Dimethyl Sulfoxide

本文作者：曾文亮博士，迪哲医药CMCRA副总监 本文是英国制药企业同行研究专家和数据专家，包括Merk, Teva, Lhasa, AZ等，在2023年3月发表的一篇关于亚硝胺事件发生的五年以来，监管界和制药界的反思综述。 2018 年出现的 N-亚硝胺 （NA） 传奇主要与源自活性药物成分 （API） 合成时产生的某些烷基 N-亚硝胺有关。随后对原料药、配方药品和包装进行的全面评估使不同类型的NA成为人们关注的焦点：各种复杂的所谓亚硝胺原料药相关杂质（NDSRIs）。 它们可能是由于 API 或 API 杂质中存在潜在的可亚硝化仲胺或叔胺部分，与作为杂质存在的低含量亚硝酸盐形成的亚硝化剂而形成的。 虽亚硝酸盐含量可能会降低，但无法完全防止药品中NAs的形成，并且目前18 ng/天的默认可接受摄入量（AI），在如此低的水平下对可行控制和分析都提出了重大挑战。 即便如此，通过药物接触的NAs预计会比通过食物或内源性形成的接触低几个数量级。虽然许多小型、简单的NAs都有可靠的致癌性数据，但大多数NDSRIs明显缺乏此类数据。 因此，成立了许多工作组来共享数据和快速提高知识（无论是在毒性数据、结构活性关系还是分析技术方面），确定评估NDSRIs遗传毒性潜力的最佳实践，并推进基于可靠科学原理计算AIs的方法。 最终，为了保护患者免受真正的癌症风险并确保获得重要药物，制造商和卫生当局努力实施同样有效和现实的NA控制策略至关重要。如果存在合理的安全问题，无可争议的是必须采取适当的行动，这可能包括从市场上撤回产品。 1.介绍 我们已经进入了N-亚硝胺(NA)传奇的第五个年头，自2018年6月首次在缬沙坦中检测到N-亚硝基二甲胺(NDMA)以来，这一直是制药商和监管机构的一个关键问题。NDMA和其他小而强效的NAs仍然是焦点，因为不久之后也在其他沙坦活性药物成分（API）、1,2吡格列酮和雷尼替丁、3,4和二甲双胍药品中发现了它们。 然而，由于存在亚硝胺原料药相关杂质（NDSRI）亚硝基伐尼克兰，2021年中期，美国、加拿大和欧盟召回了伐尼克兰（伐尼克兰）批次，情况发生了巨大变化。随后，由于存在各自的NDSRI，普萘洛尔、喹那普利和奥芬那君药物（图1和2）。 值得注意的是，这些召回是在关于如何确定可接受摄入量的问题上没有（现在仍然没有）达成一致的背景下进行的。 图1:小分子强效NAs和NDSRIs的初始检测、行业和监管响应（召回、暂停）以及监管指南的发布，药品中NAs相关的重要事件 图2:自2019年初以来，美国和加拿大发生了与NA相关的批次召回。每个点代表单个上市许可持有人召回一个或多个药品批次。点颜色表示召回的产品，点形状表示引发召回的亚硝胺。“假NDSRI”是亚硝基厄贝沙坦，其不是亚硝胺，因为亚硝基连接到芳族四唑环上 虽然有关于溶液中亚硝酸盐形成NAs的综合文献（例如，NAP试验），但即使在固体药物产品(DPs)中，NDSRIs的形成百万分之一水平的亚硝酸盐令人惊讶。 最近的研究表明，高达40%的普通API和30%的API杂质是潜在的NAs前体，因为它们含有易反应的胺部分。如果仅考虑反应性更强的仲胺，仍有13-15%的API存在潜在风险。毫不奇怪，从行业和监管角度来看，NDSRIs已成为焦点。 行业和监管机构现在面临着一个充满挑战的局面，即NDSRIs可能存在于数百甚至数千种药品中，其中一些会影响整个基本药物类别，例如β-受体阻滞剂。EMA在制药商中进行的一项调查，并于2022年11月30日在EMA亚硝胺实施监督小组(NIOG)与行业协会举行的第四次会议上提出，到目前为止90%的风险评估中发现有潜在的NDSRIs，后来都通过分析测试得到证实。 这一观点旨在通过提醒我们对食物中的NAs以及内源性NAs形成的了解，来正确看待含NAs药物的潜在风险。NAs是由易反应胺形成的，因此我们也讨论了为什么这些不能避免，因此，为什么药物不能完全不含NAs。 此外，我们强调了目前应用于一些NAs的低默认AI值带来的分析测试挑战，并讨论了如何使用交叉阅读来导出更科学合理的AI值。这也检查了AI值与小于寿命曝露量和分子量校正结合使用的潜力。鉴于此，体外致突变性试验（Ames试验）和数据共享举措的价值仍然很高。最后，我们总结了主要的过去5年的成就，并展望我们对不久的将来的发展。 2.食物中的亚硝胺 多年来已知人类大量接触来自食物的NAs。最近的一项综述13强调了122项NA研究的发表，涵盖了一系列NA及其来源，其中很大一部分与食物有关。EMA最近对NAs的审查也强调了食品中NAs的存在。 该综述重点关注2017年之前发表的同行评审文献，报告称总NAs(TNA)最高的食品类别为： 1.脂肪、油和甜食（平均TNA 8.9±3.2 ng/g） 2.肉类（平均TNA 8.1±1.4 ng/g） 3.鱼（平均TNA 5.6±1.0 ng/g） 4.蔬菜（平均TNA 5.4±1.9 ng/g） 在观察到的NAs中，发现最突出的是NDMA(2.2±0.3 ng/g)，表明每日负荷超过2 μg/天(基于由500g/天蔬菜、170g/天脂肪、油和甜食以及170g/天肉类组成的2000卡路里/天饮食)。另外1 μg/天的暴露可能来自啤酒或其他麦芽饮料的典型消耗。 如前所述，EFSA食物链污染物小组（CONTAM）就与食品中存在NAs相关的动物健康风险的科学意见草案发起了公众咨询。该文件介绍了对NAs毒性的评估、欧洲公民对食品中存在的致癌NAs的估计膳食暴露量，并在此基础上对欧盟人口的健康风险进行了评估。EFSA评估了32种NAs，并调查了它们在食品中的存在。仅测量了一定数量的NAs的可量化量。 因此，风险表征仅限于食品中出现的10种致癌NAs（TCNAs）（即NDMA、N-亚硝基甲基乙胺（NMEA）、N-亚硝基二乙胺（NDEA）、N-亚硝基二丙胺（NDPA）、N-亚硝基二丁胺（NDBA）、N-亚硝基甲基苯胺（NMA）、N-亚硝基肌氨酸（NSAR）、N-亚硝基吗啉（NMOR）、N-亚硝基哌啶（NPIP）和N-亚硝基吡咯烷（NPYR））。 总共评估了2003年至2021年间从四个欧洲国家分析的2817个食品样本结果，此外，CONTAM小组还检查了从1990年至2021年间发表的文章中提取的欧盟国家（n=3976）和非欧盟国家（n=27）的结果，这些结果是根据质量标准选择的。 与参考文献相比，EFSA审查采用了略有不同的食品类别分类方法，定义了五个食品类别“酒精饮料”、“咖啡、可可、茶和浸剂”、“鱼、海鲜、两栖动物、爬行动物和无脊椎动物”、“肉和肉制品”以及“调味料、酱料和调味品”。他们的评估强调，就膳食暴露评估而言，“肉和肉制品”是唯一有所有单个TCNAs数据的食品类别。 这两项研究之间的直接相关性并不简单。EFSA审查的结果显示，在调查、年龄组和情景中，TCNA暴露量在0至208.9纳克/千克体重/天之间，“肉和肉制品”是导致TCNA暴露的主要食物类别。 比较饮食和药物中亚硝胺的暴露水平是很有趣的。特别关注NDMA，基于其TD50值，其限度定义为96 ng/天。药物中水平限度比通常在食物中消耗的强效诱变剂NDMA的水平低10倍，这没有考虑到与药物相关的益处。 值得注意的是，其他来源的NAs进一步导致外源性暴露，包括职业暴露。到目前为止，最重要的因素是烟草产品的使用，考虑到已报告的水平超过20微克/天，这确实使所有其他暴露来源相形见绌。 3.内源性亚硝胺的形成 当考虑潜在含NAs药物带来的风险时，人体内NAs的内源性形成是另一个需要考虑的重要方面。文献报告了可测量水平的NAs的存在血液和尿液。这些NAs的来源有些不清楚，尽管有证据表明内源性形成水平很高，这最有可能发生在胃肠道，其中从食物中摄入的硝酸盐和亚硝酸盐，以及尤其是胃中的酸性pH创造了有利的反应条件。吸入氮氧化物也被认为是另一个来源。药物-亚硝酸盐相互作用产生的NDSRI可能有助于整体内源性形成，但更持续的暴露源于食物中胺的反应。 例如，NDMA前体二甲胺可由腐败细菌从三甲胺氧化物中形成，氧化三甲胺在软体动物、甲壳类动物和所有海洋鱼类中充当渗透剂，因此通常存在于海产品中。此外，亚精胺和腐胺等生物胺已被确定为NPYR、NPIP和其他挥发性亚硝胺的前体。最值得注意的是内源性暴露的可能规模。甚至有人认为，NAs的暴露主要是内源性暴露，这使外源性暴露（不包括烟草）以及通过使用药物消耗NAs相关的负担相形见绌。 美国FDA研讨会期间，报告了与内源性NDMA暴露相关的数据。根据测量的人体血液水平估计了内源性接触水平。假设稳态和人体清除率为3.45升/分钟，观察到NDMA水平在100至近2500微克/天之间=1.4至35微克/千克体重/天。还根据白细胞中O6-MeG的水平估计了NDMA水平，这与NDMA水平的直接测量密切相关，平均值约为1360 μg/天（18 μ g/kg/天）。 目前，尚未对外源性暴露和内源性形成进行明确的比较，但考虑到相对水平和仍然与通过药物使用暴露相关的较低水平，很明显后者实际上可能对人类总暴露量的总体贡献很小。 4.为什么API中的仲胺无法避免 新药的开发是一项复杂的工作，需要平衡数百种特性，以在单个分子中获得药理学、药代动力学、安全性和药学特性的独特而新颖的平衡。药物化学家使用各种官能团来影响和优化这些相互作用，其中最常见的是胺。最近的研究表明，40%的原料药含有叔胺或仲胺，这些胺有形成NAs的风险。脂肪族和芳族胺在多种方面对于优化类药物特性非常重要，并且随着时间的推移已被证明是安全且易于获得的许多基本药物的构建模块。事实上，所有类别的基本药物都依赖于仲胺的存在来发挥功效。 胺与任何其他简单的有机官能团有几个基本性质：仲胺具有氢键供体和受体性质，这通常是有效结合由蛋白质（由自身具有许多供体和受体基团的氨基酸组成）制成的生物靶标所必需的。胺通常在体内具有高分布体积，导致更好的药代动力学特性，例如更长的半衰期，从而导致患者更好的给药方案和更好的药物依从性。脂族胺的pKa，通常为在水溶液中质子化，通常会使水溶性比中性分子提高100倍，这有利于改善许多药代动力学参数。脂肪族胺在氮处表现出3D结构，这通常是药理学相互作用所必需的，而没有手性碳中心的合成复杂性。作为胺的前体或含有胺的前体的大量不同结构单元的可用性使得为药物化学结构-活性关系（SAR）探索提供大量的化学空间。 胺官能团还参与经常用于制造API的几种最稳健和有效的反应，例如酰化、还原胺化、Buchwald-Hartwig胺化和亲核芳族取代（表1）。涉及仲胺作为起始原料、中间体或最终原料的API合成实例产品如图3所示。与酸形成盐的能力使得能够增加在水性环境中的溶解度和在大规模API制造中通过结晶纯化的能力。脂肪族胺本身不是致突变性警示结构，通常具有安全的代谢和消除机制。在发现和开发如上所示的有效药物中，没有其他官能团可以满足如此重要和广泛的功能。芳族胺经常用于将脂族基团连接至芳族基团。因此，许多药物样分子含有芳基烷基仲胺或叔胺作为连接基团。 表1:涉及易反应胺作为离析物和/或产物的重要有机反应 图3:API是仲胺或在合成后期使用仲胺试剂的案例 5.为什么制备得到的药物不可能“不含亚硝胺”？ 据估计，典型的固体口服剂型的赋形剂平均含有1 μg亚硝酸盐/g此外，最近证明，大部分已知的API和API杂质是潜在的NAs前体，因为它们含有易反应的仲胺和/或叔胺部分。这意味着许多药物在其制剂中存在含有由那些易反应性的胺形成的NAs和由亚硝酸盐形成的亚硝化剂的风险。 在多数情况下，亚硝化试剂的可用性将是NAs形成的限制因素。为了说明，考虑分子量为1000g/mol的API携带易反应的仲胺部分情况，所配制的片剂基质中胺类物质的含量将在毫克/克范围内，而亚硝酸盐将存在于微克/克范围。 图4显示了限制反应种类1%和10%消耗量的这种相关性。根据易反应性胺和亚硝酸盐的含量，即使仅消耗了可用亚硝酸盐的一小部分，每克产品也可能存在超过监管默认的AI 18 ng或甚至12个月默认临时AI 178 ng的NAs量。换句话说，即使是来自辅料或非贡献原材料(NCRM)的痕量亚硝酸盐也会导致API容易发生亚硝化的相关量的NAs。该转化发生的速度将可能取决于反应物的含量、制剂pH、易反应胺的pKa、水含量、温度和可能影响反应性的其他因素，例如粒度(表面积)和结晶度。此外，亚硝化可以由痕量醛催化，痕量醛通常以低水平存在于药物赋形剂中，并且来自空气的NOx物质可以用作亚硝化剂的额外来源。 应注意，相关水平的亚硝化反应更可能从仲胺中获得，而不是从叔胺中获得，除非后者含有高水平的相应仲胺。 图4:含有易反应性胺的药物的潜在NAs含量。图显示了假设消耗了1%或10%的限制性物质，可以存在于药物产品中的NAs的含量。在大多数情况下，亚硝酸盐是限制性物质。黑点代表基于0.2、1和5ppm亚硝酸盐与5000、50000和500000ppm胺的组合的NA含量，其对应于在配制药物中形成NDSRI的情况下0.5%、5%和50%的药物负载量。圆圈区域代表亚硝酸盐和胺含量的组合，考虑到赋形剂的典型亚硝酸盐含量和实际载药量，预计这是最普遍的 6.分析灵敏度要求与技术可行性 当确定NAs形成的风险时，如果他们想避免常规测试，必须证明其产品中的含量不超过相当于适用AI 10%的水平。根据各自的分析根据法规要求，方法的定量限（LOQ）必须不超过10% AI水平，尽管从技术上讲，该水平的检测限（LOD）就足够了。所需的LOQ（以ng/g产品计）可如下计算： 其中AI是每日可接受摄入量或终生每日暴露量（单位为ng），MDD是最大每日剂量（单位为mg），DML是最高剂量强度的药物/质量负荷（DML=[API剂量强度，单位为mg]/[剂量质量，单位为mg]）。 图5显示了与NAs的AI、API的最大日剂量和药物负荷相关的必要方法灵敏度。似乎较小的AIs和较大的MDD需要较高的分析灵敏度，并且一些不利的组合导致LOQ要求超出了技术上可能的范围。 由于以下因素，实际LOQ在5-50ng/g产物的范围内：灵敏度可能因电离效率降低或基质成分干扰而受损。在NDSRIs的情况下，API本身会造成重大干扰，因为它的浓度远高于分析物的浓度，并且其物理化学性质相似，这使得有效分离变得复杂。NDSRIs的另一个问题是，与小的强效NAs相比，它们的分子量较高，这意味着分析物的摩尔浓度较低，因此可能降低方法灵敏度。 图5:NA AI、API MDD和所需方法LOQ的相互关系，以纳克/克产品表示，假设载药量为10%。对于NDSRIs，计算基于18 ng/天的最差情况AI，除非EMA问答中列出了化合物特异性AI，如亚硝基阿米替林 7.细菌回复突变（AMES）试验预测亚硝胺致癌性 NAs通常被认为是致突变杂质，因此必须根据ICH M7指导原则进行控制。 根据ICH M7，研究新的潜在致突变杂质的第一步是进行计算机评估。基于其N-亚硝基部分，NDSRIs和其他NA通常会触发致突变性警报，因此被归类为3类杂质（结构警报，但无致突变性数据）。3类杂质通常可以控制在毒理学关注（TTC）或AI阈值或以下，或者可以进行Ames试验以确认或否定潜在致突变性。如果Ames试验结果为阴性，则该杂质被视为5类非致突变杂质，可根据ICH Q3A/B限度进行控制，超出了ICH M7的范围。然而，对于NAs，由于其作为一组值得关注的化合物的地位，它们可能需要控制在显著低于1500 ng/天的一般TTC的水平。此外，仅使用Ames测试的免除风险方式尚未被卫生当局（HAs）接受。 目前，根据OECD 471测试指南进行的阴性Ames测试，仅接受亚硝胺作为证据权重方法的一部分，但不足以作为不存在致突变性的唯一证据。监管机构主要关注的是，Ames证明为阴性的化合物但体内是致癌物，此外关于溶剂类型和浓度或来源的实验条件代谢激活系统可能不是适当检测NAs致突变性的最佳方法（EMA问答）。 为了解决这些问题，行业内监管机构（如美国FDA）正在开展许多活动。HESI遗传毒理学技术委员会（GTTC）正在领导一项重大努力，以确认Ames试验最大准确性的条件。特别是该委员会正在努力证明阴性Ames试验可用作唯一的实验数据，以得出亚硝胺不是致突变致癌物的结论，符合ICH M7指南。具体来说，所有参与公司都使用优化和一致的Ames测试方案来测试约30种具有致突变性和致癌性数据的结构不同的亚硝胺，以生成解决监管机构关注的综合数据集。 Thresher等人分析了从文献、VITIC 和Lhasa癌性数据库中提取的大量数据集，了解Ames检验对NAs致癌潜力的预测性。他们发现18%的NAs是非致癌性的，与非NAs相比，NAs实际上显示了致突变性和致癌性之间更大的相关性，这表明Ames试验能够正确预测致癌潜力。最近的出版物表明，使用符合OECD 471标准的方案和菌株，按照当前最佳实践进行的Ames试验可以可靠地检测NAs的致突变性。作者还提出了溶剂的选择是否会影响试验灵敏度的问题。DMSO是最常用的溶剂之一，但被描述为Cyp2E1的抑制剂，Cyp2E1是主要负责低分子量NAs代谢激活的酶。 因此，水被建议作为首选溶剂。尽管在测试NDSRIs时，溶解度问题阻止了这种溶剂的广泛使用。两份出版物都表明，当使用DMSO或水时，观察到的灵敏度没有实质性差异。 此外，对于较大的NAs，如NDSRIs，其他细胞色素P450亚型（如2C9、2A6或3A4）对α-羟基化变得更加重要，这导致了代谢激活系统的来源（S9肝匀浆部分）是否会影响Ames试验的预测性的问题。不同亚型的水平因物种而异，这可能导致体外和体内研究中不同的实验结果。最常用的S9来自Ames试验中使用的浓度为10−30%v/v的Aroclor 1254或苯巴比妥/β-萘黄酮预处理的大鼠。 几十年前，据报道仓鼠S9可能更适合NAs的代谢激活。根据该文献，据报道，一些人拒绝了对大鼠S9进行的NAs阴性Ames试验，认为这是不合适的。最近对Lasha Vitic和Leadscope数据库中可用的大量Ames和致癌性数据的研究并未证实仓鼠S9与大鼠S9相比具有总体优势。相反，可以表明，当用于预测致癌性时，仓鼠-S9介导的Ames试验的特异性与大鼠相比显著下降，而敏感性非常相似。 讨论的另一个变量是预孵育步骤的应用，最初是为低分子量脂肪族NAs，最近的出版物比较了平板掺入与预孵育方案表明只有NDMA需要预孵育步骤来显示其诱变潜力，而其他所有小烷基NAs也可以通过平板掺入方案可靠地检测到。Trejo-Martin等人比较平板掺入与预孵育的敏感性和特异性，未检测到两种方案之间的相关差异。 基于几十年前发表的文献，关于Ames试验作为检测NAs致突变潜力的稳健可靠方法存在许多担忧和不确定性。Ames数据中有相当一部分是根据标准化程度较低的方案得出的，并且没有使用所有或仅使用当前推荐的菌株或其他测试条件。因此，这些早期Ames测试的稳健性在某些情况下是有问题的。为了完善该方案，HAs（如FDA）、国际工作组（如HESI GTTC、EMA-MutaMind）和制药公司正在开展几项旨在优化Ames方案的计划。 8.定义普遍接受的交叉阅读策略 由于某些特征的低分子量NAs是异常有效的致癌物（例如NDEA和NDMA），其AI水平远低于1.5 μ g/天的TTC，因此NAs属于ICH M7关注队列（CoC），TTC通常不适用，应建立个体AI限度。EMA在其上市许可持有人（MAH）问答文件中公布了一些已知NAs的AI限制。该列表正在快速增长，NDSRIs的比例也在增加。对于尚未包含在此列表中的NAs，EMA问答提供了几个选项： （1）如果有足够的动物致癌性数据，来自终生啮齿动物生物测定的TD50可用于通过线性外推计算物质特异性AI。通常情况并非如此，因为目前几乎没有任何NDSRIs的致癌性数据，并且此类数据的生成需要数年时间；即使选择进行致癌性研究，这也不是一个短期选择，当将此类研究的财务和伦理成本与计算机预测进行比较时，或者在最坏的情况下，考虑到体外Ames试验和3R考虑，也不太可能对杂质（甚至亚硝胺）进行进一步的啮齿动物致癌性研究。 （2）在没有足够致癌性数据的情况下，基于Lhasa致癌效力数据库中N-亚硝基TD50数据的第5百分位，18 ng/天的类别特异性AI可用作默认选项。这意味着只有5%的NAs预计比这更有效，或者换句话说，95%的NAs预计效力较低。在特定条件下，可以考虑基于178 ng/天的12个月临时限值（基于Lasha致癌效力数据库中N-亚硝基TD50数据的第33百分位，而不是第5百分位）（EMA问答）。 3）监管指南建议将交叉阅读用于合适的亚硝胺分析，来作为这些NAs的致癌不足的替代方法。然而，这种替代化合物的选择是一个具有挑战性的过程，特别是对于NDSRIs。理想的交叉阅读类似物是：(a)在亚硝胺亚结构周围结构相似，具有相似的取代模式，(b)具有稳健的致癌性数据，(c)在形成的重氮离子的潜在代谢活化和潜在DNA反应性方面可以被认为是相似的，以及(d)可以预期具有与查询化合物相似的DMPK谱，使得可以预期其分布到相似的器官并避免体内的替代命运(无论是排泄还是其他代谢途径)。 因此，在实践中，合适的交叉阅读类似物的选择可以考虑表2中列出的参数，搜索所有可用的NAs，然后不同值的比较将允许选择最合适的类似物。“Tanimoto”相似性是包括各种潜在相似性度量的术语；Tanimoto比较是用于任何一对结构指纹的相似性比较的特定方法，而不是通用数字，并且也有其他相似性度量可用。通过Tanimoto或表2中提到的其他相似性度量来比较全分子指纹通常用作相似性的度量；然而，它可能与NAs不相关。这是由于NAs的效力高度依赖于局部反应性而不是药效团相似性；与亚硝胺相邻的两个碳分别是代谢活化和形成重氮的位点。例如，在药效意义上结构不同的两种NA可以具有相似的局部环境和药代动力学性质，因此可以是彼此的合适类似物。 表2:交叉阅读亚硝胺类似物选择的关键参数 ECHA已经发布了一个用于评估一般化学用例的交叉阅读方法框架，与特定药物用例相反，交叉阅读评估框架（RAAF）。这给出了与NAs相关的交叉阅读的两个主要假设：第一，生物转化为常见化合物（即，从释放的醛不同的NAs形成相同的重氮离子，如甲基、乙基和异丙基取代的异丙基NAs都形成异丙基重氮离子（图6）），第二，两种相似的化合物可能具有相当的机制，例如将4-甲基亚硝基哌啶与亚硝基哌啶本身进行比较。 图6:不同异丙基二烷基亚硝胺的代谢活化导致相同异丙基重氮离子的形成。 值得注意的是，RAAF允许使用单一化合物类似物和基于类别的交叉阅读。在类别的情况下，如果所关注的性质根据随环大小的规则和预测趋势（如环烷基环的效力增加）在类别中变化，这可用于外推；否则，建议采用最坏的情况。RAAF67的全部细节超出了这一观点的范围，但考虑代谢途径（生物活化和替代失活代谢途径）和代谢物谱是一个有价值的教训，适用于当前的亚硝胺情况。 应该注意的是，表2中许多描述符的典型值在大多数致癌性数据可用的小分子和较大的分子之间有显著差异需要人工智能限制的NDSRIs。给定上面列出的特性，选择类似物成为多参数优化问题，其中一个类别中最合适的类似物不一定是另一个类别中最相似的。最近发表了一个通过量化来自动化一般交叉阅读案例的框架。给定NA选择特定类似物可能不遵循Lester等人描述的完全相同的指标，但一般原则可能很有用。 需要指出的重要一点是，分子量的差异可以而且应该用于根据最坏情况下体内存在的每摩尔分子的数量来缩放基于重量的限度（例如，适用于NDEA（MW=102.14）和那些化合物的26.5 ng/天限度），这仅仅是因为NA的致突变性与摩尔量而不是质量有机械联系。换句话说，如果将500Da的典型NDSRI读入NDEA，则最差情况限值应为500/102.14 × 26.5=129.7ng/天。从科学上讲，这种方法是有充分理由的，但目前还没有被HAs接受。表3中提供了来自EMA问答的NDSRI AIs的分子量校正的进一步实例。该表还包括对小于寿命（LTL）暴露的校正，这目前仅被接受为CAPA实施期间的临时措施，尽管Bercu等人已明确表明，LTL校正的AIs可保护患者的潜在致癌风险。此外，应该注意的是，NDEA是LTL最初开发中的关键化合物。 如果任何单一化合物的可用数据不足或类似物被认为不够接近，应能够考虑RAAF允许的基于类别的方法，如Dobo等人提出的。在这种情况下，应根据相关结构特征选择该类化合物，例如遵循最近提出的各种分类方案，因此提出跨A类限值的致癌性信息。 EMA和加拿大卫生部使用交叉阅读来确定几种NDSRIs的AI限值，并在其上市许可持有人的问答文件中公布了这些限值。这些替代物选择操作在所需的外推程度上有所不同。例如，EMA使用4（甲基亚硝基氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）作为他替代阅读并设定亚硝基度洛西汀和亚硝基氟西汀的AI为100 ng/天。通过检查NAs周围的取代基，选择NNK作为替代物很容易合理化。NNK以及亚硝基度洛西汀和亚硝基氟西汀具有一个N-甲基取代和一个进一步被芳族体系取代的正丙基。这三种化合物的亚硝胺亚结构周围的电子和空间特征非常相似。另一方面，亚硝基度洛西汀和亚硝基氟西汀在γ-位具有额外的大体积芳基取代，增加了NNK中不存在的显著结构障碍，因此，预计它们是效力低得多的致癌物，表明这种交叉阅读可能导致比不存在的化合物特异性数据所允许的更低的AI。良好替代物选择的其他实例是亚硝基哌啶酯和亚硝基帕罗西汀，它们是从亚硝基哌啶(NPIP)读过来的，因为它们都含有亚硝基哌啶部分。 然而，这些也可能是非常保守的跨读测量，因为亚硝基哌甲酯和亚硝基帕罗西汀在哌啶环上都具有显著的空间体积，与NPIP相比增加了相当大的空间位阻。亚硝基芬那酸与亚硝基二苯胺(NDPh)相反，因为它们在两个α-位置都有苯基。预计这些交叉阅读类似物建议会有一定程度的保守性，因为（a）如果有两种相关性相当的潜在类似物，并且找不到区分它们的机制原因，则将选择更有效的类似物，以及（b）在几乎所有亚硝胺的情况下，交叉阅读是从具有致癌性数据的小分子到包含小分子作为亚结构或与其相似的东西的较大NDSRI。在这些情况下，NDSRI几乎总是含有额外的空间体积，当然是较重的分子，因此摩尔剂量较低。 另一方面，对于EMA和加拿大卫生部选择的几种替代物，可以并且确实已经提出了替代的交叉阅读类似物，以交叉阅读到其他NDSRIs（表4）。例如，选择与亚硝基伐尼克兰(NNV)交叉阅读的替代物是亚硝基1,2,3,6-四氢吡啶(NTHP)。NTHP在NA的β-位有一个烯烃，激活α-位，使其更容易羟基化C−H键烯丙基碳的解离能显著降低，与烯烃共轭可以稳定相关的过渡态。NNV在该位置不具有双键，并且可以提出其他替代物，例如TD50为313 μ g/kg/天的亚硝基六亚甲基亚胺(NHEX)或TD50为1300 μ g/kg/天的监管机构可接受限度为1300 ng/天的NPIP作为替代。NPIP的数据可能更可靠，但如上所述，当两种类似物不能从机制上区分时，应选择更有效的。应该强调的是，虽然NNV的六亚甲基亚胺环像NTHP中的那样是不饱和的，这可以解释其作为类似物的选择，但由于NNV的桥接性质，以及因此有效的烯丙基/NTHP的苄基α-碳不能在NNV中形成。通过选择NHEX（如MAH当时提出的）作为NNV的替代物，AI将为313 ng/天，而不是使用NTHP得出的37 ng/天。 表3.基于LTL和MW校正的NDSRIs替代AIs 表4.EMA问答文件中应考虑替代交叉阅读出发点的NDSRIs示例 另一个例子是亚硝基去甲替林（NNORT），其与N-甲基-N-亚硝基苯乙胺（NMPEA）交叉读数，AI为8ng/天。最近重新评估了NMPEA的致癌性数据，建议NMPEA72的修正AI为40.1 ng/天（详见表4脚注b）。这种类似物选择的原因可能是NNORT γ-位的烯烃被认为与中的苯基相当NMPEA.然而，具有庞大三环芳族系统的NNORT不太可能比NDMA或NDEA具有更高的致癌效力。可以建议使用NNK作为NNORT的替代物，因为这两个分子在NA官能团周围具有相似的结构特征，γ-羰基及其双键，然后是更远的芳族取代，使得NNK可能比NMPEA的苯乙基取代基更接近NNORT。 最后一个例子是亚硝基达比加群，其默认AI为18 ng/天。这个默认AI可能已经被分配，因为没有识别出从中读取的代理物。然而，对于不仅在亚硝胺的一侧具有芳族系统且在另一侧具有α碳（导致限制可及性的相当大的空间位阻），而且还具有进一步降低致癌效力的游离羧酸盐以及高分子量的分子来说，指定18ng/天的默认AI是相当不可思议的。甚至NMPA，作为最简单的芳基烷基亚硝胺，也可以被选择为替代物，尽管这将是一个非常保守的选择，因为缺乏空间位阻(α-位的甲基)、低分子量和没有游离羧酸盐。此外，Ponting和Foster建议将具有α-氢但具有显著空间位阻的亚硝胺排除在CoC之外。 这些示例显示了在执行交叉阅读为NDSRIs设置AIs时，正确选择代理化合物是多么重要。 9.数据共享举措的价值 作为匿名分发高质量分析和毒理学测试数据的有效机制，竞争前数据共享计划已经建立。由此产生的数据库有两个主要效果：减少研究化学空间的测试负担和扩展。测试负担的减轻是因为数据共享联盟的成员可以访问其他组织生成和共享的结果，并且在匿名之后，可以在监管提交的背景下将它们呈现给HAs。各种出版物报告了计算机Ames预测和交叉阅读在节省成本和时间方面的好处，类似的基本原理对于Ames数据的竞争前共享非常正确。与确定相同信息的数据库查找相比，这些成本和时间考虑都非常不利。 此外，共享数据将构成交叉阅读方法和合成构效关系模型改进的核心知识来源。此外，虽然Ames试验是一种体外试验，但它确实需要啮齿动物肝脏S9级分，因此，有可能减少实验动物的使用，并且有很强的3R理由将这种常规体外试验的使用降至最低。Lhasa有限公司的科学家完成了SAR标记化学空间的扩展，他们拥有专家的眼光，可以从一组结构中提取SAR趋势，并将其提炼为结构警报，而不会暴露结构的专有方面。这种做法使捐助组织和更广泛的科学界都能从对化学空间的更好预测中受益，否则由于缺乏公共数据，这些预测将很少被覆盖。通过拉萨有限公司建立了两个与钠有关的数据共享倡议：维生素复合亚硝胺和亚硝酸盐。 复杂亚硝胺。在市售药物中检测到的NAs中，越来越多的比例结构复杂，有时被称为NDSRIs，其中高达40%的市售API和26%的注册杂质含有仲胺或叔胺12，这些杂质在存在亚硝酸盐源的情况下可能容易发生亚硝化（见下文）。其中绝大多数是以前未知的结构；因此，文献毒性数据很少。正在对这些NDSRIs进行Ames试验和潜在的体内研究，以评估有关这些NDSRIs致突变潜力的总体证据权重。由于许多药物是仿制药并由多个组织生产，因此出于所讨论的原因，需要协调这些化合物的Ames（和其他遗传毒性）测试。仓鼠S9激活的Ames检测的全球能力相对较低，后续体内检测的能力甚至更低，这加强了协作数据共享工作的需求。关于SAR的扩展，这是形成联盟和合作的关键驱动因素之一。大多数已知毒性数据的NAs都是小型NAs，因此，大多数SAR工作已在小型NAs上执行。有人假设，虽然可以从小分子的结构特征中吸取许多相关经验教训，但“复杂”和小分子NASA之间在阳性结果的效力和患病率方面存在显著差异。 因此，已建立的复杂亚硝胺联盟的任务是管理足够大的高质量Ames数据数据集，以测试差异假设并确认小分子交叉阅读的效用。成立于2022年，2022年12月的第二次复杂亚硝胺数据库更新（版本2022.2.0）包含54个NAs的Ames结果和一个NDSRI的HPRT测定（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，一种哺乳动物细胞体外基因突变测定）。大多数Ames结果都是针对NDSRIs的，也有一些相关的小分子NAs被捐赠。NDSRIs的体内致突变性研究也在整个行业进行，主要是通过转基因突变试验（TGR）。这些研究昂贵且漫长，需要大量的测试物品，最糟糕的是，它们在合同研究组织中的可用性极其有限。为了避免冗余并本着3R的精神，复合亚硝胺联盟还编制了一份公司计划进行的体内致突变性研究清单，目的是最终在数据共享计划中共享这些研究的结果。 亚硝酸盐。自2018年以来，越来越明显的是，易反应性胺亚硝化的亚硝酸盐的主要来源（见上文）是配制原料药以生产制剂的辅料。辅料中的亚硝酸盐含量即使达到百万分之一的水平也可能是一个问题，如图4所示，尽管这不是需要考虑的唯一根本原因。最近描述了收集这些辅料批次亚硝酸盐结果的数据库背后的基本原理和开发。自提交该文章以来，已对数据进行了四次进一步更新，数据库的2023.1.0版本现在包含92种不同化合物的966个结果（图7）。除了辅料之外，该数据库还不断发展以满足联盟的额外要求，并包含有关溶剂和试剂NCRM的数据，其中亚硝酸盐水平同样至关重要。 图7.亚硝酸盐数据库自2020年首次以来的演变。截至2023年2月，它包含966个结果，分为92种常见辅料、试剂和溶剂。 除了节省时间和成本以减少重复测试的机会之外，该数据库已经对更广泛的社区产生了两个重大影响：首先，跨行业盲法测试数据的存在以及关于亚硝酸盐测试的共享经验和知识使得当文献中报告了不可行的高亚硝酸盐水平时，可以提出挑战。其次，对这些数据的分析（辅料通常含有大量亚硝酸盐）允许软件预测强制降解，如Zeneth来预测NAs的形成，其中这些赋形剂与易反应性胺结合使用。亚硝酸盐水平的共享增加了对不同辅料批次中观察到的水平和可能变化的理解，并表明在大多数受试辅料中检测到相关水平的亚硝酸盐。为制药行业供货的辅料制造商可能无法解决这一挑战，部分原因是药品仅占其整体市场的一小部分。然而，通过合作加深我们对赋形剂中亚硝酸盐根本原因的了解，有助于降低药物中最常大量使用的特定赋形剂中亚硝酸盐的水平，因此对NAs的形成水平影响最大。在这方面，降低一些关键辅料中的亚硝酸盐含量已经是向前迈出的一大步。 10.展望 目前，法规场景对医药行业和监管机构都充满挑战，主要是围绕可接受的方法来设定NDSRIs的限制。即使使用修改后的协议，HAs也不接受单独的Ames测试。由于NDRSIs的结构复杂性，使用小二烷基NAs作为跨读目的的替代物来设置NDRSIs的AIs是非常具有挑战性的。NDSRIs的体内致突变性数据正在缓慢生成，主要是通过TGR和双链测序，但这一过程需要很长时间，主要是由于可以进行这些研究的实验室的可用性较低。当体外和体内研究明确表明NDSRI无致突变性时，HAs很有可能将该化合物视为ICH M7 5类杂质。然而，当体内数据显示化合物为阳性时，这些数据不能用于设定化合物特异性限度（ICH M7 Q&A 7.2）。 因此，有必要设计一种可接受的方法来设定NDSRIs的限度，特别是越来越多的证据表明大多数NDSRIs的诱变效力比小的强效二烷基NAs弱。来自行业和监管机构的各种合作专家工作组正在评估许多NAs遗传毒性试验的相关性（例如，HESI、MutAmind）。 在此期间，行业需要向HAs报告NA水平，并提供AI限制的理由。问题是，为了设置检测和证明的限制，有必要为每个新的NA设置一个AI，当然包括NDSRIs。业界已经提出了各种方法，使用证据权重方法来设置AI或至少是临时AI。例如，欧洲制药工业和协会联合会（EFPIA）（https：//www.efpia.eu/）的亚硝胺工作组已经为药物类别的NAs生成了几份立场文件，并已与HAs共享并在制药行业内传播。其中包括亚硝基-HCTZ89和钙通道阻滞剂、90 β阻滞剂和β-激动剂、91和ACE抑制剂的NAs的立场文件。92这些立场文件中的许多结论表明，至少可以将所有类别的NDSRIs视为非CoC，但在获得额外的体内数据之前，作者推荐了一种实用的方法，并提出了“标准”TTC的临时限值（1.5 μ g/天）。 根据阳性体内致突变性数据设定NDSRIs限度的另一种方法是对数据进行基准剂量（BMD）分析（为此，提前设计足够数量的剂量至关重要），然后将BMD结果与同样具有稳健致癌性数据的NAs的相同类型研究生成的BMD进行比较。通过进行这样的比较，可以在不从体内致突变性数据导出化合物特异性AI的情况下对NDSRI的效力进行排序。这种分析的几个例子表明，在EMA第5（3）条问答中被指定极低限度的NDSRIs具有比目前用于交叉阅读的替代物低得多的诱变效力。为了避免基本药物的不合理短缺，该行业以及HAs必须设计可接受的方法来设定NDSRIs的限制。科学上合理的证据慢慢地出现，表明大多数（如果不是全部）NDSRIs的效力明显低于小二烷基NAs，并且可能没有必要将NDSRIs一揽子纳入CoC。尽管许多联盟和相互（行业和HAs）工作组正在严格合作调查接触NDSRIs的潜在风险，但如果无法获得基本药物，患者可能会面临更高的风险。 不仅在适用的AI限制非常低的情况下，药品可能会退出市场，更令人担忧的是，如果销量不能证明MAH采取调查/缓解措施是合理的，这对于历史悠久的仿制药来说尤其令人担忧，因为每剂的利润率可能很小，在这种情况下，MAH可能会简单地撤回产品，而不打算更换它。较小的仿制药供应商可能会感受到这种压力特别强烈，因为它们不具备与大型跨国制药商相同的财务实力和技术资源。这可能导致供应选择减少和相应药物价格上涨。 从积极的一面来看，当已经开始的大量NDSRIs（尤其是TGR）体内致突变性研究的结果可用时，我们可以预期关于相对风险的知识将迅速增长。TGR数据可以用最高分辨率下一代测序（NGS）/双链测序的结果来补充，这有可能取代TGR研究，并在未来显著加速致突变性数据的生成。对于那些未测试阴性/非致突变性的NDSRIs，有必要开发一种公认的方法，该方法可以从体内致突变性数据中得出科学合理的AIs，因为交叉阅读选项可能不可用，并且从时间、能力或动物福利的角度来看，致癌性研究是不可行的。 新产品将受益于在建立药物生产工艺时实施NA控制策略。根据ICH Q3D指南，NA风险评估最终将成为产品生命周期管理(LCM)的一个组成部分，就像今天元素杂质的情况一样。最终，这将使行业恢复正常运营，其中对NA风险的关注是新常态的一部分，也许是在修订后的ICH M7框架下。该框架将需要允许区分那些理应属于关注队列的亚硝胺与那些非CoC和那些完全不致突变的亚硝胺。 参考文献：略 下一篇：FDA审评：吡托布鲁替尼CMC PNDA会议交流(2) 作者精彩原创集锦 1、创新药研发中原料药工艺与沟通交流常见难点 2、创新药研发中「制剂工艺」常见难点 3、创新药研发中「变更」相关难点 4、创新药研发中「质量分析控制」相关难点（1） 5、创新药研发中「质量分析控制」相关难点（2） 6、创新药研发难点分析与CMC研究策略探讨 7、《已上市化学药品药学变更研究技术指导原则（试行）原料药变更的问答》浅析 8、FDA：原料药中亚硝胺风险评估的最新观点 9、FDA审评：吡托布鲁替尼CMC PNDA会议交流(1) 曾文亮 博士 迪哲医药CMCRA副总监，公众号“文亮频道”主理人。 山东大学本科与硕士，上海中医药大学博士。   近20年药物研发经验，擅长新药研发与注册申报，近5年积累了近十个小分子新药中美IND申报成功和两个1类抗肿瘤新药上市申报成功经验。先后任职于某大型CRO医药研发公司、USP大中华区研发中心和港资原料药厂等，主导过MNC质量研究项目、USP各论更新和药厂QC实验室通过国家GMP检查和WHO审计。   受中国医药保健品进出口商会邀请在二十二届世界制药原料药中国展（CPHI）主导策划了“小分子创新药质量研究和注册策略”沙龙并发表主题演讲；同时受专业药学论坛邀请发表了《创新药质量研究要点和案例分析》、《中美新药申报沟通交流常见问题和案例分析》、《亚硝胺杂质的FDA和EMA控制策略》、《分析方法开发，验证和转移的统计学评价》和《FDA483中清洁验证的典型案例分析》等十余次主题演讲。   更多精彩内容可关注： ▲ 关注文亮频道，探索未知世界

点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注 药物遗传毒性评价研究关注点 来源 《中国新药杂志》 2024年 第33卷第14期 作者 高梅，张蓉，徐娜，陈凯，王欣欣，张岱州 山东省药学科学院； 国家药品监督管理局食品药品审核查验中心； 江苏省药品监督管理局审核查验中心 摘要 遗传毒性研究是药物非临床安全性评价的重要内容，与致癌性、生殖毒性研究密切相关。遗传毒性试验目的是检测受试物的致突变性，预测受试物的致癌性，对受试物的遗传毒性潜在性进行全面评价是药物进入临床试验及上市的重要环节。遗传毒性标准试验组合包含体内和体外试验，测试终点多样，本文从人员资质、实验室管理、给药制剂、实验系统、试验实施关键阶段等方面阐述遗传毒性评价研究的关注点，为遗传毒性研究实施提供借鉴。研究机构应严格遵循药物非临床研究质量管理规范(good laboratory practice for nonclinical laboratory studies，GLP)实施评价工作，不断提高遗传毒性试验质量。 关键词 药物; 遗传毒性; 体内; 体外; 非临床研究质量管理规范 _ 正文 _ 遗传毒性研究是药物非临床安全性评价的重要内容，与致癌性、生殖毒性研究密切相关。遗传毒性试验目的是检测受试物的致突变性，预测受试物的致癌性，对受试物的遗传毒性潜在性进行全面评价是药物进入临床试验及上市的重要环节。进行药物遗传毒性评价研究遵循的指导原则是《药物遗传毒性研究技术指导原则》(以下简称指导原则)[1-2]，其中对标准试验组合、实验系统、剂量设计、方法、结果判定等都有较详细说明和规定，试验实施过程中应遵照执行。药物遗传毒性试验必须执行《药物非临床研究质量管理规范》(good laboratory practice for nonclinical laboratory studies，GLP)，拟用于药品注册申请的遗传毒性试验，应当在通过药物GLP认证的非临床安全性评价研究机构实施[3-7]。遗传毒性试验周期较短，但包括体内和体外试验的标准试验组合，实验系统从原核细胞到真核细胞再到哺乳动物，且体外试验还需在添加和不添加代谢活化产物的条件下进行，所用试剂和仪器也种类繁多，具有操作步骤复杂、记录繁琐、测试终点多样性等特点，具有一定的特殊性。本文从人员资质、实验室管理、给药制剂、实验系统、试验实施关键阶段等方面阐述遗传毒性评价的关注点，为遗传毒性研究实施提供借鉴。研究机构应严格遵循GLP实施评价工作，不断提高遗传毒性试验质量。 1 遗传毒性试验分类 遗传毒性试验可分为体外和体内试验两大类[1-2]。体外试验主要包括: ①细菌回复突变试验。②体外哺乳类细胞染色体畸变试验。③体外哺乳动物细胞微核试验。④体外小鼠淋巴瘤细胞胸苷激酶(thymidine kinase，Tk)基因突变试验。⑤荧光原位杂交(FISH)。体内试验主要包括: ⑥体内微核试验。⑦体内中期相细胞染色体畸变试验。⑧体内彗星试验。⑨体内碱洗脱试验。⑩转基因小鼠体内突变试验。 文章内容由凡默谷小编查阅文献选取，排版与编辑为原创。如转载，请尊重劳动成果，注明【来源：凡默谷公众号】。 2 人员资质 遗传毒性试验无论是组合一还是组合二，细菌回复突变试验和体内动物试验是必选试验，如果采用组合一进行评价，还会涉及体外细胞试验，因此从事遗传毒性试验的人员应接受过与其工作相关的专业和技能培训，具备所承担工作需要的知识、经验和能力。例如: 从事细胞、细菌体外试验的人员应具有微生物学、细胞生物学等学科知识，并经过专业化培训，熟练掌握细菌、细胞的复苏、培养、传代、冻存等技术，配制给药制剂的人员在配制过程中也应无菌操作; 从事体内动物试验的人员，则应先接受动物专业知识的理论培训，上岗前动物称重、给药、临床观察、安乐死等操作也必须经过培训和考核; 对于阅片人员，如显微镜下分析染色体结构畸变的类型、计数未成熟红细胞及微核，还必须经过更长时间的培训，考核合格后方可进行相关操作。此外，人员应定期体检并评估体检结果，确保身体状况不能影响研究工作[8]。 3 设施 开展遗传毒性试验，要具备细胞实验室、细菌实验室、屏障环境动物房等设施。细胞实验室、细菌实验室应定期检测空气洁净度及沉降菌，测试要求可参考GB50591-2010《洁净室施工及验收规范》、GB/T16292-2010《医药工业洁净室(区)悬浮粒子的测试方法》、GB/T16294-2010《医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法》[9-11]等。动物饲养环境指标如温度、湿度、压差、噪声、照度、洁净度、沉降菌等应符合GB14925-2023《实验动物环境及设施》[12]要求。此外，传递物品时会用到传递窗紫外线灯对物品进行消毒，需对紫外线灯的消毒效果进行验证并定期检测紫外线灯的辐照强度。 4 实验室管理 4.1 仪器设备 遗传毒性试验实施过程中用到的仪器种类繁多，如各种温度范围的冰箱、高压灭菌器、生化培养箱、二氧化碳培养箱、水浴锅、生物安全柜、电子天平、移液器、离心机、液氮罐、pH计、搅拌器、显微镜等，每台/套仪器均要有明确的仪器责任人，放置地点合理且有状态标识，并定期进行清洁、维护保养与校准、确认或验证。为方便管理，最好建立一个清晰的仪器台账，用于记录各个仪器的名称、型号、生产厂商、启用日期、责任人、放置位置、本次及下次计量检定/校准、验证日期等。其中，试验中必不可缺的仪器设备是高压灭菌器，工作压力≥0.1MPa、容积≥30L压力容器的操作人员必须取得特种设备作业人员资格证后方可进行操作[13-14]，试验中所用的超净工作台应定期对沉降菌、气流流速、洁净度等进行检测[15-16]，生物安全柜应定期检测下降气流流速、流入气流流速等[17]。液氮罐需定期检测液氮量，储存培养基的冰箱和培养细菌、细胞的培养箱则应监测温度，如果试验实施过程中温度波动超过允许范围，应及时向专题负责人汇报，并评估对试验的影响。此外，如果试验中使用了菌落计数仪、细胞计数仪、细胞流式仪等，此类仪器还应定期进行性能验证，确保性能符合要求。全自动菌落计数仪、细胞流式仪等计算机化系统管理应符合GLP要求，如需对用户登录、权限分配进行管理，确保登录用户的唯一性，系统应开启稽查轨迹功能，生成的电子数据要定期备份，系统发生变更时需进行评估以确认是否需要进行验证，系统退役时要有对原系统数据查阅与追溯的措施等[8，18]。 4.2 实验材料 遗传毒性试验周期虽短，试验涉及试剂却种类繁多，Ames试验需要琼脂粉、牛肉膏、葡萄糖、L-组氨酸、D-生物素等试剂20余种[19-23]，体外细胞染色体畸变试验需要细胞培养基、血清、秋水仙素、甲醇、乙酸等试剂也约20种[24-27]，几乎都需要由不同成分试剂的组合才能配成最终所要的试剂，如Ames试验中菌株鉴定用的组氨酸-生物素平板，是由琼脂培养基、磷酸盐贮备液/Vogel-Bonner(V-B)培养基E、葡萄糖、组氨酸、生物素等溶液按照比例组合而成，需要使用的试剂高达9种。而且，不同试剂的储存条件和有效期也不尽相同，因此实验室试剂的管理至关重要，应做好台账，定期清点储存量和有效期，变质或过期的试剂及时处置。 遗传毒性试验耗材主要有枪头、平皿、锥形瓶、离心管、玻片、烧杯、量筒等，且耗材中许多为遗传试验专用，如冻存管、细胞培养瓶等，因此要定期清点库存，及时补充。 5 给药制剂 5.1 受试物、溶剂对照品 受试物和溶剂对照品应有专人保管，其接收、登记、分发手续齐全并完整记录。对于给药时间超过4周的试验，委托方提供的受试物和溶剂对照品应留样归档，若为常规市售溶剂，如氯化钠注射液、灭菌注射用水、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)等，可根据机构制定的标准操作规程(standard operating procedure，SOP)中的要求确定是否需要留样。因遗传毒性体外试验有其特殊性，给药制剂配制时，溶剂一般首选水或DMSO，需注意的是，染毒过程中添加DMSO的量不宜过多，指导原则中未对其进行具体规定，可参考其他标准，如食品安全国家标准GB15193.4-2014《细菌回复突变试验》中规定Ames试验每平板DMSO原液的添加量不超过0.1mL[20]，GB15193.23-2014《体外哺乳动物细胞染色体畸变试验》中规定体外染色体畸变试验DMSO浓度不应大于0.5%[25]，OECD TG473则规定一般不超过1%(v/v)[28]，其目的都是保证DMSO不对实验系统产生毒性。除了上述水或DMSO以外的溶剂，均不应与受试物发生反应，且对菌株、细胞和哺乳动物肝脏微粒体酶(S9)没有毒性和诱变性。配制后的给药制剂不应对实验系统造成污染，必要时可采取适当方法灭菌或除菌。DMSO为溶剂时，因DMSO有抑菌作用[29-30]，受试物与细胞、细菌接触作用时一般情况下不会导致污染，建议通过预试验确定是否有污染发生。 5.2 阳性对照品和麻精药品 遗传毒性试验常会用到致突变剂，如环磷酰胺、丝裂霉素等，这些物质已明确能致突变，建议在保存过程中实行双人双锁管理，双人发放和领用，做到账物相符。配制和使用过程中应穿戴好个人防护用品，如一次性无菌衣、手套、口罩、防护镜等; 称量阳性对照品的电子天平最好能做到专用，并要贴有醒目标识。使用完毕后，可按照食品安全国家标准或参考文献，利用化学反应破坏这些物质中引起致突变作用的官能团，达到无害化处理[31-32]。此外，体内试验动物实施安乐死时，会用到异氟烷、舒泰Ⓡ50等兽用麻醉剂，应严格管理防控风险，其储存和使用建议参考麻精药品管理方法，使用完毕后可倒入脱脂棉等可吸收材料吸附暂存或大量稀释后倒入废液桶中，交由有资质的专业公司处理。 6 实验系统 6.1 细菌 Ames试验中，菌株为组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌和/或色氨酸营养缺陷型大肠埃希菌，至少应包含以下5种菌株的组合: TA98，TA100，TA1535; TA1537或TA97或TA97a，TA102或大肠埃希菌WP2uvrA或大肠埃希菌WP2uvrA(pKM101)。所用菌株应背景资料清楚，定期进行菌株鉴定，包括组氨酸/色氨酸缺陷型的鉴定、脂多糖屏障缺陷的鉴定(结晶紫敏感)、R因子的鉴定(抗氨苄青霉素)、四环素抗性的鉴定、uvrB修复缺陷型的鉴定(紫外线敏感)等，鉴定合格后可批量冻存备用。国内药物Ames试验使用较多的组合是TA97/TA97a，TA98，TA100，TA102，TA1535[33-39]，这些菌株生长均需组氨酸，均对结晶紫敏感，除TA1535外均具有氨苄青霉素抗性，除TA102外均对紫外线敏感并均无四环素抗性。 6.2 细胞 体外哺乳类细胞染色体畸变试验，因中国仓鼠肺细胞(Chinese Hamster Lung Cells，CHL)对诱变剂敏感，易在体外建立细胞系，染色体数目较少且核型稳定，便于染色体分析，因此使用频率较多[40-42]。Tk基因突变试验通常采用L5178Y Tk+/--3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞。使用前，应对细胞支原体污染、核型等进行检查。 培养时，先肉眼观察培养液的颜色以及是否澄清，然后在倒置显微镜下观察细胞的生长状态、有无污染，常见为细菌、霉菌和支原体污染，导致细胞生长缓慢或停止增殖直至死亡。其中细菌污染最易被发现，培养液短时间内会变浑浊，支原体污染则在培养初期不易被发现，可用荧光染色方法进行支原体检查，荧光显微镜下观察可见在细胞核外与细胞表面的荧光小点或丝状点为支原体污染，也可用PCR检测、支原体培养等方法检测支原体[43-44]。可通过检查细胞分裂中期的染色体进行核型分析，Lorge等[41]报道CHL细胞模态染色体数目为25条，L5178Y Tk+/--3.7.2C细胞模态染色体数目为40条。 6.3 大鼠/小鼠 体内动物试验常用动物为大鼠和小鼠，动物抵达后应进行环境适应，个体标识清晰，群体饲养并提供适当的环境丰富物品，如磨牙棒、筑巢材料等[45-46]。动物的使用应关注动物福利，试验方案实施前应获得动物伦理委员会批准。 动物饲料、垫料应由合格供应商供应，并定期检测，检测频率可由机构根据实际情况制定。饲料的质量检测包含常规营养成分指标、化学污染物指标、微生物指标; 垫料检测包括物理性指标、污染物指标、微生物指标; 饮用水检测包括感官性状、一般化学指标、微生物指标、毒理指标。饲料、垫料、饮用水的检测报告应进行评估，饲料评估标准可参照国家标准GB14924.3-2010《实验动物配合饲料营养成分》、GB/T14924.2-2001《实验动物配合饲料卫生标准》、GB/T18823-2010《饲料检测结果判定的允许误差》[47-49]，垫料评估标准可参照北京市地方标准DB11/T1126-2014《实验动物垫料》、国家标准GB14925-2023《实验动物环境及设施》等[12，50]，饮用水评估标准可参照国家标准GB5749-2022《生活饮用水卫生标准》、GB14925-2023《实验动物环境及设施》的要求[12，51]。 7 实验实施关键阶段 目前药物遗传毒性评价试验方法多采用细菌回复突变试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验、哺乳动物体内微核试验的标准组合[33-39]。专题负责人要全面负责研究项目的实施和质量，研究相关的资料，如试验方案、原始数据、标本、受试物和对照品留样(如有)、总结报告以及与研究有关的其他文件、电子资料等，应及时归档且归档资料内容要完整。 7.1 细菌回复突变试验 试验实施过程中，应着重检查菌株的接收、复苏、传代、冻存、鉴定，试剂配制、受试物配制、分析以及与细菌受试物作用、培养、菌落观察计数等。 需要注意的是，指导原则中未明确要求与受试物作用前细菌的数量，OECD TG471以及化学品、食品、农药、化妆品国家标准及规范中均要求加药前细菌数达到109个·mL-1[19-22，52]，因此，每个实验室均应建立本实验室的菌株复苏、培养、冻存等相关SOP，以确认培养基、培养温度、培养时间等因素对细菌生长的影响。加药时，受试物至少有5个剂量组，此外还有溶剂对照组和阳性对照组，这就需要底层和顶层培养基各210个，共需加样525次，特殊情况下，还需设立更多的受试物剂量组和空白对照组，所以每个底层平皿均应有唯一的编号且标识清楚、准确，加样过程要注意力集中，将菌液和受试物加入到顶层培养基试管中混匀后迅速倒入底层培养基平板上，倒入后要快速转动平皿使之均匀分布，防止环境温度低时，顶层在均匀分布前过早凝固。此外，还要注意整个加样过程的无菌操作，防止污染。当试验结果为阳性时，回复突变菌落数能达到数千，菌落通常密集难以每个计数，实验室应建立此种情况计数方法的SOP。 7.2 体外哺乳类细胞染色体畸变试验 试验实施过程中，应着重检查细胞株的接收、复苏、传代、冻存、核型检查、支原体污染检查记录; 试剂配制、受试物配制、分析以及细胞与受试物作用、培养、细胞计数、染色体标本制备、染色与镜检等。 细胞染色体畸变试验，从细胞复苏、传代、细胞毒性检测到与受试物作用、收获细胞，细胞要持续培养，因此污染的控制至关重要。制备染色体玻片是整个试验的关键，收获细胞后，需要进行离心、低渗、固定、滴片、染色等过程，每一步操作都要认真仔细、按要求操作，才能制备质量较好的玻片。最常见的影响镜检的因素是染色体的分散程度和染色，可从以下方面进行把控[53-54]: ①秋水仙素的剂量和作用时间。②低渗时间，时间过久则染色体破裂，过短则染色体不能分散。③固定，固定液应新鲜配制，先加少量固定液预固定，防止直接大量加入时凝结成块。④滴片，所用玻片应干净无油污，滴片前可用冰水浸泡，使得细胞悬液容易分散; 滴片时玻片倾斜放置，将细胞悬液滴在玻片不同位置以2滴为宜，轻吹使之扩散; 滴片高度要适中，太高染色体分散，太低则分散不好。⑤染色，磷酸盐缓冲液的pH值应把握好，pH值过高染色体易染成蓝色，影响阅片的舒适感，且染液最好用全新染液，避免重复利用使着色不好。此外，离心的速度与时间、混匀过程的力度、染色后浮色的冲洗等都会影响制片的质量。 7.3 哺乳动物体内微核试验 试验实施过程中，应着重检查动物使用申请、接收、检疫、饲养管理，试剂配制、受试物配制、分析以及动物分组、称重、给药、临床观察、安乐死、骨髓涂片制备、染色与镜检等。 动物给药体积和速度可参考“A Good Practice Guide to the Administration of Substances and Removal of Blood，Including Routes and Volumes”[55]，最大可能地保障实验动物的福利。微核试验中，常采用的是制备胸骨骨髓涂片，动物安乐死后[56]，按常规血涂片法涂片，长度约2~3cm，在空气中晾干[57]，建议即使制备当日不染色，也将玻片标本置固定液中固定后保存[58]。使用吉姆萨染液染色时，嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈粉红色/淡橘红色[59-60]，染色过程中需要调好染色液的pH值，否则不易区分嗜多染红细胞和正染红细胞。除人工镜检方法外，在方法学被充分验证后，也可采用流式细胞术检测外周血微核或采用其他自动化分析系统对微核进行检测。 8 质量保证(quality assurance，QA)检查 QA对遗传毒性试验项目进行检查，应制定每项研究项目的检查计划，检查范围要覆盖项目的关键阶段，检查结果均应报告给机构负责人、专题负责人，对检查发现问题要跟踪检查并核实整改结果。对原始数据和总结报告的审查，要审查试验实施与试验方案规定的一致性、总结报告信息与原始记录的一致性以及总结报告是否包括所有偏离SOP和试验方案的情况等，审查总结报告后，QA出具质量保证声明，总结报告批准后如果有修改或补充，QA应重新审查并签署质量保证声明[61]。质量保证部门的检查记录及报告不属于研究档案，在SOP中应明确规定定期归档的具体时限及负责人员。 9 结语及讨论 遗传毒性试验是采用细菌、哺乳动物细胞等测试受试物是否引起基因突变、染色体畸变、DNA损伤的试验，这些试验也包括整体动物试验。检测的遗传终点分为基因突变、染色体畸变、DNA损伤，因遗传终点的多样化，通常不可能在单个实验系统中检测出多个终点，所以常用的科学方式是采用一组试验。 《药物遗传毒性研究技术指导原则》是进行药物遗传毒性试验的基本原则，作为一个指导性文件，目的是为试验组合和结果分析提供指导，未对试验方法的具体操作细节进行详细规定。在试验设计上，应根据受试物特点，遵循“具体问题具体分析”原则，合理选择试验方法及设计试验方案。2种组合中，标准组合一历史应用经验较多[2]，目前药物评价采用较多的是组合一中的Ames试验、体外染色体畸变试验、体内微核试验3种试验组合，根据指导原则要求，体外试验要根据受试物的溶解度和/或对实验系统的毒性来确定高剂量组，且需要加入外源性代谢活化系统模拟体内代谢条件，在加和不加代谢活化系统的条件下进行，如果受试物有毒性作用，微核试验高剂量组要有一定的毒性症状。各实验室应建立菌株回变菌落数、染色体畸变率、微核率的历史背景对照数据库，以有助于确定统计学结果的生物学意义。 药物遗传毒性研究是药物非临床安全性评价的重要组成部分，必须执行《药物非临床研究质量管理规范》。近年来，在药物GLP认证检查中，也发现了遗传毒性试验相关的不符合GLP要求的问题，如原始记录内容不完整、未规定配制后溶液的有效期、总结报告中信息错误等，这就要求试验人员严格执行试验方案和SOP，记录试验产生的所有数据，试验中不能使用变质或过期的溶液，总结报告要真实反映原始数据，报告中各项信息应与原始记录一致。此外，试验中如果使用了机械计数器，其所产生的计数结果是用来计算微核率及染色体畸变率，虽然此仪器功能简单，建议也需定期对此计数器计数的准确性进行确认。Ames试验的试验菌株的某些特性易丢失或变异，建议实验室在SOP中确定长期保存的菌株定期鉴定的频率。动物试验中，机构应对饲料开封后的使用有效期进行验证，对饲料、垫料和动物饮用水的检测报告进行审核。总之，遗传毒性试验在试验人员的资质、实验系统、试验实施的关键阶段等有其特殊性，试验实施应遵从“随机、对照、重复”的基本原则，客观评价受试物潜在的遗传毒性，降低临床用药风险。相信随着我国药物研发水平及GLP认证的高质量发展，遗传毒性试验在实施细节方面也将不断完善。 参考文献 详见《中国新药杂志》 2024年 第33卷第14期 文章信息源于公众号凡默谷，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。 学如逆水行舟，不进则退； 心似平原走马，易放难收。 行舟Drug 每日更新 欢迎订阅+ 医药大数据|行业动态|政策解读