Hydroxysafflor Yellow A

编辑：丹青 糖尿病认知障碍（diabetes cognitive impairment，DCI）是糖尿病患者常见的并发症之一，其特点是认知功能的逐渐下降，尤其是记忆、注意力和执行功能的受损[1]。随着全球糖尿病患者数量的增加，DCI的患病率呈上升趋势。流行病学数据和临床研究表明，高达50%的2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者会在一定程度上出现认知功能障碍[2]。DCI的发病机制复杂，涉及胰岛素抵抗、慢性高血糖引起的氧化应激、炎症反应以及脑血管病变等多种机制[3]。而现有的治疗策略主要集中于血糖控制及改善认知，针对DCI的特异性治疗手段仍然匮乏，且疗效有限。因此，开发新的治疗策略，改善患者生活质量，缓解医疗负担，已成为迫切的医学需求。 铁死亡是一种与铁代谢紊乱相关的新型细胞死亡方式，近年来被广泛研究并发现与多种神经退行性疾病和代谢性疾病密切相关[4]。持续高糖状态可导致氧化还原稳态失衡、脂质过氧化增强及铁代谢异常，进而诱导神经元损伤并促进认知功能下降[5]。在铁死亡的调控中，核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）信号通路具有重要作用。Nrf2作为细胞抗氧化应激反应的核心转录因子，可通过调控多种抗氧化基因维持细胞氧化还原稳态，同时在铁等金属代谢、脂质代谢及谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成中也发挥关键作用。此外，GPX4作为铁死亡的关键调控因子，通过GSH依赖性清除脂质过氧化物、维持细胞膜的稳定性，在抑制铁死亡中发挥核心作用，并被认为是Nrf2相关抗氧化调控的潜在下游靶点[6-8]。研究表明，槲皮素通过激活Nrf2/GPX4信号通路减轻氧化应激和脂质过氧化损伤，有效抑制神经元铁死亡，显著改善db/db小鼠的认知功能障碍[9]。此外，西格列汀等也可通过抑制铁过载和调控Nrf2/GPX4信号通路来抑制铁死亡，改善DCI[10-11]。因此，调控Nrf2/GPX4信号通路以抑制铁死亡，可能成为治疗DCI的潜在策略。 补阳还五汤出自王清任的《医林改错》，是活血化瘀的经典名方。补阳还五汤及其有效成分具有增强机体抗氧化水平、抑制炎症、调节糖脂质代谢、减轻神经损伤等多种药理学作用[12-13]。临床研究显示，补阳还五汤可在一定程度上改善糖尿病伴轻度认知损害患者的认知功能[14]。此外，补阳还五汤可通过减轻氧化应激、调节铁死亡相关因子进而改善糖尿病肾损伤[15]；还可通过激活Nrf2/GPX4信号通路，改善脑卒中后认知功能障碍[16]。上述研究证实补阳还五汤在改善糖尿病及其并发症与认知功能障碍方面具有突出潜力，但在治疗DCI中的具体机制尚不明确。尤其是其能否通过调控Nrf2/GPX4抑制铁死亡进而发挥神经保护作用，仍缺乏系统研究。因此，本研究通过建立DCI大鼠模型及高糖诱导的人神经母细胞瘤SHSY-5Y细胞损伤模型，从体内外2个层面探讨补阳还五汤通过激活Nrf2/ GPX4信号通路，减轻神经损伤，改善认知功能障碍的作用机制，以期为补阳还五汤防治DCI提供实验依据和理论支持。 1  材料 1.1  动物 SPF级雄性SD大鼠86只，8周龄，体质量（200±10）g，购自成都达硕实验动物有限公司，动物质量合格证号5120350006228。56只大鼠用于动物实验，30只大鼠用于细胞实验含药血清制备。所有动物饲养于陕西中医药大学中药药理实验动物房，室温20～25 ℃，相对湿度50%～60%，12 h/12 h明暗循环，自由进食饮水。动物实验经陕西中医药大学动物伦理委员会批准（批准号SUCMDL20240627001）。 1.2  药材 补阳还五汤由黄芪120 g、当归6 g、茯苓4.5 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、地龙3 g、桃仁3 g、红花3 g组成，饮片均购自陕西中医药大学校医院，经陕西中医药大学药学院中药鉴定教研室颜永刚教授分别鉴定为豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根、伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels的干燥根、多孔菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf的干燥菌核、毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根、伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎、钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum (E. Perrier)的干燥体、蔷薇科植物桃Prunus persica (L.) Batsch的干燥成熟种子、菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花，均符合《中国药典》2025年版规定。 1.3  药品与试剂 链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，批号20240402）购自北京博奥拓达科技有限公司；二甲双胍（批号A0202A24710）、JC-1线粒体膜电位检测试剂盒（批号A137250724）购自碧云天生物技术有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、GSH、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒（批号分别为20241113、20241115、20241114、20241113）购自南京建成生物工程研究所；亚铁离子（Fe2+）试剂盒（批号WE06P4463860）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）抗体（批号00168571）、膜铁转运蛋白1（ferroportin 1，FPN1）抗体（批号00140462）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号10028231）购自武汉三鹰生物技术有限公司；Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）抗体（批号BD06244484）、Nrf2抗体（批号BE03075304）、GPX4抗体（批号BE09305893）购自北京博奥森生物技术有限公司；溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）抗体（批号4000000753）、铁蛋白重链（ferritin heavy chain，FTH）抗体（批号3600010955）、转铁蛋白受体（transferrin receptor，TFR）抗体（批号3600010833）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；山羊抗兔IgG二抗（批号BST18K21C19E54）、超敏ECL化学发光液（批号20H11B71S）购自武汉博士德生物技术有限公司；DME/F12培养基（批号AL30836673）购自美国Gibco公司；胎牛血清（批号2422334）购自上海逍鹏生物科技有限公司；CCK-8试剂盒（批号20250913）购自苏州新赛美生物科技有限公司；Nrf2抑制剂‌ML385（批号281591）购自美国MCE公司。 1.4  仪器 JLBehv-MWMG型Morris水迷宫（上海吉量软件科技有限公司）；EPOCH2NS型酶标仪（美国BIOTEK公司）；Accu-Chek卓越型罗氏血糖仪（瑞士罗氏公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；Donatello型脱水机（意大利迪佩斯公司）；RM2016型组织切片机（上海徕卡仪器有限公司）；GC204005型冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；UPHW-Ⅱ-90T型纯水仪（成都超纯科技有限公司）；DYY-5D型电脑三恒多用电泳仪电源、DYCZ-TRANS2型转印电泳仪、DYCZ-24DH型双板垂直电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；Crx53型荧光倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）。 2  方法 2.1  补阳还五汤的制备 取黄芪120 g、当归6 g、茯苓4.5 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、地龙3 g、桃仁3 g、红花3 g，加入10倍量蒸馏水浸泡1 h后，煮沸40 min，趁热滤过；再加入8倍量蒸馏水，煮沸30 min，趁热滤过；合并2次滤液，浓缩即得补阳还五汤药液2.85 g/mL（生药量），常温冷却后4 ℃保存备用。参照《中国药典》2025年版一部，通过高效液相色谱进行含量测定，补阳还五汤药液中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮的质量分数分别为0.33、0.65、0.79、0.15、0.69、0.09 mg/g。 2.2  动物实验 2.2.1  DCI大鼠模型的建立、分组与给药 大鼠适应性饲养7 d后，参考课题组前期造模方法[17-18]，随机选取8只为对照组，给予普通饲料喂养；其余48只大鼠给予自制高脂高糖饲料喂养4周，4周后单次ip STZ（35 mg/kg）建立糖尿病模型。注射3 d后尾静脉取血检测大鼠空腹血糖，大于16.7 mmol/L视为糖尿病模型造模成功。造模成功后继续给予高脂高糖饲料喂养8周，通过水迷宫实验筛选认知功能障碍大鼠。将对照组大鼠逃避潜伏期平均值设为参照值，计算模型组逃避潜伏期平均值的相对增加比例。若该比例不低于20%，则认为造模成功[19]。将符合标准的大鼠随机分为模型组及补阳还五汤低、高剂量（7.125、28.500 g/kg，分别相当于临床剂量的0.5、2.0倍）组和二甲双胍（0.2 g/kg）组，每组8只，常规饲养。各给药组ig相应药物（0.1 mL/kg），对照组和模型组ig等体积蒸馏水，1次/d，连续给药4周，每周检测各组大鼠体质量和空腹血糖。 2.2.2  Morris水迷宫实验 给药结束后，采用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力。前5 d进行定位航行实验：将象限边缘设置标记点，第1象限里（目标象限）设置平台，为确保大鼠不能看见平台，水池中水面需没过平台。将大鼠分别从4个象限各放入水中1次，记录大鼠寻找平台时间（限时90 s），第6天进行空间探索实验：撤去平台，记录大鼠目标象限移动距离、停留时间及穿越平台区域次数。 2.2.3  取材及样本处理 水迷宫实验结束后，各组大鼠ip戊巴比妥钠麻醉，进行腹主动脉取血，4 ℃、3 500 r/min离心，分离血清，于−80 ℃冰箱保存。各组取3只大鼠全脑用4%多聚甲醛固定，其余大鼠取完整脑和海马组织，置于−80 ℃冰箱保存。 2.2.4  苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察大鼠海马组织病理变化 脑组织在4%组织固定液浸泡24 h后，石蜡包埋，切片脱蜡及水化，随后HE染色，洗涤切片，脱水透明，于显微镜下观察细胞损伤情况。 2.2.5 免疫组化法检测海马组织Nrf2、GPX4表达 取包埋后的大鼠脑组织样本制备切片，依次完成脱水与抗原修复处理。加入3%牛血清白蛋白在室温下封闭30 min，随后加入GPX4（1∶100）、Nrf2（1∶200）一抗，4 ℃孵育过夜；加入二抗，室温孵育50 min。PBS漂洗3次后进行DAB显色，复染返蓝，二甲苯透明，于显微镜下采集图像，使用Image J软件量化结果，统一调节图片阈值，定量检测目标蛋白阳性区域面积与总视野面积，计算阳性面积百分比。 2.2.6 大鼠血清中SOD、CAT活性及MDA、GSH水平的检测 取大鼠血清样品，置于冰上解冻。按照试剂盒说明书进行操作，检测大鼠血清中SOD、CAT活性及MDA、GSH水平。 2.2.7 脑组织Fe2+水平检测 取冻存脑组织，加入提取剂，冰上研磨，制备10%组织匀浆，离心取上清，按照试剂盒说明书操作，检测脑组织Fe2+水平。 2.2.8  Western blotting检测海马组织Nrf2/GPX4信号通路相关蛋白表达 取冻存海马组织，按照裂解液∶组织＝100 μL∶10 mg的比例加入RIPA裂解液，用组织研磨仪研磨成匀浆，12 000 r/min离心20 min，取上清，BCA法测定上清液蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭1 h。加入一抗，4 ℃孵育过夜；TBST缓冲液洗膜后，加入二抗，室温孵育1 h；洗膜后，通过ECL化学发光法显色，曝光后观察特定蛋白条带。以GAPDH作为内参，使用Image J软件测定目标蛋白的相对表达量。 2.3  细胞实验 2.3.1 细胞培养 SHSY-5Y细胞用含10%胎牛血清的DME/F12培养基，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。 2.3.2 补阳还五汤含药血清的制备 将30只SD大鼠随机分为空白组和补阳还五汤低、高剂量（7.125、28.500 g/kg）组，每组10只。空白组ig蒸馏水，其余各组ig补阳还五汤药液，1次/d，连续给药7 d。末次给药2 h后，腹主动脉取血，于室温静置2 h，3 000 r/min离心15 min，收集同组血清，56 ℃水浴锅灭活30 min，经0.22 μm微孔滤膜滤过除菌，−80 ℃保存备用。 2.3.3 葡糖糖造模浓度筛选 将SHSY-5Y细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，加入含不同浓度（40、80、120、260、200 mmol/L）葡萄糖的培养基处理细胞，对照组加入完全培养基，空白组不接种细胞不给药，每组3个复孔，37 ℃孵育24 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h后，采用酶标仪检测吸光度（A）值，计算细胞存活率。 细胞存活率＝(A实验－A空白)/(A对照－A空白) 2.3.4 细胞分组与给药 设置对照组、模型组及补阳还五汤低、高剂量含药血清组和补阳还五汤高剂量含药血清＋ML385组。对照组和模型组加入10%空白大鼠血清，补阳还五汤高剂量含药血清＋ML385组预先使用Nrf2抑制剂ML385（10 μmol/L）处理2 h[20]，随后补阳还五汤低、高剂量含药血清组和补阳还五汤高剂量含药血清＋ML385组加入相应剂量含药血清处理6 h。含药血清处理结束后，除对照组加入完全培养基，其余各组加入含160 mmol/L葡萄糖的培养基造模24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h后，采用酶标仪检测A值，计算细胞存活率。 2.3.5 线粒体膜电位检测 SHSY-5Y细胞以5×104个/孔接种于24孔板中，按照“2.3.4”项下方法进行分组和给药，PBS洗涤后每孔加入200 μL JC-1荧光探针染液（1 μmol/L），培养箱中避光孵育30 min，PBS洗涤3次，于荧光显微镜下观察并拍照。 2.3.6  SOD、CAT活性及MDA、GSH水平的检测 SHSY-5Y细胞以2×105个/孔接种于24孔板中，按照“2.3.4”项下方法进行分组和给药，按照试剂盒说明书进行操作，检测细胞内SOD、CAT活性及MDA、GSH水平。 2.3.7  Western blotting检测Nrf2/GPX4信号通路相关蛋白表达 按照“2.3.4”项下方法进行分组和给药，收集细胞，按“2.2.8”项下方法检测相关蛋白表达。 2.4  统计学分析 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，数据以表示。Morris水迷宫定位航行实验中逃避潜伏期采用重复测量方差分析，空间探索实验及其他指标各组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），若方差齐，则采用LSD检验；若方差不齐，则采用非参数检验。 3  结果 3.1 补阳还五汤对DCI大鼠体质量及空腹血糖的影响 如表1所示，对照组大鼠体质量整体呈缓慢上升趋势，而模型组大鼠体质量则呈现明显下降趋势（P＜0.01）；与模型组比较，补阳还五汤各剂量组及二甲双胍组大鼠体质量下降趋势均有所改善，其中给药第4周补阳还五汤高剂量组和二甲双胍组大鼠体质量显著升高（P＜0.05），表明补阳还五汤能够延缓DCI大鼠体质量下降速度。 如表2所示，对照组大鼠空腹血糖水平整体保持相对稳定，模型组大鼠空腹血糖持续升高（P＜0.01），且在后期升高更为明显；与模型组比较，自给药第2周各组大鼠空腹血糖水平均有所下降，其中给药第2周二甲双胍组大鼠空腹血糖显著降低（P＜0.05），给药第3周补阳还五汤高剂量组和二甲双胍组大鼠空腹血糖显著降低（P＜0.05、0.01），给药第4周补阳还五汤各剂量组和二甲双胍组大鼠空腹血糖显著降低（P＜0.01），提示补阳还五汤具有一定降血糖作用。 3.2  补阳还五汤对DCI大鼠学习记忆的影响 采用Morris水迷宫评估大鼠的空间学习记忆能力，结果如表3所示，在定位航行实验中，各组大鼠逃避潜伏期均随训练时间延长而呈下降趋势。与对照组比较，模型组自第3天起逃避潜伏期明显延长（P＜0.01），且至第5天仍维持较高水平（P＜0.01），提示模型组大鼠空间学习能力明显受损；与模型组比较，各给药组逃避潜伏期均有不同程度缩短，至训练后期已接近对照组水平，其中第3天补阳还五汤高剂量组和二甲双胍组大鼠逃避潜伏期显著缩短（P＜0.05），第4、5天补阳还五汤各剂量组和二甲双胍组大鼠逃避潜伏期显著缩短（P＜0.05、0.01）。 空间探索实验结果如图1所示，与对照组比较，模型组大鼠目标象限移动距离、停留时间及穿越平台次数明显减少（P＜0.01），表明其空间记忆保持能力下降；与模型组比较，各给药组大鼠目标象限移动距离、停留时间及穿越平台次数均明显增加（P＜0.05、0.01），表明补阳还五汤可改善DCI大鼠的学习记忆能力。 3.3  补阳还五汤对DCI大鼠海马组织CA1区病理变化的影响 如图2所示，对照组大鼠海马CA1区神经细胞排列紧密，形态完整，轮廓清晰，细胞核清晰可见；模型组细胞排列分散，间隙增大，边界模糊，大量核固缩，细胞坏死增多；与模型组比较，补阳还五汤各剂量组和二甲双胍组神经细胞病理损伤有明显改善，细胞死亡减少，排列较为紧凑，形态较为圆润，其中补阳还五汤高剂量组改善作用更为明显。 3.4  补阳还五汤对DCI大鼠氧化应激、Fe2+水平及铁代谢相关蛋白表达的影响 如图3-A所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中SOD、CAT活性及GSH水平显著降低（P＜0.01），MDA水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清中SOD、CAT活性及GSH水平显著升高（P＜0.05、0.01），补阳还五汤低、高剂量组MDA水平显著降低（P＜0.05、0.01），提示补阳还五汤可减轻DCI大鼠氧化应激损伤。 如图3-B所示，与对照组比较，模型组大鼠脑组织中Fe2+水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠脑组织中Fe2+水平显著下降（P＜0.05、0.01）。如图3-C所示，与对照组比较，模型组大鼠海马组织TFR蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），FPN1、FTH蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠海马组织TFR蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），FPN1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），补阳还五汤高剂量组和二甲双胍组FTH蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。上述结果提示补阳还五汤可改善DCI大鼠铁代谢紊乱。 3.5  补阳还五汤对DCI大鼠海马组织Nrf2/GPX4信号通路相关蛋白表达的影响 免疫组化结果如图4-A、B所示，与对照组比较，模型组大鼠海马CA1区Nrf2和GPX4蛋白阳性表达显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，补阳还五汤高剂量组和二甲双胍组大鼠海马CA1区Nrf2蛋白阳性表达显著升高（P＜0.05），各给药组大鼠海马CA1区GPX4蛋白阳性表达显著升高（P＜0.05、0.01）。 Western blotting结果如图4-C所示，与对照组比较，模型组大鼠海马组织Keap1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），Nrf2、HO-1、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，补阳还五汤高剂量组和二甲双胍组大鼠海马组织Keap1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01），Nrf2、GPX4蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）；各给药组SLC7A11蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；补阳还五汤低、高剂量组HO-1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。 3.6  葡萄糖干预SHSY-5Y细胞浓度确定 如图5所示，随着葡萄糖浓度的增加，SHSY-5Y细胞存活率逐渐下降。当葡萄糖浓度为160 mmol/L时，显著抑制SHSY-5Y细胞增殖（P＜0.01），因此选用160 mmol/L作为葡萄糖造模浓度。 3.7  补阳还五汤对高糖诱导的SHSY-5Y细胞增殖的影响 如图6所示，与对照组比较，模型组细胞存活率显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，补阳还五汤低、高剂量含药血清组细胞存活率显著升高（P＜0.01）；与补阳还五汤高剂量含药血清组比较，补阳还五汤高剂量含药血清＋ML385组细胞存活率显著降低（P＜0.05）。 3.8  补阳还五汤对高糖诱导的SHSY-5Y细胞氧化应激水平及线粒体膜电位的影响 如图7-A所示，与对照组比较，模型组SOD、CAT活性及GSH水平显著降低（P＜0.01），MDA水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，补阳还五汤低、高剂量含药血清组SOD、CAT活性及GSH水平显著升高（P＜0.05、0.01），补阳还五汤高剂量含药血清组MDA水平显著降低（P＜0.05）；与补阳还五汤高剂量含药血清组比较，补阳还五汤高剂量含药血清＋ML385组SOD、CAT活性及GSH水平显著降低（P＜0.05、0.01），MDA水平显著升高（P＜0.05）。 如图7-B所示，与对照组比较，模型组红色荧光减弱、绿色荧光增强，提示高糖诱导可导致SHSY-5Y细胞线粒体膜电位降低并引起线粒体功能异常；与模型组比较，给予补阳还五汤含药血清干预后细胞红色荧光增强，绿色荧光减弱，表明补阳还五汤能够在一定程度上改善高糖诱导的线粒体膜电位下降，减轻线粒体功能损伤。而加入ML385后，细胞红色荧光减弱、绿色荧光增强，较补阳还五汤高剂量含药血清组有所下降，提示ML385可部分削弱补阳还五汤对线粒体膜电位的改善作用。 3.9  补阳还五汤对高糖诱导的SHSY-5Y细胞Nrf2/GPX4信号通路相关蛋白表达的影响 如图8所示，与对照组比较，模型组Keap1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），Nrf2、HO-1、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，补阳还五汤各剂量含药血清组Keap1蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），Nrf2、HO-1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），补阳还五汤高剂量含药血清组SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）；与补阳还五汤高剂量含药血清组比较，补阳还五汤高剂量含药血清＋ML385组Keap1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），Nrf2、HO-1、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）。 4  讨论 中医学上对于DCI无明确记载，认为DCI属于“消渴”合并“痴呆、健忘”等范畴。研究发现DCI的中医证型以瘀血阻络为多[21]。《医林改错》中记载，所谓“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀”，即血瘀的产生是因为气虚，因此在治疗血瘀证时，侧重“补气活血”。《血证论》言：“瘀血发渴者，以津液升之……有瘀血，则气为血阻，水津因不能随气上布”。消渴日久，内热炽盛，伤津耗气，气为血之帅，气行则血行，气虚则导致气推动血液功能失常，久而血液运行不畅，瘀血困于脑，瘀血不去则新血不生，阻滞脑络，脑失所养，遂发为脑病，故导致DCI的发生[22]。可见瘀血作为主要病理产物贯穿DCI始终。长期高血糖状态可导致使血液黏稠度与聚集性升高、血液流变性下降，血液出现“黏、浓、凝、聚”的状态，血流缓慢导致瘀血内存，血液运行不畅并引发微循坏障碍，最终引起脑组织灌溉不足及缺血缺氧[23]。瘀血不去则新血难生，组织因而失于濡养。长期高血糖可使神经细胞处于持续代谢应激状态，线粒体电子传递链负荷增加，活性氧大量生成，从而损伤神经细胞膜、蛋白质及DNA，破坏神经元微环境稳态[24]。同时，脑部微循环障碍、慢性脑灌注不足、线粒体功能异常及氧化应激等改变也被认为与认知功能下降密切相关，这一过程与“久瘀令喜忘”所揭示的瘀滞于内、神失所居而致呆病的病理认识相契合[25]。在此基础上，持续氧化应激可进一步打破氧化-抗氧化平衡，使脂质过氧化产物大量积聚，同时铁代谢紊乱导致游离Fe2+增加，激活铁死亡相关信号通路，放大脂质过氧化损伤，并在GPX4等抗氧化防御功能不足时诱发神经元铁死亡[26-27]。 中医药在治疗疾病具有整体观念、辨证论治的优势，通过益气养阴、补肾填精、活血化瘀、化痰开窍等治法治疗DCI[28-30]。补阳还五汤中黄芪大补元气，气旺以促血行，则瘀去络通，为君药，当归活血通络而不伤血为臣药，赤芍、川芎、桃仁、红花使活血祛瘀之力大增，地龙力专善走，共为佐使，诸药合用，可有补气、活血、散瘀、通络之效[31]。羟基红花黄色素A为红花中代表性活性成分，已有研究表明其可在糖尿病相关血管损伤模型中调控SLC7A11、GPX4等抗铁死亡相关分子，减轻氧化应激和铁死亡[32]。芍药苷为赤芍中的主要单体成分，可通过激活相关信号通路抑制氧化应激，改善帕金森小鼠的运动功能障碍及神经元死亡[33]。阿魏酸为当归、川芎等药材中的重要酚酸类成分，具有清除自由基、抑制脂质过氧化的作用，研究显示其可上调Nrf2相关抗氧化反应并抑制铁死亡诱导剂erastin诱导的铁死亡[34]。此外，黄芪来源的异黄酮类成分如毛蕊异黄酮，亦被报道具有抗氧化、保护线粒体功能及调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路减轻神经元铁死亡的潜力[35-36]。因此，补阳还五汤并非单一成分发挥作用，而可能通过其中多类活性成分协同调控，共同发挥抗氧化和抗铁死亡作用。 本研究通过高脂高糖饮食联合小剂量STZ注射法构建DCI大鼠模型，大鼠造模后出现体质量下降、血糖升高及多饮、多食、多尿等典型T2DM特征，并且表现出认知记忆能力的下降[37]。海马是大脑参与认知和记忆的重要区域，对高血糖非常敏感，其损伤可引发认知障碍。HE结果显示，模型组大鼠海马CA1区神经细胞损伤明显，细胞皱缩，细胞核深染。上述结果提示，持续的高血糖可导致大鼠学习及记忆功能受损。而经补阳还五汤干预后，各组大鼠血糖下降，逃避潜伏期缩短，穿越平台次数、目标象限移动距离及停留时间增加，海马CA1区神经细胞形态恢复，排列整齐，提示补阳还五汤能够改善DCI大鼠的认知功能及神经损伤。 已有研究表明，铁死亡参与DCI及多种中枢神经系统疾病发生[38-39]。铁死亡的本质特征包括铁离子依赖性的脂质过氧化积聚及细胞氧化还原稳态失衡，因此调控细胞氧化还原稳态的关键分子可能在铁死亡过程中发挥重要作用[40]。Nrf2是氧化应激反应中的重要因子，生理条件下，Nrf2与Keap1特异性结合并处于相对失活状态。当细胞受氧化应激刺激时，Nrf2从Keap1解离并转位入核，进而激活HO-1、SOD等抗氧化基因的表达，从而增强组织抗氧化能力[41]。Nrf2基因敲除小鼠表现出氧化应激标志物的增加并伴有空间学习和记忆的缺陷，也可通过激活Nrf2/HO-1信号通路有效抑制DCI大鼠体内氧化应激损伤[42-43]。上述研究均提示Nrf2在抑制氧化应激及改善认知功能发挥了重要作用。除调控氧化应激外，Nrf2还可调节多种铁死亡相关基因表达并参与铁死亡过程，其活性升高可降低细胞对铁死亡的敏感性，并减轻神经元损伤[44]。SLC7A11与GPX4被认为是Nrf2的潜在下游靶点，上调两者表达可增强细胞抗铁死亡能力[45]。其中，SLC7A11负责将胱氨酸转运入胞，为GSH合成提供底物。GSH作为重要的非酶性抗氧化物质，可清除活性氧并维持细胞氧化还原稳态。而GPX4为GSH依赖性抗氧化酶，能够将脂质过氧化物还原为无毒脂质醇，从而抑制脂质过氧化[46]。已有研究指出，通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路可减轻铁死亡并改善阿尔茨海默病动物模型的认知障碍[47]。本研究结果显示，补阳还五汤干预能够降低大鼠海马组织和SHSY-5Y细胞中MDA水平和Keap1蛋白表达，上调Nrf2、HO-1、SLC7A11、GPX4蛋白表达，并且升高线粒体膜电位，改善线粒体功能异常。以上结果提示其可能通过激活Nrf2/GPX4信号通路，改善抗氧化系统失衡、降低脂质过氧化物产生并保护线粒体功能，从而减轻神经元损伤。加入Nrf2抑制剂ML385后，补阳还五汤的改善作用被明显削弱甚至部分抵消，提示该信号通路可能是其发挥神经保护效应的重要分子基础。 铁是维持脑功能活动的重要微量元素，现有的研究表明，铁代谢紊乱与认知损伤密切相关，而铁的摄取、储存与输出等过程都会影响铁沉积[48]。体内游离的Fe3+与转铁蛋白结合后，经TFR识别以复合物的形式进入到细胞内，并被还原成Fe2+随后被转运至细胞质。Fe2+可通过Fenton反应促进脂质过氧化物生成并放大氧化损伤。而FTH作为铁蛋白的组成部分，通过储存过量的Fe2+以维持铁池的平衡[49]。研究发现，敲除FTH后小鼠皮质铁代谢稳态被打破，并且能够加重创伤性脑损伤，促进神经元铁死亡[50]。FPN1作为输出蛋白，可将Fe2+转运至胞外。细胞通过吸收、转运、储存、排泄等环节共同维持铁稳态，从而降低铁过载相关损伤并增强对铁死亡的抵抗能力[51]。陈娟等[52]研究发现，补阳还五汤能够调控铁转运相关蛋白的表达，促进脑铁代谢平衡进而改善脑缺血再灌注所致的神经损伤。本研究结果显示，补阳还五汤可以降低DCI大鼠脑组织中Fe2+蓄积，下调海马组织中TFR的表达并上调FPN1、FTH的蛋白表达，提示其可能通过改善铁代谢紊乱来缓解DCI大鼠脑内铁过载，从而减轻神经损伤。 本研究通过体内外实验，初步验证了补阳还五汤通过调控Nrf2/GPX4信号通路改善DCI的作用机制，并结合铁代谢等相关指标提示其可能参与铁死亡调控。然而，铁死亡的发生涉及复杂分子网络，本研究仅在细胞水平采用Nrf2抑制剂ML385进行干预，尚未使用铁死亡的激动剂或抑制剂以及动物水平反向验证的证据进一步证实其因果关系。此外，本研究体外高糖诱导模型未设置甘露醇等渗对照组，不能完全排除渗透压变化对细胞活力的潜在影响。因此，未来将通过设置等渗对照、建立铁死亡相关模型并结合技术干预手段，进一步探究补阳还五汤在调控铁死亡过程中的具体作用。 综上，补阳还五汤可改善DCI大鼠学习记忆能力，减轻海马组织病理损伤，缓解氧化应激和铁代谢紊乱，其神经保护作用可能与激活Nrf2/GPX4信号通路并调控铁死亡相关过程有关。本研究为补阳还五汤防治DCI提供了实验依据，也为靶向铁死亡的DCI干预策略提供了新的研究思路。 利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献（略） 来  源：赵博深，安宇宇，李樱楠，孙泽萱，史永恒，韩朝军，王  川，王  斌，米燕妮，刘继平．基于Nrf2/GPX4信号通路研究补阳还五汤对糖尿病认知障碍大鼠的改善作用及机制  [J]. 中草药, 2026, 57(17): 6793-6806. END 文章内容仅供思路参考，不代表本刊观点，非中医药专业人员请勿试药 文章来源:中草药杂志社，本草全球转载仅为传播行业信息，不做商业用途。若转载不当，请联系：28331285@163.com删除，感谢原作者的辛劳付出。文中插入广告与本公众号无关。 本草全球服务内容  包括但不限于:  中药新药、经典名方、配方颗粒、中药CMC、美国FDA IND、中药保护品种临床试验申报、中药上市再评价、药物经济学评价、新药研发及中药类注册备案全过程咨询与委托服务;可为有关单位疑难问题提供解决方案与技术支持、开展内训等服务。凡提交至本草全球的疑难问题,均可协助解决。  联系人:田先生 13801667235

减重小核酸药物YKYY036获得中美临床试验许可，悦康药业的小核酸布局进一步延伸至肥胖领域。从多个靶点的研发，到临床开发与产业化投入，公司搭建数年的核酸药物平台正在接受更多疾病场景的检验。 近日，悦康药业披露，子公司悦康科创和杭州天龙自主研发的YKYY036注射液，获得国家药品监督管理局和美国FDA的临床试验许可，拟用于肥胖或超重。这款靶向抑制素亚基βE（INHBE）的小干扰RNA（siRNA）药物，为悦康的心血管及代谢疾病布局增添了一个获准开展临床研究的项目。 YKYY036采用GalNAc偶联递送技术，与悦康此前布局的降脂、降压等小核酸药物采用相同的肝靶向递送思路。从血脂、血压管理到体重管理，公司正在将递送、化学修饰和工艺开发的积累应用于更多靶点。此次获批，也让肥胖领域的研发从临床前研究向临床开发迈进了一步。 这一进展发生在核酸药物由罕见病向心血管、代谢等大病种拓展的过程中。已有产品的商业化表现，也为这一技术路线提供了参照。 2025年，RNAi药企Alnylam的全球净产品收入为29.87亿美元，其中AMVUTTRA贡献23.14亿美元；反义寡核苷酸药物Spinraza同期全球销售额约15.5亿美元。在中国，降脂siRNA英克司兰于2023年8月上市，首次给药后第3个月再次给药，此后每六个月给药一次。 从产品收入到慢病中的长效应用，核酸药物的商业前景已逐渐清晰。对悦康而言，随着更多项目取得临床许可或推进后续研究，下一步要回答的是：平台上的技术积累，如何转化为不同疾病中有临床价值的产品？ 01 赛道扩容，平台能力成为竞争核心 GalNAc可以识别肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体，将偶联的小核酸递送至肝细胞，作用于一系列肝脏靶点，如PCSK9、LPA、AGT、INHBE等。因此，一套经过验证的递送和化学修饰体系可以被反复应用于多个靶点。对企业而言，平台价值不仅体现在管线数量，还要看序列筛选、化学修饰、递送、分析质控和生产工艺能否反复使用，并缩短后续项目的开发周期。 这也是悦康将核酸药物提升为公司在创新转型过程中重点布局的赛道与核心战略的原因之一。今年5月，悦康药业董事长于伟仕在杭州核酸药物基地签约现场时表示，公司在2020年科创板上市前就把“核酸药物作为核心战略方向”。 截至目前，悦康组建了500余人的国际化研发团队，形成了覆盖靶点发现、序列设计、递送系统、工艺开发、临床研究和产业化的研发链条。 仅用五年时间，悦康便完成了从传统药企到核酸创新领跑者的蜕变。公开信息显示，悦康目前已经搭建AI驱动的RNA靶点发现、序列优化、生物偶联增强递送及规模化制造等平台，小核酸肝靶向递送技术GalNAc等创新药技术领域累计取得数百项发明专利授权，相关PCT专利进入美国、欧洲等地区。在核酸药物赛道的技术布局也是悦康创新转型的缩影。 目前，这套平台已经延展到不同疾病。除了被追加投资的三款心血管及代谢管线外，YKYY033通过沉默凝血因子XI探索动静脉血栓防治；YKYY013靶向HBV相关RNA，拟用于慢性乙肝；YKYY036则将GalNAc-siRNA的应用延伸至肥胖或超重。不同项目采用相近的肝靶向递送思路，也分别检验着平台在降脂、降压、抗栓、抗病毒和体重管理中的适用性。 悦康的技术布局还包括mRNA和多肽。mRNA方向使用自主研发的可电离阳离子脂质YK-009构建LNP递送系统，已用于RSV疫苗YKYY025、带状疱疹疫苗YKYY026；多肽方向则围绕病毒膜融合机制，布局广谱抗冠状病毒药物YKYY017和面向RSV、hMPV的YKYY018。 2026年8月，悦康药业决定将4500万元超募资金投向三款小核酸药物：靶向PCSK9的YKYY015、靶向AGT的YKYY029和靶向LPA的YKYY032。三款产品分别面向原发性高胆固醇血症及混合型高脂血症、原发性高血压和高脂蛋白（a）血症，覆盖的都是患者基数较大的慢性疾病。 创新的技术平台要走向商业化，还需要产能承接。2026年5月，杭州核酸药物基地项目计划投资10亿元，建设约10万平方米的研发中心和生产基地，承接现有核酸管线的中试放大和未来量产，并服务中美申报及全球注册。 根据2026年半年报，截至6月末，悦康披露18项在研一类新药，包括11项小核酸药物、2项mRNA疫苗、3项多肽药物和2项中药。同期，公司研发投入约2.13亿元，占营业收入的18.05%。 这些数字背后，是悦康的平台化转型已进入接受临床检验的阶段。 02 走向临床与商业验证 当前，全球核酸药物在商业化阶段的突飞猛进，也让深耕这一赛道的中国企业看到了施展拳脚的空间。 英克司兰已经验证PCSK9 siRNA的长效降脂路径，AMVUTTRA等产品则证明RNAi药物可以形成十亿美元级收入。对产业中的后来者而言，仅有相同机制或更低给药频次并不足以构成优势，真正决定产品价值的是临床效果、安全性、疗效持续时间、生产成本和支付可及性。 悦康的临床开发围绕心血管及代谢疾病、呼吸道病毒感染等方向展开，中药创新药则推进上市审评。其中，小核酸管线既在已布局的靶点上推进后续研究，也在向新的代谢调控靶点拓展。 YKYY036瞄准的是肥胖治疗中的新靶点INHBE。根据最新公告，该药通过RNA干扰机制降解INHBE mRNA，减少激活素E（Activin E）的生成。在INHBE人源化小鼠和非人灵长类动物等模型中，公司观察到INHBE mRNA及Activin E蛋白水平下降，重复给药毒性研究也显示出良好的安全性和耐受性。这些结果均来自临床前研究，中美临床许可为后续在受试者中评价其安全性、耐受性和有效性提供了条件。 从研发思路看，悦康希望通过这一靶点探索不同于GLP-1受体激动剂的减重路径。在肥胖治疗中，减重幅度之外，体脂、瘦体重和疗效持续时间同样影响产品价值。对YKYY036而言，这些问题需要在后续临床研究中逐步回答；对平台而言，则是从血脂、血压管理向体重管理拓展后，需要完成的新一轮验证。 在降压和降脂方向，已有项目也在继续推进临床研究。靶向AGT的YKYY029已于2026年4月启动原发性高血压Ⅱ期研究；靶向PCSK9的YKYY015处于国内Ⅰb/Ⅱa期；靶向LPA的YKYY032正在筹备国内Ⅱ期研究。三款产品分别对应降压、降低LDL-C和降低脂蛋白（a）的临床需求。 此外，靶向凝血因子XI的YKYY033把平台延伸至抗栓领域。目前该药处于国内Ⅰ期，国内获批研究范围已经覆盖深静脉血栓、非瓣膜性房颤、慢性冠心病及外周动脉疾病、终末期肾病和肿瘤相关静脉血栓栓塞症等方向，2026年8月又获得美国FDA临床试验许可。 瞄准慢性乙肝功能性治愈的siRNA创新药则从另一个角度检验着平台的适用性。YKYY013已取得中美临床试验许可，目前国内Ⅱ期临床研究正在筹备中。从降脂、降压、抗栓和慢性乙肝，到此次获批的肥胖或超重适应症，悦康的中美临床开发布局已覆盖多个疾病方向。 呼吸道病毒管线则同时使用多肽和mRNA两种技术。 广谱抗冠状病毒膜融合抑制剂YKYY017的国内Ⅱ/Ⅲ期研究正在推进，适用范围也从新冠病毒向其他冠状病毒延伸。YKYY018用于RSV和hMPV感染的预防和治疗，已经进入国内RSV适应症Ⅱ期临床阶段。针对RSV，悦康还布局了预防性mRNA疫苗YKYY025，由此形成“核酸+多肽”的防治组合。 两款中药一类新药则构成更靠近商业化的一端。注射用羟基红花黄色素A用于急性缺血性脑卒中的适应证上市申请已获受理，紫花温肺止嗽颗粒用于感染后咳嗽（风寒恋肺证）在10月13日获批上市。 至此，悦康的创新管线已经出现明显的层次：两款中药创新药处于商业化与上市审评阶段，YKYY017处于Ⅱ/Ⅲ期，YKYY029、YKYY018进入Ⅱ期，多款小核酸、多肽和mRNA产品则处于Ⅰ期或取得临床许可阶段，YKYY036此次获批为早期临床开发增添了新的项目。既有承担短期内注册转化的管线，也有决定公司中长期创新平台的储备。不同阶段的项目共同构成了平台转化的接力关系，也让悦康从“平台搭建”进入“临床实践”的阶段。 从中美临床许可到后续试验，再到注册和产业化，各个环节对企业能力的要求并不相同。对悦康而言，杭州基地和持续的研发投入，为管线推进提供了支持；不同疾病中的临床结果，则将进一步说明平台积累能够带来怎样的产品价值。 03 结语 从一条创新管线，到能够持续产生新药的平台和产品矩阵，是悦康药业这轮创新转型中最值得关注的变化。 随着YKYY036获得中美临床许可，悦康的小核酸药物布局从慢性乙肝、高血压、血脂异常和血栓性疾病，进一步延伸至肥胖或超重；mRNA和多肽项目、进入上市审评的中药创新药，也在沿各自的研发路径推进。 对悦康而言，新的临床许可让平台的应用范围更清晰。接下来，从不同项目的临床研究中积累证据，并把研发成果逐步推向注册和产业化，将决定这轮平台型创新能够走多远。 一审| 石宛佳 二审| 李芳晨 三审| 李静芝