨基酸组成以满足特定的设计标准。此外，库设计中还考虑了可开发性。 在几个合成库的设计中，例如HelL-11、HelL-13和Library F，经常在抗体-抗原相互作用中使用的氨基酸在CDRL3和CDRH3中占主导地位。更具体地说，在ETH2和ETH-2-Gold库的设计中，预测在silico中与抗原直接接触的选定残基被随机化，而结构支持的CDR残基保持不变。基于ETH-2-Gold库，PHILO和PHILODiamond库被设计为通过在抗原接触位点的特定位置纳入亲水残基，覆盖更广泛的表位景观。ETH系列库导致两种mAbs，Teleukin和Dekavil，在临床试验中被研究。尽管CDRL3和CDRH3在种系多样性中发挥关键作用，但已观察到CDR1和CDR2在体细胞高频突变过程中优先选择用于亲和力成熟。在Dyax库的设计中，一个半合成库，多样性的轻链和CDRH3来自自身免疫供体的抗体储备库，以增加发现针对自身抗原的抗体的可能性。然而，CDRH1和CDRH2是完全合成的，并且使用所有氨基酸（除半胱氨酸外）随机化了预测为表面暴露的残基。事实上，通过对四个选定抗原进行淘选，平均抗体亲和力（由KD指示）有三个目标低于20 nM。值得注意的是，另一个目标的中等平均亲和力（131 nM）可能是由于库构建中使用了单一的VH/VL框架对。Dyax库被用于发现四种获批的mAbs：ramucirumab,necitumumab,avelumab,和 lanadelumab.在对抗体-蛋白质和抗体-肽相互作用倾向进行系统分析时，机器学习被用来预测CDR热点残基分布。通过在所有CDRs中密集富集热点残基，GH库在高亲和力和特异性方面增强了抗体-抗原识别。实际上，通过使用最小库，已经证明只有一小部分氨基酸类型（四氨基酸代码（Tyr、Asp、Ser和Ala）或二进制代码（Tyr和Ser））足以介导与蛋白质的相互作用。 在HuCAL系列库中，包含了覆盖主要CDR规范结构类型的框架，以最大化结构多样性。通过利用TRIM技术，设计了六个CDR，精确模仿自然储备库中出现的氨基酸分布。因此，HuCAL库更有可能产生具有类似自然属性的抗体。由于TRIM技术允许在寡核苷酸合成中精确定义核苷酸组成，它还通过优化密码子使用和避免终止密码子，实现了在大肠杆菌宿主细胞中稳定和高表达抗体，这些是使用简并密码子的缺点。因此，合成库的功能多样性可以大大改善。值得注意的是，重链H137上丙氨酸的百分比可以调整，以有利于结合蛋白质或半抗原/肽。HuCAL库的另一个特点是在所有六个CDR环周围引入了限制位点。因此，通过快速CDR重组，可以促进抗体工程。在HuCAL-PLATINUM库的设计中，为了避免影响抗体的可开发性，CDR设计中避免了翻译后修饰热点，例如N-糖基化。此外，根据环长度调整了CDRH3中的氨基酸分布，以进一步模仿自然储备库。在另一项努力中，为了进一步提高从噬菌体库中选择的抗体的整体可开发性，确定了400对VH/VL对中的36对具有最佳生物物理属性，并用于构建Ylanthia库。结果，直接从库中选择的抗体显示出优越的亲和力、蛋白质表达水平、热稳定性和聚集倾向。值得注意的是，HuCAL-GOLD库产生了2017年获批的guselkumab。 总结来说，在第二代库的设计中，通过去除序列责任基序、包含CDR中的自然氨基酸分布，并选择具有优越生物物理属性的重链和轻链框架，考虑了抗体结构和可开发性属性。 3.3.第三代库 通常，第二代库中可开发性属性的改进是通过基于序列的优化实现的。虽然我们对基于序列的蛋白质责任预测的知识仍然有限，但许多生物物理属性，如稳定性、溶解性和表达，与蛋白质的高阶结构密切相关。尽管可以为库构建选择具有高稳定性和表达的支架，但噬菌体库中抗体的整体生物物理属性也高度取决于CDR序列。因此，在第三代库的构建中，通过实验改进了这些可开发性属性。 为了增强库的溶解性和热稳定性，在半合成ALTHEA Gold库的构建中，引入了一个热休克步骤，随后是蛋白A回收。这是基于观察到热变性选择了稳定且折叠良好的抗体。库的验证表明，在热休克和蛋白A选择后，多样化CDR位置上疏水性残基的总体频率降低了。相比之下，带电残基被过滤过程正向选择。通过对多样化的抗原组进行淘选，选择的scFvs显示出高亲和力（KD范围从个位数nM到亚nM）、溶解性（>50 mg/L）和热稳定性（Tm > 70°C），这与治疗性抗体的生物物理参数一致。 在另一项努力中，为了创建具有“药物样”属性的半合成噬菌体库，应用了酵母展示过滤来选择具有临床开发所需的最佳可开发性属性的序列，包括亲和力、聚集性、热稳定性、多特异性和表达水平。这一步利用了真核蛋白质质量控制系统，选择分泌的正确行为的蛋白质。具体来说，创建了五个单CDR酵母展示库，其中每个库中一个CDR（除CDRH3外）是从复制的自然多样性中合成的，分别创建。正确显示并且在高水平显示的抗体序列被选择并进行了下一代测序（NGS）分析。然而，CDRH3序列来源于人类自然抗体储备库。这样做有两个原因：1）根据长度和氨基酸使用，合成CDRH3多样性通常远远超过实际库大小；2）自然CDRH3来源可以提供足够的高多样性，并且这些序列也已经在体内筛选，以获得最佳生物物理属性，例如高稳定性和表达，低免疫原性。为了验证库，对四种抗原进行了淘选。值得注意的是，在总共分离的81个抗体中，约80%显示出个位数到亚nM的亲和力。更引人注目的是，通过确定可开发性参数，包括热稳定性、多特异性和自相互作用，97%的抗体测量值表现与相应的获批亲本抗体相似或更好。这项研究强调了真核质量控制系统在选择高质量抗体中的重要性。 总结来说，第三代库利用体外或体内实验方法进一步提高整体库质量，从而产生属性与治疗性抗体药物相当的抗体。 4.为特定应用设计的库 尽管上述通用噬菌体库为抗体发现提供了宝贵的资源，但它们在针对具有挑战性的目标和表位（例如，GPCR、凹形表位）以及特定应用（例如，pH依赖性抗体）时的性能可能会受到影响。这是由于传统抗体库的固有特性，无论是天然库还是模仿人类抗体储备的合成库。噬菌体展示技术的优势之一是库可以定制以适应不同的应用。实际上，已经设计并创建了几种专门的噬菌体库。 4.1.GPCR库 GPCR代表一类七次跨膜受体。由于大约三分之一的美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物针对GPCR，GPCR已被公认为成功的药物靶点。然而，由于高疏水性、构象柔性和细胞外部分表位的有限可及性，GPCR对抗体来说是具有挑战性的目标。迄今为止，只有两种针对GPCR的FDA批准抗体药物：mogamulizumab和erenumab，分别针对CC趋化因子受体4和降钙素基因相关肽受体。噬菌体展示为针对具有挑战性的目标提供了宝贵的抗体发现平台，包括离子通道、转运体和GPCR。例如，通过挖掘所有已知GPCR配体相互作用的序列，并在CDRH3中纳入已识别的结合基序，设计了一种合成抗体噬菌体展示库。结果，这个专注于GPCR的库成功地发现了一组针对胰高血糖素样肽-1受体的高亲和力拮抗性抗体。 4.2.选择pH依赖性抗体的库 通常，通过传统的高亲和力抗体消除可溶性目标通常需要大剂量。这是因为抗体通常在中性pH和轻微酸性pH（pH 5.5–6.0）下与抗原结合的强度相似；因此，与抗体结合在细胞外环境中的抗原不会在内体内的复合物中解离。结果，抗原可以从新生儿Fc受体（FcRn）介导的循环中逃避溶酶体降解并返回。因此，能够在生理pH中和靶标，并在酸性内体pH中释放它的抗体预计将提高治疗指数。过去，通过抗体工程实现了pH依赖性结合，例如组氨酸扫描。另外，开发了扫荡抗体技术，以在中性pH下增强与FcRn的结合，以快速摄取抗体-抗原复合物进行目标清除。虽然这些技术证明了成功，但它们都是劳动密集型的，并且都基于现有的抗体。在另一次尝试中，从合成抗体噬菌体展示库中去新分离了pH依赖性抗体。在库设计中，CDRH3中富含组氨酸残基有两个原因。首先，组氨酸在生理pH下是中性带电，但在pH 6.0时变为正电荷。因此，蛋白质-蛋白质相互作用区域内的组氨酸残基可以施加pH依赖性结合。其次，组氨酸在自然储备库中较少见。结合修改的选择策略，分离了几种在pH 7.4下具有高结合亲和力和强大的中和活性，但在pH 6.0下结合力弱的抗CXCL10抗体。 4.3.带有延长CDRH3的库 人类或小鼠抗体的一个限制是针对目标的凹形表位，例如离子通道的孔和酶的口袋，可能具有挑战性。这主要是因为相对较短的CDRH3长度，通常小鼠和人类分别为7-12和8-20个氨基酸，它们倾向于形成洞穴或平坦的副位。因此，目标的凹形构象通常对传统抗体是不可达的。尽管已经分离出具有大约30个氨基酸的扩展CDRH3的抗人类免疫缺陷病毒（HIV）广泛中和抗体，但它们只在外周感染人群中的少数人中发现，并且需要多年的发展。有趣的是，一些物种的抗体，如牛和驼类，具有自然延长的CDRH3（例如，牛可达70个氨基酸），这提供了额外的多样性和副位复杂性。牛超长CDRH3通常采用“柄和旋钮”结构，其中β链“柄”支撑具有多个二硫键稳定的结构复杂的“旋钮”域。“旋钮”域从抗体表面突出，使其可以接触到凹形表位。在一项概念验证研究中，构建了一个携带延长CDRH3（23-27个氨基酸）的合成Fab噬菌体展示库。通过对库进行淘选，鉴定出了一系列有效抑制基质金属蛋白酶-14的抗体。值得注意的是，其中一个抗体被指示与酶活性口袋附近结合。展示具有延长CDRH3的非典型抗体的库进一步扩展了噬菌体展示技术的应用。 5.结论与展望 噬菌体展示在抗体发现方面已被证明是无可争议的成功，这一点由17种获批的mAbs和越来越多的噬菌体衍生抗体正在进行临床研究所证实。作为一种完全体外的技术，噬菌体展示不仅弥补了体内抗体发现方法所固有的许多限制，而且还提供了一个高度多功能和可定制的平台，该平台不断发展以满足不同的开发目标。 亲和力是评估噬菌体库质量的关键因素。观察到可实现的亲和力与库大小相关。我们研究了已发布通用噬菌体库中获得的最高亲和力值与库大小之间的相关性（数据未显示）。与先前的观察一致，这两个参数之间存在正相关性。这是因为通用库旨在针对任何给定目标进行抗体发现。因此，更大的库（更高的多样性）提供了更大的机会来识别高亲和力抗体。在合成库的情况下，尽管使用的框架数量有限，但设计的CDR多样性通常远远超过自然CDR多样性。因此，获得高亲和力抗体的机会主要取决于CDR序列多样性。在天然库的情况下，库多样性不仅来自序列多样性，还来自轻链和重链的重组。值得注意的是，随机的重链和轻链重组过程非常类似于链重组，这是体外抗体亲和力成熟的一种常规策略。这可能解释了为什么即使从没有或非常有限的体细胞高频突变的种系序列构建的天然噬菌体库中，也能分离出具有非常高亲和力的抗体。虽然预期确定库大小是决定亲和力的关键因素，但与库类型或库代的相关性并未观察到（数据未显示）。一个原因是，除了一些早期库外，三代噬菌体库的库大小差异很小。此外，三代噬菌体库的进步主要反映了整体可开发性属性的改进。 已报道，不显示抗体片段的库克隆（秃头噬菌体）的存在部分是由于抗体基因中存在的终止密码子或移码。这些克隆经常因为减少了抗体融合蛋白的生产负担和由于噬菌体颗粒上所有野生型pIII分子导致的更高感染力而过度生长，导致库多样性丧失。为了增加功能性库大小，已经开发了几种策略。例如，使用抗标签抗体进行校验淘选，以选择内框序列，因为标签与抗体序列内框。在HuCAL GOLD库的设计中，使用β-内酰胺酶基因来消除移码序列。 关于噬菌体展示库中的框架使用，人们普遍认为使用多个框架的库比使用单一框架对的库表现更好，因为多个支架提供了更多的结构多样性。在选择框架时，考虑了诸如在自然储备库中的频率、稳定性、表达和展示水平等参数。此外，应该注意到几个重链种系基因，例如某些IGVH4家族基因，在噬菌体淘选中被发现被去选择。此外，VH4–34被发现与B细胞毒性相关。因此，这些种系应该从库设计中排除。对于大多数噬菌体展示库，VH和VL是随机重组的，这与自然储备库中没有明显的VH/VL配对偏好的观察一致。然而，在药物开发方面，由于不同的VH/VL配对确实表现出非常不同的生物物理特性，应该关注框架配对的选择。 与体内抗体发现方法相比，噬菌体展示的另一个优势是序列信息可以快速且容易地检索。然而，这种优势部分被传统的单克隆表征筛选方法所削弱，其中只有一小部分序列信息，即最丰富的序列，从淘选输出中被评估。这部分是由于在大肠杆菌宿主细胞中抗体展示噬菌体的固有扩增偏差，导致一些序列在几轮淘选后变得稀少。为了克服这一限制，NGS，允许深入挖掘样本中的序列空间，最近已被应用于抗体噬菌体展示技术，特别是用于识别那些具有潜在有趣特性的稀有序列。最近，结合NGS的机器学习已被应用于预测噬菌体淘选中序列的结合特性（例如，亲和力、表位、可开发性），甚至生成具有改进属性的新序列。 尽管噬菌体展示有许多优点，但由于缺乏体内蛋白质质量控制过程，体外衍生的mAbs的可开发性一直是一个关注点。如前所述，体内或真核质量控制步骤已集成到第三代噬菌体展示库的构建中。因此，只有具有有利可开发性的库成员被选择。事实上，已报道从第三代库中选择的mAbs显示出整体增强的可开发性属性，包括高亲和力、改善的稳定性和溶解性，以及较少的自相互作用。或者，可以使用哺乳动物展示来进一步筛选或优化mAbs的可开发性属性，基于最佳生物物理属性和展示水平之间的强相关性。值得一提的是，核酸编码生物制剂的体内递送的出现，即DNA和mRNA技术，能够在体内直接生产治疗性mAbs。这些递送技术绕过了复杂的蛋白质制造、储存和运输过程，这些过程需要具有出色生物物理属性的蛋白质。因此，可以预见，随着新药物递送技术的进步，许多对可开发性的要求，特别是制造能力，将在未来得到缓解。 随着噬菌体展示技术的不断发展，以及与其他尖端技术（如NGS和机器学习）的结合，噬菌体展示技术将继续为未来的创新药物发现做出巨大贡献。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

Bicycle Therapeutics（以下简称“BCYC”）公司成立于2009 年，2019年于纳斯达克上市，旨在开发基于双环肽（Bicycles）的新型治疗模式，其旗舰产品Bicycles来自诺贝尔化学奖获得者Greg Winter爵士以及Christian Heinis教授。BCYC总部位于英国剑桥的生命科学集群和美国马萨诸塞州波士顿的生物技术中心。据crunchbase数据显示，成立以来，BCYC共完成13轮融资，金额合计5.429亿美元。最近的一次是今年6月完成的2亿美元股权融资（Post-IPO Equity）。BCYC融资历史（数据来源：crunchbase官网）  剑桥师徒共创业，瞄准双环肽创新疗法因在酶的定向演化以及用于多肽和抗体的噬菌体展示技术方面取得的成果，BCYC联合创始人之一Greg Winter获得了2018年诺贝尔化学奖。除此之外，Greg Winter还曾获得多项国际科学奖项，包括1989年的瑞士路易斯·让特医学奖、1995年的沙特阿拉伯费萨尔国王国际医学奖（分子免疫学）、1995年的德国临床化学学会生化分析奖、2011年英国皇家学会皇家奖章和2013年盖尔德纳奖等。在企业合作方面，他于2004年获得美国国家生物技术风险奖，于2008年获得英国生物产业协会奖。Greg Winter是英国剑桥大学三一学院（Trinity College, Cambridge）成员，并于2012年10月2日被任命为三一学院的负责人，还兼任英国剑桥分子生物学实验室(MRC-LMB)的副主任和代理主任。此外，Greg还推动科研成果的产业转化，曾担任Cambridge Antibody Technology和 Domantis的创始人——这两家公司率先使用包括阿达木单抗和贝利木单抗的抗体库制造全人源抗体疗法。Sir Greg Winter（图源：BCYC官网）Christian Heinis是BCYC的另一位联合创始人，担任NCCR化学生物学研究中心的联合主任。他在苏黎世联邦理工学院（the ETH Zurich）获得博士学位后，进行过两次博士后研究：第一次师从瑞士联邦理工学院（EPFL）Kai Johnsson教授，第二次师从BYCY的联合创始人、英国剑桥分子生物学实验室(MRC-LMB)Gregory Winter教授。Heinis在Greg Winter实验室做博士后时的重要工作，就是参与BCYC的核心技术平台开发，即基于噬菌体展示技术的双环肽分子筛选的研发。回到EPFL组建自己的实验室后，他继续发展了双环肽展示和筛选平台。Prof. Christian Heinis（图源：EPFL官网）兼具靶向性与小分子量的Bicycles为了达到治疗效果，同时减少对患者的副作用，药物必须与靶蛋白高亲和力、高选择性地结合。传统的小分子化合物具有难以作用的靶点盲区，而分子量较大的抗体难以快速聚集至癌细胞。BCYC通过将化学连接化合物（也称为支架）与肽链中的特定氨基酸连接，设计出高度受限的分子——Bicycles（双环肽）。双环化合物是利用中心化学支架将短线性肽限制成稳定的双环结构而形成的，它允许两个环路中的肽采用生物相关的二级和三级结构，如α螺旋和环路——蛋白质和蛋白质配体中经常出现的特征，从而使其能够有效地模拟蛋白质与蛋白质之间的相互作用。与传统的小分子化合物相比，双环化合物可以很容易地与其他化学载荷或其他双环化合物共轭，而不会失去所需的药理作用。其结构可高精度地作用于所选靶点，分子的大表面积有望让其靶向小分子历来无法作用的靶点。其药代动力学特性使其能够迅速离开血管，迅速分布到靶组织和肿瘤，直接到达所需作用部位。与全长抗体分子相比，其分子量小，可以迅速富集进而杀伤癌细胞。也就是说，Bicycles集抗体、小分子药物及肽类的特性于一身，结合了通常与生物制剂相关的靶向性与小分子药物的生产和药代动力学的优势。● 关键特性1、是由9-20个氨基酸组成的短肽2、化学合成物，是完全合成的新化学实体(NCE)3、具有低分子量（1.5-2.5kDa），可实现快速组织渗透和可调PK（药代动力学）4、能够与各种治疗载荷多聚或共轭5、通过肾脏排出，可减轻肝脏和肠道的毒性负担6、生产具有可控性和可延展性● 由于化合物骨架的可延展性，多种基于双环肽分子的新型药物也被开发出来。分子结构图（图源：BCYC官网）● 基于能够与各种治疗载荷多聚或共轭的特性，Bicycles可以很容易地与其他化学载荷或其它Bicycles连接。Bicycle Toxin Conjugates（以下简称为“BTCs”)包含针对特定肿瘤抗原的Bicycle、选择性可裂解连接体和小分子毒素有效载荷。BTCs分子结构图（图源：BCYC官网）BTCs旨在向癌细胞释放细胞毒性有效载荷。在Bicycles引导的共轭物进入肿瘤之前，毒性有效载荷保持惰性。因此，Bicycles技术在摧毁肿瘤细胞的同时，还能保护健康细胞和组织。BTCs研发进程（图源：BCYC官网）Bicycle Radio Conjugates（以下简称为“BRCs”)包含针对特定肿瘤抗原的Bicycle、选择性可裂解连接体和高强度放射性同位素，其作用机制与BTCs基本相同。不同之处在于，在BRCs中，Bicycles试图将辐射（而不是毒素）集中在肿瘤上，作为杀伤肿瘤的有效载荷，而远离健康组织。BRCs研发进程（图源：BCYC官网）Bicycles还可被设计成免疫细胞兴奋剂，在以肿瘤抗原为靶标的 "Bicycles"的指导下进入肿瘤。肿瘤免疫药物研发进程（图源：BCYC官网）噬菌体展示筛选平台：可从300多种不同的库配置中选择BCYC的噬菌体展示筛选平台能够快速识别针对潜在高价值治疗靶点的特异性Bicycles。同时，还可以高效调整Bicycles的开发，精准导向特定的治疗领域。平台利用合成生物学技术，在工程噬菌体（噬菌体）表面展示大量（＞1020）初始线性肽。然后，这些线性肽通过硫醚键与支架之一发生共价反应，从而在肽中的半胱氨酸残基上形成噬菌体颗粒表面的Bicycles结构。Bicycles在四个关键领域的设计造就了其多样性。首先，每个氨基酸在环内半胱氨酸之间的位置都可以改变。其次，每个环中氨基酸的数量可以改变。第三，环的对称性可以改变。最后，支架的选择改变了附加氨基酸的呈现方式。这使得从300多种不同的库配置中选择成为可能，提高了从筛选活动中成功识别目标结合体的概率。平台可高效且高速地筛选可溶性蛋白质或细胞靶，同时使用整体噬菌体结合试验，为结构活性关系（SAR）提供信息。在确定能与靶点结合的初始 Bicycles后，进行多轮亲和力成熟迭代，以围绕共同的药效源创造化学多样性。为提高与靶标的亲和力，使其发挥所需的特定功能，采用非天然氨基酸取代其中的天然氨基酸在多肽合成器上合成产物。最后阶段是将候选Bicycles疗法组合，以供后续开发。由于筛选过程会自动选择具有有效载荷并适合连接的Bicycles，因此经常需要添加其他有效载荷，如细胞毒素、免疫激活剂、核酸或其它Bicycles。总之，具有灵活性的Bicycles与功能强大的筛选平台，可以较快开发潜在的候选疗法，应用于不同的治疗领域。平台作用机制示意图（图源：BCYC官网）   布局多应用领域，广纳学术界人才目前，BCYC也在开拓存在大量尚未解决的医疗需求的其它治疗领域，与多企业和学校合作，探索除肿瘤外，在眼科、抗感染、痴呆症、中枢神经系统和神经肌肉等治医学领域开发创新药物的路径。（数据来源：BCYC官网）BCYC与学术界合作，与巴斯大学（University of Bath）共同举办了毕业生培训计划，并邀请英国科学研究理事会（BBSRC）、英国科学研究理事会（MRC）的博士生和英国创新协会（Innovate-UK）的研究员来访。资助博士后科学家在学术实验室使用Bicycles作为工具，探究创新工具化合物及其作用机制，以探索新的目标空间和应用领域。双环肽虽然存在以上诸多优势，但也存在难以口服和无法针对胞内靶点的短板。目前，Christian Heinis实验室着力开发大环化合物的筛选策略。新型大环化合物，兼具跨越细胞膜和口服给药的改造潜力，以及大分子和环肽的靶点特异性和高亲和力，未来或成为重要的药物分子类型。近期推荐声明：动脉网所刊载内容之知识产权为动脉网及相关权利人专属所有或持有。未经许可，禁止进行转载、摘编、复制及建立镜像等任何使用。动脉网，未来医疗服务平台