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关注并星标CPHI制药在线今年3月24日是第28个世界防治结核病日，今年的主题是："你我共同努力 终结结核流行"。       结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一种慢性致死性疾病，近些年来，由于抗结核药物的大量使用，抗结核作用位点的突变，耐多药结核病（MDR-TB）和广泛耐药结核病（XDR-TB）成为控制和治疗结核病的重大挑战。       链霉素(streptomycin，SM)和对氨基水杨酸(p-amino salicylic acid，PAS) 是最早被发现并用于治疗TB的药物。随后，异烟肼(INH)的出现形成了" INH+SM+PAS"的三联疗法，基于患者的药源和耐受性，其中的PAS可选用氨硫脲(TB1)或乙胺丁醇(EMB)替换。1965年利福平(RIF)开始应用于临床后，相关研究发现"INH+RIF"可将治疗疗程减短到9个月，再进一步与吡嗪酰胺(PZA)结合使用能够使疗程减短至半年。此后，相关研究一直没有研发出应用于TB治疗的全新结构药物。近几十年来仅有强生公司的新型结核分枝杆菌ATP合酶抑制剂贝达喹啉（bedaquiline）和日本大冢公司的德拉马尼（delamanid）两种抗结核药物被批准上市，而目前已有耐药菌株出现及引起副作用的报道。因此，寻找新的抗结核药物作用靶点，开发新型抗结核药物迫在眉睫。（相关阅读：《新型抗结核药物的研究进展》）       结核病的防治和新药研发首先需要发现和阐明其致病菌关键生理活动的分子机制。其中，结核分枝杆菌的细胞壁合成过程、DNA/RNA合成和能量代谢过程被认为是理想突破口，许多抗结核药物和在研药物均作用于这些重要生理途径。       与细胞壁有关的药物靶点       结核杆菌的细胞壁具有独特的结构和组成，是病原体抵抗环境压力，免受抗生素杀伤和逃避宿主免疫反应的天然屏障。其结构和组成与革兰氏阳性/阴性细菌以及真菌都存在显著差异，结核分枝杆菌细胞壁组分肽聚糖(peptidoglycan, PG)、阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan, AG)、分枝菌酸(mycolic acid, MA)、脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan,LAM)等均是结构复杂的分子，其合成、运输、组装、调控等需要一系列酶和转运膜蛋白参与完成。破坏细胞壁的完整性不仅有助于杀菌药物的进入，还会严重地影响病原体的生存，故细胞壁合成通路中的关键蛋白被公认为是很好的药物靶标。       ①DprE(decaprenylphosphoryl-D-ribose 2'-epimerase)。DprE是由DprE1和DprE2构成的异二聚体，在D-核糖向D-阿拉伯呋喃糖(DPA)的转化中起重要作用，而DPA是合成细胞壁阿拉伯聚糖的唯一前体。目前研发的抑制剂主要针对DprE1，包括苯并噻嗪酮类、氟喹诺酮类和氮杂吲哚类，其中氮杂吲哚衍生物TBA-7371处于临床试验的第一阶段。       ②分枝杆菌膜蛋3(Mmp L3)。Mmp L3主要参与Mtb的脂质运输、聚合和机体免疫调节等功能，是近期发现的一类治疗药物靶点。到目前为止，大约有8类不同分子构型的具有抗菌活性的MmpL3抑制剂被发现，其中乙二胺类的SQ109已处于2b-3期临床试验阶段。该小分子对耐药菌株有很好的杀菌效果，具有极低的耐药突变率，有望成为新的抗结核治疗药物。       ③L-鼠李糖合成相关酶。L-鼠李糖连接细胞壁肽聚糖和阿拉伯半乳聚糖（AG）两种组分，通过抑制其合成，可以影响MTB细胞壁的正常合成及生存。由于人体内不存在L-鼠李糖，所以L-鼠李糖合成中相关酶可以作为具有较好选择性的药物靶点。L-鼠李糖的合成主要涉及4种酶促反应，参与反应的4种酶分别为葡萄糖-1-磷酸脱氧胸苷转移酶（RmlA）、dTDP-D-葡萄糖-4,6-脱水酶（RmlB）、dTDP-4-酮基-6-脱氧葡萄糖差向异构酶（RmlC）和 dTDP-4-酮-鼠李糖还原酶（RmlD）。其中Rml C因其结构的特殊和底物的高特异性，以及对辅酶因子无依赖性而在研究领域受到广泛关注，但目前尚无相关的抑制剂上市。       ④阿拉伯糖基转移酶。细胞壁阿拉伯糖基转移酶EmbA、EmbB和EmbC均是参与细胞壁阿拉伯聚糖合成的阿拉伯糖基转移酶，属于糖基转移酶超家族GT-C中的GT-53家族。其中，EmbA和EmbB参与阿拉伯半乳聚糖AG的合成，而EmbC参与脂阿拉伯甘露聚糖LAM的合成。Emb蛋白均是利用D-阿拉伯呋喃糖(DPA)作为阿拉伯糖供体，将阿拉伯单糖转移至特定的阿拉伯聚糖受体上，完成阿拉伯聚糖的延伸或者分枝。Emb蛋白的活性测试表明，乙胺丁醇可以抑制其活性，因而是这些蛋白的直接作用靶点。研究表明，结核杆菌中的Emb蛋白均是无法敲除的关键蛋白，而一线药物乙胺丁醇的临床耐药突变大多发生在Emb蛋白上，尤其集中在EmbB蛋白。       ⑤烯酰基载体蛋白还原酶。烯酰基载体蛋白还原酶(Inh A)在细胞壁脂肪酸合成方面发挥着重要作用，是一线药物异烟肼(INH)的一个关键作用靶点。INH属于一类前体药物，依赖于KatG酶将其激活，而KatG的基因突变会阻断该激活途径并导致耐药。因此现在许多研究聚焦于Inh A的"直接抑制剂"。三氯生(TCS)属于一类广谱抗生素，可对Inh A造成可逆、温和的抑制。       ⑥D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶A(D-Alanyl-D-alanine ligase A，DdlA)能在ATP的介导下促进D-丙氨酸(Ala)分子的二聚化，获得D-丙氨酰-D-Ala。其产物与肽聚糖(PG)的五肽生物合成相关，能显著影响Mtb细胞壁的正常功能。D-环丝氨酸(DCS)是DdlA的抑制剂，可抑制菌株的生长。       ⑦HspX蛋白。研究发现，在宿主巨噬细胞中，低氧水平会诱导分枝杆菌细胞壁中的HspX高度表达，表明它在TB感染的潜伏期中起着重要作用。由于治疗期间人体容易产生抗生素耐药性，因此通过接种疫苗进行早期预防是控制感染的有效途径之一。卡介苗(Bacillus calmette-guerin，BCG)是目前可用的唯一结核病疫苗。有学者通过编码融合HspX-PPE44-EsxV抗原，得到了一种新型DNA疫苗，并在BALB/c小鼠感染模型中测试，结果表明，HspX融合疫苗可以在小鼠体内诱导高水平的特定细胞因子，而且在BCG增强免疫方案中使用该DNA疫苗可产生大量的IFN-γ、IL-12和TGF-β等细胞因子，从而取得更好的疗效。       与DNA/RNA 合成有关的药物靶点       ①DNA回旋酶。DNA回旋酶由两个亚蛋白单元A（GyrA）和 B（GyrB）以异源四聚体的形式存在，DNA回旋酶在人体内不存在，但却是细菌生存的必需物质，抑制其作用可导致细菌死亡。氧氟沙星、左氧氟沙星和莫西沙星等喹诺酮类抗结核药物主要作用于结核分枝杆菌GyrA蛋白，阻止DNA 的复制和转录，从而杀死MTB。近年来，由于GyrA亚基易发生氟喹诺酮类耐药突变，药物研究及靶点筛选已转向GyrB亚基，相继出现了一些以GyrB 为靶点的药物，如苯并咪唑、尿素酶等。       ②RNA 聚合酶。RNA聚合酶在Mtb和真核生物中的结构存在一定差别。抗生素利福平(RIF)对快速增殖期和间断繁殖的Mtb 杀菌力都很强，与链霉素和异烟肼联用时可使它们的治疗效果增强RIF耐药性的产生主要是由 RNA 聚合酶 β 亚基的 rpoB 基因突变所致。       ③次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶。次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）是一种细胞质酶，在体内广泛存在，它不仅参与嘌呤碱基的补救合成途径，对 DNA/RNA 的合成起重要作用，而且关系到嘌呤类药物的代谢，是调控该类药物药理效应和毒性反应的关键酶，两种吡咯烷核苷磷酸盐是目前针对Mtb-HGPRT最有效的抑制剂。       ④胸苷酸激酶。胸苷酸激酶(TMK)是一种核苷单磷酸激酶，在嘧啶合成中起关键作用，对细菌的DNA合成至关重要。TMK可催化ATP和脱氧胸苷-5'-单磷酸(dTMP)之间的可逆磷酸化，产生ADP和脱氧胸苷-5'-二磷酸(dTDP)，并通过再次磷酸化得到胸苷5'-三磷酸(dTTP)。Mtb-TMK在人体中的低同源性使其成为潜在的药物靶点。通过高通量筛选和核磁共振的方法，发现了两类新型 TMK抑制剂，分别是氰基吡啶酮类和萘啶类。以往的TMK 抑制剂都是胸苷单磷酸类似物或者是含有胸苷单磷酸结构，而这两类化合物是非胸腺嘧啶核苷类 TMK抑制剂，对TMK具有较好的选择性。       与能量代谢有关的药物靶点       在近年的研究中，针对结核分枝杆菌能量代谢系统，特别是氧化磷酸化途径的靶标研究已成为研究者关注的热点。虽然病原菌的有氧呼吸与真核生物类似，都依赖于一系列蛋白质复合体，包括NADH、琥珀酸、细胞色素c氧化还原酶和ATP合成酶，但是其结构和组装形式与真核线粒体和革兰氏阳性/阴性细菌均存在显著差异，其独特的特点使相关复合物成为理想的药物靶点。       ①ATP合成酶。Mtb中的ATP合酶是一种含有多个亚基的跨膜蛋白复合物，参与几乎所有活细胞的能量代谢和部分细胞间的信号传递。由atpE基因编码的ATP合酶C亚基是抑制剂贝达喹啉的主要作用靶点。但基因突变导致的贝达喹啉耐受加上贝达喹啉所导致的心律失常及恶心、头痛一系列副作用，限制了其临床应用。对一系列双喹啉衍生物评估发现，贝达喹啉SAR衍生的TBAJ-587和TBAJ-876化合物在体外和小鼠结核病模型研究中均显示出其对TB的潜在疗效，目前两类化合物皆处于临床研究的第一阶段。       ②细胞色素bc1: aa3。Mtb的细胞色素bc1: aa3是由甲萘醌、细胞色素c、还原酶(bc1)和细胞色素aa3型氧化酶组成的复合体，主要在呼吸链中发挥电子传递效能，显著影响ATP的合成。咪唑并[1, 2-α]吡啶类化合物Q203是针对细胞色素bc1: aa3复合体中细胞色素b亚基 (the cytochrome b subunit， QcrB)而研发的抑制剂，目前处于临床研究的第二阶段。       ③莽草酸激酶。莽草酸途径的终产物是分支酸盐，是一种芳香族氨基酸和甲基萘醌等物质的前体。在该途径中起关键作用的是莽草酸激酶 (shikimate kinase，SK)，该途径只存在于细菌、真菌、藻类和植物中，人体内不存在该途径，所以此途径中的关键酶可以作为抗结核靶点。目前对SK 的研究大多数停留在通过计算机辅助药物设计，对天然底物进行结构改造指导合成底物类似物阶段，但合成的化合物与SK 的亲和力往往较好，也预示了SK作为抗结核药物靶点的广阔前景。       ④细胞色素P450酶系。细胞色素P450 (cytochromeP450， CYPs) 是一类具有混合功能的氧化还原酶，在细胞合成与分解代谢活动中发挥关键作用。许多细菌P450 酶系的酶不超过5种，大肠杆菌中甚至没有P450 酶系，而在MTB中P450 酶系却含有20 多种酶，表明其在MTB代谢中发挥着重要的作用，也表明其中的一些酶很有可能成为新的抗结核药物靶点。近年来，对MTB中P450 酶系CYP51、CYP121和CYP141的研究较多。氯法齐明(Cfz)被视作核心二线药物，体外鉴定结果显示其可有效抑制CYPs。       近年来，随着科学技术的进步和研究水平的提高，结核杆菌在分子水平上的生理功能得以精确阐释，多个药物和候选化合物的靶向作用机制得到了详细的阐明，相关的结合位点及其结合方式为新型抗结核小分子的开发提供了非常有价值的信息。相信不久的将来，对于这些靶点的新药开发一定会取得重要突破。       参考资料       [1]吴疆,崔嘉伟,薛云新,王岱.抗结核药物靶点的研究进展[J].中国抗生素杂志,2022,47(11):1119-1127.DOI:10.13461/j.cnki.cja.007423.       [2]王霞,朱宁屿,姜威,司书毅.抗结核药物靶点的研究进展[J].中国医药生物技术,2018,13(03):259-264.       [3]陈晓博,李俊.抗结核药物靶点的结构研究进展[J].自然杂志,2021,43(05):335-342.       作者简介：小泥沙，食品科技工作者，食品科学硕士，现就职于国内某大型药物研发公司，从事营养食品的开发与研究。      智药研习社近期课程报名来源：CPHI制药在线声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼点击阅读原文，进入智药研习社~