Tolfenamic Acid

经皮给药，这个被誉为 “无痛给药革命” 的技术，一直以来被角质层这座 “天然屏障” 所束缚 —— 传统认知中，只有分子量＜500 Da、具备适度脂溶性的小分子才能穿透皮肤。而如今，一类被称为 “离子液体” （ionic liquids，ILs）的特殊物质正在改写这一规则：它能让胰岛素、siRNA 等水溶性大分子轻松穿越皮肤屏障，为外用制剂和经皮吸收制剂的开发开辟了全新赛道。 作为室温下呈液态的有机盐，离子液体凭借可调控的物理化学性质、优异的增溶能力和生物相容性，正从化学实验室快步走进医药研发的核心舞台。本文将系统解析离子液体在经皮给药领域的技术突破、临床进展及未来潜力，为制药研发人员提供从基础到应用的全景视角。 01 经皮给药的 “痛点” 与离子液体的 “破局” 之力 痛点 经皮给药的优势早已被行业认可：无需承受注射疼痛、规避肝脏首过效应、实现药物长效缓释…… 但皮肤最外层的角质层，由角质细胞与细胞间脂质紧密排列而成，如同 “铜墙铁壁” 般阻断了多数药物的渗透。长期以来，能透过皮肤的药物被死死限制在 “分子量＜500 Da + 适度脂溶性” 的框架内，而当前医药研发的主力 —— 蛋白质、核酸、多肽等水溶性中大分子，几乎被挡在门外，只能依赖注射给药。 破局 离子液体的出现，为这一困境带来了转机。这类由有机阳离子与有机 / 无机阴离子组成的液态盐，通过调整离子组合可设计出无数种特性各异的溶剂。与水和有机溶剂相比，它不仅能显著提升药物的溶解度和稳定性，更能突破角质层屏障，让原本无法透皮的药物（即使是 hydrophilic macromolecules）顺利渗透。 更重要的是，离子液体的 “多功能性” 使其成为经皮给药的理想工具：既能作为溶剂溶解难溶性药物，又能作为吸收促进剂打开皮肤通道，还能稳定易降解的生物制剂。这种 “一站式” 解决方案，让它在止痛、抗炎、抗癌、糖尿病治疗等多个领域展现出巨大潜力。 02 经皮给药中的离子液体：从 “旧世代” 到 “新世代” 的进化 离子液体并非全新物质，但在医药领域的应用却是近十年的突破。根据成分和特性，可分为 “旧世代” 和 “新世代” 两大类，其安全性和适用性差异显著。 旧世代离子液体 潜力与局限并存 早期研究中，咪唑鎓（imidazolium）、吡啶鎓（pyridinium）等阳离子，与四氟硼酸根（tetrafluoroborate）、六氟磷酸根（hexafluorophosphate）等含氟阴离子组成的离子液体是研究热点。它们能有效改善药物溶解性，但存在两大短板：生物降解性差、毒性较高，且可能引发环境风险，限制了临床应用。 新世代离子液体 安全性与功能性的双重突破 为解决旧世代的缺陷，研究者将目光转向生物相容性更高的成分，推动了新世代离子液体的诞生： •氨基酸基离子液体：Ohno 团队以氨基酸为阴离子（如甘氨酸、丙氨酸），与 1-乙基-3-甲基咪唑鎓等阳离子结合，通过调整氨基酸侧链和化学修饰，可调控粘性、玻璃化温度等物性，生物相容性显著提升。 •胆碱基离子液体：Mitragotri 团队开发的 CAGE（choline and geranic acid）是典型代表。由生物体内天然存在的胆碱（阳离子）和香叶酸（阴离子）组成，不仅安全性高，还自带抗菌活性，已被广泛用于多种药物的经皮吸收研究。 •医用级离子液体库（ILTS）：MEDRx 株式会社建立的 ILTS 技术，精选已证实人体适用性的化合物组合，拥有 100-200 种离子液体库，可根据药物特性灵活选择，兼顾高安全性和高效性。 新世代离子液体的另一大优势是 “协同使用” 能力：可与水、油或微乳液复配，作为水层 / 油层成分增强药物溶解。例如，Goto 团队将离子液体与肉豆蔻酸异丙酯（油相）、吐温 - 80（表面活性剂）组成 IL/O 微乳液，显著提升了药物的皮肤渗透性。 03 离子液体的功能：溶解、稳定、促吸收 “三位一体” 离子液体在经皮给药中的核心价值，源于其在药物溶解、稳定和透皮促进三方面的独特作用，这些机制已被大量研究证实。 溶解辅助：突破难溶性药物的 “瓶颈” 多数药物（尤其是小分子化学药）因水溶性差难以制成制剂，离子液体通过多种分子间相互作用解决这一问题： •π-π 相互作用与氢键：含芳香环的药物（如心血管药 LASSBio-294）可与咪唑鎓阳离子的咪唑环形成 π-π 相互作用，同时与乙酸根等阴离子的氧原子形成氢键，溶解度显著提升。 •药物离子液体化：将难溶性药物直接转化为离子液体是更彻底的方案。例如，弱碱性药物阿米替林（amitriptyline）与脂溶性阴离子（如十二烷基硫酸根）结合后，可形成自组装纳米粒子，溶解度提升数十倍；弱酸性药物托芬那酸（tolfenamic acid）与脂溶性阳离子（如丁基十二烷基二甲基铵）结合，也能通过类似机制增强溶解。 这种 “量身定制” 的溶解策略，让许多 “躺平” 在实验室的难溶性候选药物重获开发可能。 稳定化：为生物制剂 “保驾护航” 蛋白质、核酸等生物制剂易受温度、酶、pH 影响而降解，离子液体的加入可显著提升其稳定性： •保护核酸：siRNA 易被皮肤中的 RNase 降解，而胆碱 - 磷酸二氢根离子液体可通过浓度依赖方式抑制 RNase 活性，同时提高 siRNA 的融解温度，增强热稳定性。 •稳定 DNA 与蛋白质：胆碱阳离子可与 DNA 骨架形成静电相互作用，并与小沟（minor groove）产生疏水作用，维持 DNA 结构稳定；对于蛋白质，离子液体可抑制 pH、热或振动引起的聚集和失活（如胰岛素在特定离子液体中可减少聚集）。 这一特性让离子液体成为 mRNA 疫苗、抗体药物等生物制剂经皮给药的 “保护伞”。 吸收促进：打开角质层的 “三重门” 角质层的细胞间脂质和角蛋白是药物透皮的主要障碍，离子液体通过多重机制突破这一屏障： •扰乱细胞间脂质：CAGE 等离子液体可抽出角质层中的脂质，同时增加其流动性，形成药物渗透通道；1 - 辛基 - 3 - 甲基咪唑鎓离子液体的短烷基链可在脂质膜疏水区域制造空隙，提升通透性。 •影响角蛋白：离子液体可改变角蛋白的排列结构，降低其对药物的阻碍（如含离子液体的微乳液可扰乱角蛋白定向性）。 •调节药物 - 皮肤相互作用：部分离子液体可阻断药物与皮肤成分的结合（如 zaltoprofen 与神经酰胺的氢键），促进药物在皮肤中的扩散。 这种 “多管齐下” 的促吸收机制，让大分子药物透皮从 “不可能” 变为 “常规操作”。 04 安全性：临床转化的 “红线” 与应对策略 离子液体的临床应用必须跨过 “安全性” 这道坎。其毒性与阳离子、阴离子的结构密切相关，需针对性评估。 阳离子：烷基链长度是关键 咪唑鎓、吡啶鎓等阳离子的烷基链越长，与生物膜的相互作用越强，膜损伤风险越高。例如，长链烷基咪唑鎓对皮肤角质形成细胞的毒性显著高于短链；而胆碱等天然来源的阳离子，毒性远低于传统咪唑鎓。 阴离子：脂溶性与水解性需警惕 阴离子毒性整体较低，但脂溶性高或易水解的阴离子（如三氰基甲烷根、硫氰酸根）毒性较高；而二甲磷酸根、乙基硫酸根等阴离子对成纤维细胞的毒性较弱。 安全案例与优化方向 • CAGE：兼具抗菌活性和低皮肤刺激性，对细菌杀伤强但对正常细胞毒性低，已进入临床研究。 • ILTS 技术：基于人体使用过的安全成分组合，毒性风险可控，相关贴剂已推进至临床。 • 评估标准：皮肤应用需重点关注角质形成细胞毒性，建议结合三维皮肤模型等体外模型综合评价。通过优化离子组合（如缩短烷基链、选用天然来源离子），可在保证功效的同时将毒性降至很低。 05 临床应用：从实验室到临床的 “突破清单” 离子液体经皮制剂的研发已从基础研究迈向临床，覆盖多个疾病领域，部分产品已接近上市。 疼痛与炎症：NSAIDs 的“透皮升级” 非甾体抗炎药（NSAIDs）是经皮给药的重点方向，离子液体的加入让其效率和安全性更上一层楼： • 依托度酸- 利多卡因离子液体：依托度酸水溶性差，与利多卡因形成离子液体后，溶解度提升 80 倍，透皮量显著增加，镇痛抗炎效果更持久。 • 布洛芬 - 氨基酸离子液体：布洛芬与甘氨酸、丙氨酸形成的离子液体，水溶性提升 5 倍以上，透皮性增强且无明显细胞毒性，适合长期外用。 ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪 皮肤疾病：从 “表面” 到 “深层” 的治疗 皮肤疾病的局部给药可减少全身副作用，离子液体让药物直达病灶： • 特应性皮炎：STAT6 是诱发炎症的关键因子，其诱饵 ODN（寡核苷酸）在 ILTS 技术辅助下透皮性提升 4 倍，可抑制 IL-4、IL-13 等炎症因子，缓解皮肤肥厚。 • 银屑病：NFKBIZ 是银屑病恶化的驱动因子，将其 siRNA 溶于胆碱 - 香叶酸离子液体后，透皮量增加 5 倍，可降低 NFKBIZ 表达，减轻红斑和角质细胞过度增殖。 • 皮肤感染：CAGE 不仅能促进头孢他啶（ceftazidime）透皮，还可直接抑制生物膜形成，单独或与抗生素联用均能显著增强抗菌活性。 癌症：经皮给药的 “精准打击” 皮肤相关癌症（如黑色素瘤）或体表肿瘤可通过离子液体经皮给药实现局部高浓度治疗： • 黑色素瘤：BCL-2 抑制剂 navitoclax 在胆碱 - 辛酸离子液体中溶解度提升 150 倍，虽透皮总量略低，但真皮中药物浓度更高，肿瘤局部疗效增强且全身毒性降低。 • 癌症疫苗：OVA 肽、WT1 肽等肿瘤抗原在离子液体辅助下可高效透皮，激活皮肤中的抗原呈递细胞，诱导特异性 CD8+ T 细胞应答，抑制肺癌等肿瘤生长（如 ILTS 制剂可同时促进肽抗原和佐剂 resiquimod 吸收，增强免疫应答）。 糖尿病：告别注射的 “长效控制” 胰岛素等多肽药物的经皮给药是糖尿病患者的福音： •胰岛素经皮制剂：胰岛素溶于 CAGE 后可保持二级结构，透皮后 4 小时内血糖降低 40%，作用持续 12 小时，有望替代部分注射制剂。 •诺比列汀（nobiletin）透皮：作为黄酮类降糖药，nobiletin 在 CAGE 中透皮性增强，可实现长期平稳降糖，适合 2 型糖尿病管理。 04 临床进展与未来展望：从 “单点突破” 到 “全面开花” 目前，离子液体经皮制剂的临床转化已取得阶段性成果： •MEDRx 公司：带状疱疹后神经痛治疗贴剂 Lydolyte 已完成临床，2023 年 3 月提交上市申请；替扎尼定（痉挛麻痹）、芬太尼（镇痛）贴剂进入临床。 •CAGE Bio 公司：CAGE 为主成分的 CGB400 治疗酒渣鼻样皮炎的临床研究正在推进。 未来，随着 AMED 等机构对 “中分子药物经皮 / 经肠吸收促进技术” 的投入，离子液体的应用将从经皮扩展到更多给药途径。同时，新型离子液体的设计（如响应性智能离子液体）、联合其他促透技术（如微针、电穿孔）或将进一步突破现有瓶颈。 对于制药研发人员而言，离子液体的价值不仅在于 “解决问题”，更在于 “创造可能”—— 它让原本因给药限制被放弃的候选药物重获生机，让复杂制剂的开发变得更简单高效。或许在不久的将来，“一抹就好” 的胰岛素、“一贴抗癌” 的靶向药，将成为临床常态。 离子液体在经皮给药领域的崛起，本质上是 “材料创新” 推动 “制剂革命” 的典范。从突破角质层屏障到稳定生物制剂，从实验室的分子设计到临床的贴剂应用，它正一步步改写经皮给药的 “规则手册”。对于制药研发人员而言，把握离子液体的特性与应用逻辑，或将在新一轮制剂创新浪潮中抢占先机。未来已来，离子液体与经皮给药的结合，终将为患者带来更安全、更便捷、更有效的治疗选择。 参考文献 1.Taro Shimizu, Hidetoshi Hamamoto, Tatsuhiro Ishida, Development and medical application of ionic liquid-based transdermal formulations, Drug Delivery System, 2023, Volume 38, Issue 3, Pages 230-238, 2.Gomes, J.M., et al., Chem. Soc. Rev., 48, 4317-4335（2019）  3.Ohno, H., et al., Acc Chem. Res., 40, 1122-1129（2007）  4.Fukumoto, K., et al., J. Am. Chem. Soc., 127, 2398-2399（2005）

摘要：宫颈癌和其他恶性恶性肿瘤被认为主要是由持续性人类乳头瘤病毒（HPV）感染引起的。历史上，针对产生中和抗体的病毒的疫苗接种一直是管理病毒性疾病的一种经济有效的方式。通过HPV疫苗接种，宫颈癌风险有所降低，但并未完全消除。由于疫苗在全球范围内的普及，几乎90%的HPV感染已成功避免。然而，对于已经存在的病变和疾病，尚未显示出明显的治疗方法优势。因此，需要治疗性疫苗来引发针对已建立的感染和癌症的细胞介导的免疫反应。mRNA疫苗因其在工业生产、安全性和有效性方面的优势，在抗击病毒性疾病和恶性肿瘤方面展现出巨大潜力。此外，考虑到生产速度，mRNA疫苗在针对HPV的治疗方面展现出前景。鉴于HPV编码的早期蛋白，包括致癌蛋白E6和E7，在HPV相关癌症和癌前病变中始终存在，并对HPV相关疾病的进展和持续具有关键作用，它们是治疗性HPV疫苗的理想靶点。本研究强调了HPV的作用机制和HPV相关癌症mRNA疫苗的作用机制、它们在临床试验中的最新进展，以及它们在治疗应用中的潜力，同时快速概述了当前mRNA疫苗的状态。最后，我们强调了mRNA HPV疫苗临床实践的一些困难，并提供了我们对这一迅速变化领域进一步发展的思考。预计mRNA疫苗将很快快速生产用于临床HPV预防和治疗。 1.引言 乳头瘤病毒是无包膜、二十面体、直径55纳米的微生物，具有大约8000个碱基对长度的环状双链（ds）DNA基因组。大多数高等脊椎动物，包括鸟类和哺乳动物，都含有它们，并导致皮肤和粘膜上形成肿瘤。超过一百种独特的人类乳头瘤病毒（HPV）基因型独特于人类物种和鳞状分层上皮。它们的恶性（鳞状细胞癌）和良性（疣、乳头状瘤、尖锐湿疣）肿瘤是谱系的两端。HPV是一种与宿主共同进化的庞大而历史悠久的病毒集合，它们在分层上皮的不同解剖区域复制。这些病原体在分裂细胞中表现出持续复制，通过劫持关键的宿主细胞过程操纵细胞环境，通过在宿主脱落的终末分化细胞中产生病毒粒子来逃避免疫检测，并且在分裂细胞中这样做。 尽管如此，大多数HPV会诱导潜伏和无症状的感染，除非宿主的免疫系统受到损害。到目前为止，几乎有450种独特的HPV菌株基因组已被分离和测序。超过90%的宫颈癌（CC）病例与HPV有关。多种因素，如地理变异、HPV基因型、正在研究的特定人群、HPV疫苗接种状态以及收集解剖样本的位置，都会影响HPV诱导癌症的发生和潜在机制。此外，预防措施和疫苗接种意识提升活动可能有助于降低HPV感染的发病率和流行率。与HPV相关的恶性肿瘤占所有头颈癌病例的一半以上，几乎占女性CC病例的全部。 几种安全有效的疫苗，包括葛兰素史克生产的二价疫苗Cervarix™和默克生产的四价疫苗Gardasil™和九价疫苗Gardasil9，已获得全球许可。尽管如此，低收入和中等收入国家（LMICs）脆弱的卫生系统基础设施使得对青少年女性进行双剂疫苗接种成为一个巨大的挑战。疫苗是避免这种全球传播和减轻急性和慢性感染的最经济可行的方法。在过去几十年中开发的病毒载体和基于核酸的疫苗平台具有提供解决上述疫苗挑战的潜力。非病毒载体提供的基于核酸的疫苗可以用来模仿感染或接种活微生物。 mRNA技术有潜力彻底改变传统的疫苗开发方法。mRNA的合成是通过转录合成的DNA模板发生的，该模板在全球传播编码免疫原的遗传序列后合成。一旦确定了抗原序列，只需要几周的时间就能在临床水平上创建和生产基于mRNA的疫苗。生产mRNA的过程是无细胞的，涉及体外转录（IVT）。实验室中可能有大量可用的材料来生成模板和转录物。此外，明确设计用于mRNA生产的设施应该具备快速生产针对多个目标的疫苗的能力，几乎不需要进行调整。 从商业角度来看，mRNA疫苗的体外转录反应非常高效，使其能够通过无细胞方法进行大规模制造和快速开发。值得注意的是，尽管与其他疫苗模式（例如，强烈的免疫原性和稳定性差，限制了它们在体内的使用）相比，mRNA疫苗仍然存在一些缺点，但通过修改和传递进步已经大大缓解了这些挑战，确保了体内的稳定性，并在诱导强烈的免疫反应和由长期功能导致的不可逆不良反应之间实现了平衡。针对COVID-19的mRNA疫苗是在这个平台上获得授权的首批生物制剂。它们的部署已被证明是在整个流行期间拯救生命的至关重要的干预措施。此外，研究人员已经报道了针对各种病毒的mRNA疫苗临床试验的显著进展，包括流感、HIV-1、呼吸道合胞病毒、尼帕病毒、寨卡病毒、人类巨细胞病毒和Epstein-Barr病毒。这些进展发生在mRNA平台的最初开发之后。到目前为止，临床使用中最先进的产品包括非复制型mRNA疫苗，它们包含化学修饰和未修饰的核苷酸基础。Moderna的mRNA-1273和Pfizer–BioNTech的BNT162b2都是经过批准的mRNA产品，包含由化学修饰的尿嘧啶基础组成的疫苗。 一种病原体感染（HPV）可以通过多表位疫苗（MEV）来预防和治疗，这种疫苗一直在以重组亚单位蛋白或mRNA疫苗的形式不断发展。由核酸疫苗组成的平台易于实施，快速保护，并能够引发有效的适应性反应。然而，通常需要采用方法来增强DNA疫苗的免疫原性，防止信使RNA（mRNA）分子的降解，并促进它们被免疫细胞的摄取。通过使用传递系统，使特定抗原的同化，并帮助调节免疫反应，可以绕过这个限制。 总之，关于HPV的核酸疫苗的研究有限，它们在动物实验中的有效性一直不一致。目前，由于其高度安全性和有效性，mRNA疫苗在疫情背景下越来越受到关注。因此，本研究努力将研究HPV的定制mRNA疫苗的各种属性、预防策略。 2.人类乳头瘤病毒（HPV）的特点 乳头瘤病毒是体积紧凑、无包膜、二十面体的病毒，直径为55纳米。它们拥有一个双链、环状的DNA基因组，长度约为8000个碱基对。这些肿瘤可能在包括哺乳动物和鸟类在内的多种高等动物中观察到，影响皮肤和粘膜。它们诱导的肿瘤种类多样，从非癌性生长如疣、乳头状瘤和尖锐湿疣，到癌性生长，主要是鳞状细胞癌。由于它们在生殖道引起严重的感染和疾病，大约40种这类病毒在公共卫生和医疗健康中变得非常重要。 宫颈癌是由一种或多种致癌型HPV的持续性感染引起的，在大多数宫颈癌患者中可以发现。已经鉴定并分类了200多种不同的HPV基因型，根据它们诱导癌症的倾向，被归类为高风险HPV（HR-HPV）或低风险HPV（LR-HPV）。在全球范围内，HPV基因型16、18、31、33、35、45、52和58尤其普遍地与侵袭性宫颈癌有关。同时，有记录表明HPV基因型在不同国家，包括同一国家内的地区的分布存在显著差异。 性传播疾病可以通过直接性接触传播，包括阴道、肛门和口交，由40多种不同的HPV引起。HPV通过在分层鳞状上皮中复制，引起多种恶性肿瘤。目前HPV生物学领域的科学努力集中在理解病毒与宿主之间的动态关系，这有助于HPV在组织中持续存在数年甚至数十年。 HPV根据L1开放阅读框（ORF）序列的变化被分为五个属，该序列包含主要衣壳蛋白的遗传信息。乳头瘤病毒的类型可以分为几个组：Alpha-HPV、Beta-HPV、Gamma-HPV、Mupapillomavirus（mu-HPV）和Nupapillomavirus（nu-HPV）。尽管大多数这些病毒属于Gamma-HPV、Alpha-HPV和Beta-HPV组。历史上对HPV的进一步区分是根据它们对粘膜或皮肤上皮的亲和力。因此，在文献中，Beta-和Gamma-HPV被描述为“皮肤型”，而Alpha-HPV仍被称为“粘膜型”。然而，越来越多的数据表明“皮肤型”HPV广泛分布在粘膜位置。根据国际癌症研究机构（IARC）的致癌潜力，Alpha-HPV被分为两个组：HR和LR，HR型HPV在其致癌能力上是独特的，因为它们作为头颈鳞状细胞癌（HNSCC）、外阴、阴茎和外阴癌的原因。更具体地说，口咽鳞状细胞癌（OPSCC）的发展主要归因于HPV。HPV在上述肿瘤中所占比例从25%（外阴癌）到几乎100%（宫颈癌和肛门癌）不等。特别是，HPV-16是与HPV相关的所有恶性肿瘤中最常见的形式，占与HPV-18联合的病例的60-90%。Beta-HPV存在于生殖器表皮的毛囊、额头、手背、臀部和臀部，构成它们的自然储库。然而，正如前面所述，Beta和Gamma HPVs的传播也包括皮肤以外的解剖部位，包括鼻粘膜、口腔和肛门。 HPV的基因组是环状的，大约7.9 kb双链DNA，有八个主要表达的蛋白编码ORFs，一个含有简单（AT）n和poly-T重复的基因间非编码区（NCR），以及一个上游调控区（URR）。ORFs被指定为E6、E7、E1、E2、E4、E5、L2和L1（按5′-3′列出），基于它们在病毒生命周期中的表达时间，其中“E”表示早期，“L”表示晚期。在感染的某些阶段，E8—一个序列通常为12 2/3密码子的长度—被剪接到E2以产生E8^E2，除了主要的ORFs。所有ORFs都作为多顺反子（multi-ORF）mRNA表达，并位于正义（正向）链上。两个聚腺苷酸信号，病毒早期（pAE）和病毒晚期（pAL），可以用来将所有乳头瘤病毒的基因组划分为三个不同的区域：一个URR，一个早期（E）和一个晚期（L）基因区域。由于HPV不产生自己的RNA聚合酶，它依赖于宿主RNA聚合酶II的转录。因此，病毒启动子的功能完全由宿主和病毒的染色质修饰和转录因子控制。使用宿主聚腺苷酸机制，来自每个启动子的病毒转录本随后在早期pAE或晚期pAL位点被聚腺苷酸化。pAE和HPV早期启动子在病毒生命周期的早期阶段变得活跃，而pAL和病毒晚期启动子在晚期变得活跃。更准确地说，将HPV基因组中的E6/E7基因整合到宿主的遗传物质中，然后由宿主表达这些基因，维持了一个与癌症形成相关的变化表型特征。HPV可以攻击粘膜并在子宫颈上改变细胞。这是由性传播疾病引起的。E6和E7癌基因对HPV感染至关重要。发现这些基因以识别HPV菌株，特别是HPV-16菌株，将具有重大影响，因为其出色的灵敏度；介电电化学生物传感器在其他病原体检测技术中脱颖而出。新数据显示E6和E7对于阻止宿主细胞对HPV的自然防御反应也至关重要。与其他生物学信号一起，E1和E2蛋白推动病毒传播。此外，E2已与细胞和病毒中的转录控制有关。经过几十年的研究，其他病毒蛋白的目的仍然未知（图1）。 图 1 人乳头瘤病毒（HPV）的遗传组成和组织结构。展示了 HPV-16 的遗传图谱的插图。开放阅读框（ORFs）由实心条表示。六个初始 ORFs（E1、E2、E4、E5、E6 和 E7）在上皮发育的不同阶段表达。L1 和 L2 ORFs 在高度分化的上皮细胞中活跃转录，这些细胞正在进行病毒 DNA 复制。三个正义链三核苷酸（密码子）阅读框代表了 HPV16 大约 7.9 kb 的环状双链 DNA 基因组。适当阅读框中的颜色矩形代表编码蛋白质的 ORFs。HPV 基因组的三个主要部分是长控制区（LCR）、早期和晚期区域，以及病毒进入宿主细胞后病毒蛋白产生的时机。早期部分主要编码调控蛋白，这些蛋白对于病毒的转录和复制以及细胞周期调控是必需的，这支持了 HPV 转化和获得永生的能力。两种病毒结构蛋白 L1 和 L2，需要用于衣壳形成，编码在晚期区域。大多数调控 DNA 序列，包括 DNA 复制的起始点以及增强子和启动子区域，这些序列对于病毒基因表达和基因组复制都是必需的，都位于 LCR 中。E8 完全编码在 E1 内，而 E4 完全编码在 E2 内。E4 蛋白被分类为调控蛋白，由早期病毒基因产生。E1、E2、E4、E5、E6 和 E7 蛋白负责在感染细胞中病毒基因组的复制和维持。早期和晚期启动子（p）的命名分别为 p97 和 p670，而早期和晚期多聚腺苷酸化位点（polyA）的命名分别为 polyAE 和 polyAL。 2.1.HPV疫苗接种方法 HPV疫苗是市面上最好的疫苗之一。它们是首批阻止通过性传播影响粘膜的病毒感染的疫苗，而无需特别增强粘膜免疫力。目前，中国市场为私人购买提供了五种不同的HPV疫苗类型：Cervarix®（进口的HPV-2）、Gardasil®（HPV-4）、Gardasil®9（HPV-9）、Cecolin®（国产HPV-2）和最近开发的一种国产二价疫苗，称为Waldrinvax™，重组HPV二价（16型、18型）。 2006年，第一种HPV疫苗获得了批准。所有疫苗都是为了预防HPV-16和HPV-18，这两种是导致与HPV相关癌症的主要类型。到了2020年，HPV疫苗已经成为全球100多个国家政府疫苗计划的一部分。HPV感染可以通过疫苗预防，治疗性疫苗接种提供了发展针对既存HPV感染和病变的细胞免疫的机会，以及阻止恶性肿瘤的传播。目前市场上的HPV疫苗基于病毒样颗粒（VLPs），这些颗粒自然来自L1主要衣壳蛋白。目前市场上的HPV疫苗（Gardasil、Gardasil 9和Cervarix）旨在预防HPV，由添加到其他物质中的基于L1的VLPs制成。九价疫苗Gardasil 9®于2014年获得批准，针对以下HPV菌株：HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-45、HPV-52和HPV-58。这三种已建立的疫苗使用真核生产细胞。 尽管如此，HPV疫苗市场仍在发展中，Cervavac，一种四价疫苗，刚刚在印度推出。基于VLPs，一种重组的、非感染性的L1 HPV衣壳蛋白组装，疫苗的工作方式相似。因为VLPs和引起感染的HPV病毒粒子具有相同的抗原，接触VLPs会触发强大的中和抗体反应，防止HPV被宫颈基底上皮细胞吸收。疫苗的有效性归功于这种体液反应。 一项全球双盲实验评估了九价Gardasil® 9疫苗在16至25岁女性中的有效性。招募了超过14,000名志愿者，与之前的研究不同，对照组接受了四价Gardasil® HPV疫苗接种。疫苗针对与HPV-31、HPV-33、HPV-45、HPV-52和HPV-58相关的高级别宫颈疾病（即四价疫苗未覆盖的HPV亚型）的有效性为97.1%；九价组每10,000人年有0.5例，而四价组有18.1例。两组参与者在与HPV-6、HPV-11、HPV-16和HPV-18相关的HPV异常方面相似（即四价疫苗覆盖的HPV亚型）。此外，九价疫苗显示出长达五年的抗体反应，其针对HPV-6、HPV-11、HPV-16和HPV-18的免疫原性与四价疫苗相似。科学家认为，九价疫苗可能通过提供更广泛的覆盖面和对所有疫苗HPV亚型持续高效，能够预防更多的CC发病。 VLPs引起大量病毒粒子中和抗体，并在视觉上类似于真正的病毒。GSK和默克公司是开始HPV疫苗商业开发的两家公司。GSK生产了Cervarix，一种包含HPV-16和HPV-18 VLPs的二价疫苗。默克公司创造了第一种四价疫苗Gardasil®，并在2006年获得批准。它针对HPV-6、HPV-11、HPV-16和HPV-18，并预防由HPV-6和HPV-11主要引起的生殖器疣（GW）。 两种疫苗的佐剂和病毒L1蛋白的生产细胞是进一步的区别。Cervarix和Gardasil的蛋白分别在酵母（Saccharomyces cerevisiae）和L1重组杆状病毒感染的昆虫细胞中生产。Cervarix®，一种针对HPV-16和HPV-18的二价疫苗，于2007年获得批准。虽然Gardasil包含一种铝盐佐剂（氢氧化铝磷酸盐），Cervarix具有一种名为AS04的专利佐剂，由氢氧化铝和3-脱酰化单磷脂A组成，是脂多糖的脱毒形式，以及一种Toll样受体四激动剂。后来，默克公司创造了Gardasil 9，一种与Gardasil相似的九价疫苗，但包含五种额外致癌类型的L1 VLPs：HPV-31、33、45、52和58。因此，Gardasil 9可能提供针对全球90%的CC病例的类型特异性保护。最近，中国、印度和其他国家的生产商已经开始开发L1 VLP HPV疫苗。WHO目前正在审查厦门万泰生物生产的二价疫苗Cecolin，包含HPV-16和HPV-18 VLPs。该疫苗于2020年在中国获得批准。大肠杆菌（E. coli）生产L1蛋白，疫苗包含铝佐剂。 在中国的许多地方，二价Cecolin®疫苗有效性研究在2012年和2013年包括了7,000多名18至45岁的女性志愿者。对照组接种了戊型肝炎疫苗。疫苗对与HPV-16或HPV-18相关的高级别生殖器疾病和慢性感染的有效性分别为100%和97.3%。为了进行亚组分析，参与者按年龄分为两组：27-45岁和18-26岁。Cecolin®疫苗正在进行加纳和孟加拉国的3期临床研究；预计将在2023年公布结果（NCT04508309）。 九价HPV（9vHPV）疫苗可以预防这些以及其他五种高风险HPV菌株（31/33/45/52/58），它们共同导致了大约90%的宫颈癌和其他与HPV相关的恶性肿瘤。90%的与HPV相关的生殖器疣（GW）由HPV-6和11引起，这些也可以通过4价HPV（4vHPV）和9价HPV（9vHPV）疫苗进行预防。为了预防特定的与HPV相关的疾病和恶性肿瘤，HPV疫苗最初在2006年（4vHPV）、2007年（2vHPV）和2014年（9vHPV）在临床研究中证明了它们的有效性、免疫原性和安全性后获得批准。年龄较大的成年人和青少年也在考虑进行补种疫苗接种。在欧盟，9价HPV疫苗推荐给9岁及以上的人群，没有最大年龄限制。它可以预防由特定类型的HPV引起的宫颈、外阴、阴道和肛门的癌前病变和恶性肿瘤，以及由特定HPV类型引起的生殖器疣。在美国，9价HPV疫苗被授权用于9至45岁的女性，以预防宫颈、外阴、阴道和肛门（前）癌症，以及口咽部和其他头颈癌和生殖器疣。它也适用于9至45岁的男性，以预防肛门（前）癌症、口咽部和其他头颈癌以及生殖器疣。成年人也可能从HPV疫苗中受益，尽管青少年是免疫的主要目标人群。无论成年人的HPV感染状态如何，美国免疫实践咨询委员会建议定期进行补种免疫直到26岁，并在45岁之前就HPV疫苗接种做出共同的临床决策。 全国范围内实施HPV疫苗接种经常面临挑战，例如对第二剂或第三剂的依从性差，以及缺乏足够的资金来提供HPV疫苗的全部剂量，特别是在低收入和中等收入国家。接种一剂HPV疫苗有可能解决这些问题，并有效地大大减轻这些挑战。在做出选择之前，拥有可靠和可衡量的关于单剂量HPV疫苗有效性的信息至关重要。系统综述比较了单剂量HPV疫苗（一剂）与两剂和三剂在预防感染和癌前发病率方面的效力。纳入本系统综述和荟萃分析的大多数研究提供了证据，表明单剂量HPV疫苗可以在长达8年的时间内产生HPV特异性抗体。这建立了免疫记忆，并表明单剂量在预防感染和癌前病变方面与接受两剂或更多疫苗剂量同样有效。然而，有关抗体为何对两剂或三剂没有类似反应的研究有限，且癌前病变的发生率和感染率均未显著降低。因此，需要进一步的研究和更长时间的研究来明确确立单剂量HPV疫苗的有效性（表1）。 2.2.mRNA疫苗工程 这些不同疫苗引起的免疫反应差异一直是众多研究的主题，特别是比较二价和四价疫苗的反应。大量的研究已经投入到检查抗体反应上，因为它们在介导对感染的保护中起着关键作用。尽管抗体浓度会降低，记忆免疫是通过特定记忆B细胞和T细胞的存在形成和维持的，但针对HPV抗原的细胞介导免疫在抗击HPV感染中仍然是一个关键组成部分。除了参与抗原呈递和早期防御的先天细胞外，细胞免疫还包括适应性反应，其中辅助性T细胞促进B细胞的产生和（重新）激活，从而促进高水平抗体的产生。已经证明，这三种疫苗都能针对不同的疫苗类型引发强烈的抗体反应；然而，二价疫苗引发了更显著的HPV16/18特异性血清抗体和更强大的B细胞反应。这主要归因于AS04佐剂，人们认为它能够刺激更有利的T1反应。对15至25岁女性的HPV 16/18 AS04佐剂疫苗的免疫原性的初步和随后的评估显示，针对HPV16和抗HPV18的总IgG抗体在第7个月达到峰值，在第18至24个月之间达到稳定，并在接种疫苗后长达76个月内保持稳定。通过使用伪病毒中和试验来测量中和抗体，进一步验证了高浓度功能性抗体。然后，在初次接种10年后，对15至55岁女性的血清中HPV16/18疫苗的长期免疫原性进行了评估，发现所有年龄组的抗HPV16血清阳性仍然很高。对于抗HPV18，15至25岁（99.2%）的血清阳性女性比26至45岁（93.7%）和46至55岁（83.8%）的女性更普遍。尽管这三种获批的疫苗在临床试验中对HPV感染和癌前病变表现出了可比的有效性，但它们在免疫原性上存在差异，这一点通过一系列试验得到了证实。在比较18至45岁女性和12至15岁女性中接种三剂Cervarix®和Gardasil®的头对头试验中，与Cervarix®相比，12至15岁接受Gardasil®治疗的女性的HPV-16抗体水平显著较低，尽管它们随时间达到峰值和下降的模式是可比的。与Cervarix®相比，Gardasil®的HPV-18抗体水平和血清阳性率显著降低。此外，记忆B细胞反应减弱，特别是对HPV-18，以及Gardasil®在接种疫苗后长达24个月内减少了HPV-16和HPV-18特异性CD4+T细胞反应。HPV预防性疫苗的目标是通过刺激机体的体液免疫产生中和抗体来预防HPV感染。然而，已经获得该病毒的有机体不能通过HPV预防性疫苗有效治疗。此外，由于病毒基因组整合到宿主基因组中，一些早期基因（E1、E2、E4、E5）和晚期基因（L1、L2）已经丢失，使得预防性疫苗对与HPV相关的癌前病变和恶性肿瘤无效。 截至目前，最广泛使用的疫苗是mRNA疫苗，已被证明是免疫治疗中的一个有希望的治疗方法。Malone等人在1989年展示了含有阳离子脂质（N-(1-(2,3-二油氧基)丙基)-N, N, N-三甲基氯化铵（DOTMA））的囊泡能够高效转染并在多种真核细胞中表达mRNA。随后，在1990年观察到小鼠骨骼肌细胞中体外转录mRNA的完整表达。这一事件标志着实用的体外mRNA表达的初始实例，证实了mRNA疫苗开发的可行性 。由于RNA的不稳定性、体内传递效果不佳以及容易引起过度的炎症反应，直到2000年代末，DNA基础方法的开发才成为优先事项。针对mRNA的疫苗是一种相对较新的疫苗类型，具有很大的潜力。mRNA结构由编码序列、3'聚A尾、5'帽结构以及5'和3'非翻译区（UTR）结构组成 。 众多研究表明，mRNA是不整合的（安全），并且新一代自扩增mRNA疫苗（saRNA疫苗）的自主复制能力非常高。影响mRNA疫苗相对较慢进展的重要因素是与DNA疫苗相比，它们的稳定性和传递效率不足。因此，经常使用传递载体，如DC载体、精蛋白、阳离子脂质传递系统和聚合物材料，将mRNA输送到体内。mRNA技术是传统疫苗甚至DNA疫苗的理想替代品，因为它提供了几个好处。与减毒或灭活疫苗不同，mRNA是精确的，因为它只表达特定的抗原并触发定制的免疫反应。 此外，它还诱导先天免疫系统，并刺激体液和细胞免疫反应。由于表达不需要核内进入，mRNA疫苗比基于DNA的疫苗更安全、更有效；随机基因组整合的可能性几乎不存在。此外，由于mRNA被细胞过程迅速分解并在两到三天内消失，编码的抗原表达只是暂时的。制造过程也受益于mRNA疫苗平台的适应性；编码抗原的修改不影响mRNA主干的物理化学性质，实现标准化生产。此外，使用体外无细胞转录反应进行生产减少了对病毒污染物和细胞衍生杂质的安全性担忧，这些污染物在其他平台上经常遇到 。 由于mRNA容易降解，稳定它可能增加表达。mRNA疫苗的表达和稳定性受多个变量影响。mRNA的稳定性和翻译效率直接受其结构特征的影响，包括CAP、聚(A)尾和UTR。为了使mRNA保持稳定，必须消除可能触发先天免疫反应并抑制细胞翻译并引起不良反应的mRNA 。细胞内的内质体或细胞质受体识别RNA，可能激活I型干扰素（IFN-I）途径，并促进促炎细胞因子和趋化因子的产生。这些信号分子导致抗原呈递细胞（APCs）的激活，进而触发强大的适应性反应。 与肽疫苗不同，mRNA疫苗不限制MHC单倍型。此外，由于mRNA与模式识别受体结合，mRNA疫苗有潜力作为自佐剂，这是由肽和蛋白质组成的疫苗所缺乏的特性。mRNA疫苗结合了遗传疫苗的未开发多功能性以及卓越的安全性和理想的免疫特性。mRNA疫苗不受MHC单倍型限制，可能基于原位蛋白生产，引发包括体液和细胞免疫在内的平衡免疫反应。此外，由于mRNA是最小且仅是暂时的信息载体，不与基因组相互作用，因此它是一个基本安全的载体。mRNA疫苗还提供了可能的最大发展灵活性，因为任何蛋白质都可以通过mRNA产生，而无需修改生产过程。结合在一起，mRNA提供了一个有希望的载体，可能成为革命性疫苗技术平台的基石（图2）。 图 2 mRNA疫苗对免疫激活具有双重影响。mRNA疫苗激发适应性和先天免疫。抗原呈递细胞通过内体中的TLR3和TLR7/8以及细胞质中的RIG-1、NOD2、LGP2和MDA-5检测外源性mRNA的内吞作用。这触发了强烈的IFN-I反应，刺激促炎细胞因子的产生，最终激活先天免疫（左侧）。为了激活有助于触发适应性免疫的CD4+和CD8+T细胞，由再内吞的mRNA转录的肽段在MHC-I或MHC-II分子上展示（右侧）。由mRNA编码的蛋白质的释放激活了B细胞。 为了使mRNA在细胞质中保持稳定，位于mRNA 5'和3'端的聚(A)尾和帽子是必需的。为了解决这个问题，可以通过树突状细胞转染、与聚合物、肽或基于脂质的载体结合、裸mRNA注射或将mRNA与基于脂质的载体结合来传递mRNA。mRNA疫苗传递系统将涵盖这四种材料类型——聚合物、肽、精蛋白和脂质——以及它们相应的传递方法。这将提高裸mRNA一旦被管理后的稳定性、有效性和安全性 。 此外，基于mRNA的疗法和疫苗是通过快速、无细胞的体外转录（IVT）生产的。合成mRNA是通过RNA聚合酶从已经准备好并线性化的质粒DNA（pDNA）模板转录而成的。所得的mRNA通常包含一个5'帽和一个模板编码的3'聚（A）尾。此外，必须从mRNA中清除反义和双链RNA，这些RNA可以触发先天免疫反应，抑制细胞翻译并引起不良反应。细胞内的内体或细胞质受体识别RNA，可能激活I型干扰素（IFN-I）途径，并促进促炎细胞因子和趋化因子的产生。这些信号分子导致抗原呈递细胞（APCs）的激活，进而触发强大的适应性反应。 mRNA疫苗与肽类疫苗不同，不限制MHC单倍型。此外，由于mRNA结合模式识别受体，mRNA疫苗有潜力作为自身佐剂，这是由肽和蛋白质组成的疫苗所缺乏的特性。mRNA疫苗结合了基因疫苗的未开发多样性、卓越的安全性和理想的免疫学特性。mRNA疫苗不受MHC单倍型的限制，可能引发包括体液和细胞免疫在内的平衡免疫反应，基于原位蛋白生产。此外，由于mRNA是最小且仅是短暂的信息载体，不与基因组相互作用，因此它是一个基本上安全的载体。mRNA疫苗还提供了可能的最大发展灵活性，因为任何蛋白质都可以通过mRNA产生，而无需修改生产过程。结合在一起，mRNA提供了一个有希望的载体，可能成为革命性疫苗技术平台的基石（图2）。 2.3.HPV中的mRNA疫苗 基于mRNA的治疗具有巨大的潜力作为临床疗法；然而，开发安全、高效和免疫抑制剂的生物活性剂输送方法将是实现这类药物的显著障碍。在mRNA疫苗的背景下，科学家们对mRNA进行了结构修饰，以提高其稳定性，并促进系统耐受性，以在炎症环境之外呈现抗原。治疗HPV感染的下生殖道的一个重大挑战是开发治疗性疫苗。开发治疗性疫苗对于医疗保健来说当然看起来是个好主意。然而，目前还没有这些疫苗用于临床。与预防性疫苗不同，治疗性疫苗旨在刺激特异性T细胞介导的免疫反应。这些设备是故意设计用来根除HPV感染后可能残留的任何肿瘤病变，例如尖锐湿疣，一种宫颈非典型增生。宫颈上皮内病变根据世界卫生组织女性生殖器肿瘤分类的第5版分为两类：高级别鳞状上皮内病变（HSIL），包括宫颈上皮内瘤变2级（CIN2）和CIN3，以及低级别鳞状上皮内病变（LSIL），为CIN1提供。根据研究数据，在10年的随访期后，20-30%的HSIL病例可能发展为侵袭性宫颈癌。目前，LISL的可用治疗包括切除病变和监测。LISL具有60%的自然回归率，病变持续率高30%，进展到HSIL的比率为10%。另一项元分析显示，21%的LSIL将发展为HSIL，0.15%的LSIL将发展为侵袭性宫颈恶性肿瘤，48%的LSIL自发清除。活体疫苗由病毒或细菌载体组成。李斯特菌、干酪乳杆菌和乳球菌经常用作基于细菌载体的疫苗。表达HPV-16 E7的重组干酪乳杆菌疫苗GLBL101c，在IIb期研究中显示了E7特异性免疫反应，并降低了CIN3病变。也在临床研究中研究了阿尔法病毒、腺病毒和牛痘病毒的有效性。然而，载体的潜在致病性和中和抗体的存在，限制了重复治疗，为在免疫受损个体中使用活体疫苗提供了困难。 研究人员确定，持续的HPV感染是女性癌症相关死亡的主要原因，迫切需要开发安全有效的治疗策略。比较了三种不同的mRNA疫苗模式，以评估它们针对与HPV-16感染相关的肿瘤在小鼠中的有效性。研究人员生产了自扩增mRNA封装在脂质纳米颗粒（LNPs）中，未修饰和核苷修饰的非复制mRNA疫苗，包含由1型单纯疱疹病毒糖蛋白D（gDE7）和HPV-16 E7致癌蛋白融合而成的嵌合蛋白。研究表明，任何三种gDE7 mRNA疫苗的单次低剂量接种都能激活特异性于E7的CD8+T细胞，产生记忆T细胞反应，可以阻止肿瘤复发，并消除不同发展阶段的皮下肿瘤。此外，在单次接种剂量后，gDE7 mRNA-LNP疫苗在两种不同的正位小鼠肿瘤模型中产生了强大的肿瘤保护。最后，比较实验表明，所有三种gDE7 mRNA-LNP疫苗都优于gDE7 DNA和gDE7重组蛋白疫苗。 进一步的检查发现，尽管mRNA疫苗因其针对传染病的免疫反应能力而得到认可，但它们对肿瘤微环境（TME）和次级淋巴器官中CD8+T细胞功能承诺的影响仍然不甚了解。这种理解的缺乏限制了它们在癌症免疫疗法中更广泛应用的潜力。一项调查旨在全面评估HPV E7蛋白（HPV mRNA-LNP）的免疫效应，这是一种HPV阳性OPSCC的肿瘤特异性抗原，编码在LNP封装的mRNA疫苗中。HPV mRNA-LNP疫苗接种在脾脏和TME中诱导了不同的免疫反应和疲劳模式。这种疫苗对CD8+T细胞的功能专业化有不同的影响，并激活了HPV特异性和总CD8+T细胞。同时给予免疫检查点阻断和HPV mRNA-LNP疫苗接种增加了HPV特异性CD8+T细胞，同时保持了它们的抗肿瘤能力，从而促进了额外的肿瘤退行。根据研究人员的发现，HPV mRNA-LNP疫苗接种和免疫检查点阻断的结合是HPV阳性OPSCC的有希望的免疫治疗策略。 正如他们调节细胞周期调控，包括HPV-16和18在内的特定亚型的HPV E6和E7蛋白与宫颈癌（CC）密切相关，根据另一项研究。这项研究的目的是检查由mRNA-HPV和非致癌性E6和E7蛋白组成的治疗性疫苗（mHTV）的潜在抗肿瘤特性。为此，疫苗被皮下和肌肉注射到C57BL/6j小鼠中，并评估了随后的效果。在皮下和正位肿瘤植入的小鼠模型中，mHTV疫苗显著增强了T细胞介导的免疫反应，并显著抑制了肿瘤发展，免疫细胞显著浸润到肿瘤组织中。在所有mHTV治疗的动物中，主要免疫后62天的肿瘤再移植阻止了肿瘤的发展。此外，TC-1移植在最后一次疫苗接种后160天显著抑制了肿瘤生长。mHTV诱导的恒河猴免疫产生了令人鼓舞的免疫反应。mHTV在非人灵长类动物中的免疫原性为其在人类中对抗与HPV相关的恶性肿瘤的潜在临床应用提供了有力支持。基于所有可用数据，mHTV显示出作为预防性和治疗性疫苗的潜力。 由于几个原因，致癌早期蛋白E6和E7是目前正在开发的HPV16治疗性疫苗最常针对的抗原。(1)由于E6和E7仅在癌前和癌症病变中大量表达，它们没有显著风险针对健康组织；(2)由于E6和E7对于转化和维持感染细胞是必需的，没有显著风险发生抗原丢失介导的免疫逃逸；(4) E6和E7的免疫反应已经在临床前和临床上描述；(3)没有发现针对E6和E7的中央耐受机制。目前，美国FDA尚未批准任何治疗性HPV疫苗。在这里，科学家们提出了一种编码HPV16早期蛋白E6和E7改变形式的mRNA基础疫苗。疫苗准备为基于MC3的脂质纳米颗粒（LNP），可以肌肉注射。根据体内和体外研究，翻译的mRNA是功能性的，并引起了对抗原的独特适应性免疫反应。接种疫苗的小鼠携带HPV16+病变表现出肿瘤生长减少，寿命延长，并发展了保护性免疫记忆。基于mRNA的治疗性疫苗有潜力为当前HPV16+HSILs的标准护理提供非侵入性替代方案，根据研究人员的说法。致癌早期蛋白E6和E7被广泛认为是HPV16疫苗策略的目标。如前所述，E6和E7可以通过删除和突变进行修改，以防止它们与p53和pRb结合，从而根除它们的致癌潜力。研究人员开发的HPV-16疫苗的mRNA中编码了一种高效的IgE信号序列。这个序列有助于表达一个融合蛋白，该蛋白包含修改后的E6和E7，由furin切割位点分隔。 根据另一项研究，抗击HPV的努力仍在通过开发基于重组蛋白的疫苗进行。主要衣壳蛋白L1，可能聚集在一起形成病毒样颗粒（VLP）并触发强烈的免疫反应，是免疫系统最常暴露的蛋白。Cervarix和Gardasil，两种主要获批且商业化的HPV疫苗，现在使用的是基于纯重组VLP的系统。以大肠杆菌为例，HPV L1蛋白可能在原核、真核、昆虫、植物和酵母系统中生产，等等。科学家坚持开发MEV的主要原因是其成本效益、高效率和安全性。目前，最有效的HPV疫苗是基于VLP的；这些疫苗可以使用各种表达系统生产。研究围绕比较使用两种广泛使用的酵母菌株Hansenula polymorpha和Pichia pastoris表达L1 HPV-52的重组蛋白，这两种菌株都已在疫苗的工业生产中使用。 反向疫苗学，一种生物信息学技术，也被研究人员用来创建替代的MEVs，用于重组蛋白和mRNA类型。与H. polymorpha相比，根据研究人员的发现，P. pastoris在批量系统中表现出更高程度的L1蛋白表达和生产效率。然而，在蛋白质诱导时，两种宿主都显示出稳定的整合和自组装VLPs的创建。研究人员已经开发出可以计算预测安全并具有显著免疫激活的疫苗。此外，它也可以在一系列表达系统中很好地工作。HPV-52疫苗的大规模生产可能基于这项研究对整体优化参数评估的监测。 根据另一项研究，SQZ-eAPC-HPV（eAPC）是一种自体的、HLA基因型不可知的、基于细胞的治疗性癌症疫苗，用于HPV，利用从SQZ-PBMC-HPV临床候选物（NCT04084951）中获得的制造和临床专业知识。Cell Squeeze®技术用于从外周血单核细胞工程化eAPC，同时传递五种编码全长HPV16 E6和E7蛋白、CD86、膜结合(mb) IL-2和mbIL-12细胞因子的mRNA。除了最小化已知的白细胞介素治疗毒性外，eAPCs可能通过促进共定位MHC-I抗原呈递（E6/E7）、共刺激（CD86）和细胞因子信号（IL-2/IL-12）来促进更强的T细胞激活和增殖。使用eAPC研究了基于多重mRNA的癌症疫苗创建的效果。 另一项额外的研究表明，HPV-16感染与多种恶性肿瘤有关。此外，它提供了强有力的证据，表明HPV-16的转化能力在很大程度上依赖于病毒致癌蛋白E6和E7的表达水平。具有诱导针对这些HPV-16抗原的持久和针对性免疫的治疗性癌症疫苗在实现永久疾病管理方面展现出巨大潜力。研究人员展示了静脉注射的癌症疫苗HPV-16 E7 RNA-LPX，由免疫药理学优化的抗原编码mRNA组成，在小鼠中启动和扩增抗原特异性效应器和记忆CD8+T细胞。接种疫苗的小鼠携带HPV阳性TC-1和C3肿瘤，这些肿瘤被HPV-16特异性T细胞和激活的免疫细胞密集浸润；这些细胞以促炎性、细胞毒性和免疫抑制性较小的方式定位。针对E7 RNA-LPX的免疫接种诱导了进展性恶性肿瘤的持久和全面缓解。循环中的高细胞毒性记忆T细胞保护肿瘤再暴露。此外，检查点阻断使抗PD-L1难治性肿瘤对E7 RNA-LPX免疫敏感。总之，研究人员的发现强调了HPV-16 RNA-LPX在减轻由HPV引起的恶性肿瘤方面的潜力。 根据不同的研究，CIN，CC的前体，主要由HR-HPV株感染引起。尽管预防性HPV疫苗非常有效，但由于可及性问题、缺乏知识或个人偏好，仍有许多女性面临CIN的风险。尽管环形电切术是许多CIN2/3患者的成功治疗，但它可能有严重的副作用，并没有完全去除潜在的HPV感染。因此，非手术治疗高级别CIN是一个未得到满足的医疗需求。 Nutcracker Therapeutics Inc.创建了一种名为mNTX-250的新型治疗性疫苗药物候选物，它基于mRNA。它包括包含在人类分化簇（hCD1d）框架中的HPV-16 E6/E7致癌蛋白，封装在LNPs中的免疫调节剂，以及工程化人类LIGHT（hLIGHT）和人类白细胞介素-12（hIL-12）。这项研究旨在比较mNTX-250，一种针对NTX-250的小鼠替代品，和NTX-010，包括非编码mRNA、小鼠IL-12和小鼠LIGHT，针对C3.43肿瘤中的HPV-16抗原的抗原特异性免疫记忆诱导、药效学和体内效果。在无肿瘤小鼠中重新引入TC-1肿瘤。mNTX-250治疗，分两次给药，不仅根除了用HPV16转化的已建立的B6 C3.43肿瘤，还提高了总体生存率，而且还产生了大量特异性于HPV16 E7抗原的T细胞。治疗后无肿瘤的小鼠重新引入了105个TC-1肿瘤细胞，这些是被HPV16 E6/E7转化的B6小鼠肺上皮细胞，经过mNTX-250或NTX-010治疗。尽管6/11只接受NTX-010治疗的肿瘤存活小鼠出现了TC-1肿瘤发展，但所有接受mNTX-250治疗且C3.43肿瘤完全根除的小鼠都完全排斥了TC-1肿瘤。在接受NTX-010治疗的小鼠中，TC-1肿瘤发展也产生了较少的特异性于HPV16抗原的T淋巴细胞。在C3.43肿瘤模型中，mNTX-250显示出强大的抗癌效果，并产生了特异性于HPV-16抗原的免疫记忆，足以保护宿主免受另一种HPV-16驱动的肿瘤的复发（表2）。 2.4.mRNA疫苗的优势和劣势 在动物模型中，mRNA疫苗构建已被多项近期研究显示，能够针对广泛的病原体提供保护，包括链球菌属、弓形虫、寨卡病毒、狂犬病、人乳头瘤病毒（HPV）、流感病毒、巨细胞病毒和埃博拉病毒。研究表明，基于mRNA的疫苗配方可能在动物中诱发强烈的免疫反应，即使接种剂量较低。当给予含有寨卡病毒前膜和包膜（prM-E）糖蛋白遗传信息的mRNA-LNP疫苗时，非人灵长类动物（NHPs）和小鼠显示出强烈且持久的免疫反应，以中和抗体的形式存在。这种抗体反应赋予了对ZIKV感染的无菌免疫。类似地，接受用LNPs配方的mRNA疫苗进行肌肉注射的NHPs，编码狂犬病病毒糖蛋白（RABV-G），产生了稳定一年的抗体滴度，并且能够增强。研究发现，接受含有H1N1pdm09流感病毒株的血凝素糖蛋白遗传代码的mRNA-LNP疫苗单剂量的NHPs，产生的抗H1N1-HI抗体水平至少与人类中认为具有保护性的抗体水平一样高，甚至更高。这些抗体水平也与一种名为fluad的许可的灭活流感病毒疫苗产生的抗体水平相当。这些动物研究的结果激发了相当大的热情。目前正在进行临床试验，以评估针对各种病毒疾病的mRNA疫苗，如新型冠状病毒（SARS-CoV-2）、狂犬病病毒、流感病毒、寨卡病毒、巨细胞病毒和呼吸道合胞病毒。然而，除了SARS-CoV-2试验外，这些临床试验都没有超过初始阶段。例如，一项研究表明，科学家已经创造了一种针对HPV-16的晚期肿瘤蛋白E6和E7的基于mRNA的疫苗。这些肿瘤蛋白在宫颈疾病的前体阶段HSIL中表达独特且丰富。研究人员的体外和体内调查确定，翻译的mRNA诱导了抗原特异性适应性免疫反应并且是功能性的。携带HPV-16+病变的小鼠在接种疫苗后表现出肿瘤生长抑制、寿命延长以及保护性免疫记忆的形成。鉴于上述发现以及针对SARS-CoV2的mRNA疫苗的显著临床成就，研究人员相信他们的基于mRNA的治疗性疫苗可以为现有的HPV-16+HSILs黄金标准提供一种替代的非侵入性治疗方法。 快速的制造周转和相对较低的生产成本是mRNA方式的额外优势。这些因素在Spikevax®和Comirnaty®两款旨在引发针对SARS-CoV-2 Spike蛋白保护性免疫的mRNA疫苗的成功中发挥了重要作用。此外，mRNA合成平台的多功能性得到了增强，因为mRNA有可能编码任何蛋白质或肽；因此，个性化疫苗不再是一个遥不可及的梦想。研究人员和其他HPV疫苗存在的两个限制是限制在单一基因型特异性抗原（HPV16的E6和E7）以及缺乏与其他HR-HPV基因型的重叠效力证明，这可能增强并扩大对HPV病变的免疫反应。目前针对E6和E7的疫苗旨在治疗与HPV16相关的病变患者。在Zhou等人的研究中，观察到患者来源的T细胞在暴露于表达疫苗蛋白的假定树突状细胞时表现出IFNγ反应。这增强了这项研究对于研究人员疫苗可能被转化的潜力的信心。C3.43 TME向细胞毒性特征的转变是另一个重要发现。通过分析接种疫苗的小鼠脾细胞的免疫原性，确定抗原刺激激活了细胞毒性T淋巴细胞而不是辅助T细胞。根据观察到的体液反应，不能排除对C3.43肿瘤细胞的消除贡献微不足道的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。由于E6和E7在宫颈转化上皮细胞内表达，我们疫苗引起的体液免疫反应不太可能以ADCC实施的形式具有任何实际意义。总之，我们的疫苗引起的免疫记忆，无论是独立还是与针对C3.43肿瘤抗原的预先存在的肿瘤反应相结合，都在所有完全反应者中导致肿瘤排斥，而不需要额外剂量。这一发现意味着Zhou等人的疫苗有效地建立了一个持久的屏障，防止复发或重新激活。然而，在接种E1、E2和E5的C3.43肿瘤携带小鼠中观察到的缺乏肿瘤抑制表明，E6和E7是疫苗诱导的免疫反应的主要目标，这比其他可能与疫苗无关的免疫反应更为普遍和保护性。总之，研究人员利用mRNA针对HPV-16的肿瘤蛋白E6和E7的治疗性疫苗显示出作为后续临床试验评估的候选物的潜力。在更大的动物种类中进行的进一步调查将为这种疫苗的临床转化潜力提供宝贵的见解。如果在人体受试者中有效，他们的疫苗可能作为生育年龄妇女中HSIL患者的手术干预的安全且较少侵入性的替代品。 大量的证据不仅表明mRNA有助于提高转染效率和延长蛋白表达时间，而且还揭示了区分mRNA与DNA的主要优势。mRNA的优势包括：(1) mRNA要发挥功能，不需要进入细胞核。一旦进入细胞质，mRNA就开始蛋白质翻译过程。相比之下，DNA必须首先进入细胞核，然后转录成mRNA。因此，DNA的效率不如mRNA，因为它的功能取决于细胞分裂期间核膜的解体。(2) 与病毒和DNA载体不同，mRNA表达编码蛋白是暂时的，不会整合到基因组中。由于其插入突变的可能性很小，它为制药公司和研究人员提供了卓越的安全档案。(3) 通过体外转录（IVT）合成mRNA是简单的。这个过程价格合理，可以迅速在各种治疗方式中实施。(4) 此外，从理论上讲，mRNA有潜力编码任何蛋白质，因此可以用来治疗几乎所有疾病。 此外，mRNA相较于其他基于RNA的HPV-16疫苗具有以下优势：(1) 将抗原E6和E7整合到一个单一的多肽中，消除了同时使用两种药物产品的需求。(2) 通过肌肉注射接种疫苗，从而确保患者的依从性和接受一个或多个剂量的意愿；(3) 在单一且适度的3微克剂量下显示出临床前效力，且没有表现出自我放大特性。 除了比传统疫苗具有许多优势和便利性外，这些疫苗还有一些缺点。mRNA疫苗对细菌病原体和病毒大流行有效。假设mRNA疫苗在临床上安全有效，会带来许多好处。其中一个主要好处是生产速度。由于合成产出，这个过程不需要卵或细胞。通过在发现免疫原的遗传序列几周内制造疫苗，可以组建临床组。mRNA技术使针对多个目标的疫苗快速合成成为可能，并促进了复杂蛋白质的表达，这些蛋白质否则具有挑战性或无法生产。RNA疫苗不具传染性，没有病原体突变风险，因为它们不包含病原体颗粒或灭活病原体。进一步使疫苗的细胞内传递复杂化的是体内游离RNA的快速降解。mRNA可以因其注射后迅速破坏而引发炎症反应。研究人员发现，通过用LNPs（微小的油滴）包裹mRNA，可以延长其寿命，这可以作为mRNA炎症反应的指标，同时传递传递。为了减轻这种潜在危险，信使核糖核酸疫苗被包裹在更大的分子中或包裹在颗粒或脂质体中，这有助于RNA链的稳定。mRNA疫苗的另一个缺点是罕见的副作用。疫苗信使核糖核酸链由于设计的外来序列与体内细胞产生的序列相似，可能会引发意外的免疫反应。 尽管将这些分子有效地转化为药物受到以下障碍的阻碍：（i）mRNA的巨大尺寸；（ii）其固有的不稳定性以及对核酸酶降解的敏感性；以及（iii）其激活免疫系统的能力。虽然mRNA的化学修饰有助于解决这些障碍中的一部分，但mRNA的细胞内传递仍然是一个重大障碍。要将基于mRNA的治疗转化为临床实践，需要保证mRNA在生理条件下稳定性的传递技术。特别是在大流行期间，它们的高效力、低成本和生产简单性使它们成为预防和治疗传染病的理想候选者。通过使用结合的佐剂或同时传递未结合的mRNA和佐剂结合的RNA，体外RNA转录过程中遇到的障碍在一定程度上得到了缓解。通过体外转录（IVT）在无细胞环境中产生，mRNA疫苗不涉及任何固有风险。此外，已经证明，对mRNA分子的化学修饰，包括改变的核苷和帽结构，对于解决与免疫原性、实现长期稳定性和促进体内精确高效蛋白质合成相关的问题是不可或缺的。鉴于其最小的不良效应概况和快速的生产过程，它作为疫苗的候选者显得非常具有前景。然而，重要的是要注意，并非所有看似黄金的东西都是黄金，正如疫苗接种者报告的严重反应原性和各种系统性副作用所证明的那样。这些不良影响正在改变人们对疫苗的态度，并助长了疫苗犹豫。尽管它们不常见，但过敏反应、抗体依赖性增强和死亡是最严重的不良反应。在储存和运输过程中的温度敏感性使其几乎无法进入像印度这样的国家。基于mRNA的治疗涵盖了广泛的应用，包括基因修饰、蛋白质替代疗法和疫苗接种。目前有数十种基于mRNA的疫苗候选正在进行临床前和临床开发，这表明基于mRNA的疫苗技术作为创造针对HPV及其相关恶性肿瘤的新型预防性和治疗性疫苗具有巨大的潜力。然而，将基于mRNA的治疗从实验室转移到病床边，仍然受到mRNA的巨大尺寸、电荷、固有不稳定性以及对酶降解的高度易感性所带来的众多挑战的阻碍。因此，由于需要增强的载体或药物传递系统，基于mRNA的治疗的有限适用性仍然存在。通过利用复杂的传递系统，可以绕过未修饰的mRNA所表现出的不充分稳定性、细胞特异性和翻译效率。尽管如此，许多已经进行临床测试的mRNA疫苗候选物是没有任何传递系统配制的。这表明需要对mRNA疫苗的传递系统进行额外的改进。目前mRNA传递主要涉及脂质体和基于脂质的纳米颗粒。此外，脂质-聚合物混合纳米颗粒和聚合物在成本效益、安全性、稳定性和转染效率方面显示出相当的潜力。通过各种纳米材料对mRNA的配方和传递的持续进展有可能增强mRNA在预防和治疗与HPV相关的恶性肿瘤中的适用性。 3.结论 尽管HPV是最常见的性传播疾病，但目前对于那些已经感染的人来说，尚无有效的治疗方法，所有可用的疫苗都是为预防疾病而设计的。考虑到目前全球有2亿人感染了HPV，显然开发一种能够根除感染和治疗疾病的疫苗至关重要。从本质上讲，针对HPV的治疗性疫苗的未来前景包括完善临床前模型、创建新的抗原靶点和开发更有效的佐剂。mRNA疫苗技术代表了疫苗开发领域的巨大进步。此外，当前的SARS-CoV-2大流行引起了人们对mRNA疫苗在应对新出现的威胁时的快速性和有效性的关注。最近证明，用LNP配制的自扩增（sa）RNA含有E7，也可以抑制啮齿动物中与HPV相关的恶性肿瘤。一个例子是非人类灵长类动物中mHTV的免疫原性，这提供了令人信服的证据，表明它可以在临床上用于对抗由HPV引起的人类恶性肿瘤。根据所有可用数据，mHTV作为预防性和治疗性疫苗具有潜力。相反，尽管旨在对抗传染病的疫苗通常是针对明确定义的抗原进行预防性接种，但大多数抗肿瘤疫苗直到肿瘤进展后才接种。此外，值得注意的是，癌症靶点抗原特征不清，包含有限数量的癌症特异性细胞表面抗原，并表现出显著的个体间异质性。此外，尽管针对病毒和恶性肿瘤的mRNA疫苗有许多好处，但它们仍处于起步阶段。安全是当前最重要的关注点。在设计mRNA疫苗时应考虑抗体依赖性增强。它们的预期应用将使用成本效益比进行评估。总之，适应性免疫反应的特性和强度可以通过调节先天免疫反应来影响。必须研究先天和适应性免疫系统之间的早期相互作用，以获得最佳、持久和增强的免疫反应，以及有效保护和限制炎症。尽管mRNA疫苗在临床阶段显示出有限的效力，但它们在临床前研究中总体上是有效的。未来的进一步发展将涉及调查额外的原位肿瘤模型，实施联合药物治疗，并开发新的抗原靶点（例如E1和E5），以增强mRNA疫苗的有效性。我们对mRNA疫苗有效治疗和预防HPV的潜力持乐观态度。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 转发分享福利：疫苗研发企业、科研院校和监管机构人员，前30位报名人员转发分享会议信息可免费参会（不含餐饮）报名后，扫描下方二维码加工作人员微信后，发送截图即可。 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 大会日程 已经确定的报告人 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。