Dimethyl Sulfoxide

在肿瘤生物学研究领域，细胞系作为重要的实验模型，为疾病机制探索、药物研发以及治疗方案优化提供了关键支撑。NCI-H661细胞作为人大细胞肺癌的代表性细胞系，因其独特的生物学特性，成为肺癌研究领域不可或缺的工具。建立专业的基因库保种体系，对于维持该细胞系的遗传稳定性、保障实验的可重复性以及推动肺癌研究的持续发展具有重要意义。本研究将围绕NCI-H661细胞基因库专业保种展开深入探讨，系统阐述其技术体系、质量控制标准以及应用价值。 二、NCI-H661细胞的生物学特性 2.1 细胞来源与基本特征 NCI-H661细胞源自一位43岁患有大细胞肺癌的男性白人的淋巴结，1982年建系，保藏机构包括ATCC（HTB-183）等^。该细胞形态为上皮细胞样，呈贴壁生长特性，倍增时间约为32.7 - 61小时^。其缺乏产生粘液和鳞状分化的亚显微结构和生化证据，角蛋白和波形蛋白纤维染色阳性，神经丝三联体蛋白阴性^。这些特征为细胞的鉴定和培养提供了基础依据。 2.2 遗传特性 NCI-H661细胞表达的p53 mRNA水平明显高于正常肺细胞，但未出现总体性的结构DNA畸变，提示可能存在点突变或微小变异^。这种独特的遗传特性使其成为研究肺癌发生发展机制，尤其是p53基因相关通路的理想模型。此外，该细胞系在长期培养过程中需密切监测遗传稳定性，以确保实验结果的可靠性。 三、NCI-H661细胞基因库保种的技术体系 3.1 细胞培养体系的建立与优化 3.1.1 培养基与培养条件 NCI-H661细胞的培养体系通常采用RPMI - 1640培养基添加10%胎牛血清（FBS），培养条件为气相：空气，95%；二氧化碳（CO₂），5%；温度：37℃^。在实际培养过程中，需根据细胞生长状态对培养基成分和培养条件进行微调。例如，当细胞生长缓慢或状态不佳时，可适当调整血清浓度或添加生长因子，以促进细胞增殖。 3.1.2 细胞传代技术 当细胞密度达到80% - 90%时，即可进行传代培养。具体步骤如下：弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1 - 2次；加入2ml消化液（0.25%Trypsin - 0.53mM EDTA），置于37℃培养箱中消化1 - 2分钟，显微镜下观察细胞消化情况，待大部分细胞变圆并脱落时，迅速拿回操作台，轻敲培养瓶后加少量培养基终止消化；按6 - 8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000rpm条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1 - 2ml培养液后吹匀；将细胞悬液按适当比例分到新的培养瓶中，加入新鲜培养基继续培养^。首次传代推荐按1:2的比例分瓶，后续可根据实际情况调整为1:2到1:4的比例^。 3.2 细胞冻存技术 3.2.1 冻存液的配制 冻存液通常采用完全培养基添加5%二甲基亚砜（DMSO），DMSO作为细胞保护剂，可降低细胞在冻存过程中的损伤^。在配制冻存液时，需注意无菌操作，避免污染。同时，DMSO具有一定的毒性，应在室温下避光保存，并在使用前预温至37℃。 3.2.2 冻存步骤 细胞冻存时，先弃去培养基，用PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，待细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数细胞密度；在1000rpm条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入适量血清和DMSO，使DMSO终浓度为5%，细胞密度不低于1×10⁶个/ml；将细胞悬液分装至冻存管中，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，并做好标识；将冻存管置于程序降温盒中，放入 - 80℃冰箱至少2小时后，转入液氮罐中长期储存^。程序降温盒可使细胞以约1℃/分钟的速率缓慢降温，减少细胞内冰晶的形成，提高冻存存活率。 3.3 细胞复苏技术 3.3.1 复苏前准备 从液氮罐中取出冻存管后，需迅速放入37℃水浴锅中，轻轻晃动冻存管，使细胞悬液在1 - 2分钟内完全融化。同时，提前预热培养基和PBS，准备好培养瓶等实验器材。 3.3.2 复苏操作 将融化后的细胞悬液转移至离心管中，加入适量预热的培养基，轻轻吹打混匀，在1000rpm条件下离心4分钟，弃去上清液，以去除DMSO；加入1 - 2ml新鲜培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至培养瓶中，放入37℃、5%CO₂培养箱中培养；复苏后24小时内尽量避免晃动培养瓶，待细胞贴壁后更换新鲜培养基^。 四、NCI-H661细胞基因库保种的质量控制体系 4.1 细胞鉴定 4.1.1 STR鉴定 STR（短串联重复）鉴定是细胞系身份认证的金标准。通过对细胞系的STR位点进行扩增和分析，与已知的细胞系STR数据库进行比对，可准确鉴定细胞系的身份，防止细胞交叉污染^。NCI-H661细胞在保种过程中，需定期进行STR鉴定，每批次细胞出库前也应进行该检测，确保细胞系的正确性。 4.1.2 形态学鉴定 显微镜下观察细胞形态是最直观的鉴定方法。NCI-H661细胞典型的上皮细胞样形态可作为初步鉴定依据，同时需关注细胞的生长状态、贴壁情况等^。当细胞形态出现异常变化时，需进一步排查原因，如是否存在污染、遗传变异等。 4.2 微生物污染检测 4.2.1 支原体检测 支原体是细胞培养中常见的污染物，可影响细胞的生长、代谢和遗传特性。常用的检测方法包括PCR法、荧光染色法等。在NCI-H661细胞保种过程中，需定期进行支原体检测，每3 - 6个月检测一次，确保细胞无支原体污染。一旦发现支原体污染，应及时采取处理措施，如使用四环素类、大环内酯类等抗生素进行清除，或丢弃受污染细胞。 4.2.2 细菌、真菌检测 通过肉眼观察培养基是否浑浊、有无菌落形成，以及显微镜下观察是否存在细菌、真菌菌丝等方式，可初步判断细胞是否被细菌、真菌污染。同时，可进行细菌、真菌培养，进一步明确污染类型。为预防污染，细胞培养全过程需严格遵守无菌操作规范，培养环境定期消毒。 4.3 遗传稳定性监测 4.3.1 染色体核型分析 染色体核型分析可检测细胞染色体数目和结构的异常。定期对NCI-H661细胞进行染色体核型分析，观察染色体是否出现缺失、重复、易位等变异，有助于评估细胞的遗传稳定性^。一般每传代5 - 10代进行一次染色体核型分析。 4.3.2 基因突变检测 针对NCI-H661细胞特有的p53基因等，可采用测序技术检测基因突变情况。通过对比不同传代细胞的基因序列，监测基因突变的发生频率和类型，及时发现遗传变异^。此外，还可检测其他与肺癌发生发展相关基因的突变情况，全面评估细胞的遗传稳定性。 五、NCI-H661细胞基因库保种的应用价值 5.1 肺癌基础研究 5.1.1 疾病机制研究 NCI-H661细胞作为人大细胞肺癌的模型，为研究肺癌的发生发展机制提供了重要工具。通过该细胞系，可深入探讨p53基因、细胞信号通路等在肺癌发生中的作用。例如，研究人员可利用基因编辑技术调控p53基因的表达，观察细胞的生长、凋亡等变化，揭示p53基因相关通路在肺癌中的功能^。此外，该细胞系还可用于研究肺癌细胞的侵袭、转移机制，为寻找潜在的治疗靶点提供线索。 5.1.2 药物筛选与评价 在抗肿瘤药物研发过程中，NCI-H661细胞可用于体外药物筛选。通过检测药物对细胞增殖、凋亡的影响，初步评估药物的抗肿瘤活性。同时，可利用该细胞系构建耐药模型，研究耐药机制，为克服肿瘤耐药提供实验依据。例如，采用CCK - 8比色法、平板克隆实验等方法，检测不同浓度药物对NCI-H661细胞生长的抑制作用，筛选出具有潜力的候选药物。 5.2 临床转化应用 5.2.1 个体化医疗研究 基于NCI-H661细胞的药敏试验结果，可为肺癌患者的个体化治疗提供参考。通过比较患者肿瘤细胞与NCI-H661细胞对不同药物的反应差异，预测患者对特定药物的敏感性，从而制定更加精准的治疗方案。虽然细胞系与体内肿瘤存在一定差异，但这种体外药敏试验仍可为临床治疗提供有益的指导。 5.2.2 新型治疗方法的验证 随着肿瘤治疗技术的不断发展，免疫治疗、基因治疗等新型治疗方法逐渐成为研究热点。NCI-H661细胞可用于这些新型治疗方法的体外验证。例如，通过将免疫检查点抑制剂作用于NCI-H661细胞，观察细胞的免疫应答反应，评估免疫治疗的效果。同时，可利用基因编辑技术修饰NCI-H661细胞，研究基因治疗的可行性和安全性。 六、NCI-H661细胞基因库保种面临的挑战与应对策略 6.1 遗传漂变与变异 在长期传代和冻存复苏过程中，NCI-H661细胞可能发生遗传漂变和变异，导致细胞的生物学特性改变，影响实验结果的可靠性。为应对这一挑战，需建立严格的传代管理制度，控制传代次数，一般建议细胞传代不超过20代^。同时，定期进行遗传稳定性监测，如染色体核型分析、基因突变检测等，及时发现遗传变异并采取相应措施，如更换种子细胞等。 6.2 微生物污染防控 微生物污染是细胞培养中的常见问题，严重威胁细胞系的质量。除了定期进行微生物检测外，还需加强培养环境的管理，包括超净工作台的定期消毒、培养箱的清洁与维护等。在细胞操作过程中，严格遵守无菌操作规范，避免人为因素导致的污染。一旦发现污染，应立即隔离受污染细胞，分析污染原因，并对培养环境进行彻底消毒。 6.3 保种成本与资源管理 建立和维护NCI-H661细胞基因库需要投入大量的人力、物力和财力，包括培养基、试剂、仪器设备等费用，以及专业技术人员的薪酬。为降低保种成本，可优化培养体系，提高细胞培养效率，例如采用无血清培养基替代传统的含血清培养基，不仅可减少血清带来的批间差异，还能降低成本。同时，建立合理的资源共享机制，与其他科研机构合作，实现细胞系的共享与交流，提高资源利用率。

点击蓝字 关注我们 /摘要/ 胶质母细胞瘤（GBM）细胞可在神经突样肿瘤微管（TMs）上形成神经元-胶质瘤恶性突触，进而驱动肿瘤的浸润性生长与复发。目前，GBM 细胞之间、以及GBM细胞与神经元之间如何通过协同交互作用，优先促进恶性突触形成而非正常突触生成的潜在机制仍未明确。本研究证实，胶质瘤分泌的C1QL1是介导胶质瘤-神经元、胶质瘤-胶质瘤细胞间交互作用的关键信使分子，可驱动肿瘤微管扩张与恶性突触形成。C1QL1可与邻近神经元和GBM细胞上的BAI3受体结合，激活Rac1介导的细胞骨架重排，从而修剪正常神经元突触、促进肿瘤微管生长延伸，最终推动恶性突触形成与胶质瘤网络构建。采用一种非鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）靶向的Rac1抑制剂进行靶向治疗，可逆转C1QL1介导的突触修剪效应，通过抑制肿瘤微管形成与恶性突触生成，进而阻滞胶质瘤复发。本研究结果阐明了GBM细胞与神经元之间的交互作用，如何使具有侵袭性的GBM细胞重塑并整合入宿主已有的神经环路，同时提出了一种通过同时抑制肿瘤微管形成与胶质瘤诱导的突触修剪，从而对抗GBM复发的治疗新策略。 /研究意义/ 本研究发现，C1QL1是浸润性胶质瘤细胞分泌的关键信使分子，它通过C1QL1-BAI3-Rac1信号轴，协调胶质瘤-胶质瘤细胞间及胶质瘤-神经元间的交互作用，诱导肿瘤微管扩张与神经突触修剪，进而驱动恶性突触形成与肿瘤复发。我们研发的这款非鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）靶向的Rac1抑制剂，可通过靶向Rac1阻滞胶质瘤复发，延长模型动物生存期。 /序言/ 胶质母细胞瘤（GBM）是颅内最常见、致死性最高的原发性恶性脑肿瘤，其核心特征为瘤内高度异质性与浸润性生长模式，这也是肿瘤产生治疗抵抗并最终复发的根源。GBM细胞存在四种转录组特征截然不同的细胞状态，分别为少突胶质前体细胞样（OPC-like）、神经祖细胞样（NPC-like）、星形胶质细胞样（AC-like）和间充质样（MES-like）。富集于肿瘤核心区的AC-like与MES-like细胞，常伸出细长的、神经突样的膜突起，即肿瘤微管（TMs），并通过这些结构形成由间隙连接偶联的互联胶质瘤网络，进而介导肿瘤的治疗抵抗。与之相反，富集于肿瘤浸润区的OPC-like与NPC-like细胞，通常未接入胶质瘤网络，是驱动肿瘤脑内侵袭的核心细胞亚群。一旦这些细胞在脑内远端区域定植，便会逐步伸出肿瘤微管，与其他胶质瘤细胞及胶质瘤网络建立连接。胶质瘤网络的这种动态重塑，无疑需要局域和长程的信号调控，来介导胶质瘤细胞内肿瘤微管的生长与形态重塑。尽管已有研究报道，内膜相关蛋白GAP43、间隙连接蛋白GJA1（CX43）、氯离子通道蛋白TTYH1等结构蛋白是肿瘤微管形成的必需分子，但能够调控 GBM 细胞生成肿瘤微管、接入胶质瘤网络的分泌型信使分子，至今仍未被发现。 肿瘤微管同时也是胶质瘤细胞接收肿瘤微环境（TME）中神经元电化学信号输入的关键位点。突触前的兴奋性神经元可在突触后的肿瘤微管上形成有功能的谷氨酸能突触，这一结构使具有侵袭性的 GBM 细胞整合入宿主神经环路，进而引发局部脑区过度兴奋与癫痫发作。局灶或远隔区域的神经元活动，可通过旁分泌或跨突触信号传导，促进胶质瘤的发生、进展与复发。同时，神经元活动还能驱动浸润区OPC-like/NPC-like胶质瘤细胞的肿瘤微管生长，促使其向互联的网络整合状态转变。与此同时，胶质瘤细胞会上调突触相关基因与GPC3、THBS1等促突触生成因子的表达，进一步促进突触形成并诱导脑区过度兴奋。与正常的神经元-神经元突触不同，这种神经元-胶质瘤突触被定义为恶性突触。恶性突触的形成是否以牺牲正常突触为代价，此前尚未有研究探索。在脑发育、学习与记忆过程中，突触发生与突触修剪始终相伴发生，机体通过清除多余或功能薄弱的突触，实现神经环路的精细化修饰与重塑。而GBM细胞是否劫持了这一类似的神经发育程序，通过修剪宿主已有的神经环路，优先促进恶性突触而非正常突触的形成，仍有待阐明。 本研究通过单细胞与空间多组学数据挖掘，结合体内外功能验证，证实胶质瘤细胞可通过C1QL1介导的胶质瘤-神经元、胶质瘤-胶质瘤细胞间交互作用，主动修剪正常神经元突触，同时促进恶性突触形成与肿瘤微管生长。靶向C1QL1-BAI3信号轴可有效减少恶性突触形成、破坏胶质瘤网络，最终阻滞GBM复发。 /结果/ ｜1.C1QL1 在具有电活动的浸润性GBM细胞中高表达 为了筛选出与神经元连接增强的浸润性GBM细胞所表达的特征基因，我们重新分析了Wang等人的数据集，该数据集涵盖了来自肿瘤核心区与瘤周浸润区的GBM单细胞数据（图 1A）。此外，我们还分析了Krishna等人的数据集，该数据集通过对GBM浸润的大脑皮层进行术中电生理检测，划分出了高功能神经连接区（HFC）与低功能神经连接区（LFC），并涵盖了这两个脑区的GBM单细胞数据（图 1A）。我们最终鉴定出210个在瘤周区与HFC区的GBM细胞中均高表达的基因（图 1B），其中包括OPC-like与NPC-like细胞的特征基因，如PDGFRA和DCX，这与既往报道中 “OPC-like与NPC-like细胞富集于肿瘤浸润区，并可与微环境中的神经元形成恶性突触” 的结论一致。在这些基因中，有6个基因编码的分泌蛋白参与突触或肿瘤微管、细胞骨架的调控，分别为C1QL1、CNTN2、ADAM23、DRAXIN、APOD和ACAN（图 1B），它们是介导浸润区胶质瘤-神经元和胶质瘤-胶质瘤细胞间交互作用的潜在候选分子。 其余5个基因均隶属于轴突修复、轴突导向、细胞外基质（ECM）和突触组装相关通路，而C1QL1是其中唯一与突触修剪相关的基因。在Neftel等人的GBM单细胞RNA测序数据集中，C1QL1优先在OPC-like型GBM细胞中表达，而在肿瘤相关的小胶质细胞或巨噬细胞中不表达。与之相反，既往报道的其他肿瘤微管或神经元-胶质瘤突触调控分子，如SEMA4F、THBS1、GPC3、GAP43、GJA1 和 TTYH1，均富集于NPC-like、MES-like或AC-like型细胞中。我们通过分析更多数据集进一步证实，C1QL1在瘤周区表达水平更高（图 1C），且在有电活动或锋电位发放的胶质瘤细胞中的表达水平显著高于无锋电位发放的胶质瘤细胞（图 1C）。为明确C1QL1表达的空间分布模式，我们重新分析了本团队自建的及已公开的GBM空间转录组数据集。在存在明确肿瘤浸润区域的样本中，与细胞肿瘤区（CT）相比，C1QL1 在肿瘤浸润区（IZ）和侵袭前沿（LE）的表达水平更高（图 1D）。综上，这些数据证实，C1QL1在具有电活动的浸润性GBM细胞中高表达。 具有电活动的浸润性GBM细胞与肿瘤复发及不良预后密切相关。空间转录组数据显示，与原发性GBM相比，复发性GBM的细胞肿瘤区中，C1QL1高表达的位点呈增加趋势（图 1E）。与之一致的是，来自CARE联盟的GBM纵向单细胞RNA测序数据显示，C1QL1在复发性GBM中表达水平更高。随后，我们分析了C1QL1表达水平与复发性GBM患者预后的相关性。在中国胶质瘤基因组图谱（CGGA）和胶质瘤纵向分析联盟（GLASS）两个队列中，C1QL1的表达水平均与复发性GBM患者的总生存期呈负相关（图 1F、G）。此外，C1QL1高表达与更短的肿瘤复发间隔、更差的复发后生存期显著相关（图 1H）。这些数据证实，C1QL1的表达在GBM患者中具有明确的预后价值与临床相关性。 图1 多数据集分析证实C1QL1是电活性浸润型胶质母细胞瘤细胞的标志物 ｜2. C1QL1 在多种 GBM 模型中促进肿瘤发生发展与浸润 我们采用既往报道的患者来源胶质瘤干细胞（GSC）异种移植模型（BNI23和BNI21），探究了C1QL1在GBM发生发展中的作用。整合935K甲基化阵列分析证实，这两株细胞系均与TCGA数据库中、与IDH野生型状态相关的G-CIMP阴性GBM样本聚类在一起。推断的全基因组拷贝数变异（CNV）谱也显示，这两株细胞均不存在G-CIMP阳性或IDH突变型GBM的特征性染色体改变，如10号染色体短臂10p15.3-p11.21扩增、1p/19q 共缺失等。这些数据与我们的临床记录一致，即上述胶质瘤干细胞均来源于确诊为IDH野生型GBM的患者。 我们分别通过CRISPR/Cas9技术在BNI23胶质瘤干细胞中实现了C1QL1双等位基因敲除（KO），通过shRNA技术在BNI21胶质瘤干细胞中实现了C1QL1敲低（KD），并通过基因组测序、qPCR及Western blot分别完成了验证。在两种胶质瘤干细胞皮质异种移植模型中，C1QL1敲除或敲低均能有效抑制肿瘤进展，显著延长荷瘤小鼠的生存期（图 2A）。随后，我们通过人核抗原（HNA）和神经丝蛋白200（NF200）免疫荧光染色，评估了胶质瘤的浸润范围，以及神经元-胶质瘤的空间邻近关系。在两种模型的终末期，我们均观察到肿瘤细胞广泛浸润至周围皮层，同时沿胼胝体（CC）的白质束发生侵袭，完美复刻了人GBM的病理特征（图 2B）。此外，我们在肿瘤浸润区和胼胝体中，观察到大量NF200染色阳性的神经纤维与胶质瘤细胞交织分布（图 2B）。 C1QL1敲除或敲低显著缩小了胶质瘤的浸润范围，同时在肿瘤核心区和浸润区均抑制了肿瘤细胞的增殖，这一表型在皮质异种移植后2周即可观察到（图 2B、C）。与之相反，在两种胶质瘤干细胞模型中，过表达C1QL1均显著缩短了荷瘤小鼠的总生存期。 为验证C1QL1的促癌效应在不同遗传背景下具有保守性，我们采用了本团队构建的另外两种基因背景明确的GBM模型，包括TP53/NF1/PTEN三突变人神经干细胞（hNSC）异种移植模型（TNP），以及来源于Trp53/Nf1双突变转基因小鼠模型的原代鼠源细胞系（BT5）。在两种模型中，mCherry或EGFP标记的胶质瘤细胞均展现出比胶质瘤干细胞模型更强的浸润性生长能力，在终末期常沿白质束侵袭至对侧大脑半球（图 2D）。与之相反，C1QL1敲除的TNP肿瘤、C1QL1敲低的BT5肿瘤，均表现出肿瘤体积显著缩小、浸润能力明显下降的表型（图 2D、E），同时荷瘤小鼠的生存期显著延长（图 2F）。有趣的是，我们还观察到，在C1QL1敲除的TNP肿瘤中，OLIG2和HNA双标记的少突胶质谱系肿瘤细胞比例显著降低，这与C1QL1在OPC-like型GBM细胞中高表达的结果一致。综上，在不同遗传背景、不同荷瘤小鼠免疫状态的多种GBM模型中，C1QL1均能促进肿瘤的生长与浸润。 图2 C1QL1在多种GBM模型中促进肿瘤增殖与浸润 ｜3. C1QL1 促进 GBM 细胞的肿瘤微管形成 鉴于C1QL1在神经元突触调控中的已知作用，我们采用单独培养、或与原代皮质神经元共培养的mCherry标记胶质瘤干细胞，探究了C1QL1的促肿瘤效应是否依赖于神经元微环境。单独培养时，与载体对照组胶质瘤干细胞相比，C1QL1敲除组胶质瘤干细胞的每个视野平均细胞数减少了37%（图 3A）。与皮质神经元共培养可使载体对照组胶质瘤干细胞的细胞数增加36%，但这一促增殖效应在C1QL1敲除组胶质瘤干细胞中完全消失（图 3A）。极限稀释分析（ELDA）结果显示，C1QL1敲除或敲低均会降低BNI21和BNI23细胞的自我更新和增殖能力（图 3B）。上述结果表明，C1QL1对胶质瘤干细胞同时发挥肿瘤细胞内源效应，以及神经元微环境依赖的调控效应。 为探究C1QL1的肿瘤细胞内源效应，我们对培养的载体对照组和C1QL1敲除组胶质瘤干细胞进行了批量转录组测序（bulk RNA-seq）。结果显示，已知的肿瘤微管调控分子GJA1和TTYH1，在C1QL1敲除组胶质瘤干细胞中表达均显著下调（图 3C）。C1QL1敲除组胶质瘤干细胞中下调最显著的通路包括细胞连接、细胞黏附、跨突触信号传导以及胶质发生（图 3D）。这些结果提示，C1QL1可能调控胶质瘤干细胞中间隙连接偶联的肿瘤微管。为验证这一猜想，我们使用肿瘤微管的标志物人巢蛋白（hNestin）对培养的胶质瘤干细胞进行染色。在两株胶质瘤干细胞系中，C1QL1敲除均显著降低了带肿瘤微管的细胞比例、带分支型肿瘤微管的细胞比例，同时显著缩短了肿瘤微管的长度（图 3E）。在胶质瘤干细胞异种移植模型中，C1QL1敲除组的带肿瘤微管细胞比例、人巢蛋白标记的肿瘤微管长度，也同样出现了一致性的显著下降（图 3F）。综上，C1QL1在体外和体内均能促进肿瘤微管的形成。 图3 C1QL1促进肿瘤微管形成 ｜4. C1QL1 在诱导神经元突触修剪的同时促进恶性突触形成 接下来，我们旨在明确胶质瘤来源的C1QL1是否会对神经元产生影响、以及其具体作用机制，因此对与载体对照组或C1QL1敲除组胶质瘤干细胞共培养的神经元进行了批量转录组测序。结果显示，与C1QL1敲除组胶质瘤干细胞共培养的神经元中，Fos、Junb、Arc等神经元活化相关的即刻早期基因，以及Egr1、Egr4等神经元活性和可塑性相关基因的表达均显著下调（图 4A），提示胶质瘤来源的C1QL1可能会促进微环境中神经元的活性与可塑性。与之相符的是，与C1QL1敲除组胶质瘤干细胞共培养的神经元中，表达下调的基因显著富集于突触可塑性通路上调相关的基因集（图 4B）。 上述转录组测序结果，结合既往报道的C1QL1突触修剪功能，促使我们直接检测C1QL1对神经元突触的影响。我们将载体对照组或C1QL1敲除组胶质瘤干细胞的条件培养基（CM）加入原代皮质神经元的培养体系中，结果发现，经C1QL1敲除组胶质瘤干细胞条件培养基处理的神经元，其突触素阳性的突触斑点密度更高（图 4C）。而使用C1QL1-flag过表达（OE）胶质瘤干细胞的条件培养基处理神经元，会进一步降低突触密度，将该条件培养基按1:6稀释后，可逆转这一效应。为验证突触密度的降低是否伴随神经元电活动的改变，我们对经载体对照组或C1QL1敲除组胶质瘤干细胞条件培养基处理的神经元进行了钙成像检测。我们使用绿色荧光钙指示剂Fluo-4，记录了这些神经元的自发性钙瞬变（图 4D），结果发现，载体对照组条件培养基处理组的钙瞬变幅度与频率，均显著低于C1QL1敲除组条件培养基处理组（图 4E）。综上，这些数据证实，C1QL1可诱导神经元发生突触修剪，进而导致神经元-神经元间的电传递减弱。 为验证C1QL1是否能促进神经元-胶质瘤恶性突触的形成，我们将表达突触后标志物PSD95-GFP的胶质瘤干细胞与神经元共培养，并沿人巢蛋白标记的肿瘤微管，定量分析了与神经元突触前标志物突触素共定位的PSD95-GFP阳性斑点的占比（图 4F）。结果显示，C1QL1敲除组胶质瘤干细胞形成的、突触素与PSD95-GFP共定位的恶性突触占比，仅为载体对照组的约50%（图 4F）。为可视化观察神经元突触修剪与恶性突触形成的动态过程，我们采用了既往报道的 “哺乳动物突触伴侣GFP重组系统（mGRASP）”，该系统基于分别锚定在突触前、突触后膜上的两段互补的非荧光拆分GFP片段构建。当分别表达其中一段片段的神经元与胶质瘤细胞，在突触间隙两侧紧密贴合时，拆分的GFP片段会发生结合，重建出有荧光的GFP，从而实现对神经元-胶质瘤突触的特异性可视化。我们对神经元-胶质瘤干细胞共培养体系进行了活细胞成像，观察到GFP阳性的恶性突触出现的同时，邻近的、由神经元PSD95-miRFP670nano3标记的正常突触发生清除，直接证实胶质瘤细胞在形成恶性突触的同时，会主动修剪正常神经元突触。 为验证BNI23和BNI21细胞在体内也能与神经元形成突触，我们在mCherry标记的胶质瘤干细胞皮质异种移植2~3周后，制备小鼠脑切片进行免疫电镜检测。在两种模型中，我们均能清晰地在突触结构的突触后侧，观察到免疫金标记的mCherry阳性胶质瘤细胞；约11%的胶质瘤细胞突起上可检测到神经元-胶质瘤突触（BNI23组267/2450，BNI21组37/316），且这些突触常与神经元-神经元正常突触相邻（图 4G）。C1QL1敲除后，恶性突触的占比下降了约50%（176/3128）（图 4H）。 我们进一步通过胶质瘤干细胞海马异种移植模型的急性脑切片全细胞膜片钳分析，验证了这些恶性突触具有电生理功能。我们在荧光显微镜下对mCherry阳性的胶质瘤细胞进行了膜片钳记录。在两种胶质瘤干细胞模型中，均能在胶质瘤细胞内记录到刺激诱发的兴奋性突触后电流（EPSCs），该电流可被NMDA/AMPA受体拮抗剂APV/CNQX完全阻断，洗脱拮抗剂后电流可部分恢复。记录到的电流的上升时间、衰减时间与时程，均符合兴奋性突触后电流的特征，而非既往报道的慢内向电流。我们观察到，C1QL1敲除或敲低组胶质瘤细胞的兴奋性突触后电流幅度显著降低，提示恶性突触的数量减少或传递强度下降（图 4I）。与之相反，在两种胶质瘤干细胞中过表达C1QL1，均会显著升高兴奋性突触后电流的幅度。综上，这些数据充分证实，C1QL1可诱导神经元发生突触修剪，同时促进有功能的恶性突触形成。 图4 C1QL1诱导神经元突触修剪，同时促进恶性突触形成 ｜5.C1QL1通过BAI3受体激活胶质瘤细胞与神经元中的Rac1信号通路 接下来，我们探究了C1QL1发挥肿瘤细胞内源效应与神经元微环境依赖效应的潜在分子机制。Flag标签标记的C1QL1蛋白可与其受体BAI3发生免疫共沉淀，而胶质瘤干细胞可表达BAI3蛋白（图 5A）。既往研究已证实，BAI3可通过激活Rho GTP酶家族的Rac1调控树突形态发生，而Rac1是调控细胞骨架重排与突触可塑性的核心信号通路分子。我们首先通过Rac1的GTP结合活性形式（Rac1-GTP）在总Rac1蛋白中的占比，评估了Rac1的活化水平。在两株胶质瘤干细胞系中，C1QL1敲除或敲低均可使 Rac1-GTP的占比降低40%~50%（图 5B）。 为明确C1QL1是否通过BAI3调控胶质瘤干细胞中的Rac1活性，我们在两株胶质瘤干细胞系中均敲低了BAI3的表达，并观察到Rac1活性随之下降（图 5C）。BAI3敲低可复刻C1QL1敲除或敲低对胶质瘤干细胞自我更新或增殖的抑制效应，而C1QL1/BAI3双敲除或双敲低并未产生额外的抑制作用。此外，胶质瘤细胞BAI3敲低后，体外培养的胶质瘤干细胞、以及胶质瘤干细胞异种移植肿瘤中的肿瘤微管长度均显著缩短（图 5D），与C1QL1敲除或敲低的表型高度一致（图 3E、F）。与之对应，接种BAI3敲低BNI23胶质瘤干细胞的荷瘤小鼠生存期显著延长（图 5E），而BAI3敲低的BNI21胶质瘤干细胞在异种移植后几乎无法成瘤。 为验证胶质瘤细胞BAI3敲低对胶质瘤-神经元相互作用的影响，我们在胶质瘤干细胞海马异种移植模型中，对胶质瘤细胞与瘤周神经元进行了电生理记录。结果发现，胶质瘤细胞BAI3敲低组中，记录到的胶质瘤细胞与瘤周神经元的兴奋性突触后电流（EPSC）幅度均显著降低（图 5F），提示恶性突触形成减少，同时瘤周神经元的过度兴奋状态得到缓解。这些数据证实，C1QL1可通过BAI3激活胶质瘤细胞中的Rac1信号通路，进而促进肿瘤微管形成与恶性突触发生，最终推动胶质瘤进展。 BAI3 在神经元中同样高表达。事实上，胶质瘤干细胞条件培养基中，胶质瘤分泌的C1QL1-Flag可与共培养神经元树突上的BAI3阳性斑点发生共定位（图 5G）。随后，我们检测了经胶质瘤干细胞条件培养基处理的神经元中Rac1-GTP的占比。结果显示，经C1QL1过表达胶质瘤干细胞条件培养基处理的神经元，其Rac1-GTP占比最高；而C1QL1敲除或敲低胶质瘤干细胞的条件培养基，可显著降低神经元中的Rac1-GTP占比（图 5H）。为明确C1QL1介导的神经元突触修剪是否依赖于神经元自身的BAI3，我们通过慢病毒感染，在体外培养的神经元中分别导入了乱序对照shRNA（shSCR-GFP与Bai3 shRNA-GFP。与既往报道一致，我们发现Bai3敲低的神经元初级树突分支增多。随后，我们检测了经载体对照组或C1QL1敲除组胶质瘤干细胞条件培养基处理后，这些神经元的突触密度。结果显示，经C1QL1敲除组条件培养基处理时，与野生型神经元相比，Bai3敲低神经元的整体突触密度有所下降，这与既往研究结果相符。值得注意的是，无论经载体对照组还是C1QL1敲除组的条件培养基处理，Bai3敲低神经元的突触密度均无显著差异；与之相反，乱序对照神经元经载体对照组条件培养基处理后，突触密度出现显著下降。这些结果证实，C1QL1可通过神经元自身的BAI3激活神经元内的Rac1信号通路，进而引发主动的突触修剪。 为明确肿瘤细胞内源效应与神经微环境效应之间的机制关联，我们将载体对照组、C1QL1敲除组的PSD95-GFP阳性胶质瘤干细胞，与Bai3敲低的神经元共培养，并对恶性突触的形成情况进行了定量分析。结果显示，C1QL1敲除组中，单个胶质瘤细胞形成的、PSD95-GFP与突触素共定位的恶性突触数量显著减少。由于神经元中的Bai3敲低已阻断了C1QL1介导的突触修剪，这一结果提示，C1QL1介导的胶质瘤细胞肿瘤微管形成，在恶性突触发生过程中同样发挥重要作用。事实上，有相当比例的C1QL1敲除胶质瘤细胞不表达肿瘤微管。若排除这部分细胞，仅对比带有肿瘤微管的载体对照组与C1QL1敲除组胶质瘤干细胞，二者的恶性突触形成占比无显著差异。 为验证体内环境中神经元Bai3敲低的效应，我们通过立体定位注射，利用腺相关病毒（AAV）在小鼠海马或皮层中实现了神经元特异性的乱序对照shRNA和Bai3 shRNA-GFP的表达。3周后，可在靶向脑区清晰观察到AAV-GFP的表达，同时在对侧脑区也能检测到标记的神经元投射；且Bai3敲低组中，GFP阳性神经纤维上的BAI3阳性斑点数量显著减少。此时，我们将mCherry标记的野生型胶质瘤干细胞异种移植至相同的脑区。电生理检测结果显示，神经元Bai3敲低后，记录到的胶质瘤细胞兴奋性突触后电流幅度显著降低，提示恶性突触形成减少（图 5I）。对于两株胶质瘤干细胞系，海马或皮层神经元的Bai3敲低，均能一致性地延长荷瘤小鼠的总生存期（图 5J）。这些数据共同证实，神经元中C1QL1-BAI3轴介导的突触修剪，可在体内促进恶性突触形成与肿瘤进展，且这一效应不依赖于其在肿瘤细胞中的内源作用。 图5 C1QL1通过BAI3受体激活胶质瘤细胞与神经元中的Rac1 ｜6. 全球首创Rac1抑制剂JK50561可破坏肿瘤微管，并逆转胶质瘤诱导的神经元突触修剪 鉴于C1QL1在胶质瘤细胞与神经元中均通过BAI3-Rac1轴发挥功能，我们接下来探究了靶向抑制Rac1活性，是否能同时阻断C1QL1介导的胶质瘤-胶质瘤、胶质瘤-神经元间的交互作用。基于我们既往在阿尔茨海默病（AD）模型中，针对Rac1依赖的遗忘机制开展药物筛选所发现的先导化合物，我们研发了全球首创的Rac1抑制剂JK50561。该抑制剂可竞争性阻断F -肌动蛋白与CORO1A/PAK1/RhoGDI复合物的结合（图 6A），从而破坏Rac1激活的细胞骨架依赖型正反馈环路，因此其作用机制与其他已报道的、靶向Rac1-鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）的Rac1抑制剂完全不同。JK50561可高效穿透血脑屏障，其在人神经母细胞瘤SY5Y细胞中抑制Rac1的半数最大抑制浓度（IC50）为63 nM，而SY5Y细胞是神经元研究中广泛使用的细胞模型。该抑制剂的效果显著优于经典的GEF靶向Rac1抑制剂NSC23766，也是目前唯一完成阿尔茨海默病II期临床试验（NCT05811442）的Rac1抑制剂。 我们首先证实，JK50561可有效抑制胶质瘤干细胞中的Rac1活性（图 6B）。中、高浓度的JK50561可抑制胶质瘤干细胞的自我更新和增殖能力，而低浓度无此效应。随后，我们在75 nM至50 μM的浓度梯度下，评估了该抑制剂对胶质瘤肿瘤微管的抑制效果，并与另一种强效GEF靶向Rac1抑制剂1A116进行对比。与二甲基亚砜（DMSO）对照组相比，两种抑制剂在50 μM、10 μM、5 μM 的高浓度下，均能缩短培养胶质瘤干细胞的肿瘤微管长度（图 6C、D）。但在150 nM、75 nM的低浓度下，仅JK50561仍能发挥显著的抑制作用（图 6C、D），说明在抑制胶质瘤肿瘤微管方面，JK50561的效果显著优于1A116。此外，JK50561处理可逆转胶质瘤干细胞条件培养基诱导的神经元突触修剪表型（图 6E），同时减少胶质瘤-神经元共培养体系中的恶性突触形成（图 6F）。综上，JK50561处理可破坏胶质瘤肿瘤微管、逆转胶质瘤诱导的神经元突触修剪，并抑制恶性突触形成。 图6 Rac1抑制剂JK50561破坏肿瘤微管， 挽救C1QL1诱导的神经元突触修剪与恶性突触形成 ｜7.JK50561治疗可延长GBM复发模型的生存期 为明确JK50561能否在体内有效抑制GBM复发，我们在GBM复发模型中开展了药物治疗实验（图 7A）。我们向胶质瘤干细胞中转染了超高灵敏度的荧光素酶报告基因AkaLuc，从而能够通过纵向生物发光活体成像，监测术后残留的少量胶质瘤细胞，追踪肿瘤复发情况（图 7A）。胶质瘤干细胞原位移植14天后（dpt），手术切除小鼠皮层的肿瘤组织，并通过活体成像确认切除效果（图 7A、B）。从术后第 1 天（dps）起，我们每日通过灌胃给予小鼠50 mg/kg 的JK50561，持续给药至小鼠终末期，对照组则给予溶媒对照（图 7A）。 JK50561治疗可有效抑制术后复发模型中的肿瘤生长，生物发光成像结果可直观反映这一效应（图 7B）。我们将每个时间点感兴趣区（ROI）的总生物发光值，以术后第1天的数值为基准进行归一化，计算倍数变化（FC），结果显示JK50561治疗组的肿瘤生长速度显著慢于溶媒对照组（图 7B）。在两种胶质瘤干细胞异种移植复发模型中，与溶媒对照组相比，JK50561治疗组小鼠的生存期均显著延长（图 7C），同时肿瘤体积和细胞密度显著降低，hNestin阳性的肿瘤微管结构被明显破坏（图 7D）。这些数据共同证实，JK50561在体内具有抗GBM复发的显著疗效。 为明确JK50561治疗在体内对胶质瘤细胞、以及胶质瘤相关神经元的影响，我们对手术切除的原发肿瘤、以及溶媒对照或 JK50561治疗后的复发肿瘤，分别进行了单核RNA测序（snRNA-seq）（图 7E）。我们整合了所有样本的单核测序数据，区分了人源肿瘤细胞与鼠源肿瘤微环境（TME）细胞，并基于谱系标志物的表达对肿瘤微环境的细胞类型进行了注释。与原发肿瘤细胞相比，溶媒对照组的复发肿瘤细胞中，GAP43等肿瘤微管调控基因表达显著上调；上调基因显著富集于缺氧、血管生成、细胞生长、WNT信号等与肿瘤生长和干性相关的通路，以及肌动蛋白丝组装、轴突发生等与肿瘤微管或突触相关的通路（图 7F）。而在JK50561治疗组的肿瘤细胞中，GAP43的表达及上述促肿瘤通路均出现显著下调（图 7F）。 随后，我们通过生物信息学分析，从其余的肿瘤微环境细胞中分离出了肿瘤相关兴奋性神经元（ENs）（图 7E）。与原发肿瘤相关的兴奋性神经元相比，溶媒对照组复发肿瘤相关的兴奋性神经元中，突触或轴突发育、可塑性相关通路显著上调（图 7F），同时Fosb等神经元活性相关基因表达升高。与之相反，JK50561治疗可有效降低肿瘤相关神经元中Fosb的表达，以及突触可塑性相关基因与通路的活化水平（图 7F），这一结果也通过对浸润性胶质瘤细胞邻近神经元的FOSB染色得到了验证。综上，JK50561可通过同时调控复发过程中的胶质瘤细胞与胶质瘤相关神经元，发挥治疗效果。 放疗是GBM的标准治疗方案，因此我们在AkaLuc标记的胶质瘤干细胞异种移植小鼠中，完成手术切除后给予放疗（RT），随后分别给予溶媒对照或JK50561治疗，并通过活体成像监测肿瘤复发情况（图 7G）。与放疗+溶媒对照组、JK50561单药治疗组相比，放疗+JK50561联合治疗组的肿瘤生长速度最慢（图 7G），提示放疗与JK50561治疗具有协同效应。 图7 JK50561治疗可延长GBM复发模型小鼠的生存期 /讨论/ 新兴的癌症神经科学领域，已充分证实肿瘤-神经元的相互作用在肿瘤发生发展中的核心作用。然而，肿瘤细胞如何重塑宿主已有的神经环路，进而促进恶性突触形成，其机制仍未被完全阐明。既往两项研究提出，胶质瘤细胞可分泌GPC3、THBS1等促突触生成因子，进而驱动新突触发生；但这两个分子均仅在一部分间充质样（MES-like）细胞中表达，而非驱动胶质瘤浸润、介导胶质瘤-神经元相互作用的核心细胞亚群——神经祖细胞样（NPC-like）和少突胶质前体细胞样（OPC-like）细胞。本研究结果证实，除了诱导神经元形成新突触外，胶质瘤细胞还能通过C1QL1/BAI3信号轴，主动修剪宿主已有的神经元突触，进而促进恶性突触形成。这一发现，与出生后脑发育、学习记忆过程中的突触修剪现象高度相似。事实上，已有研究证实，在小脑发育过程中，C1QL1/BAI3介导的突触修剪与突触竞争，决定并维持了与浦肯野细胞形成突触的 “单赢家” 爬行纤维。因此，本研究结果揭示了一个被胶质瘤细胞劫持的关键神经发育程序。 除了神经元依赖的功能外，本研究还证实，C1QL1同时是GBM细胞形成肿瘤微管的必需分子。OPC-like/NPC-like型GBM细胞在脑内远端区域定植后，如何通过肿瘤微管与其他胶质瘤细胞、胶质瘤网络重建连接，此前一直未有明确答案。本研究结果支持这样一个模型：OPC-like型细胞可分泌C1QL1，促进邻近或远端的GBM细胞生长肿瘤微管，进而推动胶质瘤网络的扩张。因此，C1QL1是同时介导胶质瘤-胶质瘤、胶质瘤-神经元细胞间交互作用的关键信使分子。它在胶质瘤进展中的促癌作用，也与我们既往的研究发现一致，即在TNP人神经干细胞异种移植胶质瘤模型中，C1QL1的表达在胶质瘤发生过程中显著上调。 C1QL1一旦与其受体BAI3结合，便可同时激活胶质瘤细胞与神经元中的Rac1信号通路。Rac1作为细胞骨架重排的核心调控分子，已被证实与多种癌症特征密切相关。但既往研究主要聚焦于其在肿瘤细胞中的内源功能，如调控增殖、迁移与转移。本研究证实，C1QL1/BAI3介导的Rac1激活，不仅能促进胶质瘤细胞的肿瘤微管形成，还能诱导微环境中神经元发生突触修剪，进而推动恶性突触形成；这一结果凸显了Rac1是同时靶向胶质瘤-胶质瘤、胶质瘤-神经元相互作用的极具价值的治疗靶点。尽管神经元与胶质瘤细胞中的C1QL1-BAI3-Rac1信号均汇聚于细胞骨架重排通路，但二者产生的生物学效应存在差异，这可能与剂量依赖效应有关，即BAI3 在神经元中的表达水平远高于胶质瘤细胞。 尽管靶向Rac1在肿瘤治疗中极具前景，但受限于半数最大抑制浓度（IC50）过高、血脑屏障穿透性差、存在毒性或脱靶效应等诸多缺陷，绝大多数已报道的Rac1抑制剂仍停留在临床前研究阶段。本研究首次报道的JK50561，是一款非鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）靶向、全球首创的Rac1抑制剂，具有高效力、高血脑屏障穿透性的优势。该抑制剂是同类药物研发中的领跑者，已完成阿尔茨海默病的II期临床试验；而与其最接近的竞品MBQ-167（一种Cdc42/Rac1 双靶点抑制剂），目前仅处于活跃的I期临床试验阶段（NCT06075810）。JK50561已在I期临床试验中证实了其安全性，结合本研究临床前模型中的疗效数据，该药物在复发性GBM治疗中具有巨大的转化潜力。本研究结果提示，在未来的临床试验中，可基于C1QL1/BAI3的表达水平、或Rac1的活化状态对GBM患者进行分层，从而实现JK50561的个体化最优治疗。此外，我们预测，合并癫痫的GBM患者同样能从JK50561治疗中获益，因为这类患者体内的胶质瘤-神经元相互作用水平显著升高。 /临床意义与前景/ 本文首次明C1QL1-BAI3-Rac1轴是GBM复发的核心调控通路，完整解释了GBM如何劫持神经发育程序、整合进宿主神经环路实现浸润与治疗抵抗，为理解GBM的肿瘤-神经交互机制提供了关键理论依据。C1QL1高表达与GBM患者复发间隔缩短、复发后总生存期显著下降呈强相关，尤其对IDH野生型复发GBM具有明确的预后价值。 本文研发的首创非GEF靶向Rac1抑制剂JK50561，可高效穿透血脑屏障，同时阻断肿瘤-肿瘤、肿瘤-神经元双向交互，在GBM术后复发模型中可显著抑制肿瘤复发、延长生存期，且与放疗具有明确协同效应。本文证实C1QL1介导的神经环路重塑与神经元过度兴奋是GBM相关癫痫的核心诱因，而JK50561可逆转胶质瘤诱导的突触异常与神经元高兴奋性，为GBM合并癫痫患者提供了“抗肿瘤+控癫痫”的双重对因治疗方案。 基于JK50561已有的临床安全数据，可快速启动针对复发GBM的Ⅱ/Ⅲ期临床试验，尤其针对C1QL1/BAI3高表达的患者人群开展精准治疗，有望成为全球首个靶向GBM肿瘤网络与恶性突触的上市药物，改写复发GBM的治疗指南。 —— 推荐阅读 —— 1、胶质瘤诊断-治疗-复发的多组学研究 2、经静脉内和颅内注射GD2-CAR-T 细胞治疗 H3K27M 突变型弥漫性中线胶质瘤 3、IDH野生型胶质母细胞瘤的纵向多模态分析揭示了预后不同治疗反应背后的分子进化和细胞表型