Etranacogene dezaparvovec

摘要 重组腺相关病毒（rAAV）是最有前景的基因治疗载体之一。它由包裹遗传物质的蛋白衣壳构成。然而，在生产过程中，除了包含基因组的完整颗粒外，还会同时产生多种类型的颗粒，例如空颗粒（衣壳内未包裹DNA）、病毒碎片、受损病毒和病毒聚集体。据报道，空颗粒会引发不必要的免疫反应并降低转导效率。因此，客观评估含有基因组的rAAV颗粒含量的定量方法对于质量测量至关重要。在本研究中，我们开发了一种利用冷冻透射电子显微镜（cryo‑TEM）检测rAAV样本中空衣壳比例的技术。该方法不仅能精确定量空衣壳的百分比，还能对样本中其他不同类型的颗粒进行表征和分析。我们对特异性、精密度、准确度、线性和定量下限（LOQ）的综合评估，证明了冷冻透射电镜技术在定量分析rAAV空壳比例方面的优点。此外，本研究提供了一种全面、多维的方法，以增进对rAAV质量控的理解和实施。 1.引言 腺相关病毒（AAV）属于依赖病毒属，细小病毒科。AAV主要由两部分组成：一个二十面体衣壳和一个约4.7kb的线性单链DNA基因组，该基因组被衣壳包裹 [1,2]，但无法自主复制。AAV衣壳可与宿主细胞表面的特定受体结合，从而启动感染途径[3]。已有充分文献记载，不同的AAV血清型（如AAV1、AAV2、AAV5、AAV9等）可利用不同的受体[4–7]，并且AAV载体几乎可以携带所有类型的基因，包括小RNA以及CRISPR/Cas等基因编辑工具的组件9 [8,9]。 通过对AAV进行工程化改造，可以获得rAAV，以实现对不同细胞类型的特异性感染，从而提高基因治疗的安全性和有效性[10,11]。得益于其相对较高的安全性、广泛的宿主细胞范围、低免疫原性以及能够在体内长期表达外源基因的能力，rAAV已成为基因治疗领域应用最广泛的载体之一[10,12-14]。迄今为止，已有九种基于rAAV载体的基因疗法——Glybera、Luxturna、Zolgensma、Roctavian、Upstaza、Hemgenix、Elevidys、Beqvez/Durveqtix、Kebilidi[15-23]——获得批准，还有更多产品处于研发或临床阶段。在rAAV生产过程中，会产生多种类型的颗粒，例如完整颗粒（基因组完整包装在衣壳内）、部分包装颗粒（部分DNA片段包装在衣壳内）、空颗粒（衣壳内无基因组）、病毒碎片、受损病毒和病毒聚集体。除完整颗粒外，其他颗粒都可能影响最终产品的纯度，并可能降低病毒的’转导效率及治疗效果、引发额外的免疫应答、并增加总体病毒载量[24]。因此，对产品纯度，特别是空壳颗粒比例，进行快速准确的质量控制分析至关重要。 有多种技术可用于检测rAAV空壳比例，包括分析型超速离心(AUC)[25]，冷冻透射电镜[26]，负染电子显微镜(nsTEM) [27]，微滴式数字PCR/ELISA[28]，阴离子交换色谱(AEX)[29]，尺寸排阻色谱结合多角度光散射(SEC‑MALS)[30]，质量光度法(MP)[31]，和质谱(MS)[32]。各种技术的比较见表1。每种技术都有其独特的技术原理、优势和局限性。然而，除了基于电子显微镜的方法外，大多数这些技术无法直接揭示样品的真实形态和结构细节，并且通常需要相对较大的样品体积。 冷冻透射电镜技术是一种直观的直接表征技术。通过使用液态乙烷将样品快速冷冻在铜网上，冷冻透射电镜可将样品保存在非晶态的玻璃态冰层中，维持其天然状态[33]。对于rAAV的冷冻透射电镜图像，病毒衣壳内的DNA含量直接对应于病毒颗粒图像的灰度值。通过分析病毒颗粒的灰度分布，可以直接测量病毒衣壳内DNA的填充程度，从而区分并量化空颗粒、部分包装颗粒和完整颗粒的数量和比例。尽管先前研究表明冷冻透射电镜技术可用于表征rAAV的空壳比例[26,34–36], 但在当前良好生产规范(cGMP)条件下进行系统、全面的方法学验证仍然有限。本研究成功建立了一种基于冷冻透射电镜的rAAV空壳比例检测方法，并按照cGMP法规进行了多方面的方法学验证。经验证的方法为在制造工作流程中确保rAAV质量提供了标准化途径，并为基因治疗产品开发提供了实用框架。通过符合行业要求和监管期望，本研究推进了冷冻透射电镜作为生物制药应用中可靠分析工具的实用性。 2.材料与方法 2.1.rAAV样本 样品，包括高比例的空壳颗粒样品（HE，目录号：GPA‑rAAVx‑001）、高比例的全颗粒样品（HF，目录号：rAAV GPA‑rAAV‑Luc），以及用作空白对照的rAAV制剂溶液均购自uBriGene Biosciences。根据uBriGene Biosciences提供的数据，HE样品中空衣壳、部分填充、全填充、碎片化及聚集的百分比分别为94.12%、0.00%、3.28%、1.20%和0.00%。因此，HE的空衣壳比例为95%。类似地，对于HF样品，其百分比分别为0.00%、0.00%、98.80%、0.05%和1.15%，HF的空衣壳比例为0.00%。HE和HF的滴度通过ELISA测定，其值分别为8.0E+13 病毒颗粒每毫升和1.1E+13 病毒颗粒每毫升。为获得中等浓度的AAV标准品，我们首先用rAAV制剂溶液将HF样品稀释至1.1E+13 病毒颗粒每毫升。然后，将其与HE样品按体积比9:1、3:1、1:1、1:3和1:9混合，以获得空衣壳比例分别约为10%、25%、50%、75%和90%的AAV样品。系列稀释样品是通过用rAAV制剂溶液稀释HE获得的。样品详细信息如表2所示。 表1 常用定量腺相关病毒空衣壳比例的正交对比 表2 样品库存 2.2.冷冻透射电镜样品制备与数据采集 冷冻透射电镜载网的制备方法为：将3 μl样品滴加至经辉光放电处理、带有2纳米连续碳膜的多孔碳载网（Quantifoil Cu R1.2/1.3，300目，+2 nm碳膜）上，在4℃、100%湿度条件下吸滤4.5秒，随后使用Vitrobot Mark IV快速投入液态乙烷中。冷冻透射电镜数据采集于药明生物安全检测（上海）有限公司。显微图像通过配备Falcon3直接电子探测器的Glacios2（赛默飞世尔科技）获取。使用EPU软件进行自动数据采集（参数如下：像素尺寸：1.6 Å/像素，总剂量：30 e/Å2，离焦范围：3-4 μm）。对于每个载网，为确保取样的代表性，随机选择三个具有合适冰厚度的不同区域进行成像，所获取的所有图像及颗粒将用于后续的颗粒识别与空衣壳比例分析，确保从每个载网成像的rAAV颗粒总数超过2000个。冷冻透射电镜数据采集参数列于补充表S1。 2.3.空衣壳比例分析 根据冷冻透射电镜图像中观察到的灰度强度和形态特征，将颗粒分类为空颗粒或完整颗粒。空衣壳比例的计算方式为空颗粒数量除以计数的总颗粒数，以百分比表示。在空衣壳比例分析中，采用了双重审查方法。具体而言，由两名经过良好培训的检测工程师独立对图像中的空衣壳和完整病毒颗粒进行分类和计数，最终结果为两次测量的算术平均值。 3.结果 3.1.特异性检验 为测试其特异性，使用相同的参数对HE、HF以及rAAV制剂溶液进行了冷冻透射电镜成像和测试。理论上，在rAAV制剂溶液中不应观察到任何rAAV颗粒。与此假设一致，rAAV制剂溶液的冷冻透射电镜图像显示出一个连续且均匀的玻璃态冰层，未观察到任何rAAV颗粒（图1A）。对于HE和HF样本，rAAV样本呈现出均匀的球形结构。对于HE样本，空颗粒的衣壳未包裹基因组，因此在图像中显示为黑色圆圈，其衣壳与内部之间存在清晰的灰度边界（图1C）。对于HF样本，完整颗粒的衣壳包裹着基因组，在图像中呈现为均匀的黑色圆盘，衣壳与内部之间没有明显的边界（图?1D）。此外，少数颗粒表现出介于空衣壳颗粒和完整颗粒之间的特征，表明它们是部分包装的病毒颗粒。然而，本研究专注于空颗粒与完整颗粒群体的二元区分，因此这些颗粒被定义为其他颗粒，并在此工作的统计分析中予以排除。 3.2.耐用性统计实验 通过采集每个样本的图像集并直接识别颗粒类型，可以获得样品中的空衣壳比例。为确保分析的统计耐用性，我们研究了空衣壳比例值与病毒颗粒数量之间的关系，以确定提供耐用性统计所需的最低颗粒数。如图1B所示，当每个样本的颗粒数达到或超过2000个时，rAAV空壳比例表现出良好的稳定性。因此，在本研究中，每个样本的最低颗粒数设定为不少于2000个。值得注意的是，有报道称，冷冻透射电镜测得的空衣壳比例有时与分析型超速离心或其他技术测得的比例不同[36]，而颗粒数量不足很可能是主要原因之一。 图1.S11、S10和S7的冷冻透射电镜图像及耐用性统计检验。(A)rAAV制备缓冲液的冷冻透射电镜图像。(B)rAAV颗粒数量与空衣壳比例的关系图。(C)HE样本的冷冻透射电镜图像，白色箭头指示一个空颗粒。(D)HF样本的冷冻透射电镜图像，黑色箭头指示一个完整颗粒。 3.3.精密度实验 我们首先通过重复性实验评估了冷冻透射电镜检测rAAV空衣壳的可靠性，重点关注标准样本的空衣壳比例。在一致的操作条件下，我们对样本HF和HE进行了六次重复实验。对于HE，结果显示平均空衣壳比例为99.15%，相对标准偏差为0.49%。对于HF，这些值分别为1.67%和12.44%（补充表S2）。我们发现，与HE样本相比，HF的空衣壳比例相对标准偏差更大，这是由于HF中空衣壳颗粒数量极少。相比之下，HF样本表现出较高的相对标准偏差，主要是因为HF中空衣壳颗粒数量极低，导致平均空衣壳比例接近零，从而降低了相对标准偏差的参考价值。为解决此问题，我们还计算了标准偏差，发现HF样本的标准偏差为0.21%，这是一个相对较小的值，表明即使在极低的空衣壳比例下，冷冻透射电镜技术仍保持良好的重现性（补充表S2）。此外，这些发现与分析型超速离心获得的结果相当，后者报告当空衣壳百分比超过50%时，相对标准偏差为≤5 %，而当空衣壳百分比低于15%时，相对标准偏差较大[16]。两种技术都在可接受的限度内表现出良好性能，展示了其稳定性和可靠性。值得注意的是，HE和HF样本分别表现出极低和极高的空衣壳比例，这与样本分析证书中提供的分析型超速离心结果一致。 为评估方法的可靠性和实验室内重复性，针对HE样品由三名检测工程师员进行了三次重复性实验。三次重复实验的结果如图2A及补充表S3所示，其组间相对标准偏差为0.04%，表明该方法具有极佳的一致性，并对常规操作变化展现出良好的耐用性。 此外，还评估了重现性，以衡量该方法在不同实验室、由不同操作人员、使用不同仪器并在不同实验条件下应用时结果的一致性。在我们的研究中，两个不同实验室的操作人员组使用S4样本进行了重现性实验。三次重复实验的结果显示在图2B和补充表S4中。三次实验的平均空衣壳比例为49.13%，组间相对标准偏差为4.70%，表明在不同实验室间具有极佳的一致性。这些数据表明，冷冻透射电镜可作为AAV空衣壳比例放行检测的候选方法。 3.4.稀释准确度检验 为了评估稀释的准确度，我们分析了HE样品在四种不同稀释水平下的情况：1E+11 病毒颗粒每毫升、1E+12 病毒颗粒每毫升、1.1E+13病毒颗粒每毫升和8E+13 病毒颗粒每毫升（样本S1、S8–S10）。如图3A–D所示，样本浓度的降低导致每张图像检测到的颗粒减少。统计分析显示，这四个样本的空衣壳比例平均值为98.92%，组间相对标准偏差为0.57%（图3E和补充表S5），表明具有高度一致性和可靠性。因此，由于颗粒的灰度值保持一致（这对准确测定空衣壳比例至关重要），样品稀释不会影响使用冷冻电子显微镜检测空衣壳比例的准确度。对于低滴度样品，增加捕获图像的数量足以保持准确度。特别是，对于滴度超低至1E+11 病毒颗粒每毫升的样本，其空衣壳比例记录为98.14%，组间相对标准偏差为2.39%。该样本与其他三种稀释样品一起，表现出良好的数据一致性，详见补充表S5。因此，我们将最低检测限浓度设定为滴度1E+11 病毒颗粒每毫升，有效满足了该阈值及更高滴度的检测要求。这种方法确保我们的方法在一系列样本浓度范围内都具有稳健性和可靠性，为rAAV制剂中的空衣壳比例提供了可靠的测量手段。 3.5.线性实验 制备了理论空衣壳比例分别为95%、90%、75%、50%、25%、10%和0%的rAAV样本（S1–S7），共七个梯度。为确保空衣壳比例检测的准确性和可靠性，每个梯度样本均进行了三次独立的空衣壳比例测定。通过这些实验，我们计算了每个梯度样本的空衣壳比例、平均值、标准偏差和相对标准偏差（补充表S6）。基于这些数据，我们进一步对七个不同浓度梯度的平均空衣壳比例进行了线性方程拟合，并绘制了结果图。图4展示了由冷冻透射电镜测定的空衣壳比例与理论空衣壳比例之间的相关性，其线性回归方程为Y= 1=1.018*X‑0.4843，R^2值为0.9878。 3.6.准确度实验与定量下限确认 我们通过计算回收率评估了冷冻透射电镜方法检测rAAV空壳比例的准确度。回收率是通过将测得的空壳比例与理论空壳比例进行比较来确定的。理论比例是基于标准参考物质和精确的实验设计计算得出的，而测得比例则源自通过冷冻透射电镜检测获得的数据。理论空壳比例为95%、90%、75%、50%、25%和10%的样本，即样本S1– S6，接受了冷冻透射电镜的空壳比例评估。如表3所示，回收率范围分别为104.38-104.81%、93.34–97.93%、102.44–110.36%、92.30–99.62%、102.04–115.96%以及97.40–113.40%。这表明用于空壳比例检测的冷冻透射电镜具有高准确度，并能准确反映样本的空壳比例。 我们确定了用于检测空衣壳的冷冻透射电镜方法的定量下限。基于这些结果，该方法在所评估的空壳比例范围（10–95%）内是可靠的，确保了对空壳比例在此阈值内的样品进行准确检测。 图2.HE样本的中间精密度与S4样本的重现性。(A)HE样本的中间精密度。(B)S3样本的重现性。数据为平均值±标准差，n= 3 个生物学独立样本。 图3.使用冷冻透射电镜检测腺相关病毒空衣壳比例方法的稀释准确度验证。(A–D)四种不同稀释水平（1E+11 病毒颗粒每毫升、1E+12 病毒颗粒每毫升、1.1E+13 病毒颗粒每毫升和8E+13 病毒颗粒每毫升）的rAAV图像。(E)用于稀释准确度检验的HE样品四次重复性结果的百分比散点图。数据为平均值± 标准差，n= 3 个生物学独立样本。 4.讨论 本研究依据cGMP工作流程中采用的《分析方法验证》原则，即ICH Q2(R1)，成功开发了一种利用冷冻透射电镜技术检测rAAV空衣壳比例的方法[37]。利用冷冻透射电镜成像，实现了对玻璃态冰中病毒颗粒的快速、准确成像，从而能对空衣壳和完整颗粒进行精确表征与识别，并对空衣壳比例进行定量。该方法的高精密度通过多次平行实验中显示的低相对标准偏差得到了证明。此外，冷冻电子显微镜测得的不同测试样本的空衣壳比例，与空衣壳比例呈梯度变化的样本理论空衣壳比例之间存在极佳的线性相关性，这进一步验证了该方法的准确性。 图4.不同空壳率梯度的rAAV样本之间的线性关系。数据为平均值± s.d.，n= 3 个生物学独立样本。 表3 具有五种不同理论空衣壳比例的rAAV样本的回收率。 对于rAAV质量控制，特别是空衣壳比例的定量，冷冻透射电镜具有独特的优点。它是唯一能直接可视化天然AAV颗粒的技术，提供最高的分辨率（接近原子分辨率，单颗粒），并且与AUC相比具有相当的准确度（对于HF和HE样本，冷冻透射电镜测得的空衣壳比例与AUC结果接近）。与其他方法相比，它不需要离心[25]，染色[27]，或添加其他标记物，也不依赖于沉降系数或荧光等间接指标 [28,30]。此外，冷冻透射电镜适用于各种rAAV血清型[34]，以及较低的浓度和纯度，最小样本体积仅需3–10 μ微升。这不仅显著提高了实验的经济性，也增加了其可操作性，尤其在工艺开发的早期阶段。 除了量化空衣壳比例，冷冻透射电镜还能让我们识别更多其他类型的颗粒，例如变形/受损的颗粒/聚集颗粒，并且可以提供关于样本的更多关键质量属性信息，包括但不限于颗粒形态、尺寸、纯度、结构完整性（补充图S1A）、聚集程度、聚集体中空或完整颗粒的存在（补充图S1B）以及三维结构[26]。尽管冷冻透射电镜可以直接观察颗粒形态、尺寸和聚集状态等关键属性，但这些参数的详细定量分析方法学验证仍需进一步专门研究以完善。这些关键质量属性信息有助于促进工艺开发、衣壳工程设计和质量控制。例如，一个功能性的病毒颗粒不仅需要基因组，还需要衣壳结构完整性，不应受损、变形或聚集，而rAAV的三维结构可以揭示衣壳的表面结构和关键表位的构象，指导rAAV衣壳的修饰与进化。对于慢病毒等非球形病毒样本的表征，许多技术并不适用[25,30,38]（例如，分析型超速离心、SEC‑MALS），但冷冻透射电镜仍然完全适用。 得益于冷冻透射电镜仪器和算法的发展，冷冻透射电镜已被广泛用于解析蛋白质结构，以促进药物发现[39–42]。然而，其在rAAV质量控制方面的能力尚未被业界充分理解和采纳。一个挑战是如何将冷冻透射电镜技术纳入cGMP工作流程。与AUC类似，冷冻透射电镜设备昂贵且复杂，这使得将冷冻透射电镜方法应用于rAAV QC放行成本高昂且具有挑战性。为确保冷冻透射电镜方法在rAAV质量控制中的技术性能和cGMP合规性，有一些工作需要完成。除了安装确认、运行确认和性能确认、设备校准与预防性维护外，还应建立全面的员工培训和资质认证体系、详细的标准操作规程与文件，以及严格的质量控制体系。确保合格的操作员精通严格的cGMP标准，将提高实验的准确度和重现性。此外，开发自动图像处理软件以确保完整的数据完整性和符合21CFR第11部分要求，可以进一步提高效率和数据完整性。通过采用这些策略，可以优化冷冻透射电镜方法在rAAV质量控制中的应用，使其成为QC放行的可行选择。 5.结论 本研究结果充分证明了基于冷冻透射电镜技术的空衣壳比例检测方法在特异性、精密度、准确度和线性方面的优异性能，满足对AAV空衣壳比例进行定量检测的要求。该研究首次确立了冷冻透射电镜在1E+11的检测限，为该技术更广泛的应用奠定了基础。同时，我们进行了跨实验室重现性研究，以确保结果在不同平台和实验室间的高度一致性和可比性。这项工作推动了冷冻透射电镜方法在工业应用和监管接受方面取得关键进展。这些发现不仅证明冷冻透射电镜能够准确、快速地表征和量化rAAV等病毒载体的空衣壳比例信息，而且可以与其他技术（如分析型超速离心）结合使用进行正交验证。此外，它还能提供多维度的关键质量属性信息，包括但不限于形态和粒径，从而为rAAV等病毒载体的开发、质量控制和QC放行提供支持。 CRediT作者贡献声明 Lingyi Xu: 数据管理、形式分析、研究、方法论、资源、验证、可视化、初稿撰写、稿件审阅与编辑。 Jinhuan Chen：数据管理、形式分析、研究、方法论、资源、验证、可视化、初稿撰写、稿件审阅与编辑。 Wei Zhu: 数据管理。 Yaokun Zhao: 数据整理。 Fangfang Zheng: 数据整理。 Rong Du: 数据整理。 Yuwei Jiang: 数据整理。 Yidan Yang: 数据整理。 Yuanyuan Chen: 概念化、数据管理、资金获取、项目管理、资源、监督、验证、稿件审阅与编辑。 Yuanshu Dong：概念化、数据管理、资金获取、项目管理、资源、监督、验证、稿件审阅与编辑。 Zhengxi Zhang: 概念化、数据整理、资金获取、项目管理、资源、监督、验证、撰写、评审与编辑。 Yong Tong: 概念化、数据整理、资金获取、项目管理、资源、监督、验证、撰写、评审与编辑。 附录A.补充材料 补充图 S1. 通过冷冻电镜观察到的特殊重组腺相关病毒颗粒。（A）受损的重组腺相关病毒颗粒，其放大图像在虚线框内显示。（B）重组腺相关病毒聚集体（由一个白色箭头指示，其中可分辨出完整的颗粒和空的衣壳）。 补充表 S1. 冷冻电镜数据收集统计 参数名称 参数值 电子显微镜 Glacios 2 加速电压/kV 200 探测器 Falcon 3 发大倍数 92,000× 像素大小 /Å 1.6 电子吸收剂量 /e-/ Å2 30 离焦范围 /μm -3 ~ -4 收集的颗粒数 >2,000/样 补充表 S2. 利用冷冻透射电镜对空壳率检测的重复性检验 测试 HE   (S10) HF   (S7)  E% 平均值   %E 标准差 相对标准偏差  E% 平均值   %E 标准差 相对标准偏差 T1 99.85% 99.15% 0.48% 0.49% 1.39% 1.67% 0.21% 12.44% T2 99.42% 1.94% T3 98.40% 1.55% T4 99.14% 1.88% T5 98.93% 1.59% T6 99.13% 1.68% 补充表 S3.利用冷冻透射电镜对空壳率检测的中间精度检验 变量 重复 1 重复 2 重复3 组内平均值  %E 组内相对标准偏差 组间平均值 %E 组间相对标准偏差 操作者 1 99.43% 99.38% 98.93% 99.25% 0.28% 99.22% 0.04% 操作者 2 99.20% 99.41% 98.93% 99.18% 0.25% 操作者 3 99.77% 98.83% 99.14% 99.25% 0.48% 补充表 S4. 利用冷冻透射电子显微镜对空壳率检测的重复性检验 变量 重复 1 重复 2 重复 3 组内平均值 %E 组内相对标准偏差 组间平均值%E 组间相对标准偏差 实验室1 46.15% 47.06% 49.81% 47.67% 4.00% 49.31% 4.70% 实验室2 57.21% 51.81% 45.43% 50.95% 11.45% 补充表 S5. 冷冻透射电镜对空壳体比例检测的稀释准确性检验 样品 效价  (vp/mL) 重复 1 重复 2 重复 3 组内平均值 %E 组内相对标准偏差 组间平均值 %E 组间相对标准偏差 S8 1.0E+11 95.44% 99.62% 99.37% 98.14% 2.39% 98.92% 0.57% S9 1.0E+12 99.07% 98.77% 99.06% 98.97% 0.17% S1 1.1E+13 99.43% 99.20% 99.77% 99.47% 0.29% S10 8.0E+13 99.25% 99.14% 98.93% 99.11% 0.16% 补充表 S6. 利用冷冻透射电镜对空壳率检测的线性度检验 样品 重复 1 重复 2 重复 3 平均值 %E 标准差 相对标准偏差 S1 99.24% 99.57% 99.16% 99.32% 0.23% 0.22% S2 88.14% 84.77% 84.01% 85.64% 2.20% 2.57% S3 81.35% 76.83% 82.77% 80.32% 3.10% 3.86% S4 46.15% 47.06% 49.81% 47.67% 1.91% 4.00% S5 28.99% 25.51% 28.37% 27.62% 1.86% 6.72% S6 9.74% 10.80% 11.34% 10.63% 0.81% 7.66% S7 1.68% 1.55% 1.94% 1.72% 0.09% 11.52% 参考文献 [1] J.A. 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