Ethanol

摘要：Edwin Cohn 于1920年被哈佛医学院聘任，1940年受美国军方委托开发一种稳定的白蛋白溶液，用于治疗战场伤员的失血/血浆流失。白蛋白最初在哈佛中试工厂使用 Cohn 的五变量乙醇沉淀工艺生产，并迅速转移到私营企业进行工业化生产。在过去的几十年里，免疫球蛋白 G 被用于治疗多种疾病，并成为行业的主要驱动力，而白蛋白现在已成为一种低价商品。纯化技术的发展，特别是层析技术，推动了从 Cohn 分离组分中生产用于血友病治疗的凝血因子和其他蛋白质，从而形成了目前独特的多种必需血浆源性药品体系。分离的主要成本在于血浆，这使得重组和其他非因子替代品对该行业构成了挑战。血浆源性血友病疗法在西方经济体已基本被取代，尽管其他产品，包括凝血酶原复合物、α-1-抗胰蛋白酶、纤维蛋白密封剂，提供了必要的治疗。成熟的行业也受到 IgG 潜在替代品的挑战。尽管存在多种替代制造技术，但结合通过其他技术“上游”收获其他蛋白质以及整合了病毒安全单元操作的“下游工艺”的 Cohn 分离法，仍然是全球行业标准。1. 血浆分离的奠基 血浆分离的过去、现在和未来的实践与 Edwin J Cohn 的工作密不可分。Cohn 在提出 pH 标度的 Sørensen [1] 指导下于嘉士伯实验室研究氨基酸和蛋白质，后来在 Arrhenius [2] 指导下研究电解质并随后访问欧洲，于 1920 年被任命到哈佛医学院物理化学实验室，以建立美国对蛋白质的研究 [3]。当时占主导地位的蛋白质理论是 Svedberg [4] 提出的小分子胶体群理论。Cohn 则追求大分子理论 [5]，使 Svedberg 信服蛋白质的结晶性质，后来结晶了牛和人白蛋白以及许多其他血浆蛋白 [6]，同时确定了一个潜在的纯化步骤。这个概念在历史上常被忽视，即白蛋白通过其“胶体渗透压”对血液渗透压的贡献。Cohn 研究了蛋白质的溶液性质，包括通过渗透压和后来的超速离心法测定的分子量，以及通过超滤法测定的分子尺寸。新的分析方法很重要，根据 Tiselius 的电泳法（他引入了血浆蛋白的 α、β、γ 表示法 [7]）成为常规方法。在整个哈佛实验室的工作中，分析方法对于血浆蛋白分离的控制和可重复性至关重要。Cohn 1922 年的论文 [8] 讨论了测定等电点的新方法以及通过与 Sørensen [9] 共同开发的“盐析”方法测定牛血清球蛋白和硫酸铵组分的溶解度。凭借二十年的物理化学研究[10]和广泛的影响，科恩为哈佛实验室的物理化学家开发人类血浆的分级技术奠定了基础。该技术的批评者偶尔提到“桶化学”，忽略了作为其基础的细致的蛋白质分析表征程序。 2. 使用乙醇的血浆分离技术的发展 在二战威胁和爆发之前，哈佛的工作重点是纯化蛋白质的表征，而不是动物和人血浆的分离，这发生在 1930 年代，由 Cohn 等人于 1941 年总结[11]。研究了纤维蛋白原、凝血酶原、补体、球蛋白和白蛋白。牛和人白蛋白被证明具有显著相似性：牛白蛋白作为潜在的血浆替代品受到关注，可以避免涉及人血采集的必要性。战时考虑阻止了发表，1935-1939 年间的工作在战后通过多篇报告和文章总结，包括在主要标题“氨基酸、肽及相关物质的物理化学研究”下，以及从 1940 年代到 1950 年代的标题为“血清和血浆蛋白的制备和性质”的 30 多篇出版物。 乙醇作为沉淀剂的使用首次在 1908 年与白喉抗毒素/抗体的研究相关描述 [12]。乙醇因其无毒和挥发性而优于硫酸铵，使其更容易去除。混合过程中的产热可以通过仔细添加沉淀剂来控制。血清蛋白及其沉淀以及重要的溶解性的详细独立研究在 1930 年代初进行 [13,14]。Cohn 的研究组于 1940 年开始开发使用乙醇-水混合物的新分离方法。对为远方休克伤员提供血浆替代品的战时关切促使美国国家研究委员会于 1940 年 5 月 31 日召开会议 [15]。Cohn 的实验室受命制备牛白蛋白而不是血浆（以及保质期仅 6 天的全血）。牛血清白蛋白使用第一代乙醇沉淀法在哈佛和 Armour 实验室制备 [16]。牛白蛋白项目直到 1943 年才被放弃。 到 1940 年仲夏，在迫在眉睫的冲突压力下，Cohn 确信已经开发出一种不仅能生产白蛋白，还能生产其他血浆蛋白的分离系统，这描述在始于 1940 年 12 月的专利申请中。该分离方法源自超速离心和电泳测量，而非经验性实验。它确定了蛋白质浓度、pH、离子强度、温度和乙醇浓度为五个关键变量，以及富含纤维蛋白原、IgG、α-和 β-球蛋白以及最终白蛋白的组分 [17]。1940 年的论文指出了对标准化方法的需求，“能够用于大规模制备，将血浆分离成尽可能多的组成蛋白质”，并描述了五个组分 I、II、III、IV 和 V。当时用于牛血浆的低温乙醇程序产生了一个不含白蛋白的 IgG 组分和一个不含 IgG 的白蛋白组分，可以服务于“生理学和医学以及工业中完全不同的目的”[18]。 1941 年 4 月，NRC 的资助使得能够建设一个批量为 40 升的人血浆分离中试工厂，首批产品于 7 月发布，并于 12 月临床用于治疗珍珠港事件的受害者。该工厂从美国红十字会提供的血液中每周产出 500-800 克白蛋白。Cohn 报告称，70% 的白蛋白（血浆中 40 g/L）在组分 V 中，85% 的 IgG（血浆中 8 g/L）在组合的组分 II + III 中 [19]。还报告了从 2 升血浆中获得 50 克白蛋白的产率 [20]，这在长达八十年的分离过程中几乎没有改进。 1942 年 1 月，NRC 召开会议，海军军医总监授权了人白蛋白的商业生产合同，尽管曾希望牛源材料足够。合同授予了 Eli Lilly、Squibb、Cutter、Lederle、Sharp and Dohme、Upjohn 和 Armour，这些公司将其工艺从牛白蛋白转换为人白蛋白 [19]。这可能是技术转让的首例，这些公司的人员在 Cohn 的实验室接受培训，同时工厂正在建设中。哈佛中试工厂全天候运行，通过现在称为“Cohn 分离法”的方法生产白蛋白。 被广泛引用的 1946 年论文 [21]，是该系列“血浆蛋白研究”的第 43 篇，描述了人血浆的分离，并强调了 Cohn 团队研究的深度和细致。6 种方法中每一种的规格都提供了无与伦比的细节。分离基于在低电解质浓度溶液中添加有机溶剂以降低蛋白质溶解度。Cohn 写道：“通过精确平衡电解质的溶剂作用和有机液体的沉淀作用，可以定义广泛不同的条件，使得所考虑蛋白质的溶解度保持恒定。在其他某些这些系统中，其他蛋白质的溶解度通常会有足够大的差异，从而可以进行满意的分离 .... 蛋白质浓度越小，越能准确地从各组分的溶解度曲线预测混合物的溶解度曲线以及沉淀物和溶液的组成。” 开发了六种不同的方法，试剂的添加顺序各不相同。在所有方法中，组分 I 都针对纤维蛋白原的回收进行了优化，只有在方法 1 中，组分 II 和 III 是分别沉淀的。在后续方法中，组分 II + III 被合并以优化 IgG 的回收，IgG 同时存在于这两个组分中。在方法 1-5 中作为一个沉淀物分离的组分 IV，在方法 6 中被发展为组分 IV-1 和 IV-4，分别含有可溶的 α-和 β-球蛋白。方法 5 是专门为优化白蛋白产率而开发的，并延续到方法 6，方法 6 现在是公认的参考，因为它是为尽可能多地分离天然状态的血浆蛋白而开发的。在描述的细节中，Cohn 指出“采集血液中柠檬酸盐、碳酸盐和蛋白质比例的任何变化都会导致所需缓冲液的变化”，这可能影响目标蛋白的精确沉淀条件。无处不在的分离方案，也称为五变量系统，及其主要蛋白质如图 1 所示。由于出版限制，Cohn 在战时报告中总结了哈佛实验室的分离工作 [22,23]。后来，Cohn 如常在历史背景下总结了血浆蛋白的溶解和沉淀条件以及各组分的组成 [24]。 在威斯康星大学的协同努力中，Deutsch [25] 研究了从哈佛实验室提供的组分 II + III 中回收 IgG 的条件以及其潜在的工业生产和医学应用。使用低离子强度来实现 γ-和 β-球蛋白的分离。发现的分离条件可以回收超过 75% 的 IgG 而不牺牲纯度，作者指出这是从恢复期或超免疫个体制备抗体药物的重要一步。来自麻省理工学院的 Oncley 于 1939 年加入哈佛实验室，并将注意力集中在从方法 1 到 6 的组分 II + III 中分离 IgG，特别是亚组分的组成。来自方法 6 的沉淀子程序后来被称为方法 9，并生产了纤溶酶原、凝血酶原和同种凝集素组分，以及在该系列“血浆蛋白研究”第 73 篇出版物中描述的 IgG 的组分 II, 1,2 [26]。 基于 Cohn 的避免“对组分 II + III 进行繁琐的亚分离”的方法 10 [27] 以及 Deutsch 对方法 6 的改进，瑞士红十字会输血服务中心的 Kistler 和 Nitschmann 开发了一种方法，用于进一步提高产率并简化处理，同时保持主要组分白蛋白和 IgG 的纯度 [28]，如图 2 所示。本质上，组分 I 如方法 6 一样沉淀，然后 IgG 在 19% 乙醇/pH 5.85 条件下沉淀，白蛋白可以在不预先去除组分 IV-1 和 IV-4 的情况下以 94% 的纯度沉淀。当时，较低纯度的白蛋白产品——血浆蛋白组分被认为是有用的。通过引入组分 IV 以及随后沉淀 γ-和 β-球蛋白可以获得更纯的白蛋白。高纯度 IgG 可以在有或没有预先沉淀组分 I 的情况下获得 [29]。除了与方法 6 和 9 相比方案简化外，Kistler-Nitschmann 方法的优势还在于持续提高 IgG 和白蛋白的产率和纯度，将乙醇用量从 2000 L/L 血浆减少到 1200 L/L 血浆，并减少了处理体积 [30]。 全球范围内所有大规模血浆分离工艺对于主要蛋白质 IgG 和白蛋白的基础，都是由 Cohn 或 Kistler 和 Nitschmann 或其变体定义的方法和沉淀条件。这些方案最初使用同样基于乙醇沉淀的亚分离程序生成最终产品。它们构成了治疗用血浆蛋白工业化生产的支柱。 3. 纯化时代 对使用替代沉淀剂的研究，包括消毒剂 2-乙氧基 6,9-二氨基吖啶乳酸酯和用作白蛋白溶液稳定剂的辛酸，在各个实验室进行过研究 [31]，但重大进展是通过层析技术取得的。对生产“更纯、更安全”产品的重大影响已由 Johnston 和 Adcock 彻底评述 [32]。1950 年代引入用于蛋白质层析的离子交换介质和用于尺寸排阻层析的葡聚糖基介质，为无需进一步乙醇沉淀纯化 Cohn 组分铺平了道路。后来，交联琼脂糖介质使得层析能够在工业规模上使用。在早期的纯化工作中，Bjorling 使用阴离子交换吸附从 Cohn 组分中提取铜蓝蛋白 [33]，后来应用批量吸附到重新悬浮的组分 II，从 IgG 中去除了白蛋白、转铁蛋白和血红蛋白结合的结合珠蛋白。在使用胎盘血清的实验中，组分 V 中的血红蛋白被阳离子交换剂吸附。使用来自血液透析队列的高滴度乙肝表面抗原血浆显示，离子交换步骤去除或降低了抗原水平 [34]。 随着对白蛋白的需求推动血浆分离，Curling 等人 [35-37] 设计了一种直接从血浆纯化的柱层析工艺，使用两个主要的离子交换步骤和简单的醋酸盐缓冲液。在 DEAE 离子交换剂上结合和洗脱白蛋白之前，获得了一个用于 IgG 回收的起始组分。白蛋白组分在 CM 阳离子交换剂上进一步纯化，然后通过凝胶过滤脱盐。白蛋白的最终产品产率 >95%，纯度 >96%，相对于经典的乙醇分离法有显著改进。该程序需要一个初始预处理步骤，使用 PEG [38,39] 沉淀纤维蛋白原和脂质，这些物质会导致柱子污染。一个商业工厂在澳大利亚建成，后来该工艺扩大到每年 250 吨，增加到 500 吨血浆 [40]，批量为 5000 升 [41]，白蛋白产品于 1997 年获得 TGA 批准。该工艺扩展到生产层析纯化的 IgG，并于 2007 年获得产品批准。尽管产率提高（高达 5 g/L 血浆 IgG）和纯度提高，但这些工艺后来被停止，以便制造商统一不同分离地点的生产方法并确保产品供应 [42]。尽管如此，这些大规模生产工作确立了各种形式的层析技术作为行业的支柱，同时证明了 Cohn 分离法作为初始程序的韧性。类似地，开发了一种从冷沉淀中纯化 FVIII、从 800 升批次中纯化 FIX、IgG 和白蛋白的 100,000 升/年的层析工艺 [43]。这种工艺规模的经验，加上添加的病毒安全步骤，为分离超免疫球蛋白产生了平台离子交换技术 [44]。直到 1993 年，一个工业规模的多步离子交换工艺也在运行，用于从胎盘血浆中回收白蛋白和 IgG [45]。 从追求提高 IgG 产率出发，如 Vogelaar 在 1974 年报告 [46] 在 460 升规模上产率为 58% (SD 9%)，主要损失在组分 III，焦点继续转向对 IgG 日益增长的需求。开发了从组分 II + III 回收 IgG 的程序，提高了产率，并包括杀病毒制造步骤和专用的病毒减少步骤，如纳滤 [47]。Lebing 等人 [48] 报告处理时间缩短 70%，产率比传统工艺提高 50%，这很大程度上归功于连续的阴离子交换步骤。整合了辛酸沉淀、避免组分 II 步骤以及顺序阴离子和阳离子交换步骤的方法持续被研究和采用，同时伴随着产率和纯度的提高 [49,50]。导致 IgG 产品损失的主要因素以及相应的工艺改进目标已由 Buchacher 等人记录 [51]，如表 1 所示。工业工艺变更的实施需要在患者对最终产品配方的偏好等效性、维持临床疗效以及同时提高安全性、纯度和产率方面进行进一步开发，同时工艺效率得到改善。一个由质量源于设计驱动的 IgG 工艺开发和优化，导致产品纯度和处理可靠性提高的实例已由 Wasserman 等人详细描述 [52]。产率最常表示为 g/L 血浆，涉及工艺或最终粗品产率，而不是考虑到灌装完成步骤损失和每瓶实际 IgG 量的原料药或最终产品的产率。此外，这不考虑回收血浆和单采血浆 IgG 含量的差异，也不考虑由于区域差异或单采频率引起的差异 [53]。与回收血浆相比，高频采集的单采血浆含有低 10-20% 的 IgG 浓度 [54]。 乙醇分离法在选择性和对不稳定蛋白（特别是 FVIII）变性方面的局限性，导致了替代技术的发展，包括用于 FVIII/VWF 的冷沉淀 [61,62]。冷沉淀的小规模和简便性使得许多输血中心能够制造 FVIII 浓缩物，彻底改变了血友病治疗。然而，组分 I 被用于商业生产，包括在瑞典的广泛使用 [63]。随后获得高纯度凝血因子的纯化程序最初依赖于阴离子交换层析 [64]。后来的发展通过使用针对因子 VIII 或因子 VIII/VWF 复合物的单克隆抗体的免疫亲和层析成为可能，并带来了同时减少病毒的好处 [65]。冷沉淀或组分 I 通常是纤维蛋白原制造的起始原料，例如通过甘氨酸沉淀和离子交换层析 [66]。PCC 和 C1 抑制剂在组分 I 之前被分离。在初始步骤中，将 DEAE 离子交换剂以分批模式添加到上清液中，以主要吸附因子 II、VII、IX 和 X [67]。在第二步中，将 DEAE 离子交换剂添加到冷上清液（去除 PCC 的上清液）以吸附 C1 抑制剂：两个沉淀步骤得到浓缩产品 [68]。这些在非营利部门开发的方法，构成了在工业中增加病毒灭活步骤进行进一步大规模生产的基础。其他上游收获的蛋白质包括 FVII、FIX、FXI 和 ATIII。由 Cohn 在组分 IV-1 和 IV-4 中鉴定的蛋白质，如 α1-蛋白酶抑制剂和抗凝血酶 III [69]，来源于在制备 IgG 和白蛋白时原本会丢弃的组分。AAT 可以从单独的或合并的组分 IV 制造，并通过 PEG 沉淀然后离子交换层析纯化 [70]。类似地，组分 IV 是回收其他血浆蛋白如抗凝血酶 III 的起点。层析技术的普遍使用，使得能够分离和纯化当前范围的血浆源性产品，已由 Burnouf 总结 [71]。4. 血浆产品的当前制造 血浆产品的制造已发展成为两个阶段：乙醇分离和组分的“下游”处理，包括纯化和病毒去除/灭活。这种混合工艺在整个行业的商业和非营利部门都在使用。纯化工艺随着离子交换、亲和层析和超滤的日益广泛应用而发展。早期优势已由 Burnouf 等人 [72,73] 以及 Johnston 和 Adcock [32] 讨论。 与 Protein A 亲和用于单克隆抗体捕获的生物制药应用不同，亲和层析在许多血浆产品工艺中通常用作精纯步骤，而不是在分离初期富含脂质的步骤中使用。遗憾的是，分离行业目前还没有直接从血浆中捕获 IgG 的直接方法，类似于从细胞培养中捕获单克隆抗体。在重组和单抗生产中，下游处理步骤可能占成本的 50% [74]，而在血浆产品制造中，仅原材料就占总成本的 56-58%，另外的制造成本为 13-17%，这给制造商带来了专注于工艺强化、效率和经济的巨大压力。以销售成本占收入的百分比表示，2022 年主要分离企业的成本范围在 52% 到 80% 之间 [75]。商业参与者专注于价格最高、利润最丰厚的市场，特别是北美市场，这些市场带来了最高的收入。4.1. 凝血因子 在高收入国家，从血浆生产凝血因子，现在占血浆产品收入不到 10%，已大部分被重组替代品取代，如下文所述。尽管在中低收入国家仍需要潜在成本较低的血浆源性产品，但应考虑单因子重组凝血产品的可用性。血浆源性 FVIII、FIX、PCC 和 VWF 的层析生产方法已由 Chutourou [76,77] 以及 Grancha 等人详细描述 [78]。PCC 基本上按照原始方法制造，并增加了病毒安全步骤。4.2. 免疫球蛋白 G 目前获得许可的免疫球蛋白产品主要使用 Cohn 组分 I + II + III 或 II + III [50]，或者在吸附凝血因子和一些蛋白酶抑制剂（特别是 C1 抑制剂）后使用 Kistler-Nitschmann 的 Precipitate A 从单采血浆制造。纯化工艺通常在阴离子交换层析和/或阳离子交换层析之前，以进一步的沉淀步骤（使用 PEG 或辛酸）开始。深层过滤用于澄清和去除脂质，超滤用于浓缩和缓冲液置换。所有工艺都包含至少两个病毒减少步骤，通常是 S/D 和纳滤（20 nm 或 35 nm 和 20 nm），以及最终的 37°C 下 pH 4 保持，以及工艺步骤如辛酸沉淀，这些都增加了整体产品安全性。（见下文第 5 节 - 病毒安全性）。最终产品现在配制成 5-10% 的静脉注射溶液或高达 20% 的皮下注射溶液 [79]。Buchacher [51,80] 和 Bertolini [81] 提供了带有基本流程图的详细信息。图 3 显示了最新（截至撰写时）FDA 批准的 IVIG 产品的典型流程图 [82]。最初的观察表明，在缺乏 IgA 的患者中，针对 IgG 的抗体可能在过敏反应沉淀中起作用 [83]，这导致了 IG 产品中 IgA 水平的最小化，并反映在监管要求中。这些标准仍然适用，尽管关于 IgA 在 IG 治疗后不良事件中的作用仍存在争议 [84,85]。对 IVIG 产品经历过过敏性或类过敏反应的患者可以耐受皮下给药的免疫球蛋白 [86]。总的来说，需要更多的临床研究来阐明这个问题。 制造程序的微小差异，从血浆汇集、去除或保留冷沉淀后，到使用不同的层析基质、吸附剂、助滤剂和过滤器，意味着所有 IgG 制剂并不相同，蛋白质杂质谱不同 [87]。配方也因使用的不同稳定剂而异。工艺强化带来的产率提高可能导致产品中出现严重不良事件。在某些 IVIG 产品中发现了活化的因子 XI，并被确定为血栓栓塞不良事件的根本原因[88]。现在必须去除血栓生成剂，如 FXIa，例如通过阳离子交换 [78]。对更高纯度和产品安全性的追求导致了新步骤的引入，特别是选择性去除抗-A/B 同种凝集素。使用固定化的血型 A 和 B 三糖进行的伪亲和层析有效去除了 87-90% 的同种凝集素，而特异性抗体滴度没有变化，该方法适用于工业规模 [89,90]。用于生产免疫球蛋白的初始汇集规模现在可达 10,000 升血浆。因此，如上所述，IgG 浓度的微小差异和较低的产率对血浆分离企业至关重要。这种情况因“最后一升”情景而加剧，即从所有分离血浆的相当大一部分中只生产 IgG，构成输入血浆的最后几升，这个概念由 Goss 和 Curling 更充分地描述 [91]。2007 年报告的平均 IgG 产率为 3.5 g/L [92]。一项针对美国静脉和皮下注射 IgG 市场的调查发现，当前的工业产率范围从接近 3.5 到接近 5 g/L，大多数分离企业报告为 3.8-4.5 g/L [93]。4.3. 白蛋白 白蛋白是 Cohn 方法 6 的主要目标，从组分 V 生产，将组分 V 重建后，在最终的 40% 沉淀之前，通过 10% 乙醇步骤去除杂质。已经研究了多种白蛋白生产方法 [94]，包括早期的连续处理变体 [95]，但原始的 Cohn 方法 6（包括 Kistler-Nitschmann 条件的变体）占主导地位，批次规模相当于至少 6000 升血浆 [96]。到达组分 V 之前的白蛋白损失约为 20%。制造差异不可避免地导致最终产品存在微小但可能显著的差异 [97]。杂质仍然存在，因此引入了额外的层析精纯步骤。在生产高纯度白蛋白的层析工艺中，引入了 4-巯基乙基吡啶疏水电荷相互作用配体吸附剂以减少一系列杂质，同时将单体含量提高到 98%，二聚体含量降低到 1.4% [98]。Matejtschuk 等人报告，在结合 Kistler-Nitschmann - Cohn 工艺后，通过最终的 DEAE 流穿阴离子交换步骤，显著降低了结合珠蛋白、α2-HS 糖蛋白和 α1-酸性糖蛋白，如图 4 所示，同时增加了单体含量并降低了铝含量 [99]。分离早期的一个问题是冻干去除乙醇以便配制的高昂成本。 5. 病毒安全性 1940 年代早期的观察表明，未经处理的汇集血浆具有传播肝炎的风险 [101]。血浆组分当时未被牵连，尽管研究表明，实验规模分离添加了病毒的血浆得到的组分保留了传染性 [102]。Cohn 分离的白蛋白没有传播肝炎或任何后来出现的血源性病原体，归因于在其使用早期引入的巴氏消毒步骤 [103]。未经巴氏消毒的白蛋白传播了肝炎 [104]，这表明分离本身并不能消除风险。 对血液和血浆捐献使用几代乙肝病毒检测进行筛查，对用于治疗血友病的产品传播肝炎的影响有限 [105, 106]。到 1970 年代末，将乙肝定性为主要的经肠外传播肝炎形式后，人们意识到血液和血浆供应中存在另一种经肠外传播的肝炎形式，被指定为“非甲非乙型肝炎”。该病毒被指定为丙型肝炎病毒 [107]，其对输血安全的影响通过开发血液抗体筛查测试而得以缓和。血浆衍生物的安全性走了一条不同的道路，因为输血传播 NANBH/HCV 风险的降低并未伴随治疗血友病患者的大型汇集浓缩物风险的降低 [108, 109]。到核酸检测使输血传播 HCV 在 1980 年代末后成为极其罕见的事件时，通过在制造过程中引入病毒灭活步骤，血友病治疗产品对 HCV 的安全性已大大超过血液和成分的安全性。 艾滋病流行对汇集血浆产品（主要是血友病群体）的接受者造成了悲剧性后果 [110]。美国疾病控制中心简洁地说明了单个感染性捐献对血友病治疗浓缩物供应和使用的影响 [111]。 献血者延迟和筛查测试增强了单次献血输血的安全性 [112]，但是，与肝炎一样，它们对汇集血浆产品安全性的影响微乎其微。这些措施，包括第一代 HIV 抗体检测，仍然允许较高的 HIV 暴露风险持续存在 [113,114]。这种认识加速了开发病毒灭活方法以消除 HIV 风险的努力 [115]。一些热处理工艺通常能有效灭活 HIV 并预防血友病患者中的艾滋病 [116,117]，但并不总能防止 NANBH 的传播 [118]。溶剂-去污剂混合物处理 [119] 能有效灭活脂包膜病毒，并确保免受主要血源性致病病毒 HIV、HCV 和 HBV 的影响 [120]，这已由 CDC 对血友病出生队列的分析（图 5）所证实。 早期通过 Cohn 主要方法 6 制备的 IgG 似乎不传播肝炎，尽管有零星的肌肉注射 IgG 后不明肝炎的报告 [122-124]。随后，在两次独立的流行中，Rh 阴性妇女在产后被给予抗 RhD IgG，导致数百名健康妇女感染了 NANBH/HCV [125,126]。所有 IgG 产品的母体组分 Cohn 组分 II，以及多种肌肉和静脉注射 IgG，都含有 HCV 病毒核酸 [127, 128]，这表明长期以来认为 Cohn 分离法赋予 IgG 产品安全性的假设是错误的。这被一系列通过 IV IgG 传播 HCV 的事件所证实，当时这些产品未经过病毒灭活程序处理 [129]（见表 2）。很可能避免了更广泛的血液传播感染流行（如影响血友病群体的流行），因为幸运的是，为最小化 IVIG 产品中 IgG 聚集而引入的制造步骤恰好也能灭活或去除病毒 [130]。这些幸运事件并不能否定在 1980 年代中期这些方法可用时，未能强制规定和实施 IgG 产品的病毒灭活方法，特别是溶剂-去污剂处理本可以消除任何 HCV 威胁，这代表了监管机构和行业共同的一次重大集体失败。 静脉注射免疫球蛋白溶液在 pH 4.0 下孵育，最初是为了抑制聚集形成而引入，被证明可以灭活丙型肝炎病毒 [136]，然而，1990 年代初几种低 pH 处理的免疫球蛋白制剂传播 HCV，经 Foster 和 Bieneck 评述 [137]，导致所有制造商在其免疫球蛋白工艺中增加额外的杀病毒步骤。 随着纳滤技术的发展，小的非包膜病毒也可以从 IgG 和凝血因子等血浆产品中去除 [138]。该技术的稳健性使其迅速被采纳为广泛生物产品（除血浆衍生物外）的病毒去除步骤 [139]。此类方法从 1995 年起普遍采用，从而形成了血浆产品安全性的现状。 多种因素导致了传染性病原体在全球生态系统中的出现和重新出现，包括旅行、环境破坏和农业实践 [140-142]。其中一些感染已通过血液和成分输血传播 [143]。在过去三十年间采用强有力的病原体减少方法生产的血浆衍生物中，没有此类传播的报告，尽管无疑有许多病原体存在于血浆池中，因为全球用于分离的血浆很少对这些病原体进行筛查。分离工艺已反复验证其消除这些病原体的能力 [144-146]。正是制造过程中系统性地包含了强有力的病原体灭活/去除步骤，才使得血浆衍生物的安全性达到目前的水平，总结为所谓的“病毒安全三脚架”（见图 6）[147]（见图 7）。 6. 替代分离技术 血浆分离企业一直是创新的，评估新的分离方法和技术，这些方法和技术可能提高产品产率、纯度或安全性。目前，成熟的行业受到对免疫球蛋白日益增长的需求的驱动 [71,148]，因此寻找提高该蛋白产率的方法。当前的分离方法基于对组分 II + III 或组分 II 下游进行纯化并整合病毒安全措施，在这些步骤产率损失可能高达 40% [50]。 因此，新技术可能针对从血浆或 Cohn 组分中回收目标蛋白。如果针对新工艺，该方法将是颠覆性的，但如果旨在改进现有方案，那么只要产品的杂质和安全谱保持不变，就可能有益。诸如离子交换和亲和层析等技术，虽然旨在颠覆，但反而被整合到纯化方案中，或用于从血浆中提取单一蛋白质。虽然被称为新技术，但许多技术有很长的历史——例如 1968 年就描述了使用柠檬酸钠代替乙醇进行分离 [149]。许多替代方法，如使用固相电解质吸附剂和通过过滤分离 [150]，源于学术界，通常由生物分离公司在实验室工作台开发，没有机会在中试工厂进行大规模放大，也没有将病毒减少和去除步骤与必要的质量控制相结合。 其他改进初始分离、捕获或纯化的策略包括提议使用磁性分离，其中吸附剂被磁化，产品可以在磁性分离器中从原料中回收。在经典层析（例如离子交换和亲和层析）、扩张床吸附和水性两相系统中，有许多关于蛋白质与新的物理场相互作用的变体 [151]。 许多关于开发中的工艺、目标蛋白产率和纯度谱的描述与实验室数据相关，没有考虑工艺的可放大性，或在 GMP 环境下、遵守法规和制药标准的工业制造的约束和要求下的转移。正如 EJ Cohn 所指出的，中试工厂阶段至关重要，中试工厂需要是预定工程制造工厂的缩小模型。一些近期探索用于工业用途的值得注意的技术描述如下。6.1. 水性两相系统 自 50 年代末 Albertson 描述水性两相系统以来，方法开发一直局限于学术界 [152]，并在过去十年中复兴并应用于血浆分离。Vargas 等人 [153] 描述了一种 PEG-磷酸钾系统，作为乙醇沉淀组分 II + III/组分 II 的替代方案，为使用已知的辛酸沉淀和层析途径进行 IgG 的“下游”纯化提供了起点。约 80% 的免疫球蛋白在富含 PEG 的上相中回收，后续纯化后为 70%，纯度为 92%。白蛋白从磷酸盐相回收。也描述了一种用于纯化超免疫抗蛇毒 IgG 的类似方案 [154]。在进一步发展中，使用了 PEG/葡聚糖相系统，其中 PEG 150 用二脂氨酸衍生化形成阳离子 PEG-COOH。93% 的 IgG 在顶部的 PEG 相中回收 [155]。ATPS 方法如果仅针对主要蛋白质 IgG 和白蛋白或单一蛋白质（如超免疫球蛋白）进行分离，可能被证明是有用的。放大、工业化和包含病毒安全步骤有待研究。从环境角度看，柠檬酸盐优于磷酸盐，并且需要解决危险化学品 PEG 的处置或再利用问题。6.2. 亲和层析 随着金属离子亲和层析的引入，Porath 和 Hansen [157] 描述了血清蛋白的“级联”分离。该方法采用一系列五种亲和基质，共同吸附 99% 的血浆蛋白，这些蛋白可以作为五个组分洗脱。Uemura 等人 [158] 描述了一种亲和层析和离子交换层析序列与乙醇分离的整合，其中纤溶酶原用固定化的赖氨酸分离，抗凝血酶 III 用肝素吸附剂分离。在基于三嗪染料化学和已知的白蛋白与固定化 Cibacron Blue 结合 [159] 的稳健配体的进一步发展中，开发了一个使用固定床、轴向或径向流柱的蛋白质吸附/洗脱步骤的完整亲和序列。在这个灵活的伪亲和级联中，吸附顺序是 VWF/FVIII、纤维蛋白原、纤溶酶原、IgG、白蛋白和 AAT，每种蛋白质的产率都高于相应的 Cohn 组分 [160]。每个洗脱步骤达到的蛋白质纯度取决于吸附配体的选择性和亲和力。这项颠覆性技术未被分离界采纳，因为它需要大量投资，替换当前的乙醇分离工厂，并且需要为每种蛋白质产品进行新的临床试验和注册。尽管如此，该技术进一步发展为使用赖氨酸类似物配体捕获纤溶酶原，现在这是一种获批产品 [161]。因此，该方法有潜力从血浆池或废弃的 Cohn 组分中回收单一产品。固定化肝素的亲和层析已用于大规模制造 FVIII、FIX 和 ATIII [162-164]，而金属螯合层析已用于一种 FIX 制造工艺。然而，制造过程中配体从树脂中浸出被认为是亲和纯化中的一个问题，需要采取措施确保产品不受污染 [165]。如今，主要树脂制造商选择经过临床验证的无毒配体，这些配体也可能进行致突变性测试。通常提供纯化和清洁步骤的浸出数据，并且 ELISA 检测试剂盒可能可供用户在其特定操作条件下测试泄漏。过去几十年中，配体发现过程已显著改进，使用广泛的文库来寻找特定的适配体、线性和环状肽以及骆驼科动物配体 [166]。基于核酸适配体的纯化已应用于 FVII、因子 H 和 FIX 的纯化 [167]，但对于 IgG 捕获或主要蛋白质纯化可能过于昂贵。在寻找类似于用于单克隆抗体的 Protein A 的 IgG 捕获步骤时，Hofbauer 等人比较了专用的 IgG 捕获树脂与 Protein G，并发现了 IgG 亚类捕获/洗脱、补体结合或 IgA 含量以及大规模使用的成本问题 [168]。类似地，一种结合到 IgG Fc 部分的肽配体已研究用于从 Cohn 组分 II + III 和其他来源捕获 IgG [169]。 从血浆中直接捕获 IgG 的替代方案侧重于使用在酿酒酵母系统中表达的骆驼科动物来源的配体，该系统不含动物源产品和毒素。CaptureSelect/IgSelect，14kD 配体特异性结合到 Fc 结构域的 CH3 部分，因此保留所有四种 IgG 亚类，且与其他免疫球蛋白无交叉反应，并专为大规模生物工艺设计。这些树脂的结合特性暗示了用于血浆和工艺样品中 IgG 定量的潜力 [170]。6.3. 扩张床吸附 扩张床吸附旨在避免在纯化前澄清含有颗粒/细胞的原料，特别是来自细胞培养的重组 DNA 产品 [171]。根据吸附配体，可以实现目标产物的同时浓缩。开发了不同的介质，使用加有石英或碳化钨的琼脂糖珠，这些珠可以以与传统层析介质相同的方式衍生化。实现了扩张床，并使用向上流动施加原料。当扩张床沉降到传统的固定床状态时，可以洗脱吸附的蛋白质。该方法已应用于使用一系列类似于上述亲和步骤序列的 EBA 柱分离血浆蛋白 [172]。高密度 (2.5-3.0 g ml-1) 的 10% 碳化钨 - 4% 琼脂糖珠被衍生化为阴离子和阳离子交换剂，血浆蛋白按顺序捕获和洗脱：凝血酶原复合物、FVIII/VWF、IgG、AAT、白蛋白和转铁蛋白。报告 IgG 产率为 85%。已报道了进一步的开发，从去冷沉淀血浆中按顺序捕获 PCC、IgG、C1 抑制剂、AAT，白蛋白在最终流穿液中 [173]。高密度、碳化钨吸附剂首先在实验室规模（170 mL 床）使用，并放大了 50 倍。对于 IgG 捕获步骤，使用了混合模式的 4-氨基苯甲酸吸附剂，IgG 经过辛酸钠病毒灭活、深层和无菌过滤，然后通过常规离子交换层析和后续的灌装/完成操作进行纯化。中试工厂规模的最终产品纯度报告为 >96%，单体含量为 99%，13 个批次的平均产率为 67.0 ± 5.1%，相当于每升血浆回收 4.7-5.3 克。该产品已在一项针对疗效、安全性和耐受性的美国及加拿大 12 个中心进行的 3 期前瞻性、开放标签、多中心研究中进行评估 [174]。尽管产率比传统 Cohn 分离法有所提高，但主要分离企业由于前文所述的原因未采纳该技术，留给开发者的剩余选择是建造一个新工厂，将扩张床作为经典纯化和病原体安全单元操作的支柱。6.4. 连续流电泳6.4. 连续流电泳 连续流电泳分离在 1970 年代发展起来，并由 Thomson 等人详细描述 [175]。在一个带有外旋转圆筒的环形空间中创建一个自由、稳定的溶液，原料向上流动，电泳垂直于流动方向进行。脱盐血浆在连续流模式下以 250 mg/min 的规模分离，主要产生两个组分：IgG 和白蛋白。单独研究表明，宽的 IgG 组分富含 IgM 和 IgA。进一步研究了产热、对流和水动力因素的问题 [176]，并设想了放大。然而，该方法未被继续推进。在后来的一项发展中，设计了用于切向流电泳的设备，包括具有确定孔隙率的聚丙烯酰胺膜，以通过电荷和分子尺寸同时实现分离。根据要纯化的目标蛋白，包含不同孔隙率的膜，例如 50 kDa 和 1000 kDa。该技术已应用于血浆蛋白分离，在小规模实验中，报告使用“IgG 膜”时 IgG 产率为 76% [177]。与其他颠覆性技术一样，需要进行研究以确定该技术是否可以应用于多种血浆产品的分离，或者是否更适合单一产品，如超免疫 IgG 生产。需要进一步的纯化和病原体安全步骤，尽管声称具有一定的病毒清除能力。一些基本的工程问题，包括能耗、产热和散热，需要在放大时解决。6.5. 聚丙烯酸沉淀 上述方法通常试图取代提供 Cohn 组分作为“下游加工”起点的乙醇沉淀，现在则通过已建立的纯化技术。因此，对于在制造工厂有重大投资的成熟分离企业来说，改变这些方法是一个挑战。尽管如此，最近的一种方法是用聚丙烯酸代替乙醇 [178]。顺序的、水相的聚丙烯酸在 7%、12% 和 20% 浓度下沉淀，并添加柠檬酸钠，产生富含纤维蛋白原、IgG 和白蛋白的组分。报告沉淀物产率为 80-90%，此步骤 IgG 纯度为 55% [179]。7. 血浆分离产品的竞争性技术7.1. 白蛋白 在白蛋白使用的几十年里，基于成本开发了各种合成胶体作为替代品 [180]。大多数这些旨在替代白蛋白血浆扩容能力的替代品，会导致诸如出血和肾功能障碍等不良事件，而这些事件在白蛋白中不明显。重症监护和液体疗法的发展导致了当前的共识，即使用白蛋白和合成胶体很少是合理的 [181]，临床关注点已转向利用白蛋白潜在的分子结构来有益于脓毒症和肝硬化等疾病[182]。关于白蛋白在这些疾病中益处的临床观点各异，基于大型临床试验记录的临床结果差异 [183]。这种分歧促成了白蛋白在全球市场的持续存在，尽管它从每升收集血浆中提取的“最后一升”蛋白降级到大约 56% 的全球收集血浆提取率 [71]。不同白蛋白产品之间的结构异质性，源自血浆分离对白蛋白分子的影响，可能是其可变性的一个因素 [88]。这导致了对通过重组制造获得更完整分子的潜力的持续兴趣 [184]。成本问题以及从该技术生产兆吨级白蛋白的实际困难带来了相当大的挑战 [185]。尽管如此，一家公司已将毕赤酵母生产的重组白蛋白推向市场 [186]。该产品的临床研究表明，rHA 在健康受试者中是安全且耐受性良好的。rHA 和 HSA 表现出相似的安全性、耐受性和 PK/PD 谱。对该产品和另一种产品的进一步研究 [187,188] 报告了在治疗肝病方面的疗效，但迄今为止这些仅以摘要形式提供，且 Kedarisetty 引用的临床试验 [182] 在引用的数据库中无法验证 [189]。参考了 Wiedermann 最近的全面综述 [184]，该综述“强调需要进一步的临床开发和研究以探索 rHA 的全部潜力，特别是在肝硬化和脓毒症中，其比较疗效和安全性尚未完全阐明”，我们对此表示赞同。血浆源性白蛋白生产的经济性也必须考虑，因为这种白蛋白是一种相对便宜的产品，其供应受益于从免疫球蛋白生产中吸收成本的策略。这对独立生产 rHA 的成本效益构成了挑战，需要创新方法来降低生产成本以具备竞争力。7.2. 凝血因子 1965-1975 这十年见证了治疗血友病的治疗选择大幅增加 [60]。到 1970 年代末，对因子 VIII 的需求使该蛋白成为血浆采集的驱动力，但需求超过了供应，因为预防性治疗和手术等措施有助于提高预期寿命和生活质量。对血友病中肝炎传播日益增长的认识并未削弱使用和期望，因为人们认为这种风险被不治疗的后果所抵消。这种情况因血友病中的艾滋病和丙型肝炎流行而戏剧性地改变 [101]。当血浆行业努力开发消除病毒传播风险的工艺时，其他团体专注于通过重组技术生成 FVIII [190] 和 FIX [191]。到 1990 年代中期，重组凝血因子获准上市。 通过使用病毒灭活的血浆浓缩物和重组产品，消除了血友病疗法中的病原体安全问题后，对 FVIII 抑制物的开发已成为血友病治疗中最大的安全问题。重组产品使用的增加导致研究其生产的某些方面是否会增加抑制物发展的风险，相对于血浆源性浓缩物而言。尽管几项使用荟萃分析的观察性研究尚无定论 [192,193]，但一项前瞻性研究专注于这个问题，即“血浆产品暴露幼儿抑制物调查”。该研究得出结论，接受重组产品治疗的先前未经治疗和极少治疗的患者，其（总计 - 非高滴度）抑制物发生率高于接受血浆源性产品治疗的患者 [194]。监管机构一直对将这些发现转化为产品选择指南持谨慎态度，治疗者仍然可以自由评估患者并根据个体情况做出治疗选择。最近报道的前瞻性收集的注册数据表明，重组和血浆源性产品之间的抑制物发生率相似，对于延长半衰期产品有降低发生率的趋势但不显著 [195]。 直到 2010 年代中期，格局一直很稳定，当时重组技术通过开发经过修饰以增强输注后半衰期并减少输注频率的 FVIII 和 FIX 分子实现了其承诺 [196]。关于 FVIII，这些分子的市场因双特异性人源化单克隆抗体 emicizumab 的开发而缩小，该抗体通过每周/每两周一次的皮下自我给药获得了市场份额，现在已成为美国治疗血友病 A 的主导方式。值得注意的是，使用这种药物的患者对其他治疗（包括基因疗法）的临床研究兴趣不大 [197]。血友病 A 和 B 的基因疗法已通过多项商业努力引入 [198]，但唯一获准的血友病 A 疗法的持续开发已被相关公司大幅缩减，原因是用户接受度低 [199]。FVIII 活性随时间大幅下降 [194]，加上 emicizumab 取得的非常有效的成果，可能促成了这种情况。这与血友病 B 的情况形成对比，血友病 B 中可以获得显著持续的 FIX 水平，并且直到最近还缺乏类似的方式 [200]。一种此类疗法获得监管批准 [201]，加上多个机构的报销 [202,203]，已导致一家制造商停止其血友病 B 基因疗法产品的商业化 [204]，尽管其在美国获得了监管批准 [205]。加拿大卫生技术机构就卫生干预措施的报销提出的一份持怀疑态度的综述可能影响了这一决定 [206]。其他非因子基础血友病疗法的快速发展的竞争格局也导致一种对血友病 A 和 B 均有效的有希望的旁路药物被放弃 [207,208]。最近获准用于血友病 A 和 B 的其他疗法包括 Fitisiran [209] 和 Hympavzi [210]，导致血友病治疗几乎成为一个琳琅满目的疗法大杂烩，其中许多疗法并非基于传统的因子替代，且在报销环境中。这导致人们认识到，与历史性的因子替代相比，这些疗法的实验室评估和治疗监测面临挑战，缺乏合适的标准和方法 [211-213]。通过测量和监测凝血酶生成的全球凝血评估正日益用于评估患者出血表型和出血性疾病的治疗效果 [214]。世界血友病联盟发布的最新估计 [215] 表明，修饰的重组 FVIII 和 FIX 分子以及非因子基础疗法现在构成了高收入国家的主要治疗方式。7.3. 免疫球蛋白 对 IgG 需求的持续增长导致多个国家产品长期短缺，这刺激了对可能用于治疗目前由 IgG 治疗的各种疾病的合成替代品的研究。对 IgG 分子不同部分功能的理解（图 7）使注意力集中在 Fc 片段上，已知其在炎症和补体结合作用中至关重要。这些方面在自身免疫性疾病中很重要，这类疾病占 IgG 使用的很大一部分 [216]。 已经提出了两种方法，涉及 Fc 片段的多聚化以抑制补体激活 [218]，以及阻断参与体内 IgG 处理的 Fc 新生儿受体。Fc 多聚体方法在自身免疫性神经病的动物模型中显示出前景，但所有提议在人类中进行的临床试验都因缺乏临床可行性而被放弃 [219]。FcRn 阻断更为成功，其中一种方式——efgartigimod——获得了治疗重症肌无力和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病的监管批准 [220]。值得注意的是，efgartigimod 与静脉注射 IgG 的头对头比较显示，前者改善了临床结果 [221]。其他方式已在临床试验中显示出疗效，导致监管批准 [222] 或监管申报 [223]。这些药物对目前由 IgG 治疗的适应症的有效竞争有可能颠覆高达 40% 的 IgG 市场，对血浆行业产生重大影响。 构成其余 IgG 用途的免疫缺陷疾病需要 IgG 分子 Fab 部分的多克隆群体，以提供在缺陷患者中赋予免疫力所需的各种特异性。因此，诸如单克隆抗体之类的合成分子，初步看来，不适合颠覆免疫缺陷适应症。重组抗体开发的最新进展可能证明对这些疾病有效 [224,225]。有趣的是，这项技术正由一家主要的血浆分离公司赞助。该技术的支持者强调，其目前状态不是替代，而是对 IgG 的补充。该技术的进一步研究将表明它是否将提供 IgG 的可行替代品，但其发展表明，当前宣称免疫缺陷适应症不受替代品颠覆的范式可能需要进行修订。时间和科学将给出答案。 7.4. 其他蛋白质 除了针对连续几代驱动/最后一升蛋白质的替代品外，其他血浆源性蛋白质也已使用重组和其他生物技术开发出来。在其血浆衍生形式中，这些蛋白质为开发它们的公司增加了每升血浆的宝贵收入。因此，当这些技术不由血浆分离企业拥有时，它们被其他技术颠覆可能会影响该行业的经济性。最近，一种重组 VWF 由一家血浆分离企业开发，用于治疗血管性血友病 [226]。一系列治疗血浆源性 C1 抑制剂的替代品也已可用 [227]。α-1-抗胰蛋白酶缺乏症目前用血浆源性 AAT 浓缩物治疗，会导致肺部和肝脏疾病。浓缩物的增强疗法仅能有效改善肺部疾病，并且许多替代疗法正在进行临床开发，以解决该疾病的所有方面 [228]。8. 实施总结和建议 血浆分离企业一直了解开发中的新方法，并召开会议讨论重组 DNA 技术对分离的潜在影响 [229,230]。重组凝血产品现在是高收入国家的标准，随之而来的是血浆源性产品收入的损失，并使首/末升经济以及收入对两种主要分离产品——白蛋白和 IgG——的依赖受到质疑。血浆源性凝血因子在中低收入国家使用，但重组产品可能成为标准，正如它们在高收入国家已成为的那样。小规模的 GMP 血浆源性产品制造是值得怀疑的，除非由于高投资成本、法规遵从性以及病毒安全方面的持续警惕，能够进入广阔的地理市场。基因治疗替代品提供了重要的长期替代方案。目前，对治疗多种疾病的 IgG 需求将继续推动对血浆源性产品的需求。 血浆分离从 1940 年代和白蛋白生产发展而来，现已涵盖 IgG、凝血因子和其他用于治疗罕见病的血浆源性蛋白质。这种扩张和全球产业发展 [231]，以及从单一来源独特分离多种治疗性蛋白质，使得整合了大量技术成为必要，如图 8 所示。层析是从 Cohn 组分中纯化的主导技术。对方法改进的探索仍在继续，尽管生产起始组分的替代方法尚未被行业采纳。 本文描述的主要分离替代方案已从生物加工角度由 van Alstine 等人详细讨论和比较 [69]。考虑新的潜在颠覆性技术时的简单建议，既适用于血浆蛋白分离，也适用于一般生物加工。需要考虑的要点包括： 稳健（对批次间进料变异性不敏感，多种进料和目标） 简单配方（例如，单一廉价添加剂） 易于实施（开发指导、可预测性、高通量筛选兼容性） 成本效益（显著效益足以弥补实施成本） 易于放大（从毫升到 1000 升） 与现有设施兼容（设备、规模） 与现有工艺兼容，包括后续层析 与一次性、灵活处理兼容 提供独特优势，如能够减少病毒载量、储存目标物等 无毒添加剂，易于分析，无需额外单元操作即可去除 然而，应强调的是，开发血浆源性产品需要认真关注病毒减少步骤的纳入以及广泛的产品表征，包括与广为接受和临床优选产品的比较。必须考虑配方和呈现方式，包括从制造角度和患者可接受性两方面。需要解决供应链问题，并监控病毒安全性。新产品需要根据 FDA 和/或 EMA 标准进行临床试验和监管批准，新技术制造工厂可能需要迄今未使用的工程解决方案，并且必须符合 GMP 要求。在这方面，需要考虑产品获批所需的时间尺度和所需投资，谨慎评估替代生产技术的使用。 9. 结束语 在创立八十年后，血浆分离行业持续发展，并为许多患者提供必需的治疗。2022 年，全球大约有 1650 万人接受了血浆源性产品 [232]： 1250 万人接受了超免疫产品治疗，仅中国就有 650 万人。 100 万人为慢性和急性疾病开具了多价 IgG 处方（美国有 30 万人）。 190 万人使用了白蛋白（几乎 50% 在中国），主要用于急性疾病。 100 万患者（占总数的 6%）接受了另一种血浆源性产品。 大约 10 万患者接受了 FVIII、FIX、VWF 复合物或其他血浆源性因子的治疗。 该行业继续寻找新的适应症，以利用血浆中许多已知与疾病相关的缺陷蛋白质。与其早年相关的相对快速的临床开发相比，该行业面临的监管障碍是巨大的。其中许多是 1980-90 年代病毒传播流行事件的结果，并导致“预防原则”被嵌入到血浆产品法规和政策的各个方面。这些事件所孕育的文化也因为评估各方在其发生过程中的作用而设立的各种公开调查而形塑。从这些过程中引用一些概括这一框架的部分是恰当的。在关于加拿大病毒传播问题的报告中，Horace Krever 法官很好地阐述了预防原则的观点： “当有证据表明一种潜在的致病因子是或可能是血源性时，即使没有证据表明接受者已受到影响，也应采取预防行动。如果危害可能发生，应假定其会发生。如果没有能完全防止危害的措施，则应采取可能仅部分防止传播的措施。” [233] 在他开创性工作的这一部分，Krever 的评论指向行业及其监管监督者，在加拿大和其他地方，这些监管者被视为“在值班时睡着了”。美国医学研究所的委员会（应联邦政府要求设立，研究 HIV 通过血液和血液制品的传播）在谈到美国 FDA 对艾滋病可能通过血液传播的可能性的反应时，表达了类似的观点： “委员会在评估 FDA 在 1980 年代保护公众免受 HIV 影响方面的行动时，发现了值得关注之处。记录显示，有许多机会可以改善该机构处理血液供应危机的能力……在危机中，决策者可能过于专注于寻找能显著降低危险的解决方案，以至于未能实施那些效果较差但可能在一定程度上提高公共安全的解决方案。如本文所述，部分有效的降低风险的改进措施可以挽救生命，等待更有效的安全措施的开发……如果未来出现对血液供应的威胁，FDA 应鼓励针对大型、困难问题的小型、低风险解决方案……” [234]。 我们其中一位作者作为该行业主要监管者十五年的经验证实了这种文化对一整套措施的影响，其中许多措施通过国际协调会议等在全球日益协调，构成了该行业的监管框架。行业批评该框架过于繁重且不利于创新，需要以对其演变之前发生的事件的认识来加以调和。进一步认识到血液产品制造和使用生态基础的不确定性（以但不仅限于疾病传播风险为例 [235]），使得预防方法合法化。接受的基于证据的临床验证范式所面临的挑战，加上商业化任何新产品的困难，更有可能影响新血浆源性疗法的出现，而不是监管负担。该行业继续寻找新的蛋白质，但在试图扩大血浆治疗性蛋白质范围时面临困难。最近一项静脉注射人 apoA-I 制剂未能证明疗效 [236]，经过多年的临床前和临床开发，导致其作为商业提案被放弃 [237]。这些障碍是巨大的，但将行业的创新与简化批准流程的监管举措相匹配，将有助于推进 Cohn 的项目在哈佛启动数十年前就已开始的治疗努力进程[238]。 文献来源：Biologicals 91 (2025) 101849