Recombinant coagulation factor VIII ( Sino Cell Technologies)

摘要:基因治疗为患有遗传性单基因疾病、癌症和罕见遗传病的患者带来了希望。自然存在的腺相关病毒（AAV）由于其缺乏显著的临床致病性，并且能够被改造以在多种细胞类型中长期稳定表达治疗性转基因，因此成为临床基因转移的理想载体。AAV已被生物工程改造，生产出重组AAV（rAAV）载体，用于许多已获批或处于晚期开发阶段的基因疗法。然而，持续的挑战限制了rAAV载体介导疗法的更广泛应用。这些挑战包括对rAAV载体的免疫反应、有限的转基因包装能力、次优的组织转导、插入突变的潜在风险和载体脱落。这篇综述着重讨论了由自然暴露于AAV或rAAV载体给药后产生的抗AAV中和抗体（NAbs）介导的rAAV免疫反应。我们深入分析了决定AAV血清流行率的因素，并检查了管理rAAV载体给药前后抗AAV NAbs的临床方法。还讨论了用于量化抗AAV NAb水平的方法和克服预先存在的AAV免疫的策略。rAAV载体介导的基因疗法的广泛采用将需要更广泛的临床认识其当前限制，并进一步研究以减轻其影响。 1.引言 基因治疗为全球患有遗传性单基因疾病、癌症和罕见遗传病的患者带来了越来越多的希望，尽管多年来遭遇了许多挫折。为了在体内将感兴趣的基因（转基因）传递到目标组织，已经探索了一系列载体（传递治疗基因的载体）。由于腺相关病毒（AAV）缺乏显著的临床致病性，它为基于重组AAV（rAAV）载体的临床基因转移提供了理想的基础。rAAV能够包装并传递转基因到广泛的分裂和非分裂细胞，并在包括肝脏、视网膜和中枢神经系统在内的非快速或非分裂细胞中维持稳定且可能长期的转基因表达。此外，AAV具有相对较低的免疫原性，并且有优化的生产协议，允许用于临床使用的高滴度和高纯度制造（表1）。重要的是，由于rAAV基因组主要在细胞中以染色体外形式维持，因此最小化了与临床基因治疗中使用的某些其他病毒载体固有的插入突变相关的并发症。 表1. 基于腺相关病毒的基因治疗载体的特性、优势和挑战。 AAV由一个约4.7 Kb的单链DNA（ssDNA）基因组和一个直径约26 nm的衣壳组成（图1A）。AAV基因组两侧是两个T形发夹结构——反向末端重复序列（ITRs）。重叠的基因、选择性剪接和多个翻译起始位点允许高效利用AAV基因组，并产生三种衣壳蛋白（Cap）、四种复制蛋白（Rep）以及一种促进某些血清型病毒组装的组装激活蛋白。这三种基因共同介导基因组复制和包装、衣壳生产和整合。最近，还鉴定出一种额外的基因产物，编码一种与膜相关的辅助蛋白（MAAP），有助于AAV的出站和封装。 图1. AAV基因组、AAV生命周期和通用rAAV表达盒的工程化示意图。(A) AAV由一个约4.7 Kb的单链DNA基因组组成，被直径约26 nm的衣壳包围。AAV基因组包含三个开放阅读框，两侧为两个T形反向末端重复序列(ITRs)。AAV基因组的cap、rep、MAAP和AAP编码三种衣壳蛋白、四种复制蛋白、促进AAV出芽和包装的膜相关辅助蛋白(MAAP)以及在某些血清型中促进衣壳组装的组装激活蛋白(AAP)。(B) 在rAAV中，AAV基因组被一个转基因表达盒所取代，包括专用启动子、增强子、感兴趣的转基因和终止子，两侧为ITRs。(C) rAAV载体通过(1)结合细胞表面受体和/或辅助受体，然后通过(2)内吞作用内化。AAV然后(3)通过内体和高尔基体，经过内体逃逸后，进行(4)核运输和(5)脱壳释放基因组，然后(6)表达。相对大小表示不按比例。 存在多种AAV血清型，具有相同的整体基因组结构，并且在核苷酸序列上有超过80%的同源性。血清型之间的差异主要在于它们的衣壳蛋白的氨基酸序列。正是衣壳序列的差异以及宿主细胞上的受体或辅助受体的存在，决定了特定AAV血清型的细胞/组织趋向性（图2）。AAV2是最常见的血清型，与所有AAV血清型（除了AAV4和AAV5）在氨基酸序列相似性上非常接近。比较人类和非人类灵长类AAV血清型的系统发育表明，人类AAV4和AAV5血清型是最分歧的，而其他人类血清型（AAV1、AAV6、AAV2、AAV3和AAV9）、独特的非人类灵长类血清型（AAV7）或在人类和非人类灵长类中都发现的血清型（AAV8）聚集成组。AAV1、AAV2和AAV3彼此密切相关，在氨基酸水平上有83%到93%的同源性。AAV4和AAV5与AAV1、AAV2和AAV3的关系较远，基于病毒蛋白VP1/VP3的氨基酸序列，AAV4的序列身份范围从51%到63%，AAV5为51%到59%。AAV6是AAV1和AAV2的杂交种，与AAV1有99%的同源性。 图2. 典型AAV血清型及其优先组织趋向性。衣壳序列的差异和特定宿主细胞受体的存在决定了典型AAV血清型的细胞/组织趋向性。AAV，腺相关病毒。CNS，中枢神经系统。 AAV已被生物工程改造，生产出rAAV载体，以针对多种单基因疾病，许多疗法要么已经获批，要么处于晚期开发阶段（表2）。在rAAV载体中，AAV基因组被一个转基因表达盒所取代，该盒子包括一个专门的启动子、感兴趣的转基因和转录终止子，两侧有ITRs（图1B）。除了容纳转基因表达盒外，病毒编码序列的这种替代还有助于降低免疫原性和细胞毒性（表1）。产生的rAAV的组织趋向性主要由所使用的衣壳决定，有一系列天然或工程化的衣壳可用于针对不同的组织。通过优化转基因表达盒，可以进一步提高转导的选择性和效率，例如通过改进密码子使用、CpG耗尽或包括组织或细胞选择性调节元件。AAV通过受体介导的内吞作用进入细胞（图1B）。然后AAV通过内体和高尔基体运输，并且在内体逃逸后进行核运输和解壳。单链AAV基因组通过细胞DNA聚合酶的活性转化为双链基因组。AAV需要一个辅助病毒（例如，腺病毒、单纯疱疹病毒）来促进基因表达和病毒复制。在辅助病毒存在的情况下，AAV会经历特征性的生产性感染，包括基因组复制、病毒基因表达和病毒颗粒产生。没有辅助病毒，AAV可以通过整合到染色体19上的腺相关病毒整合位点1（AAVS1）以及其他由Rep蛋白介导的染色体位置来建立潜伏期。到目前为止，还没有报告过rAAV介导的基因毒性事件的确认案例。然而，由于在小鼠研究中报告了一些插入突变的情况，对rAAV的基因组整合的研究仍然非常活跃。 表2. 已批准或处于晚期开发的AAV疗法。 2.rAAV基因传递的挑战 2.1.体液免疫反应 尽管AAV具有多个使其成为有吸引力的基因治疗载体的特征，但在开发广泛的成功的AAV介导疗法方面仍有挑战需要克服（表1）。尽管AAV具有低免疫原性特征，但rAAV载体仍能刺激宿主针对衣壳和/或编码的转基因产物的抗病毒免疫反应，特别是当系统性给药或在较高载体剂量时。抗AAV中和抗体（NAbs）可能在接触自然发生的AAV后发展，人口血清阳性率随年龄增长而增加。母体抗AAV抗体的被动转移也会发生。AAV衣壳之间的高度同源性允许这些NAbs与不同的衣壳发生交叉反应，包括用于基因治疗的那些。在接受基因治疗的患者中触发针对衣壳的体液免疫反应，随后导致中和交叉反应的rAAV的给药。在这种情况下，NAbs可能覆盖rAAV载体并“阻止”其与目标细胞上的受体结合，从而防止附着和细胞进入。或者，NAbs可能在载体结合到细胞后抑制病毒包膜蛋白和细胞表面受体的相互作用，或者以其他方式抑制转导，从而限制基因治疗的有效性。NAb覆盖的载体可能与细胞受体结合并被内化，但有效的转导被抑制。或者，NAb本身可能与细胞受体结合并阻止rAAV的结合和内化（图3）。然而，已经提出一些AAV血清型可能对抗体中和不太敏感，在最近的血友病B基因治疗试验中观察到对AAV5的部分抗性。NAbs还可能影响载体的生物分布，将AAV载体从目标细胞转移到次级淋巴器官。抗AAV NAbs的水平取决于多种患者和治疗相关因素，包括患者的人口统计学、疾病状态、衣壳类型、转基因和剂量。正在探索最小化针对AAV的体液免疫效应的方法，但仍存在重大障碍。 图3. NAbs的经典作用机制。在没有预先存在的NAbs的情况下，可以实现强大的转基因表达。在存在NAbs的情况下，由于之前接触AAV而发展出来的NAbs会结合到AAV载体上，并可能阻止与目标细胞受体的结合，这可以阻断载体转导和转基因表达。NAb还可能在载体结合到细胞后，抑制病毒包膜蛋白与细胞表面受体的相互作用。NAbs损害转基因表达的其他机制未示出，包括NAb包被的载体结合到细胞受体并被内吞后在细胞内被破坏；NAbs结合到细胞受体并阻断rAAV的结合及随后的内吞作用。NAb，中和抗体；rAAV，重组腺相关病毒。 除了影响rAAV初始转导的预先存在的抗AAV NAbs外，宿主细胞免疫反应可能会降低转基因表达的长期持久性。细胞进入后的T细胞介导的免疫可能包括在细胞表面通过toll样受体（TLR）2识别衣壳并刺激TLR9介导的先天免疫。Cap在主要组织相容性复合体（MHC）I类分子上的降解和呈递可能导致通过衣壳特异性细胞毒性CD8+ T细胞清除转导细胞，并在MHC II类分子上呈递衣壳蛋白。反过来，MHC II类复合体可能被CD4+ T淋巴细胞识别，导致白细胞介素的分泌和B淋巴细胞的刺激。这可能导致针对衣壳的体液反应，从而降低治疗的长期持久性或防止成功的载体重新给药。 2.1.1.NAbs的血清流行率 考虑到AAV感染的流行率、NAbs的交叉反应性和NAb介导的rAAV介导的基因治疗的潜在抑制，了解AAV NAbs的血清流行率是很重要的。已经在健康个体以及可能适合基因治疗的患者中研究了血清流行率。人类AAV血清型1至9和生物工程衣壳的血清流行率特征因地理、种族、年龄以及检测方法和它们的灵敏度而异（表3）。需要注意的是，这里讨论的血清流行率研究主要集中在AAV上。因此，需要谨慎对待这些数据直接适用于基因治疗试验中使用的特定rAAV。 表3. 健康受试者中针对AAVs的NAbs的血清流行率。 2.1.2.地理差异在血清流行率上的表现 一项针对来自四个地区10个国家的健康志愿者的大型人群基础研究发现，抗AAV2 NAbs在所有地区中都是最普遍的抗体（30%-60%），其次是抗AAV1、抗AAV7和抗AAV8 NAbs。与其他国家相比，美国抗AAV1、抗AAV7和抗AAV8 NAbs的流行率较低。在另一项针对美国和欧洲健康志愿者的研究中，尽管注意到了一些地区差异，但抗AAV2和抗AAV8 NAbs的流行率很高。另一项对来自10个国家（澳大利亚、加拿大、法国、德国、意大利、日本、韩国、西班牙、英国和美国）的非基因治疗试验参与者的观察性回顾性研究发现，抗AAV1 NAbs的流行率最高（74.9%），其次是AAV6（70.1%）和AAV5（63.9%）。然而，流行率因检测中使用的稀释度而异，AAV5的血清流行率最低。总体而言，所有研究的AAV血清型的流行率在韩国最高，在日本、澳大利亚和美国最低。在血友病A患者中也观察到了血清型之间的相当大的地理变异性，特别是对于抗AAV5 NAbs。在一项涵盖九个国家的研究中（N=546），AAV5一致显示出所有血清型中最低的血清流行率。AAV5血清流行率的全球加权平均值（考虑到特定国家的血友病A流行率）为29.7%，血清阳性率从英国的5.9%到南非的51.8%不等。另一项研究发现，抗AAV5 NAbs的流行率从美国的21%到俄罗斯的47%不等。 2.1.3.种族差异在血清流行率上的表现 在美国对自认为属于某个种族的健康捐献者进行的一项研究发现，与自认为白人的人相比，黑人和西班牙裔捐献者对大多数AAV血清型的NAbs流行率更高。对来自10个国家的非基因治疗试验参与者的研究发现，亚洲人的血清流行率比非亚洲参与者更高。 2.1.4.年龄差异在血清流行率上的表现 在健康个体和许多疾病状态中，随着年龄的增长，抗AAV NAbs的血清流行率有所增加。一项研究调查了美国从出生到青少年期（N=752）的抗AAV NAbs血清流行率，报告称抗AAV2和抗AAV8 NAbs在新生儿中较高（分别为59%和36%），但在7至11个月大的婴儿中显著下降，然后在3至18岁的儿童和青少年中再次增加。有趣的是，在一项较小的黏多糖症III（MPS）患者和健康个体的研究中，两个队列之间的血清流行率存在差异。所有AAV血清型的NAbs在8至15岁的健康儿童中高于2至7岁的儿童，而在MPS III儿童中则相反，血清流行率在8岁之前达到峰值。 需要注意的是，并非所有研究报告了年龄和血清流行率之间的关联。例如，在一项较小的中国健康参与者研究中（N=100），年龄在≤35岁、36至50岁和≥51岁之间的参与者中，AAV2、AAV3、AAV8或AAVLK03的血清流行率没有年龄相关差异。 2.1.5.性别差异在血清流行率上的表现 一些研究提出，抗AAV NAbs的流行率可能受性别影响。在中国健康女性中，抗AAV1、抗AAV5和抗AAV8 NAbs的流行率显著高于男性。类似地，另一项研究发现成年女性的抗AAV9 NAbs水平更高。然而，并非所有研究报告了抗AAV1 NAbs的显著性别差异。在种族内部，也观察到了性别之间的差异，与性别相对应的白人女性和西班牙裔男性的血清阳性率更高。 2.1.6.根据疾病状态的血清流行率差异 AAV的NAbs血清流行率在疾病状态与健康人群之间也有所不同（表4）。证据表明，患者的血清阳性可能受疾病性质和/或接受的治疗的影响。研究中确切比率的不一致可能可以通过研究设计和实施的差异（即，检测类型：见“为rAAV基因治疗做准备：筛查抗AAV NAbs”部分）、地理位置或其他因素如年龄等来解释，但血清流行率趋势是相似的。例如，抗AAV2 NAbs在包括血友病、囊性纤维化、类风湿性关节炎和原发性Sjögren综合征在内的疾病状态中是最常见的抗体。此外，血友病A和囊性纤维化患者中抗AAV NAbs的流行率随着年龄的增长而增加。 表4. 患有单基因疾病的患者中针对AAV的NAbs的血清流行率。 关于接受血浆来源血液制品的个体中抗AAV NAbs的有趣报告。一项此类研究发现，接受血浆制品的血友病A患者中抗AAV8 NAbs增加，以及接受丙型肝炎治疗的患者中抗AAV5和抗AAV8 NAbs增加。尽管作者指出了输血传播感染的可能性，但他们承认需要进一步调查以确定原因。这通过使用高灵敏度检测方法在一系列商业可用的血浆和重组因子VIII（FVIII）及因子IX（FIX）产品中检测AAV基因序列进一步探索。结果表明，在一些血浆衍生的血液制品中存在AAV和其他病毒血清型。相比之下，另一项研究没有发现血友病B患者中抗AAV6 NAbs与接触污染血浆衍生物之间的关联。这种明显的差异可以通过所研究的AAV血清型来解释。通过NAbs的交叉反应或同一个体中多次或共感染导致的NAbs共存，对多种AAV血清型的中和活性也是可能的。这在尝试在临床实践中实施替代血清型或工程化衣壳时产生了深远的影响。 最近提出的问题与接受基于rAAV的疫苗（包括针对SARS COV-2的疫苗）的受试者中抗AAV NAbs的发展有关。由于不同AAV血清型之间高度交叉反应，这类疫苗可能使遗传疾病患者不符合未来基于rAAV的基因治疗的条件。这是一个需要进一步讨论和研究的话题。 2.1.7.预先存在的NAb滴度和给药后NAbs增加 关于预先存在的抗AAV NAbs滴度与载体转导效率之间的关系存在相互矛盾的数据。rAAV载体给药后抗AAV NAbs的存在显著增加（表5），这对重新给药有影响。在使用表达人类FIX的rAAV2进行的第一次血友病B基因治疗临床试验中，载体给药后抗AAV NAbs滴度增加了超过10,000倍。这对于治疗前有或没有可检测抗AAV NAbs的参与者都是如此。达到了治疗水平的FIX，但在输注后约8周减少，与衣壳特异性T细胞的发展相关。在大多数使用rAAV的基因治疗试验中，预先存在的抗AAV NAbs是患者入组的排除标准。例如，预先存在的抗AAV9 NAbs超过阈值的患者被排除在一期脊髓性肌肉萎缩症临床试验之外，同样，抗AAV5 NAbs的患者也被排除在血友病A的三期临床试验之外。然而，一些发现挑战了基于这一标准的排除。例如，在一期/二期血友病B基因治疗试验（NCT02396342）中，预先存在的抗AAV5 NAbs对基于AAV5的基因治疗表达hFIX的效率没有影响，即使在高滴度下也是如此。同样，在三期血友病B试验（NCT03569891）中，预先存在的抗AAV5 NAbs与AAV5介导的hFIX传递之间没有相关性，直到18个月。鉴于观察到的平均FIX活性在18个月时恢复到接近正常范围，这些试验暗示了AAV5基疗法的广泛适用性。NCT03569891试验基于基于绿色荧光蛋白（GFP）的报告基因检测排除了预先存在的抗AAV5 NAbs患者。在随后使用更敏感的基于荧光素酶的检测方法的研究中，检测到了针对AAV5的免疫球蛋白（Ig）G和IgM抗体。这些观察结果强调了使用检测NAb水平的检测方法的重要性。 表5. 在给予重组治疗性AAV载体血清型后的抗AAV NAbs的血清流行率 除了NAbs，记忆B细胞和T细胞也是由于自然AAV感染而产生的，可以在随后接触rAAV载体时重新激活。通过筛选健康捐献者的人类外周血单核细胞和血清，对自然AAV1感染的免疫反应进行调查，显示AAV1特异性T细胞和抗AAV1 NAbs反应之间没有相关性。T细胞反应主要由效应记忆CD8+细胞亚群组成。这表明，患者筛查应包括测试预先存在的AAV特异性细胞反应，而不仅仅是抗AAV NAbs。 需要标准化预先存在的抗AAV NAbs滴度与载体转导效率之间的关系。随着基因治疗产品的商业化，提供确定NAb滴度的验证检测方法非常重要。缺乏伴随某些基因治疗产品监管批准的验证检测方法，使临床医生在评估非验证NAb检测试剂盒的结果时面临挑战。 2.2.全身炎症反应 将基因治疗给预先存在的NAbs患者可能会由于免疫复合物形成、增强的载体进入抗原呈递细胞（APCs）和补体激活，特别是在较高滴度下，引起全身炎症反应。一项研究表明，NAb滴度≥1:100显著增加了对AAV载体的先天免疫反应，增加了促炎细胞因子/趋化因子的分泌、APCs对载体的摄取和补体激活。由于补体是抗AAV免疫反应的重要调节因子，抑制补体途径可能有助于减轻抗AAV免疫反应。 3.为rAAV基因疗法做准备 3.1.筛选抗-AAV NAbs 有几种检测方法可以量化人体内的中和性和总（非中和性加中和性）抗-AAV抗体，包括体外基于细胞的检测方法和酶联免疫吸附测定（ELISA）的变体（图4）。协议和试剂尚未标准化，通常需要根据正在研究的AAV血清型和/或转基因进行调整。最广泛使用的体外基于细胞的检测方法是转导抑制测定，该方法涉及使用“报告基因”测量转导水平（图4A）。与治疗性转基因不同，rAAV载体含有报告基因，如GFP、β-半乳糖苷酶或荧光素酶，这在宽动态范围内提供了一种方便且敏感的转导测量方法。然后通过测量报告蛋白的活性来评估NAbs抑制特定AAV载体转导的能力（图4B）。抗-AAV NAb滴度定义为最高稀释度，该稀释度抑制转基因表达指定量（例如，≥50% [ID50]）。这种方法的优点是它使用了与基因治疗载体中相同的AAV衣壳，重现了临床环境。然而，输出（例如，转导抑制50%）可能与生物学上相关的患者反应无关。由于检测测量的是转导的减少，除了NAbs之外，可能还涉及其他因素。例如，并非所有AAV血清型在体外都能高效转导，检测的灵敏度可能取决于AAV载体基因组的数量或感染的多重性（MOI），以及所使用的细胞系和报告系统。实际上，荧光素酶报告系统可能比基于GFP的报告系统更敏感。此外，载体制剂的纯度也会影响NAb滴度，存在单体或寡聚体衣壳蛋白、“空”载体或含有截断基因组或基因组DNA的载体可能会影响该检测的结果。血清中其他因素的抑制作用，如人类血清半乳糖凝集素3结合蛋白（G3BP），也可能影响检测的灵敏度。此外，这些检测通常是专有的，因此标准化和广泛应用仍然具有挑战性。因此，随着临床基因疗法的普及，协调这些检测方法在管辖区内外的机会迫在眉睫。另一种体外基于细胞的检测方法是中和测定，该方法测量AAV载体与目标细胞的结合（图4C）。由于抗-AAV NAbs可以干扰AAV与目标细胞的结合，培养液中NAbs水平的增加与可测量的rAAV细胞结合减少有关。通常通过测量报告蛋白的活性来评估NAb抑制AAV结合的能力。由于许多基于细胞的检测方法耗时，因此开发了使用实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）方法而不是报告基因来确定NAb滴度的新方法，并且可以快速、高效、经济地应用于所有血清型（图4C）。还开发了其他快速基于细胞的检测方法，为体内NAb滴度的确定提供了替代方法。然而，中和测定并不直接告知整体基因转移效率或转导，因为未评估细胞结合后的步骤。总抗体检测，如ELISA，可用于测量抗体与整个AAV衣壳或衣壳蛋白的结合。这些通常涉及用AAV衣壳（完整或空的）或肽段涂覆检测板，添加患者样本，最后检测信号（图4D）。基于肽段的ELISA可能比基于衣壳的ELISA更敏感、特异和一致。与细胞培养协议相比，基于肽段的ELISA方法具有简单性的优势，尽管没有直接测量中和活性，而是捕获了总抗-AAV抗体的水平。总抗体检测测量针对AAV的中和性和非中和性抗体。有证据表明，总抗-AAV抗体水平与NAbs水平之间存在相关性。已有研究表明，非中和性抗体可能增强某些血清型的转导率，包括AAV8，尽管这一现象背后的机制尚未确定。因此，需要进一步研究使用总抗体检测来确定患者是否适合AAV基因疗法。 图4. 用于检测AAV免疫的检测方法。(A) 一种体外基于细胞的转导抑制测定，使用“报告基因”如GFP、β-半乳糖苷酶或荧光素酶，这提供了方便且敏感的转导检测。报告基因表达的抑制程度与血清样本的稀释度作图对比。抗-AAV NAb滴度定义为与阴性对照样本相比，最高血清稀释度抑制载体转导指定量（例如，≥50%）。(B) 一种体外基于细胞的中和测定测量rAAV与目标细胞的结合。NAbs水平的增加与rAAV细胞结合成比例减少。(C) ELISA可用于测量抗体与AAV衣壳或其他血清型特异性蛋白或肽段的结合。该方法包括用AAV衣壳（完整或空的）或肽段涂覆测定板，添加患者样本，最后检测信号。AAV，腺相关病毒；ELISA，酶联免疫吸附测定；GFP，绿色荧光蛋白；NAb，中和抗体；qRT-PCR，定量逆转录聚合酶链反应；rAAV，重组腺相关病毒；IC50，半数最大抑制浓度。 目前，除了缺乏标准化的检测方法外，不同研究中NAb阳性的截断值也存在差异。这使得跨研究比较NAb滴度变得困难，特别是当使用的检测方法细节缺乏时。在血友病患者中进行的临床试验就体现了这个问题，使用的截断值和检测类型存在差异。例如，在一项使用基于rAAV5载体表达FVIII的严重血友病A男性患者（NCT02576795）的试验中，排除是基于体外转导抑制测定，截断值为44.9%转导和总抗-AAV5抗体检测的信号稀释≥39.7%。所使用的转导抑制测定采用了HEK293T/17细胞系，rAAV5载体表达荧光素酶报告基因，MOI为25,000载体基因组（vg）/细胞。另一项使用基于rAAV5载体表达野生型人类FIX的血友病B成人（NCT02396342）的试验，排除是基于29%的转导抑制。该测定采用了rAAV5载体表达GFP报告基因，但没有提供MOI的详细信息。在另一项使用基于rAAV5载体的2b期试验（NCT03489291）中，包括了可检测到抗-AAV5 NAbs滴度的患者。NAb水平是使用HEK293T细胞系、rAAV5载体表达荧光素酶报告基因和MOI为378.4 vg/细胞确定的。随着利益相关者，包括临床医生、科学家、行业、消费者和监管机构寻求比较试验结果，标准化报告每单位体积（例如，μL）血清或血浆中中和的AAV载体颗粒数量的方法将是必不可少的。 3.1.1.抗-AAV NAbs筛查以确定AAV基因疗法的适用性 在AAV基因疗法施用前常规评估NAbs的滴度，这很重要，因为即使低滴度也可能潜在地抑制系统施用后的载体转导。指南建议在开发过程的早期开发适当的检测方法，以测量对基因疗法产品的免疫反应，以监测结果并指导治疗决策。然而，预先存在的抗-AAV NAb滴度与临床载体转导水平之间没有明确、一致的关系。在最近对临床AAV使用的元分析中，确定45%的试验排除了具有预先存在的抗-AAV Nabs的受试者。这在治疗领域之间有所不同，从眼部疾病不到10%到血液疾病约90%。最近一项针对严重血友病A的AAV5介导的基因疗法的1/2期临床研究排除了具有预先存在的抗-AAV5 NAbs的患者。长达3年的免疫原性数据显示，由载体输注引起的主要免疫反应主要限于发展对其他血清型的交叉反应的抗-AAV5抗体反应，包括AAV2、AAV6、AAV8和AAVrh10。另一项针对血友病A的3期研究（NCT03370913）也排除了具有预先存在的抗-AAV5 NAbs的患者，该研究成功减少了参与者的出血和对FVIII浓缩物的需求。相比之下，另一项目前正在招募具有预先存在的抗-AAV5 NAbs的患者的研究，这将有助于告知NAbs是否应作为排除标准，特别是对于基于AAV5的基因疗法临床试验。其他最近的研究表明，NAbs可能并不总是损害基因传递的效力，正如前面讨论的1/2期试验（NCT02396342）。事实上，在这项试验中，观察到的最高输注后FIX活性是在具有最高预先存在的抗-AAV5 NAb滴度1:340的参与者中，表明效力并不总是与抗-AAV NAb滴度相关。在一项针对血友病B的不同AAV5基基因疗法的2b期试验（NCT03489291）中，所有参与者在最初的26周随访和2年随访期间都达到了主要效力终点，并具有持续的FIX产生和防止自发性出血。因此，在随后的3期试验（NCT03569891）中，预先存在的抗-AAV5 NAbs没有被用作排除标准。18个月和24个月的随访数据显示，治疗效果与预先存在的抗-AAV5 NAbs之间没有相关性。值得注意的是，54名注册参与者之一在载体剂量前有高抗-AAV5 NAb滴度3212，并且没有对治疗做出反应。这些发现表明，在一般人群中发现的NAb滴度水平的患者中可能可以实现临床意义的结果，因此可能使更多的患者能够从基于AAV的基因疗法中受益。载体剂量对结果和长期临床影响的完整程度尚不清楚，需要进一步调查。AAV5血清型也可能是独特的，对NAbs不太敏感。鉴于预先存在的NAbs对结果的影响，需要可靠的体外检测方法来检测抗-AAV NAbs，不仅用于患者选择，而且用于指导治疗前、治疗中和治疗后患者的临床管理。 3.2.减轻抗-AAV NAbs的策略 3.2.1.减轻预先存在的抗-AAV NAbs的策略 鉴于全球大多数人口已接触AAV，并且可能对特定AAV血清型具有高水平的预先存在的NAbs（表3），开发减轻风险的策略，并且可能扩大基因疗法适用的患者人群（表6）是很重要的。在低滴度NAbs存在的情况下，给予高载体剂量可能是克服NAbs影响的一个选择。然而，临床和前临床研究已经证明，在通过脑脊液给予高剂量AAV载体后，背根神经节出现毒性（尽管没有观察到临床症状）。改变给药方式或途径可能是减少对AAV介导的基因疗法的体液免疫反应的另一个选择。在猕猴中进行的一项研究表明，使用生理盐水冲洗的门静脉导向传递AAV8基载体是有效的，可以最小化预先存在的抗-AAV8 NAbs的抑制作用。同样，对预先存在抗-AAV NAbs的患者进行肌肉注射基于rAAV2的血友病B基因疗法，已被证明可以成功进行基因转移，表明这种方法对NAbs的中和活性不太敏感。但需要注意的是，尽管基因转移成功，但在这次试验中循环FIX低于治疗水平，并且肌肉注射rAAV载体后可以触发针对衣壳的T细胞反应。确定具有改变表位的AAV衣壳可能是另一种策略，这可能能够避免预先存在的NAbs的中和活性。或者，可以使用血清流行率较低的AAV血清型，因为已经鉴定出100多种自然发生的AAV。例如，在39名患有Sjögren病的患者和38名健康捐赠者的血清中比较AAV2、AAV4、AAV5、AAV12和BAAV的NAb水平，发现AAV12在两组中的血清流行率最低。AAV载体也可以通过定向进化或AAV衣壳的合理设计突变进行工程改造——这可能导致具有不同组织趋向性、免疫原性和/或对NAbs的敏感性的衣壳。然而，针对人类基因疗法的人为衣壳工程与几个挑战相关。首先，设计具有所有期望属性（趋向性、免疫逃避、包装能力、安全性）的衣壳是低效的。这个过程可能会改变自然生物学，降低包装能力，影响大规模生产，甚至增加抗原负荷。在临床前和临床环境中都需要对每种新的衣壳进行所有这些方面的评估。尽管如此，有几份报告表明，AAV衣壳的修改可以导致逃避NAb的载体。AAV衣壳的额外非遗传性、化学修饰可能避免体液免疫反应和NAbs的中和。例如，将AAV表面与聚乙二醇链（PEG化）结合可能保护AAV载体免受NAbs的影响。在最终载体配方中包含抗体诱饵，如空衣壳，可能克服NAbs的抑制作用。然而，空衣壳也可能有助于MHC I类上呈现的衣壳抗原的总数，并且也可能对AAV载体的免疫原性产生影响。在基因转移期间或之后给予的免疫抑制剂通常用于防止rAAV转导细胞的排斥。然而，尽管它们在抑制抗-AAV T细胞反应方面显示出有效性，但使用这种方法绕过预先存在的NAbs是具有挑战性的。血浆置换术，使用过滤或离心技术从个体血液中选择性体外去除AAV特异性NAbs，可能有助于管理血清阳性患者并实现成功的AAV转导。使用免疫球蛋白降解酶如imlifidase进行预处理，可以切割血清阳性患者的IgG抗体，以降低预先存在的NAb水平，可能会产生类似的结果。尽管这些策略已经适度降低了滴度，但它们并没有消除NAbs的存在。需要确定一种或多种或全部上述策略的组合对减轻预先存在的NAbs的影响最有益。 3.2.2.减轻给药后针对rAAV载体的体液免疫的策略 由于在rAAV载体给药后抗-AAV NAbs的水平可能会显著增加，防止重新给药相同的载体，因此开发减轻给药后针对rAAV载体的体液免疫的策略是很重要的（表6）。最小化载体剂量是其中一种策略，因为rAAV载体的免疫原性似乎是剂量依赖性的。可能可以使用低剂量载体与广谱免疫抑制剂（如皮质类固醇）一起管理转基因的表达。这些已在批准用于遗传性视网膜营养不良症的治疗中使用（1.5 × 1011  vg），并在Crigler-Najjar综合征的治疗中开发（2 × 1012 vg/kg至5 × 1012  vg/kg剂量）。通过降低CD4+辅助T细胞，可以间接降低抗-AAV NAb水平，因为它们能够调节B细胞和抗体产生后代浆细胞的功能。例如，在几种临床前眼部模型中抑制B细胞激活显示出前景。使用组织特异性启动子减少转基因的非目标表达也可以限制针对转基因的免疫反应。有效克服预先存在的NAbs并预防针对AAV基因疗法的体液免疫的策略可能包括多种方法的组合，特别是如果患者具有高预先存在的NAb滴度。 表6. 正在研究的策略，用以减轻预先存在的抗-AAV NAbs以及基因治疗后对rAAV载体的体液免疫。 3.3.儿科患者的考虑因素 接受基于AAV的基因治疗的儿科患者有一些特别的考虑。在考虑预先存在的抗-AAV NAbs的挑战时，3岁以下患者的血清流行率最低，并且随着年龄的增长逐渐增加至成年期。这可能是一个最佳的治疗窗口，此时抗-AAV NAbs的风险最低，适合基因治疗的患者比例最高。然而，当AAV载体输送给儿科患者时，随着肝脏生长和血容量增加，转基因表达可能会稀释。对于像血友病这样的疾病，单次给予基于AAV的载体可能足以实现终生受益，其治疗阈值相对较低，即使转基因的低表达也可能将疾病表型从严重转变为轻度。由于从出生到青少年时期肝细胞的增殖，预计游离的rAAV会稀释，可能导致治疗效益的丧失。对于需要强大转基因表达或在儿童期治疗的疾病，可能需要重新给药或使用载体基因组整合或基因组编辑的方法。 4.结论 有令人信服的证据表明，rAAV已成为人类基因治疗的确立载体。尽管许多临床试验已经显示了rAAV介导的基因转移的疗效和安全性，但NAbs（预先存在的或治疗后诱导的）仍然是一个重大挑战。人类中AAV血清型的血清流行率特征因地区、地理、种族和年龄而异。由于NAb水平是临床试验中重要的患者排除标准，对于准备进行基因治疗的医疗专业人员来说，了解与NAbs相关的挑战及其对AAV基因治疗临床试验的资格以及减轻其影响的策略的影响是很重要的。需要阐明NAb滴度与对个别AAV血清型转导的影响之间的关系。特别是对于像AAV5这样在NAbs存在时与其他AAV血清型表现不同的衣壳。临床基因治疗在报告每单位体积血清或血浆中和的AAV载体颗粒数量时需要一致的方法。可能需要全面和组合策略来减轻AAV NAbs，以克服预先存在和治疗后的体液免疫反应。基因治疗试验通常是小型、单臂、短期试验，因为合格患者是从有限的潜在人群中筛选出来的，这些人群患有罕见、严重或晚期疾病。使用来自注册表和电子健康记录的实际世界证据将是了解长期患者结果和实际世界有效性的重要方面。

什么样的药企能够可持续发展？ 上世纪50年代，默沙东时任CEO乔治·W·默克说过一段制药界广为流传的话： “我们应当永远铭记，药物是为了人类而生产，而不是为了追求利润而制造。只要我们坚守这一信念，利润必将随之而来。” 确实如此。纵观海外大型药厂，它们成功的关键在于以患者为中心，具有强烈的社会责任感。在国内，这样的例子也越来越多。 例如，神州细胞的愿景，是专注研发百姓急需药品，为患者提供高品质且经济可承受的生物药。看起来，与默沙东不谋而合。 在产品端，神州细胞利用技术创新，提供质量更高、成本更低的药物，减轻了国内患者的经济负担，同时带来了更好的治疗效果，实现了经济效益和社会效益的双赢。 正是基于这样的经营逻辑，神州细胞的业绩实现了持续增长。2024年上半年，公司营收达到13.04亿元，继续保持高速增长，增速达61%。 从其基于愿景构筑的产品管线潜力来看，神州细胞的成长才刚刚开始。 或许，在当前的创新药市场中，神州细胞的发展轨迹能够为市场提供一些有益的启示。 让患者不再彷徨 根据半年报，神州细胞业绩的增长引擎，是重组八因子安佳因®： 凭借突出的产能和成本优势，市场占有率和渗透率进一步提升，销售收入继续稳定增长。 当然，仔细研究能够发现，安佳因®的持续放量，固然是得益于产能和成本优势，但更深层次的原因，是其作为首个国产重组八因子，很好弥补了未被满足的市场需求。 血友病作为一种凝血功能障碍的疾病，不仅在异常出血时容易造成严重伤害，而且还可能以潜移默化的方式影响关节等部位，因此对治疗的需求极大。 然而，在安佳因®出现之前，受限于来源以及国产品牌的技术路径，我国八因子的人均使用量显著低于世界平均水平。根据开源证券发布的研报数据，2018年中国人均凝血八因子使用量仅为0.026IU，甚至低于印度。 图片来源：氨基观察 正是在这一背景下，安佳因®应运而生。2021年7月，安佳因®作为国内首款重组凝血八因子获批，凭借其卓越的效果和安全性，打破了进口垄断，有效增加了市场供应。 以更大的视角来看，这是“为了人类而生产药品”的一个典型。 安佳因®供给的增加，使我国血友病患者的用药水平和身体状况得到显著改善，降低了因治疗不足导致的致畸致残风险，实现了经济效益和社会效益的双赢。同时，该产品也为公司带来了持续、稳定的收入。 2023年1月，安佳因®儿童适应症获批，进一步满足了儿童患者的用药需求，助力公司营收继续增长。 目前来看，在满足患者需求方面，安佳因®还有更多的提升空间。 一方面，我国目前A型血友病患者接受治疗的比例仍然偏低，2022年末仍不足20%，这表明背后有很大的提升空间。 另一方面，我国A型血友病患者的治疗用量还没有达到国际平均水平，进行预防治疗的患者比例较低。这也意味着，在人均用量方面还有增加的空间。 在帮助我国更多患者接受治疗，并且确保足量使用的过程中，安佳因®也将继续扩大供应，持续放量。 不只是重组八因子 秉承着“专注研发百姓急需药品，为患者提供高品质且经济可承受的生物药”的愿景，神州细胞的成就不仅限于首个国产重组八因子，而是实施了双轮驱动的研发战略布局，后续管线蓄势待发。 一方面，针对市场成熟但价格可能仍然昂贵的生物药领域，神州细胞希望利用其强大的工艺和成本优势，使更多患者受益。基于这一逻辑，瑞帕妥单抗注射液、阿达木单抗注射液、贝伐珠单抗注射液等产品先后获批。 另一方面，神州细胞着眼于临床需求尚未得到满足的领域，布局了多个具有潜力的改进型或同类最佳产品管线。例如新冠疫苗、14价HPV疫苗以及IL-17单抗等。 以患者需求为基础构筑起来的管线，背后的放量逻辑自然也极为清晰。 例如，神州细胞的新冠疫苗安诺能®4，对当前多个主要流行毒株及其子变异株的针对性和广谱性，是当前应对变种毒株的核心武器之一。 目前，新冠疫苗的接种需求仍然存在。新的变种毒株XEC在海外肆虐，有专家预计该毒株可能在冬天蔓延。根据国家新冠病毒疫苗接种政策，已完成基础免疫或已感染新冠病毒的目标人群，在最近一次接种3—6个月后或最近一次感染6个月后，可接种1剂次含XBB变异株抗原成分的疫苗。 而目前新冠疫苗已经转为自费支付，这意味着神州细胞能够基于其研发投入，收取合理的商业回报。 14价HPV疫苗的前景，同样让人期待。“价”指的是疫苗包含的病毒型别种类。“价”越高，能预防的HPV病毒亚型种类就越广，保护率相应也越高。然而，随着“价”的增加，研发和产业化的难度也会相应提高。目前，全球市场上最高价的HPV疫苗为9价。 面对HPV疫苗保护率仍有提升空间的挑战，神州细胞率先投入14价HPV疫苗的研发，并已完成3期临床研究的第三针接种，目前处于随访阶段。 按照我国批准上市的九价HPV疫苗接种适应年龄范围为9至45岁适龄女性，以国内9至45岁女性人口3.1亿测算，九价HPV疫苗渗透率仅约为10%。对比之下，欧美发达国家高达50%～60%的渗透率，意味着我国高价HPV疫苗的渗透率有着极大提升空间。也正因此，神州细胞的14价HPV疫苗，在未来具备持续放量的可能。 此外，神州细胞在肿瘤、自身免疫病等核心领域的多个管线也基于同一理念，正在加速推进中。 例如，PD-1单抗SCT-I10A单药用于一线治疗头颈部鳞状细胞癌，以及联合贝伐珠单抗一线治疗肝细胞癌的两个适应症的上市申请，已分别于2023年11月和2024年1月获得受理，并已顺利完成该两项适应症的注册现场核查。 根据过往NMPA审批节奏来看，SCT-I10A可能于近期获批，成为神州细胞实现其愿景的一大有力帮手。 同时，公司自主开发的用于治疗CD38阳性血液系统恶性肿瘤的单抗产品SCTC21C、用于治疗CD20阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤的双特异性抗体产品SCTB35、用于治疗多种实体瘤的双特异性抗体产品SCTB14，均已启动I期临床研究。 IL-17单抗SCT650C则正在开展针对银屑病的国内Ib期临床研究，并已启动针对中轴型脊柱关节炎（强直性脊柱炎）适应症的全球多中心（包括土耳其和中国）II期临床研究。 神州细胞怀有远大的抱负，希望通过不懈努力，为患者带来更多高品质且经济可承受的生物药，这也构成了神州细胞持续成长的底层逻辑。 “以终为始”的信念 支撑一家药企走得更远、更稳的因素是什么？ 或许，有人会回答，管线的质量；可能，也有人会说，企业的管理能力。确实，上述要点，可能都事关药企成败。 但纵观海外药企发展，最为核心的因素，还应当是核心价值观。一家企业的核心价值观，决定了它的使命、愿景和发展方向，同时也是企业文化的核心。 不论是默沙东、强生，还是礼来、诺和诺德，这些知名大药企的核心价值观都是围绕着为患者生产药这一宗旨。正是这种坚定的信念，使它们的产品能够不断地更新迭代，最终成为一代药王。 核心价值观支撑药企长远发展的逻辑，也将是神州细胞的故事。 基于“用毕生精力做好药”的使命，支撑神州细胞在激烈市场竞争中稳步前行的逻辑清晰可见。 在创新药领域，质量、成本和效果构成企业竞争力的三大支柱。在这三大维度上，神州细胞均不断追求卓越，通过确保药品的高质量，同时在成本控制和疗效提升上展现优势，从而确立了其在行业中的核心竞争力。 同时，政策对于创新药产业的重视与扶持，更是为神州细胞等具有社会责任感的药企提供了发展的良好时机。7月初，《全链条支持创新药发展实施方案》获得国务院常务会议审议通过，将强化政策保障，统筹用好价格管理、医保支付、商业保险、药品配备使用、投融资等政策，优化审评审批和医疗机构考核机制，合力助推创新药突破发展。 除了最顶层的政策方案，包括北京、上海等地也相继发布了相关产业发展政策。随着医疗改革的不断深入和各类扶持政策的落地推进，神州细胞能够持续、高效地将创新药品推向市场，迅速响应患者的医疗需求。 在这个过程中，公司也将获得相应的回报。正如乔治·W·默克所言，“只要我们坚守这一信念，利润必将随之而来”。 究其根源，支撑一家药企能走多远的，在于其能否在变化莫测的市场环境中，始终保持初心，坚持创新，以患者需求为导向，不断提供高质量的产品和服务。对于神州细胞这样的企业来说，它们已经在路上，正以坚实的步伐，迈向更加辉煌的未来。 来源 | 氨基观察（药智网获取授权转载） 撰稿 | 蔡九 责任编辑 | 八角 声明：本文系药智网转载内容，图片、文字版权归原作者所有，转载目的在于传递更多信息，并不代表本平台观点。如涉及作品内容、版权和其它问题，请在本平台留言，我们将在第一时间删除。 商务合作 | 王存星 19922864877（同微信）  阅读原文，是受欢迎的文章哦