Recombinant coagulation factor VIII ( Sino Cell Technologies)

近日，神州细胞发布2024年度中报业绩报告，报告期内，公司实现营业收入13.05亿元，同比增长61.45%。归属于上市公司股东净利润1.26亿元，首次实现半年度盈利。 自有财务记录以来，神州细胞连续8年录得亏损，随着过去两年来公司营收飞速增长，亏损大幅缩小，公司也越来越靠近盈利。 事实上，2023年神州细胞就离盈利仅差临门一脚了，2023年公司全年总营收约18.87亿元，扣非净利润-6368.05万元，在今年Q1季度也实现了扭亏为盈，归母净利润7419.74万元。照此营收增速，神州细胞今年实现全年度盈利在望。 推动营收迅速增长的最大贡献者无疑还是安佳因。 安佳因®（重组人凝血因子VIII）是神州细胞首个获批产品，于2021年7月获批上市，用于成人及青少年（≥12岁）血友病A患者出血的控制和预防。 在神州细胞的重组八因子上市之前，国内重组八因子市场被拜耳、百特、辉瑞等跨国公司控制，没有一款国产重组八因子药物。 安佳因是国内首个获批上市的国产重组人凝血因子Ⅷ，凭借先发和成本优势，上市后迅速放量，在1年内就扭转了国内重组八因子的市场格局。首年，安佳因的销售额达到1.34亿元，2022年销售额破10亿大关，达到10.23亿元。2023年新增了12岁以下儿童适应症，全年销售额约17.8亿元，占据公司总营收的90%以上。 目前神州细胞也在布局安佳因的海外市场，公司与印度、俄罗斯等十多个国家的合作伙伴签约，预计到2025年会陆续在海外上市。 除安佳因外，神州细胞还有三款上市产品，分别是2022年8月获批上市的瑞帕妥单抗注射液、2023年6月先后获批的阿达木单抗生物类似药--安佳润以及贝伐珠单抗生物类似药--安贝珠，不过三者的营收远不及安佳因，2023年加起来的总收入为1.03亿元。 造成亏损多年没能实现盈利的重要原因之一，就是神州细胞一直保持了相对高水平的研发投入，过去5年来，神州细胞研发费用累计超过40亿元。今年上半年研发费用为4.76亿元，较上年同期略有下降，主要用于SCTV01、SCT1000、SCT-I10A 等产品的临床中后期研究，以及众多产品的临床前开发。 后续管线方面，PD-1单抗SCT-I10A用于一线治疗头颈部鳞状细胞癌和联合贝伐珠单抗一线治疗肝细胞癌的两个适应症已经递交了上市申请，头颈鳞癌适应症为国产首家申报。 另外，公司自主开发的14价HPV疫苗SCT1000已经完成III期临床第三针接种，目前正处在随访阶段。该HPV疫苗涵盖了WHO公布的全部12个高危致癌的HPV病毒型及2个最主要导致尖锐湿疣的HPV病毒型，相比九价HPV疫苗（92%），可将保护率提高到96%。 参考出处：神州细胞之年！财务记录亏损八个年头后盈利，重组VIII因子造血

摘要：治疗性抗体在临床上的广泛应用已经改变了包括罕见和具有挑战性条件在内的许多疾病的药物疗法格局。然而，外源生物制剂的给药可能会潜在地触发不希望的免疫反应，例如产生抗药物抗体（ADAs）。现实世界的经验已经揭示了ADA发生与不满意的治疗结果以及免疫相关不良事件之间的明确相关性。通过回顾性检查涉及免疫原性分析的研究，我们注意到人们越来越强调阐明基于抗体的治疗药物的免疫原性表位谱，以机制性理解免疫原性的产生，并理想地减轻风险。因此，我们在这里全面总结了实验和计算方法在治疗性T细胞和B细胞表位表征方面取得的进展。此外，本文特别强调了生物治疗药物去免疫原性驱动的表位成功实践。 1.引言 由于其卓越的生物活性、特异性和安全性，治疗性单克隆抗体（mAbs）是治疗蛋白（TPs）中最有前途的类别之一，现在已成为生物制药行业组合的重要组成部分。尽管有许多优点，作为外来大分子，mAbs和其他基于抗体的TPs（图1a）可能会引发不需要的体液免疫反应，通过触发抗药物抗体（ADAs）的发展，这些抗体通过调节生物治疗药物的效力、药代动力学和药效学（PK/PD）以及免疫相关的安全性特征，表现出多样的临床意义（图1b）。根据mAbs（即，嵌合型、人源化、全人源）的遗传来源，位于框架区（FR）或互补决定区（CDRs）中的非生殖系内容可能导致治疗后显著的ADA出现。ADA（既有预先存在的也有治疗后出现的）的程度需要在整个药物给药过程中密切监测，正如监管当局所要求的。对于涉及具有高免疫原性风险的生物治疗药物的临床研究，可能需要在研究结束后延长ADA监测，因为一些个体中ADA的持续存在。 图1. 免疫原性对基于抗体治疗药物的影响。(A) 不同基于抗体治疗药物的结构图。mAb，单克隆抗体。KIH，旋钮-孔洞。BiTE，双特异性T细胞引导剂。ADC，抗体-药物偶联物。Fv，可变片段。(B) 对基于抗体治疗药物的影响。结合到mAb的表位的ADA引发中和能力，从而导致治疗效果减弱。ADA还可能触发I型（IgE介导）和II型（IgG介导）超敏反应的发生。一旦ADAs（IgM或IgG）和治疗药物形成免疫复合物，就可能发生与III型超敏反应相关的不良事件。免疫复合物的大尺寸也导致治疗药物从血液中更快清除。该图表是在BioRender.com上创建的。 近年来，许多工程化基于抗体的治疗药物（例如，抗体-药物偶联物、多特异性抗体）和抗体类似分子（例如，重链可变域[VHHs]、设计的ankyrin重复蛋白）正在作为药物或TP组分开发，许多产品已进入临床阶段。值得注意的是，随着多域生物治疗药物（MDBs）、细胞疗法和基因疗法等创新生物模式的爆发，ADA风险的复杂性和特异性有所增加。因此，需要一种综合策略来评估和表征免疫原性，以促进生物制药的非临床发现、临床开发以及上市后监测。 ADAs的产生涉及两种机制：T细胞非依赖性（Ti）和T细胞依赖性（Td）B细胞激活（图2）。Ti过程是由治疗药物的重复表面抗原通过多价交联B细胞受体（BCR）启动的，随后是BCR信号的激活和抗体的快速分泌。通过Ti途径产生的抗体主要是短暂存在的五聚体免疫球蛋白M（IgM），由于缺乏体细胞超突变和亲和力成熟过程，它们对目标的结合亲和力低。在生物制药研究中，一个已经很好地阐明的Ti介导的抗体产生情况是，在给药聚乙二醇化纳米药物后出现的抗聚乙二醇（PEG）IgM。另一方面，IgG类型的ADAs，具有高亲和力和长期持久性，主要是通过Td途径产生的，这涉及通过内质体-溶酶体系统由抗原呈递细胞（APCs）如树突细胞（DCs）摄取和水解TPs。从TPs衍生的短肽可能与抗原处理细胞内的MHC II类分子复合，然后被运输到DCs表面，允许与生发中心的滤泡辅助T淋巴细胞（Tfh）表达的特定表位T细胞受体（TCR）结合。 图2. T细胞依赖性和非依赖性B细胞激活途径的示意图。DC，树突细胞。pMHC II，肽-MHC II复合物。TCR，T细胞受体。BCR，B细胞受体。该图表是在BioRender.com上创建的。 DCs在抗原处理过程中成熟并产生对CD4+辅助T细胞激活所必需的细胞因子。与MHC II限制性肽段相关的互补TCR被定义为T细胞表位（TCEs）。激活的、抗原许可的Tfh群体进一步与已经遇到并呈现相同抗原的B细胞结合，并产生诱导B细胞向分泌ADA的浆细胞成熟的必需细胞因子。在这一点上，一部分B细胞获得了在二次免疫后更快反应的潜力，并分化为记忆群体。在B细胞的抗原处理过程中，称为B细胞表位（BCEs）的抗原内特定区域被BCRs识别，以促进它们的摄取和处理。虽然理论上TCEs可以分布在整个抗原蛋白中，但BCEs限于BCRs/抗体直接可访问的表面积。TCEs和BCEs的存在共同决定了ADA产生的可能性。因此，研究人员需要通过检查TCEs和BCEs（它们可能重叠也可能不重叠）来明确评估生物治疗药物的免疫原性风险。 进行分层免疫分析以检测总ADA和中和ADA（Nab）是TPs开发的标准实践，正如监管指南和行业白皮书（或建议）所支持的。然而，基于完整治疗药物的免疫分析并不能提供深入的信息，如表位谱，这些信息包含了概述抗治疗免疫影响的关键见解。因此，已经开发了许多方法来表征TCE/BCE以满足不同的研究目的。在这项工作中，我们旨在通过重点介绍用于特别分析基于抗体的治疗药物的TCEs和BCEs的方法，提供免疫原性评估的战略概述。 2.实验策略用于TCE发现和免疫风险降低  TPs的免疫原性主要由Td免疫反应决定。因此，可以预先在早期发现阶段进行TCEs为重点的免疫原性评估，用于领先评估，或事后用于临床免疫原性表征，对于勾画候选药物的开发能力至关重要。由于外源性Td免疫反应的一些关键步骤可以通过培养的细胞重现，因此开发了许多体外检测平台来监测生物治疗药物的T细胞介导的免疫原性。这些方法涉及测量与HLA II分子的物理或功能性结合的治疗药物衍生肽，如表1所总结。以下段落中的例子说明了不同的TCE表征方法。值得注意的是，这些策略，即体外结合、免疫肽组学和基于细胞的方法，通常以综合方式利用。 2.1.体外HLA结合 肽-MHC II结合是Td免疫原性先决条件，在CD4+ T细胞激活之前。考虑到肽-MHC II相互作用的分子特征得以保留，研究人员试图通过检查合成肽与MHC II分子的结合来调查抗原的TCE谱。体外HLA结合测定用于鉴定或验证治疗性mAbs（如英夫利昔单抗）的TCE簇，这是一种嵌合型肿瘤坏死因子（TNF）靶向mAb，在人类中具有相当的免疫原性。Hamze等人的研究中合成了来自英夫利昔单抗重链和轻链的重叠15-肽，并将其分组为亚池进行体外结合测定。结果发现，位于重链（HCDR2、HCDR3）、轻链框架区1和2（LFR1、LFR2）附近的肽与许多HLA II等位基因结合得足够好。由于结合测定通常与其他方法一起进行，而不是单独用于TCEs的去新识别，我们在后续部分讨论了更多涉及基于抗体的药物免疫原性分析的例子。 体外结合测定的使用也促进了对许多治疗蛋白（TPs）酶替代疗法免疫原性风险的理解。促红细胞生成素（EPO）通常用于恢复纯红细胞再生障碍患者对EPO产生自身抗体的红细胞生成。因此，提出了诸如引入N-糖基化或消除T细胞表位（TCEs）的蛋白质工程策略来规避免疫原性问题。Tangri等人使用来自野生型人类EPO的合成肽库进行了体外HLA II结合筛选。令人惊讶的是，几乎所有肽都显示出与一个或多个HLA II等位基因结合的亲和力。在肽筛选阐明的TCE景观基础上，通过修改最具免疫原性的肽并随后通过外周血单核细胞（PBMCs）增殖测定来实现EPO的去免疫原性。HLA II结合测定也用于表征和减少因子VIII（FVIII）的免疫原性，FVIII是血友病A患者缺乏的关键凝血因子。与EPO类似，临床研究表明，在治疗过程中，大量接受野生型FVIII的患者发展出抑制性抗体。Steinitz等人使用合成肽库鉴定了八个T细胞表位簇。在随后的研究中，通过使用具有单突变肽的HLA II结合测定定位了一个关键的表位肽后，研究人员随后定位了关键残基。相应地产生了去免疫原性FVIII突变体，并通过T细胞功能测定进行了验证。 肽-MHC II结合的机制理解得到了大规模体外肽结合研究的证实。例如，Wang等人进行了最全面的肽-MHC II结合筛选，共有180个库，每个库有一个固定氨基酸的位置和另外19个位置是所有20种天然残基的等量混合物。这些库被测试了结合亲和力，并产生了约40,000个结合亲和力数据点，涉及全球人群中频率较高的26个HLA II等位基因。基于对肽-MHC II结合的深入阐明以及实验结合亲和力数据的积累，许多计算TCE预测算法已被实施，以替代体外MHC II结合测定用于初始表位筛选。体外结合测定通常用于验证来自替代策略的候选肽。然而，需要注意的是，结合表位不一定是随后引发免疫反应的“功能性表位”。因此，MHC II结合测定通常与体外T细胞测定结合使用，以功能性验证抗原衍生肽。 2.2.免疫肽组学 体外结合测定提供了一种无偏的方法，全面检查任何给定TPs的潜在TCEs，但它并不考虑生理条件下的抗原处理。MHC相关肽蛋白质组学（MAPPs）测定是一种基于细胞的体外方法，用于鉴定由DC自然呈现的MHC II限制性肽。为了建立这种测定，需要从PBMCs中最初分离出CD14+单核细胞，并通过分化混合物处理以获得高HLA II表达的DCs。通过TPs脉冲处理后细胞裂解，pMHC II复合物可以免疫沉淀，通过质谱（MS）鉴定HLA相关肽组。通常需要来自多个捐赠者的原代细胞，以覆盖HLA II的多态性。 MAPPs测定已广泛用于确定来自基于抗体治疗药物的TCEs。例如，涉及MAPPs测定的多项研究揭示了英夫利昔单抗的CD4 TCEs。在英夫利昔单抗的重链CDR2、CDR3、轻链LFR1等几个区域鉴定了TCE簇。正如预期的那样，MAPPs测定鉴定的大多数肽根据体外数据被确认为HLA II配体。在Karle等人的研究中，通过MAPPs结合细胞增殖测定评估了secukinumab（临床批准的抗白细胞介素[IL]-17A mAb，用于治疗斑块状银屑病）的免疫原性。与五种具有不同免疫原性风险的市场mAbs相比，secukinumab在MAPPs测定中发展出最低密度的TCE簇。有趣的是，所有六种mAbs的肽呈现水平与临床ADA发生率之间发现了相关性，强调了MAPPs测定对临床免疫原性风险评估的预测能力。Casotta等人对natalizumab（一种用于治疗多发性硬化症的抗整合素4 mAb）的Nab进行了深入表征。通过使用来自患者衍生的、natalizumab特异性B细胞的pMHC II纯化的MAPPs测定，发现了一个单一的TCE，略位于LCDR2上游，决定了对natalizumab的免疫原性。有趣的是，这个表位似乎是可工程化的，这促使产生了去免疫原性变体在体内进行测试。 为了提高MAPPs测定的效率和一致性，Lee等人开发了一种半自动化工作流程，以简化样品准备步骤（即，细胞裂解、免疫沉淀、洗涤和洗脱）。通过这种工作流程测试了一系列临床mAbs，结果表明，具有临床免疫原性风险的抗体可以鉴定出肽簇。更重要的是，一些揭示的肽与其他小组以前发表的结果很好地一致，表明这种新型测定工作流程的稳健性和可靠性。此外的研究还表明，其他因素的选择，如DC培养基、免疫沉淀珠子和抗体对MAPPs测定结果的影响。与依赖于给定长度的合成肽的体外结合测定不同，MAPPs测定作为一种强大的工具，展现出额外的生理相关性，因为它只揭示了自然呈现的TCEs。这也使得可以检查参数，如侧翼氨基酸和翻译后修饰等对TCE形成的影响。尽管如此，肽检测灵敏度仍然是MAPPs测定的最大限制因素，特别是当测试具有低免疫倾向的分子时。包括但不限于细胞培养、pMHC II免疫沉淀、色谱分离和MS检测的因素需要优化，以实现满意的免疫肽组学结果。 2.3.基于细胞的功能测定 体外功能测定为从计算预测、体外结合筛选和MAPPs测定中鉴定的抗原肽诱导的免疫反应提供了可靠的验证。此外，基于细胞的实验可以用来确认通过表位消除成功去免疫原性。 在T细胞依赖性（Td）免疫原性生成途径中，pMHC II-TCR结合后的抗原特异性CD4+ T细胞扩增（图2）。因此，测量T细胞增殖和激活是监测免疫原特异性T细胞反应的有利方法。T细胞增殖测定可以在PBMCs的背景下执行，或者使用纯化的DCs和自体CD4+辅助T细胞（也称为DC-T细胞测定）。在前一种情况下，测试化合物被置于PBMCs中足够时间以刺激T细胞增殖，这反映了分析物的免疫原性。对于DC-T细胞测定，需要先用治疗剂脉冲处理纯化的DCs，然后刺激自体CD4+ T细胞。如Gokemeijer等人在一项调查中指出的，T细胞增殖测定在两种格式中在测定参数方面都有很大的不同，例如供体数量、对照选择、读数等，由生物制药行业的研究人员执行。 许多例子强调了T细胞增殖测定在推进基于抗体治疗药物的开发能力方面的价值。例如，治疗性mAbs的结晶片段（Fc）可以被工程化以适应不同的药理特性，例如减少抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。在Wilkinson等人的研究中，创建了ADCC消除的人类IgG1 Fc变体，并通过T细胞增殖测定筛选了携带相应突变的肽的免疫新表位。与代表野生型Fc序列的肽相比，含有L234/235A突变的肽，这是mAb工程中常用的ADCC耗竭策略，在PBMC增殖测定中没有显示出增量的T细胞反应。Steven等人报道了通过体外成熟过程对针对人血清白蛋白（HSA）的鲨鱼可变域（VNAR）的去免疫原性。将随机突变引入到先前构建的huE06v1.10中，这是一个人化的抗HSA VNAR，并对其进行了DC-T细胞测定以评估免疫原性。因此，建立了表现出完整目标结合能力和最小免疫原性的克隆BA11。 T细胞增殖测定不断发展，以增强其在免疫原性评估中的稳健性。例如，由于抗原特异性CD4+ T细胞自然丰度低，T细胞增殖测定的灵敏度有些不尽人意。在这方面的限制下，Siegel等人开发了一种创新的DC-T共培养测定，涉及重新刺激步骤以增强测定灵敏度。具体来说，在CD4+ T细胞和抗原脉冲DCs共培养几天后，向共培养中添加新鲜制备的、抗原挑战的自体单核细胞，以进行额外的T细胞刺激。通过这个工作流程，作者成功地再现了以前出版物中鉴定的TP衍生TCE肽引起的免疫效应。此外，这些肽的去免疫原性对应物显示出减弱的DC-T测定反应，表明了这个测定平台的稳健性。另一项研究表明，在PBMC测定的背景下，使用其他T细胞激活标记物，如CD134和CD137，可以特别概述抗原反应性CD4+ T细胞群体。研究人员通过测试14种不同免疫潜力的生物制剂，证明了体外刺激后CD4+ T细胞中CD134+/CD137+群体的比例与临床ADA发生率很好地相关。这些报告强调了进一步协调体外测定的必要性，以更准确地预测TPs的临床免疫原性。 与T细胞增殖测定一起，酶联免疫吸附点（ELISpot）测定也用于可视化抗原特异性T细胞激活。与T细胞激活相关的细胞因子（例如，IL-2，干扰素[IFN]-γ）通常用作ELISpot测定的读数，以检查TPs的Td免疫原性。与酶联免疫吸附测定（ELISA）相比，后者测量大量细胞培养的总细胞因子水平，当需要量化分泌细胞因子（功能性）细胞群体时，ELISpot更为有利。在上述Spindeldreher等人的研究中，通过使用抗原负载的PBMCs挑战的CD4+ T细胞进行IFN-γ ELISpot测定，验证了MAPPs测定中鉴定的ixekizumab衍生肽。PE38是用于构建重组CD22靶向免疫毒素moxetumomab pasudotox的细菌衍生毒素。由于PE38的非人源性，moxetumomab pasudotox在临床上表现出相当高的免疫原性，这促使人们努力发展PE38的去免疫原性版本。Mazor等人使用合成的PE38衍生肽通过ELISpot测定鉴定了PE38的TCEs。随后产生了TCE耗尽的去免疫原性PE38，并通过消除的T细胞免疫反应进行了验证。在治疗肽中引入非天然氨基酸（unAA）已被广泛实施，部分是为了免疫原性管理的兴趣。Azam等人通过将unAA引入模型抗原，流感血凝素（HA）肽HA306-318，进行了概念验证研究。正如ELISpot和体外肽结合测定所证实的那样，修改后的肽显示出受损的T细胞启动能力以及不同程度的减少HLA II结合。 值得注意的是，无论是表位肽还是完整的TPs都可以作为T细胞增殖测定的输入。肽无疑提供了更多以表位为中心的观点，而完整的TPs提供了关于整体免疫原性潜力的更全面的见解。然而，使用完整TPs进行基于细胞的免疫原性分析的主要担忧源于化合物的作用机制。大多数免疫调节治疗剂自然地向T细胞传递刺激性信号，这导致强烈的T细胞激活和增殖，很难区分免疫原性触发的细胞扩增。在这种情况下，DC-T细胞测定可能更可行，因为它避免了被测试代理直接激活T细胞。否则，肽（或重叠肽池）可能作为PBMC测定的输入材料，以突出特定表位的T细胞激活。而不是利用通用程序，应为每个项目计划一种适合目的的方法，通过整合一系列体外测定。Xue等人报告了对ATR-107的系统免疫原性评估，ATR-107是一种高度免疫原性的抗IL-21受体（IL-21 R）mAb。在这项研究中，作者观察到当由ATR-107而不是对照mAb脉冲时，T细胞的增殖更强，并通过MAPPs测定鉴定了位于轻链CDR2（LCDR2）的ATR-107衍生的TCE簇。更重要的是，通过进行内化测定，表明ATR-107的免疫反应部分归因于其与DCs的抗原处理和呈现机制的有效参与，这可以通过药物靶标（IL-21 R）在DCs上的高表达来解释。在另一项研究中，研究人员比较了三种人源化mAbs（即mAb1、mAb2和mAb3）针对同一靶标的T细胞扩增、DCs激活和抗原处理，并通过了MAPPs测定鉴定了TCEs。mAb1引起的更好的T细胞增殖归因于APCs的激活。在90%的患者中表现出免疫原性的mAb3在体外未能促进T细胞增殖，可能由于缺乏DC激活。然而，来自MAPPs数据的合成肽簇引发了强大的CD4+ T细胞反应。这些发现表明，依赖任何单一平台来估计候选分子的潜在免疫原性风险是不充分的。 3.BCE 映射方法的范围  与可以通过体外测量确定的TCE不同，体液免疫反应是由不同组织中的多种细胞类型完成的，这不能轻易地通过体外或离体系统重现。因此，BCE分析通常是通过使用来自动物或人类研究中获得的ADA样本进行无细胞实验来执行的。已经建立了多样化的策略来表征TPs的BCE谱，如下所述。鉴于ADAs的异质性本质，我们特别讨论了多克隆抗体（pAbs）的表位映射，与mAbs相比，其表征可能更具挑战性。实验方法，如配体结合测定（LBA）、质谱（MS）和结构分析，通过不同原理揭示了抗体-抗原结合界面。本节讨论的每种策略的适应性、费用以及时间消耗都列在表2中。每种技术都提供了独特的优势和限制，强调了需要一个综合策略来明确理解生物治疗药物的表位谱。 3.1.基于LBA的方法 基于LBA的表位映射的基本原理是在抗原的不同片段或突变体中描绘抗体的结合偏好（定性或定量）。许多学术和工业实验室都报告了他们开发的内部表位映射测定，并有许多商业选项可供具有不同研究目标和目标的研究人员使用。通过几个案例研究，我们详细阐述了基于LBA的方法如何帮助揭示域、肽段和残基水平分辨率的表位信息。 3.1.1.域特异性表征 美国食品药品监督管理局建议评估ADA与MDBs相关ADA的不同临床相关域的结合特异性。Gorovits等人提出了一种通用的逐步策略，以满足MDBs相关ADA的域特异性表征的要求。作为ADA域特异性分析的代表性研究，Stubenrauch等人报告了在非人灵长类动物研究中，通过域检测和竞争测定（DDA和DCA）来检查由靶向免疫细胞因子（TIC）诱导的ADA的域特异性的实践。简而言之，TIC的三个基本模块，即抗原结合片段（Fab）、Fc和细胞因子域，分别纯化并用作诱饵（DDA）或竞争者（DCA），以分析ADA结合偏好。根据DDA和DCA结果的一致性，所有12个受试者都表现出针对Fab和/或细胞因子域的ADAs，而只有一个受试者发展出针对Fc的ADAs。另一项典型研究涉及对moxetumomab pasudotox的域特异性分析，这是一种高度免疫原性的CD22靶向免疫毒素，由结合域（BD）和毒素PE38组成。Vainstain等人建立了桥接测定，使用每个域作为抑制剂来测量域特异性ADAs的相对丰度。他们的方法也得到了验证，并应用于临床研究，揭示了36/67和66/67的Nab阳性受试者分别表现出针对BD和PE38的ADAs。 域特异性分析也已经在涉及多特异性抗体的研究中实施，这些抗体包含两个或更多目标结合域。Luong等人开发了一种基于细胞的域特异性Nab测定，以支持PF-07257876的临床开发，这是一种双特异性抗体，共同靶向PD-L1和CD47。值得注意的是，作者提出了一种独特的基于珠子的Nab提取方法，用于测定之前，并观察到从非中和ADAs中显著减少的假阴性。从Nab的域特异性中可以获得更多的见解，以更好地解释有关PK、效力和安全性的临床观察。 与基于终点测量的免疫测定不同，表面等离子共振（SPR）可以监测配体-受体结合的动力学，也可以用来量化ADAs对药物分子的占据。Lewis等人报告了一种基于SPR的策略，用于表征血浆中凝血因子VIII的C2域特异性抗体的存在。然而，域特异性分析代表了表位映射的基本方法，因为它获得的表位分辨率相对较低。应以案例特定方式部署更复杂的测定，以明确指出介导ADA-TP相互作用的BCEs。 3.1.2.肽结合方法 与基于肽的TCE映射类似，可以通过与合成肽库的体外结合测定来研究BCE。肽库的覆盖范围从单个蛋白质到整个蛋白质组，具体取决于研究目的。基于肽的表位映射的第一个尝试是由Barteling等人报道的，他们将口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1分解为208个合成肽。鉴定了一个七肽区域作为抗体产生的主要表位。Brand和同事开发了一种肽筛选测定，以检查由Fabry病患者产生的ADAs识别的人类α-半乳糖苷酶A（AGAL）上的BCEs，这些患者没有功能性AGAL。如所示，许多患者对AGAL及其同源物α-半乳糖苷酶B共享的肽产生了ADAs，这表明了对ADA交叉反应性的严重关注。 几项研究利用肽筛选来表征对高免疫原性治疗性mAbs（如英夫利昔单抗和阿达木单抗）的ADAs的表位谱。通过筛选覆盖英夫利昔单抗全长序列的15-肽，研究人员鉴定了六个ADA表位，其中四个位于TNF结合界面内，支持了英夫利昔单抗在临床上与免疫原性相关的效力丧失。同一小组在另一项涉及阿达木单抗的研究中后来鉴定了类似分布模式的表位。此外，肽微阵列已被广泛用于明确指出来自病原体和食物过敏原的多克隆BCEs（pBCEs）。 肽也可以在细胞展示系统中呈现，以绕过化学合成过程。Rockberg等人创建了一个细菌展示的人类表皮生长因子受体2（HER2）的随机片段cDNA库，并用它来映射几种抗HER2 pAbs的域特异性。通过对每个pAbs结合的细菌进行测序，作者揭示了每个pAbs池可以靶向的一个到五个域。基于相位展示系统的类似策略也可以建立，以揭示由病原体或毒素诱导的pBCEs。 肽筛选用于表位映射的主要缺点是其无法再现构象和不连续表位。一些化学策略已被提出，旨在模拟肽阵列上的构象表位。Timmerman等人建立了一个通过化学交联在特定位置引入的肽内半胱氨酸的构象肽阵列。这项技术已成功商业化，并用于鉴定利妥昔单抗的构象表位。然而，非线性表位的广泛复杂性使它们极其难以通过任何通用化学策略来重建。 对一系列带有点突变的肽进行二次筛选可以提供残基水平的表位信息。在Geyson等人的研究中，确定了一个单一的6-肽作为高潜力线性表位后，生成了一个深入的库，包含120个六肽，每个六肽都包含一个来自亲本肽的单点突变，并揭示了Leu148和Leu151这两个关键残基决定了抗病毒抗体的结合能力。 尽管存在显著的局限性，但由于分辨率适中、成本相对较低且易于解释，肽筛选的BCE精细映射被广泛采用。整合额外的补充策略可能有助于弥补肽筛选相关的空白。 3.1.3.突变扫描 深度突变扫描（DMS）结合细胞分选，能够高通量地识别完整蛋白质上的功能决定性残基。对于表位映射，特别是需要创建并表达目标蛋白质带有单个氨基酸突变的DNA库。这里的假设是一旦关键的表位残基缺失，抗体就不再与抗原结合。展示负抗体结合信号的细胞群体将被分离并进行深度测序，以随后揭示这些关键残基。如所指出的，DMS有助于发现通过氨基酸到丙氨酸库筛选无法识别的表位。值得注意的是，DMS在最近SARS-CoV-2爆发的相关研究中贡献显著。通过筛选SARS-CoV-2受体结合域（RBD）的酵母展示突变库，Greaney等人鉴定了三个关键的RBD-驻留表位，这些表位被中和pAbs识别。在这些表位区域内发生的突变，以不同程度恢复了病毒的感染，通过减少抗体介导的中和能力。 一种不同的pBCEs映射方式是将pAbs库拆分为mAbs，以单独表征BCE。Onda等人从用免疫毒素PE38免疫的动物中鉴定了总共60个mAbs，并通过相互竞争结合和点突变筛选鉴定了七组表位。随后，该研究小组开发了一系列去除先前工作中识别的BCE的变体，并通过体内研究确认了减少的免疫原性以及持续的效力。在概念验证研究中的成功转化为新免疫毒素LMB-100的开发，这是通过将针对间皮素的Fab与截断的、BCE耗尽的毒素PE24连接而生成的。LMB-100目前正在进行临床试验，用于治疗表达间皮素的肿瘤（例如NCT02798536，NCT02810418）。在之前提到的涉及natalizumab的研究中报告了类似的策略。通过研究从两名接受natalizumab治疗的患者中分离出的单克隆Nabs，检查了决定Nab结合的关键CDR定位残基。 然而，虽然这种策略提供了最高水平的表位分辨率，但涉及的相当大的工作量在许多情况下可能不可行。 3.2.基于质谱的方法 质谱策略是另一种广泛使用的方法，用于解析蛋白质复合物的高级结构信息。作为一种具有卓越灵敏度的分析器，质谱已经被用于生物和制药研究数十年，并且已经使用了几代基于质谱的方法来解码关于抗原-抗体识别的结构信息。在这一部分，我们将深入探讨这些方法如何促进映射pBCEs的努力。 3.2.1.蛋白质酶解切除/提取 蛋白质酶解切除/提取（PROTEX）-质谱策略依赖于通过固定化抗原捕获的蛋白质酶解抗原肽的质谱鉴定。根据抗原-抗体复合物形成和酶介导的抗原降解的顺序，这种方法可以分为表位切除（结合先于消化）和表位提取（消化先于结合）。表位切除/提取结合质谱检测为最少的材料输入提供了宝贵的表位信息。一些研究报告了其对pAbs的使用，如Opuni等人的调查。其中，Roth等人通过表位切除-质谱表明，活动性抗中性粒细胞胞浆抗体相关血管炎患者的抗髓过氧化物酶自身抗体与健康受试者相比具有不同的表位特异性。考虑到PROTEX-MS在广泛的实验设置中的众多研究中的应用，将其作为分析ADAs表位的潜在策略是合理的。PROTEX-MS的一个潜在限制是它依赖于蛋白质水解消化来释放适当长度的肽以精确确定表位位置。因此，抗原的内在因素，如大小、序列和在天然构象中的可及性，都会影响酶解后的输出。此外，不连续的表位可能不会被有效回收，特别是当抗原的三维结构不可用时。 3.2.2.蛋白质足迹分析 一种称为蛋白质足迹分析的先进质谱策略已被越来越多地用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。原则上，蛋白质的溶剂暴露区域可以通过特定试剂进行修饰（可逆或不可逆），并通过蛋白质-蛋白质相互作用诱导的修饰轮廓（足迹）可以通过质谱随后进行检查。Liu等人全面回顾了基于质谱的蛋白质足迹分析的方法和应用。 氢-氘交换结合质谱（HDX-MS）广泛用于研究蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质构象变化。目标蛋白质的溶剂暴露区域通过氢到氘的可交换性进行标记。由于HDX效率几乎完全由溶剂中的暴露状态决定，因为每个氨基酸（除脯氨酸外）都有一个单一的背骨氢，HDX-MS通常被认为是一种无偏的足迹分析方法，用于概述高级蛋白质结构。与一些使用纯化的pAbs进行分析的案例研究不同，Stander等人表明，HDX-MS可以利用免疫后产生的非富集pAbs池，进一步扩展了这种策略的稳健性和适应性。 HDX-MS的一个主要技术障碍是由于原子交换过程的可逆性导致氘原子的损失。为了克服这个缺点，通过共价修饰一个或几个首选残基，开发了许多不可抑制的标记方法。快速光化学氧化蛋白质（FPOP）依赖于使用来自KrF激光脉冲的过氧化氢产生的羟基自由基标记蛋白质。Genentech最近的一项概念验证工作涉及基于FPOP的临床候选双特异性抗体的ADA表位映射。据报道，根据FPOP-MS数据，ADAs可以识别两个臂中的重链和轻链的CDRs。有趣的是，在ADAs存在的情况下，两个臂上另外两个区域逐渐暴露，表明ADAs可能作为TPs的变构调节剂。 3.3.结构生物学方法 揭示抗原-抗体复合物的结构提供了BCEs的原子级分辨率。X射线晶体学和核磁共振（NMR）广泛用于获取抗原-mAb复合物的结构，这对理解mAbs的特异性和作用模式具有重要意义。Cassotta等人展示了纳他利珠单抗-单克隆ADA复合物的晶体结构，但据我们所知，尚无研究报告成功实施任一技术捕获抗原-pAbs结构。 电子显微镜（EM）目前是实现大尺寸和异质性大分子复合物结构可视化的最可行方法，这些是NMR和X射线晶体学的瓶颈。2018年首次报告了使用EM多克隆表位映射（EMPEM）进行pBCE可视化。在这项研究中，从接种HIV包膜（Env）疫苗的家兔血清中纯化的IgG被消化以释放Fab，随后与Env孵育形成Env-pAbs复合物，然后进行负染色EMPEM（nsEMPEM）。作者通过检查不同时间点样本的染色模式，观察了免疫过程中pAbs多样性的时间变化。此外，在低频率下还鉴定了一个未报告的抗体类别，它位于Env叶片之间结合。类似的实验流程后来用于其他类型病毒和疫苗的表位映射研究。迄今为止，尚无研究报告使用nsEMPEM可视化TP-ADA复合物。尽管如此，我们仍然对EMPEM在未来免疫原性评估中的实施持乐观态度，考虑到这项技术的日益普及。 4.计算表位预测  药物开发者对预测与生物治疗药物相关的免疫原性风险有着浓厚的兴趣。考虑到为候选筛选生成的大量mAb候选物，再加上实验方法的技术障碍和高成本，依靠实验策略在早期开发阶段进行免疫原性评估是不切实际的。然而，随着免疫信息学的快速发展，许多计算平台已经出现，以加速基于TCE和BCE预测的免疫原性评估。所有开发者都应认识到，抗药物免疫反应是一个多因素过程，其中许多与化合物相关（例如，配方、聚集）和与患者相关（例如，免疫状态、遗传背景）的属性起着关键作用。因此，应谨慎应用基于序列的计算免疫原性分析的见解以进行决策。当前TCE和BCE预测工具的可用性和性能如下。 4.1.T细胞表位预测 体外T细胞预测通常由抗体开发者执行，以便在早期阶段提供快速和高通量的免疫原性评估。由于CD4+ T细胞反应在触发抗药物免疫反应中发挥决定性作用，因此已经做出了广泛努力，以推进MHC（HLA）II呈现的肽表位的计算预测。HLA II类基因由三个位点编码，即DR、DP和DQ，它们在人类群体中都表现出极端的多态性。尽管HLA II具有广泛的变异性，但源自抗原的肽总是使用9-mer核心区域与MHC II分子的结合槽相互作用，尽管结合槽外的侧翼残基似乎对结合有所贡献。P1、P4、P6和P9的侧链面向MHC II结合口袋，使这四个位置成为决定肽-MHC II相互作用选择性和亲和力的关键“锚定残基”。每个不同的MHC II分子都呈现其独特的9-mer肽核心偏好，特别是四个锚定位点。肽-MHC结合的高度限制模式使基于序列的预测成为免疫原性风险评估的可行方法。 免疫表位数据库（IEDB，http://www.iedb.org）已经积累了超过44,000个MHC II配体结合亲和力数据，以实现算法开发的模型训练。已经开发了多种定量矩阵驱动（例如，SMMalign）和机器学习驱动平台（例如，NNalign），用于预测针对已知序列的HLA II等位基因的TCE（请参阅Doneva等人的综述，了解TCE预测方法的全面收集）。Nielsen等人在NN-align的基础上开发了Ethician，以实现更准确的泛特异性HLA-II表位预测，以克服只有有限数量的HLA等位基因已经实验研究了它们的表位特异性的障碍。这种方法通过包含来自MAPPs测定的肽洗脱数据进一步改进。截至2023年9月，Ethician 4.1已根据IEDB的自动基准测试结果被指定为最推荐的方法。 算法区分免疫原性与非免疫原性肽的能力通常通过曲线下面积（AUC）反映，其范围从0.5（随机预测）到1.0（完全准确预测）。迄今为止，许多MHC II表位预测方法可以实现AUC>0.8，这通常是令人满意的。所有当前的MHC II表位预测工具都基于计算算法计算的肽-MHC II结合亲和力，这通常会导致免疫原性的过度预测。根据抗原的摄取和处理，理论上可以与MHC II结合的表位可能不会由细胞机制功能性地呈现。一些方法已经提出通过检查N-和C-末端基序来识别目标蛋白的蛋白酶裂解位点，但这些方法未能显著改善MHC II限制性表位预测。与MHC I表位预测相比，这远不理想，后者从纳入像NetChop这样的蛋白酶体处理分析工具中大大受益。 T细胞表位的一个子集被调节性T细胞识别，称为Tregitopes，对效应CD4+辅助T细胞的免疫耐受起到抑制作用。Tregitopes最初在IgG的Fc区域被识别，后来扩展到更多非IgG蛋白。据报道，通过在MHC II结合预测的背景下包括Tregitope校正，整体免疫原性预测性能得到了提升。因此，结合Tregitopes以诱导Treg介导的免疫耐受代表了TP去免疫原性的替代策略。 对于基于抗体的治疗药物，由于mAbs的新表位通常位于定义mAbs结合亲和力和特异性的CDRs中，因此通常使用计算TCE预测进行候选筛选，而不是蛋白质工程。然而，计算TCE识别在药物优化中的价值已经在其他模式中得到体现。由Eli Lilly开发的一种抗糖尿病治疗药物度拉糖肽，是通过将人类IgG4的Fc结构域与胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物肽融合而制成的。通过点突变R36G消除了靠近母体肽C末端的一个强表位，从而创造了去免疫原性的GLP-1类似物。涉及FVIII去免疫原性的案例研究也代表了展示由计算平台驱动的免疫原性风险降低的例子。 应该适当评估MHC II表位预测的计算范式的稳健性，以指导决策过程。已经报告了计算评估与临床观察之间的相关关系，但随着样本量的增加，结论是否会受到挑战仍然值得怀疑。虽然许多赞助商倾向于在早期阶段利用计算数据支持开发行动（前瞻性），但只有少数人用它来理解在临床观察到的与免疫原性相关的事件（回顾性）。计算分析可以与体外测定相结合，以支持早期阶段的候选选择（如Xue等人所示例）。还应注意，当前算法仅基于氨基酸序列设计和优化。现有的方法无法评估翻译后或化学修饰等非蛋白质元素的影响。 4.2.B细胞表位预测 与TCE类似，通过建立在各种算法基础上的一系列方法可以实现BCE预测。基于序列的平台，如BepiPred，审查氨基酸的化学和物理性质（包括疏水性、极性和灵活性等因素），以描绘目标抗原内潜在的线性表位。构象表位约占所有BCEs的90%，可以通过DiscoTope和ElliPro等方法预测，这些方法基于已知的抗体结合区域进行训练。深度学习工具的最新进展使高阶蛋白质结构的准确预测成为可能。在DiscoTope的最新版本（3.0）中，结构预测的强大功能被嵌入到之前建立的训练模型中，使得在没有解决结构的情况下对广泛的抗原进行基于结构的BCE预测成为可能。 最近发表了许多具有先进预测稳健性的增强计算方法，其中一些在性能上优于IEDB概述的方法。然而，它们在现实世界案例研究中的表现仍然不尽人意。Cia等人提出了一个独立且严谨的BCE预测方法的基准研究，并使用SARS-CoV-2刺突蛋白作为示例来评估这些方法的性能。由于用于模型训练的表征抗原-抗体共结构的数量不足，没有一种方法达到了期望的性能。此外，当前的结构收集在很大程度上偏向于病原体和药物靶标，这些并不很好地代表自然存在的抗原，特别是对于TPs。在Lin等人的工作中，他们试图去免疫原化VHH支架，Ellipro和BepiPred都未能区分多个VHH变体的免疫原性潜力。的确，鉴于对抗体-BCE相互作用的内在性质缺乏深入理解，大多数BCE预测平台提供的AUC低于0.6，与TCE分析相比远远不够理想。这些不理想的做法促使需要结合实验和计算方法来全面分析pBCEs。目前，药物开发者对BCE预测的价值尚无共识。此外，关于BCE的存在是否仅由蛋白质固有特性决定的问题仍然存在争议。换句话说，值得质疑的是，蛋白质的某些区域，特别是TPs，在BCE识别方面是否是免疫显性的。的确，在利用BCE预测信息进行决策时需要谨慎。 5.结论和未来展望  预计TP开发者将根据监管当局的指导对其TP产品的免疫原性风险因素进行评估。在所有风险因素中，已经意识到免疫原性概况，特别是TCE和BCE景观，在决定基于抗体的治疗药物的开发能力方面具有根本的重要性。在这篇综述中，我们介绍了一个表位驱动的免疫原性评估路线图，介绍了当前的实验和计算方法的集合，用于TCE和BCE鉴定，这个工具箱在基因组和蛋白质组分析的基础上不断扩展。由于每种研究工具都有独特的优势和局限性，我们在此在图3中展示了一个推荐的时间表，指示在药物开发生命周期中何时应用不同的免疫原性评估策略。 图3. 推荐的TPs免疫原性评估行动时间表。不同的计算和实验策略可以执行，以支持从早期发现到市场阶段的免疫原性调查。注意：由于缺乏确凿证据证明其在候选评估中的价值，计算BCE分析以虚线标示。 证据表明，药物开发从表位分析中受益，尤其是以TCE为重点的研究（实验和计算）。通过识别和去除TCE，可以构建具有降低免疫原性风险的先进治疗药物，正如我们讨论的许多例子所显示的。迄今为止，TCE表征已被认为是非临床和临床免疫原性评估的标准程序，因为：1) TCE在决定TPs的免疫原性倾向中起决定性作用，2) 方法更易获得且成熟，能够产生可靠的结果。另一方面，B细胞研究通常在开发的后期进行，因为ADA样本的可用性。尽管如此，BCE与药物学和毒理学结果的联系更紧密，因为它介导了TPs和ADAs之间的物理相互作用。因此，不应低估BCE表征在药物开发中的重要性和益处。总的来说，基于TCE去除的主动免疫原性降低策略自早期开发阶段以来已被成功使用，因为它们更容易识别、操作和验证。相比之下，BCE探测在实验和计算上似乎都更加复杂。BCE信息不直接指导药物优化，而更多地用于监测和表征临床中的免疫原性相关不良效应。尽管如此，目前在TP开发中缺乏共识的计算和体外免疫原性风险评估策略。每个评估中的计划都需要一个针对具体情况、基于风险的工作流程。 尽管上述常规实施的方法，创新平台的出现提供了替代策略，允许研究人员在早期阶段评估TPs的潜在免疫原性。利用微流控芯片系统上的类器官培养，Goyal等人通过共培养原代人血T和B淋巴细胞，重新组装了适应性免疫形成的关键器官——淋巴滤泡。利用这个系统，作者观察到在流感疫苗挑战后成功产生了抗体。然而，适应性免疫的整个过程很难通过体外组织培养来再现。鉴于基于动物的免疫原性研究的转化性差，这在很大程度上归因于不同的免疫库，人们已经努力开发HLA人源化或免疫重建的小鼠模型，以预测非临床阶段的免疫原性。研究表明，使用HLA转基因小鼠可以识别CD4 TCEs，但发现限于特定等位基因。另一方面，免疫重建的小鼠可以通过向免疫缺陷的小鼠注入来自个体供体的免疫细胞来模拟个性化的免疫反应，但需要现实世界的证据来证明这种模型的可行性和可靠性，导致赞助商面临投资回报的担忧。 总之，免疫原性研究领域在近几十年中经历了快速发展。创新技术不断被开发、验证和商业化，这些技术建立在对治疗诱导的免疫原性的先进理解基础上。根据风险因素、样本可及性、预算和时间表，开发者可能会考虑适当的策略来阐明治疗分子的免疫原性潜力，以创造安全有效的药物。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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