Acetic Acid, Glacial

一、期刊与作者信息1. 期刊信息 期刊名称：Advanced Science（《先进科学》） 分区：中科院1区TOP（工程技术/材料科学领域） 影响因子：2024年影响因子约15.1（Wiley旗下综合性顶刊，涵盖自然科学、工程技术等多个领域） 2. 作者信息 第一作者（共5位，贡献均等）：Hongyu Wang、Shipeng Dai、Yuchen Xie、Pengyu Chen、Yue Chai 通讯作者（共5位）：Junfeng Shi（南京医科大学附属南京医院肿瘤科）、Yongxiang Xia、Xiaofeng Qian、Weiwei Tang（南京医科大学附属第一医院肝胆中心）、Yichan Zhou（南京医科大学附属第一医院老年消化科） 研究单位：主要来自南京医科大学附属第一医院（肝胆中心、老年消化科）、南京医科大学附属南京医院肿瘤科，涉及肝胆肿瘤国家卫健委重点实验室、中国医学科学院肝移植重点实验室等平台二、摘要翻译原文摘要 Colorectal cancer liver metastasis (CRLM) involves complex molecular mechanisms. By integrating The Cancer Genome Atlas (TCGA) data and employing Cox regression, Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA), and single-cell RNA sequencing, this study identifies RNF32 as a key gene linking poor prognosis to metastasis. Functional assays demonstrate that RNF32 promotes tumor cell proliferation, invasion, and epithelial–mesenchymal transition (EMT) in vitro, and drives tumor growth and liver metastasis in vivo. Mechanistically, RNF32 catalyzes K48-linked ubiquitination at the K60 site of GSK3β, stabilizing β-catenin and activating the Wnt signaling pathway, thereby upregulating CCL2. Mass cytometry and other experiments further reveal that RNF32 recruits SPP1+ macrophages via CCL2 to remodel the metastatic niche, a process dependent on the CCR2/FABP1/PPARG axis. Macrophage depletion abrogates metastasis, while the FABP1 inhibitor orlistat reverses SPP1 upregulation in macrophages. Moreover, SPP1+ macrophages interact with tumor cell CD44, synergizing with RNF32 to enhance cancer stemness via Wnt signaling. Importantly, virtual screening identifies indole-3-acetic acid (IAA) as an RNF32 inhibitor that suppresses liver metastasis and reverses immunosuppression in vivo. This study establishes RNF32 as a dual-functional driver of metastasis and proposes IAA as a promising therapeutic agent, offering new hope for targeting both tumor-intrinsic EMT and the immune microenvironment in CRC liver metastasis.翻译摘要 结直肠癌肝转移（CRLM）涉及复杂的分子机制。本研究通过整合癌症基因组图谱（TCGA）数据，结合Cox回归分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和单细胞RNA测序，鉴定出RNF32作为连接不良预后与转移的关键基因。功能实验表明，RNF32在体外促进肿瘤细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化（EMT），在体内驱动肿瘤生长和肝转移。机制上，RNF32催化GSK3β的K60位点发生K48连接的泛素化，稳定β-连环蛋白（β-catenin）并激活Wnt信号通路，进而上调趋化因子配体2（CCL2）的表达。质谱流式细胞术及其他实验进一步揭示，RNF32通过CCL2招募SPP1阳性（SPP1+）巨噬细胞，重塑转移微环境，这一过程依赖于趋化因子受体2（CCR2）/脂肪酸结合蛋白1（FABP1）/过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）轴。耗竭巨噬细胞可阻断转移，而FABP1抑制剂奥利司他（orlistat）能逆转巨噬细胞中SPP1的上调。此外，SPP1+巨噬细胞与肿瘤细胞表面的CD44相互作用，与RNF32协同通过Wnt信号通路增强癌干性。重要的是，虚拟筛选鉴定出吲哚-3-乙酸（IAA）作为RNF32抑制剂，其在体内能抑制肝转移并逆转免疫抑制。本研究证实RNF32是具有双重功能的转移驱动因子，并提出IAA作为潜在治疗药物，为同时靶向肿瘤内在EMT过程和免疫微环境治疗结直肠癌肝转移提供了新希望。 三、题目与摘要中核心专有名词解释 Colorectal Cancer (CRC)：结直肠癌，源于大肠（结肠或直肠）内壁细胞的恶性肿瘤，是全球第三大常见癌症，第二大癌症相关死亡原因。 Colorectal Cancer Liver Metastasis (CRLM)：结直肠癌肝转移，结直肠癌最常见的远处转移部位，约50%-60%的结直肠癌患者会发生肝转移，是导致患者死亡的主要原因之一。 RNF32：环指蛋白32（Ring Finger Protein 32），属于RING型E3泛素连接酶家族，含有双RING-H2结构域，最初被认为与精子发生相关，本研究首次证实其在结直肠癌肝转移中的关键作用。 SPP1+ Macrophages：SPP1阳性巨噬细胞，SPP1（Secreted Phosphoprotein 1）即分泌型磷蛋白1（又称骨桥蛋白），这类巨噬细胞表达SPP1，具有促肿瘤、免疫抑制特性，是肿瘤微环境中的关键“帮凶”。 Indole-3-Acetic Acid (IAA)：吲哚-3-乙酸，一种植物生长激素，同时也可由人体肠道菌群产生，本研究发现其可作为RNF32抑制剂，具有抗肿瘤转移作用。 Epithelial–Mesenchymal Transition (EMT)：上皮-间质转化，上皮细胞失去细胞间连接、极性等上皮特性，获得迁移、侵袭能力的间质细胞特性的过程，是肿瘤转移的关键步骤。 Ubiquitination：泛素化，一种蛋白质翻译后修饰，通过泛素分子标记靶蛋白，调控蛋白的降解、定位或功能，K48连接的泛素化主要介导靶蛋白通过蛋白酶体降解。 GSK3β：糖原合成激酶3β（Glycogen Synthase Kinase 3β），Wnt信号通路的关键负调控因子，可促进β-catenin降解，抑制肿瘤发生发展。 β-catenin：β-连环蛋白，Wnt信号通路的核心分子，稳定后可进入细胞核激活下游促癌基因表达。 Wnt Signaling Pathway：Wnt信号通路，一条保守的细胞信号通路，调控细胞增殖、分化、迁移等过程，异常激活与多种肿瘤的发生转移密切相关。 CCL2/CCR2：趋化因子配体2/趋化因子受体2，CCL2是一种趋化因子，可与巨噬细胞表面的CCR2结合，招募巨噬细胞向肿瘤组织迁移。 FABP1/PPARG：脂肪酸结合蛋白1/过氧化物酶体增殖物激活受体γ，FABP1参与脂肪酸代谢，PPARG是核受体超家族成员，二者构成的信号轴调控巨噬细胞功能。 Cancer Stemness：癌干性，肿瘤细胞具有的类似干细胞的自我更新和分化能力，是肿瘤复发、转移和耐药的重要原因。 Virtual Screening：虚拟筛选，利用计算机技术从化合物库中筛选出可能与靶蛋白结合的潜在药物，是药物研发的高效手段。四、Result部分梳理与分析（按原文顺序）2.1 小标题：RNF32 Emerges as the Mastermind of Colorectal Cancer Liver Metastasis（RNF32成为结直肠癌肝转移的关键基因）①结论 RNF32是同时与结直肠癌不良预后和肝转移相关的关键基因，在转移性结直肠癌组织、高转移潜能的结直肠癌细胞系中高表达，且主要富集在肿瘤细胞中。②实验设计及细节（对应原文位置与Figure） TCGA数据分析（Figure 1A-E）：从TCGA数据库获取483例结直肠癌肿瘤样本和41例正常组织的基因表达数据，以调整后p<0.05和|log₂FC|>1为阈值，通过limma R包鉴定出5093个差异表达基因（DEGs），其中2509个上调、2584个下调（Figure 1A火山图、1B热图）。对这些DEGs进行GO和KEGG富集分析，发现其涉及跨突触信号调控、神经活性配体-受体相互作用等通路（Figure 1C-E）。 通俗解释：对比癌症组织和正常组织的基因表达差异，找出表达变化显著的基因，并分析这些基因可能参与的生物学过程。 生存分析与关键基因筛选（Figure 1F-H）：对309例有完整临床数据（随访≥30天）的结直肠癌患者，对5093个DEGs进行单变量Cox回归分析（p<0.01），筛选出74个与总生存期（OS）相关的基因；再通过LASSO回归和多变量Cox回归，最终得到17个独立预后相关基因（Figure 1F-G为Cox回归结果，1H为多变量分析结果）。 通俗解释：通过统计方法找出与患者生存时间相关的基因，筛选出对预后影响最大的核心基因。 WGCNA分析（Figure 1I-N）：对5093个DEGs进行加权基因共表达网络分析，去除异常值（cutHeight=40000），选择软阈值β=3构建共表达网络，聚类得到7个模块（Figure 1I-L）。通过模块与临床特征（性别、分期、TNM分期）的相关性分析，筛选出与M期（转移期）显著相关（p<0.05）的黑色和绿色模块，共604个基因（Figure 1M-N）。 通俗解释：把表达模式相似的基因归为“模块”，找到与肿瘤转移最相关的模块及其中的基因。 关键基因交集与验证（Figure 1O-V、Figure S1）：将17个独立预后基因与604个转移相关基因取交集，仅得到RNF32这一个重叠基因（Figure 1O）。通过TCGA、GEPIA2数据库验证，发现M1期（转移期）结直肠癌患者的RNF32表达显著高于M0期（无转移），且高RNF32表达患者的总生存期更短（p=0.026）（Figure 1P-Q）；GEO数据集（GSE81558、GSE49355）也证实RNF32在原发肿瘤和肝转移灶中表达高于正常组织（Figure 1T）。单细胞RNA测序显示，RNF32主要富集在原发灶和转移灶的肿瘤细胞中（Figure 1W-X、Figure S1E-F）。 通俗解释：找到同时影响预后和转移的唯一基因RNF32，并通过多个数据库和单细胞技术验证其表达特征。 组织与细胞系验证（Figure S1C-D、Figure S2A-B）：免疫荧光染色（CK8与RNF32共染）证实肿瘤组织中RNF32高表达（Figure S1C），且高RNF32表达与不良预后相关（Figure S1D）；qRT-PCR和Western blot检测不同转移潜能的结直肠癌细胞系（非转移HCT116、中度转移SW480/LoVo、高度转移SW620），发现RNF32表达随转移潜能升高而增加（Figure S2A-B）。 通俗解释：通过实验验证RNF32在实际肿瘤组织和癌细胞中的表达情况，确认其与转移潜能的关联。③与其他Result的逻辑关系 本部分是全文的“起点”，明确了RNF32是结直肠癌肝转移的关键候选基因，为后续的功能验证、机制探究和药物筛选奠定了基础，后续所有实验均围绕“RNF32在结直肠癌肝转移中的作用及机制”展开。④实验思路启发 既然RNF32在转移组织和高转移潜能细胞中高表达，且与不良预后相关，作者自然会提出核心科学问题：RNF32是否真的能“驱动”结直肠癌的转移过程？为回答这一问题，需要先通过体外实验验证RNF32对肿瘤细胞核心生物学功能（增殖、侵袭、迁移等）的影响，这就是下一个实验（2.2）的设计思路。⑤对全文逻辑的贡献 确立了研究的核心靶点RNF32，明确其“临床相关性”（与转移、预后相关），为后续的“功能验证-机制解析-药物研发”提供了合理的研究起点，让整个研究有了明确的聚焦方向。 2.2 小标题：RNF32 Promotes In Vitro Proliferation, Invasion, Migration, and EMT in Colorectal Cancer（RNF32促进结直肠癌体外增殖、侵袭、迁移和EMT）①结论 RNF32在体外能显著促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，并诱导上皮-间质转化（EMT）过程。②实验设计及细节（对应原文位置与Figure） 细胞系选择与干预（Figure 2A-B）：根据Figure S2的结果，选择RNF32表达最低的HCT116细胞和表达最高的SW480细胞作为研究对象。通过siRNA（小干扰RNA）对SW480和HCT116细胞进行RNF32敲低（设计3条siRNA，筛选出沉默效率最高的si-3用于后续实验），通过质粒转染进行RNF32过表达，以空载体或对照siRNA作为阴性对照（NC）（Figure 2A为敲低效果验证，2B为过表达效果验证）。 通俗解释：选择两种RNF32表达水平差异大的细胞，通过“降低RNF32表达”和“增加RNF32表达”两种方式，观察其对细胞功能的影响（类似“减法”和“加法”实验）。 增殖能力检测（Figure 2C-F）： CCK-8 assay：将干预后的细胞接种到96孔板，分别在0、24、48、72小时加入CCK-8试剂，通过酶标仪检测450nm处吸光度，反映细胞增殖活性（Figure 2C）。 EdU assay：用EdU（一种胸腺嘧啶类似物，能掺入增殖细胞的DNA中）标记细胞，荧光染色后观察增殖细胞比例（Figure 2D-E，比例尺50μm）。 集落形成实验：将干预后的细胞接种到6孔板，培养14天后用结晶紫染色，计数形成的细胞集落数量，反映细胞长期增殖能力（Figure 2F）。 通俗解释：通过三种不同方法从短期（CCK-8、EdU）和长期（集落形成）角度，验证RNF32对细胞增殖的影响。 侵袭与迁移能力检测（Figure 2G-H）： Transwell侵袭实验：在Transwell小室上室铺Matrigel基质胶（模拟细胞外基质），接种干预后的细胞，下室加入含10%FBS的培养基（趋化因子），培养24小时后，计数穿过基质胶和膜的细胞数量，反映细胞侵袭能力（Figure 2G）。 划痕愈合实验：将细胞培养至汇合后，用20μL枪头在细胞单层划一道“划痕”，清洗掉脱落细胞后继续培养，在0、24、48小时观察划痕愈合情况，计算划痕宽度变化，反映细胞迁移能力（Figure 2H）。 通俗解释：Transwell实验模拟肿瘤细胞穿透组织屏障的过程，划痕实验模拟肿瘤细胞在组织内的迁移过程。 EMT标志物检测（Figure 2I-J）：通过Western blot（蛋白质印迹）检测EMT相关标志物的蛋白表达：上皮标志物E-钙粘蛋白（E-cadherin）、间质标志物N-钙粘蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）（Figure 2I）；通过免疫荧光染色观察这些标志物的细胞内定位和表达水平（Figure 2J，比例尺50μm）。结果显示，RNF32敲低后E-cadherin上调，N-cadherin和Vimentin下调；过表达后则相反。 通俗解释：EMT的核心特征是“上皮标志物减少、间质标志物增加”，通过检测这些标志物的变化，判断RNF32是否调控EMT过程。③与其他Result的逻辑关系 本部分承接2.1的“临床相关性”，通过体外实验验证了RNF32的“功能相关性”——即RNF32确实能调控肿瘤细胞的核心恶性表型（增殖、侵袭、迁移、EMT），为后续体内实验（2.3）和机制探究（2.4及以后）提供了功能层面的依据。④实验思路启发 体外实验已证实RNF32在细胞层面的促癌功能，但体外实验无法模拟体内复杂的生理环境（如血液循环、器官微环境等），因此需要进一步通过动物实验验证RNF32在体内是否能真正促进肿瘤生长和肝转移，这就是2.3实验的设计初衷。同时，体外实验发现RNF32能诱导EMT，而EMT常与Wnt等信号通路相关，这也为后续机制探究（2.4）提供了方向。⑤对全文逻辑的贡献 从“临床关联”推进到“体外功能验证”，证明RNF32不仅是一个“相关基因”，更是一个“功能驱动基因”，为研究的后续深入提供了功能基础，强化了“RNF32是结直肠癌肝转移关键靶点”的核心假设。 2.3 小标题：RNF32 Propels Tumor Growth and Metastatic Vigor In Vivo（RNF32在体内推动肿瘤生长和转移活力）①结论 RNF32在体内能显著促进结直肠癌的皮下肿瘤生长和肝转移，且这种促进作用与增强肿瘤细胞增殖和诱导EMT相关。②实验设计及细节（对应原文位置与Figure） 皮下肿瘤模型（Figure 3A-F）：将转染了RNF32过表达慢病毒或空载体的MC38小鼠结直肠癌细胞，皮下注射到C57BL/6小鼠的侧腹（每组5只小鼠）。每7天测量肿瘤体积，小鼠处死後称量肿瘤重量（Figure 3A为肿瘤照片，3B为重量统计，3C为体积生长曲线）。通过Ki67免疫组化染色检测肿瘤细胞增殖（Ki67是增殖细胞标志物，阳性率越高增殖越活跃）（Figure 3D，比例尺50μm）；通过免疫荧光染色检测EMT标志物（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）的表达（Figure 3E-F，比例尺50μm）。结果显示，RNF32过表达组的肿瘤体积更大、重量更重，Ki67阳性率更高，E-cadherin表达降低，N-cadherin和Vimentin表达升高。 通俗解释：在小鼠身上接种癌细胞，观察RNF32是否能让肿瘤长得更快、更大，并检测增殖和EMT标志物的变化。 脾-肝转移模型（Figure 3G-L）：通过脾内注射转染了RNF32过表达慢病毒或空载体的MC38细胞，建立结直肠癌肝转移模型（每组5只小鼠）。接种4周后处死小鼠，解剖观察肝脏转移灶，称量肝脏重量（转移灶越多肝脏越重），计数转移灶数量（Figure 3G为肝脏照片，3H为肝脏重量统计，3I为转移灶数量统计）。通过Ki67免疫组化染色检测转移灶中肿瘤细胞的增殖活性（Figure 3J，比例尺50μm）；通过免疫荧光染色检测转移灶中EMT标志物的表达（Figure 3K-L，比例尺50μm）。结果显示，RNF32过表达组的肝脏转移灶更多、肝脏更重，Ki67阳性率更高，EMT标志物变化与皮下肿瘤模型一致。 通俗解释：模拟结直肠癌通过血液循环转移到肝脏的过程（脾脏的血液会流入肝脏），观察RNF32是否能促进肿瘤细胞在肝脏的定植和生长。③与其他Result的逻辑关系 本部分承接2.2的“体外功能”，在体内水平验证了RNF32的促癌作用，形成了“临床关联-体外功能-体内验证”的完整证据链，进一步巩固了RNF32的核心地位。同时，体内实验再次证实RNF32对EMT的调控作用，为后续深入探究其分子机制（2.4）提供了更充分的理由。④实验思路启发 体内外实验均已证实RNF32能促进结直肠癌增殖、转移和EMT，但“RNF32是通过什么分子机制实现这些功能的？”这一核心问题尚未解决。因此，作者下一步的思路是探究RNF32调控这些表型的下游信号通路，结合EMT常见的调控通路（如Wnt、MAPK等），优先选择Wnt信号通路进行验证（因为已有研究表明RING家族成员可能参与Wnt通路调控），这就是2.4实验的设计背景。⑤对全文逻辑的贡献 完成了RNF32促癌作用的“临床-体外-体内”三重验证，让“RNF32是结直肠癌肝转移关键驱动因子”的结论更具说服力，同时为后续的机制探究指明了方向，使研究从“是什么”（RNF32的功能）深入到“为什么”（RNF32的作用机制）。 2.4 小标题：RNF32 Drives CRC Liver Metastasis via GSK3β/Wnt/β-catenin Signaling-Mediated EMT（RNF32通过GSK3β/Wnt/β-catenin信号通路介导的EMT驱动结直肠癌肝转移）①结论 RNF32通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进结直肠癌的EMT和转移，且这一过程依赖于对GSK3β的调控。②实验设计及细节（对应原文位置与Figure） RNA测序与通路富集分析（Figure 4A-C、Figure S3A-B）：对RNF32敲低的SW480细胞进行RNA测序，分析差异表达基因的通路富集情况。火山图（Figure 4A）和热图（Figure 4B）显示，RNF32敲低后大量基因表达变化；GSEA分析发现，这些差异基因显著富集在Wnt信号通路（Figure 4C）；GO和KEGG分析显示，差异基因涉及碳水化合物运输、细胞迁移调控、cAMP信号通路等（Figure S3A-B）。 通俗解释：通过测序分析RNF32敲低后细胞内所有基因的表达变化，找出受RNF32调控的信号通路。 Wnt通路相关分子表达验证（Figure 4D-F、Figure S3C-F）： Western blot检测：检测RNF32敲低/过表达后，Wnt通路核心分子（GSK3β、β-catenin）、下游靶基因（TCF4、LEF1、c-Myc、Met）的蛋白表达，以及核质分离后的β-catenin（核内β-catenin增多表明通路激活）（Figure 4D-F）。结果显示，RNF32敲低后，GSK3β蛋白水平升高，β-catenin总蛋白和核内蛋白水平降低，下游靶基因表达降低；过表达则相反。 免疫荧光验证：观察RNF32敲低/过表达后，GSK3β和β-catenin的细胞内定位和表达水平（Figure 4E，比例尺50μm），结果与Western blot一致。 临床样本与数据库验证：对66例结直肠癌临床样本进行免疫荧光染色，Spearman秩相关分析显示RNF32与活性β-catenin表达呈正相关（Figure S3D）；TCGA数据库分析显示，RNF32表达与β-catenin及其下游靶基因（TCF4、LEF1、c-Myc）呈正相关（Figure S3E-F）；GSEA分析显示，结直肠癌肝转移灶中Wnt信号通路显著上调（Figure S3C）。 通俗解释：从细胞、临床样本、数据库三个层面，验证RNF32与Wnt通路的关联。 通路激活/抑制实验验证（Figure 4G-J）： 通路激活实验：用Wnt通路激活剂LiCl（能稳定β-catenin）处理RNF32敲低的细胞，Western blot检测显示，LiCl能恢复β-catenin及其下游靶基因的表达，逆转EMT标志物的变化（E-cadherin升高、N-cadherin/Vimentin降低）（Figure 4G）；功能实验（EdU增殖实验、Transwell侵袭实验）显示，LiCl能部分恢复RNF32敲低导致的增殖和侵袭能力下降（Figure 4I-J）。 通路抑制实验：用Wnt通路抑制剂XAV-939（能促进β-catenin降解）处理RNF32过表达的细胞，Western blot检测显示，XAV-939能抑制β-catenin及其下游靶基因的表达，逆转EMT标志物的变化（Figure 4H）；功能实验显示，XAV-939能抑制RNF32过表达导致的增殖和侵袭能力增强（Figure 4I-J）。 通俗解释：通过“激活通路挽救敲低RNF32的表型”和“抑制通路阻断过表达RNF32的表型”，证明RNF32的功能依赖于Wnt通路。③与其他Result的逻辑关系 本部分承接2.2和2.3的“功能表型”，揭示了RNF32调控这些表型的核心信号通路（Wnt/β-catenin），将“RNF32的功能”与“分子机制”联系起来，为后续更深入的分子机制（如RNF32如何调控Wnt通路）奠定了基础。④实验思路启发 已知Wnt通路的核心负调控因子是GSK3β（GSK3β能促进β-catenin降解，抑制通路激活），而RNF32是E3泛素连接酶（其核心功能是介导靶蛋白的泛素化降解）。因此，作者提出假设：RNF32可能通过泛素化降解GSK3β，减少β-catenin的降解，从而激活Wnt通路。为验证这一假设，需要进一步探究RNF32与GSK3β的相互作用及泛素化修饰关系，这就是2.5实验的设计思路。⑤对全文逻辑的贡献 从“功能表型”深入到“信号通路机制”，明确了RNF32促癌作用的下游通路，回答了“RNF32如何调控肿瘤细胞增殖、转移和EMT”的问题，使研究从“现象”深入到“通路”，为后续探究更上游的分子机制（蛋白-蛋白相互作用、翻译后修饰）提供了明确靶点（GSK3β）。 2.5 小标题：RNF32 Mediates K48-Linked Ubiquitination at K60 to Direct the Degradation of GSK3β（RNF32介导GSK3β的K60位点发生K48连接的泛素化降解）①结论 RNF32作为E3泛素连接酶，直接结合GSK3β的D3结构域（281-420 aa），通过其自身的△2结构域（208-293 aa）催化GSK3β的K60位点发生K48连接的泛素化，促进GSK3β通过蛋白酶体降解，进而稳定β-catenin并激活Wnt通路。②实验设计及细节（对应原文位置与Figure） RNF32与GSK3β的相互作用验证（Figure 5A-D）： 分子对接：通过AI技术预测RNF32与GSK3β的潜在结合位点（Figure 5A）。 Co-IP实验：在293T细胞中过表达FLAG-RNF32和HA-GSK3β，免疫共沉淀实验显示，FLAG抗体能沉淀出HA-GSK3β，HA抗体也能沉淀出FLAG-RNF32，证明二者存在相互作用（Figure 5B）。 GST pull-down实验：体外表达并纯化GST-GSK3β和FLAG-RNF32，将GST-GSK3β与FLAG-RNF32孵育后，用谷胱甘肽琼脂糖珠沉淀，Western blot检测到FLAG-RNF32，证明二者直接相互作用（Figure 5C）。 免疫荧光共定位：在HCT116细胞中进行免疫荧光染色，发现RNF32（绿色）与GSK3β（红色）在细胞质中存在共定位（Figure 5D，比例尺50μm）。 通俗解释：通过计算机预测、细胞内实验和体外实验，三层验证RNF32和GSK3β是否直接结合。 相互作用结构域鉴定（Figure 5E-H）： 构建截短突变体：根据RNF32和GSK3β的结构域，构建RNF32的截短突变体（△1、△2、△3）和GSK3β的截短突变体（D1-D5）（Figure 5E）。 Co-IP实验：将截短突变体转入293T细胞，Co-IP结果显示，RNF32的△2结构域（208-293 aa）和GSK3β的D3结构域（281-420 aa）是二者相互作用必需的（Figure 5F）。 点突变验证：根据HADDOCK预测的结合位点，对RNF32的221位残基和GSK3β的376、378位残基进行点突变，Co-IP实验显示，突变后二者的相互作用显著减弱（Figure 5G-H）。 通俗解释：找出RNF32和GSK3β结合的具体“区域”和“关键位点”。 RNF32对GSK3β稳定性和泛素化的影响（Figure 5I-O、Figure S3G）： 蛋白稳定性实验（CHX chase assay）：用环己酰亚胺（CHX，抑制蛋白质合成）处理RNF32敲低/过表达的细胞，不同时间点检测GSK3β的蛋白水平。结果显示，RNF32敲低后GSK3β的半衰期延长（降解变慢），过表达后GSK3β的半衰期缩短（降解变快）（Figure 5J）。 蛋白酶体降解验证：用蛋白酶体抑制剂MG132处理RNF32敲低的细胞，GSK3β的蛋白积累被逆转；而用自噬抑制剂氯喹（CQ）处理则无影响，证明RNF32促进GSK3β通过蛋白酶体降解（Figure 5I、K）。 泛素化实验：用MG132处理细胞后，免疫沉淀GSK3β，Western blot检测泛素化水平。结果显示，RNF32过表达能增加GSK3β的泛素化水平，敲低则减少；RNF32突变体（△Ring，失去E3泛素连接酶活性）无法促进GSK3β泛素化（Figure 5L、O、Figure S3G）。 泛素化类型和位点鉴定：通过转染不同泛素链突变体（K48R、K63R等），发现只有K48R突变体能抑制RNF32介导的GSK3β泛素化，证明是K48连接的泛素化（Figure 5M）；对GSK3β的潜在泛素化位点（K60、K135、K266）进行点突变，发现K60R突变体能显著抑制GSK3β的泛素化，证明K60是关键泛素化位点（Figure 5N）。 通俗解释：明确RNF32通过“K48连接的泛素化”修饰GSK3β的“K60位点”，促进其通过蛋白酶体降解。③与其他Result的逻辑关系 本部分承接2.4的“信号通路机制”，进一步揭示了RNF32调控Wnt通路的分子细节——即RNF32通过泛素化降解GSK3β激活Wnt通路，完成了“RNF32→GSK3β泛素化降解→β-catenin稳定→Wnt通路激活→EMT→转移”的细胞内机制链。同时，为后续探究RNF32在肿瘤微环境中的作用（2.6及以后）留出了空间，因为肿瘤转移不仅依赖细胞内在机制，还依赖肿瘤微环境的调控。

栀子豉汤收录于国家药品监督管理局发布的《古代经典名方目录（第二批）》[1]，汉代张仲景所著《伤寒论》[2]言：“发汗、吐下后，虚烦不得眠；若剧者，必反复颠倒，心中懊侬，栀子豉汤主之。”是治疗“虚烦”而“心中懊侬”的名方。栀子豉汤由栀子和香豉（即淡豆豉[3]）2味药构成[4]，其配比与用法用量为栀子14个（擘），香豉4合（绵裹），常见的用量折合现代为栀子10～15 g，淡豆豉15～30 g。此方虽药仅2味，却开创了治疗郁热之先河，方中栀子味苦性寒，清透郁热、解郁除烦，香豉体轻气寒、升散降中，既载栀子于上，又和降胃气于中。二者相合，降中有宣，宜中有降，共奏清热除烦之功。 根据《伤寒论》记载栀子豉汤主治“不得眠”对应其镇静催眠的功效，治疗“心中懊憹”“虚烦”等症状与其抗抑郁作用相关，而“吐下后反复颠倒”则是治疗胃内容物反流损伤食管，“胸中室塞”“热郁气闭”为肺气郁闭的表现，因栀子豉汤能够“清宣郁热、疏通气机”，其对肺损伤具有调节作用。现代药理研究表明栀子豉汤具有调节神经系统、保护心肌、肝脏和黏膜、调节肺损伤、降糖等药理作用；现代临床根据患者临床表现辨证论治，在本方的基础上加味，并选择不同的炮制品入药，目前广泛用于治疗抑郁症、失眠症、反流性食管炎、胃炎等疾病，在呼吸系统和心血管疾病方面的研究较少，且目前尚未有制剂上市。本文从药理作用、临床应用展开，总结栀子豉汤现代制剂与研究技术的发展，为栀子豉汤的成方制剂和临床用药提供参考。 1  药理作用 栀子豉汤在神经系统调节、肝脏保护、降糖、肝脏保护、心肌保护、抗炎护膜等方面具有一定的活性，其发挥作用的机制见图1。 1.1  神经系统调节 1.1.1  镇静催眠 中医理论认为“火热之邪”是“不寐”主要发病原因[5]。《伤寒论》记载栀子豉汤是治疗“火郁发之”“虚烦不得眠”的代表方剂，现代药理研究表明，栀子豉汤的镇静催眠作用可能与脑组织中神经递质、炎症因子含量有关，从而降低脑部神经元的兴奋性，调节睡眠状态。康璐等[6]通过小鼠镇静催眠实验，发现栀子豉汤4.33 g/kg能降低小鼠脑组织海马、下丘脑中去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）的含量，增加5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）代谢使5-羟吲哚乙酸（5-hydroxyindole acetic acid，5-HIAA）的含量升高，显著缩短翻正反射消失时间，延长小鼠的睡眠持续时间。刘晓东等[7]基于网络药理学探究了栀子豉汤的镇静催眠作用，发现其机制可能源于栀子苷、大豆苷元、芦丁、西红花酸、染料木素等成分，作用于5-HT、TNF、IL-6、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）等通路发挥药理作用。 以上研究表明，栀子豉汤通过调节NE、5-HT、5-HIAA、GABA等神经递质与TNF、IL-6等炎症因子，发挥镇静催眠的作用，为缓解和治疗失眠提供了积极的治疗前景。 1.1.2  神经退行性疾病干预 栀子豉汤中的环烯醚萜类和栀子色素类已被证实具有神经系统调节作用，在神经退行性疾病治疗方面具有较大的潜力与优势，如治疗阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）和帕金森（Parkinson’s disease，PD）等。Zhang等[8]以氯化铝诱导AD大鼠模型，发现栀子色素类成分可改善大鼠AD样行为，抑制海马神经元凋亡；还能通过抑制NOD样受体热蛋白结构域3（NOD like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）炎症小体活化及下游胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）、IL-1β、IL-18表达发挥抗炎作用，进而缓解记忆障碍，提示栀子豉汤或为AD治疗的候选药物。Zhou等[9]以鱼藤酮诱导PD小鼠模型研究环烯醚萜类成分栀子苷改善PD机制，发现栀子苷可改善小鼠运动障碍，恢复纹状体多巴胺及代谢物水平，保护黑质-纹状体多巴胺能神经元；还能激活核因子E2相关因子2通路减轻氧化损伤，激活mTOR通路抑制神经元凋亡，为PD治疗提供候选方向。 1.1.3  神经保护  谷氨酸是中枢神经系统内一种兴奋性神经递质，但在病理状态下其含量异常升高并堆积，会对神经细胞造成明显的损伤，研究表明栀子豉汤减少谷氨酸介导细胞毒性的机制可能是减少氧化应激和线粒体损伤等。姚媛等[10]建立了谷氨酸对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞兴奋毒损伤的模型，研究栀子豉汤对谷氨酸的神经保护作用，发现栀子豉汤能改变细胞内代谢物含量和恢复紊乱的代谢通路，升高PC12细胞中谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性，维持细胞内谷胱甘肽的适当水平，阻止谷胱甘肽耗竭触发Bcl-2关联X蛋白单克隆抗体（monoclonal antibody to Bcl-2 associated X protein，Bax）蛋白诱导的细胞凋亡；栀子豉汤富含的环烯醚萜苷类和异黄酮类成分[11-12]能清除细胞内线粒体损伤产生活性氧[13]，减少活性氧所诱导PC12细胞凋亡，达到抗氧化及神经保护作用。张银[14]建立慢性不可预测轻度应激联合孤养的抑郁大鼠模型和体外培养神经损伤细胞模型，通过代谢组学分析栀子豉汤治疗后抑郁大鼠的脑代谢轮廓，发现其通过改善大鼠细胞的能量代谢、氨基酸代谢和脂质代谢，使脑内代谢物的含量和受干扰的代谢通路恢复到正常水平，为栀子豉汤基于神经保护治疗抑郁症提供了实验依据。 1.1.4  肠道菌群调节  精神类疾病患者体内肠道微生物生态系统的物种多样性和菌群结构，都与正常的机体有着明显的区别，恢复肠道菌群失调状态与治疗中枢神经系统疾病密切相关[15]。其中丁酸盐在维持肠道屏障完整性方面具有重要作用，产生丁酸盐的细菌减少会使肠道屏障通透性受损进而导致精神障碍[16]。Liu等[17]发现栀子豉汤可调节肠道菌群促进丁酸盐的产生，通过组织学和行为学评价证明丁酸盐能够恢复抑郁小鼠海马神经元和蔗糖偏好率，显著缩短悬尾实验和强迫游泳实验的静止时间，且大鼠血清、回肠和下丘脑中促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）升高，脑源性神经营养因子降低。于德勋[18]研究肠道菌群体外培养实验，证明栀子豉汤能够显著提升鼠李糖乳杆菌B33的A600值，通过降低致病菌和诱发抑郁症菌属的相对丰度，提升丁酸盐产生菌相对丰度，重塑肠道菌群的稳态，从肠道菌群方面揭示了栀子豉汤抗抑郁的机制。基于中医脏腑学说，栀子归心、肺经，淡豆豉归肺经，从“心与小肠相表里”和“肺与大肠相表里”的整体观来看，与栀子豉汤通过改变肠道菌群治疗抑郁症的理论是相通的，但仍需要从配伍和剂量方面确定的目标菌群，为治疗抑郁症实现定向调节肠道菌群。 1.1.5  调节炎症因子、神经递质水平 栀子豉汤除通过神经保护、调节肠道菌群等方式起到抗抑郁作用，还与调节炎症因子、神经递质水平等机制有关。曲书阅等[19]建立脂多糖诱导的抑郁小鼠模型，栀子豉汤中环烯醚萜苷类通过升高抑郁小鼠脑内海马区GABA、5-HT、多巴胺水平及降低谷氨酸、氯化乙酰胆碱水平，达到改善小鼠模抑郁行为学特征的作用，证明了栀子豉汤实现调节海马区神经递质的作用，为现代临床使用栀子豉汤治疗抑郁症提供了新的方向。Ren等[20]建立脂多糖炎症小鼠模型，通过组织学发现栀子豉汤能够激活前额叶皮层中的神经元和垂体腺苷酸环化酶激活多肽/血管活性肠肽，可能增强海马CA1区域的突触传递，实现栀子豉汤快速抗抑郁作用。Liu等[21]采用慢性社交挫败应激模型诱导小鼠抑郁样行为，发现栀子豉汤可逆转抑郁小鼠的社交回避（社交互动实验互动时间增加）、快感缺失（蔗糖偏好实验蔗糖偏好升高）及绝望行为（强迫游泳/悬尾实验的不动时间缩短），显著降低抑郁小鼠血清及脑组织中促炎因子水平，减少齿状回区活化小胶质细胞数量，通过靶向调控肌醇三磷酸受体3型-葡萄糖调节蛋白75-电压依赖性阴离子通道1复合物，改善线粒体相关膜结构完整性，进而维持内质网与线粒体之间的钙稳态，减轻内质网应激与线粒体功能损伤，最终缓解抑郁样行为。 在中医理论中，情绪低落、思维迟缓等症状归属“郁证”范畴[22]，其病证表现与西医所述的抑郁症相近，郁证发病机理可概括为“始于气郁，终于五脏”。《伤寒论》记载栀子豉汤主治热郁阻滞气机所致的烦躁、懊憹等症状，因其具备疏通气机、清解郁热的核心功效，故现代临床常将其用于抑郁症的治疗。抑郁症致病因素不详、发病机制复杂，目前主流的假说有神经递质学说、下丘脑-垂体-肾上腺轴学说、肠道菌群失调学说等[23]。栀子豉汤主要通过调节神经递质、保护神经元等发挥神经保护作用从而抗抑郁，此外，也可通过调节肠道菌群、抗炎、抗氧化、调节炎症因子、神经递质水平等发挥抗抑郁作用。 1.2  肝脏保护 现代药理表明，酒精性肝损伤与氧化应激过程、炎症因子水平相关，而栀子具有保肝利胆、抗炎利尿的良效，淡豆豉则有良好的体内外抗氧化作用，栀子豉汤可通过增强肝组织脂质代谢水平、抑制氧化应激反应和降低炎性因子水平保护肝脏[24-25]。刘俊泽[26]研究发现栀子豉汤可显著降低酒精性肝损伤小鼠肝脏中的丙二醛、活性氧2个氧化应激指标，并不同程度逆转了肝损伤伴随着的炎症指标上升。Zang等[27]发现栀子豉汤可通过多靶点协同作用改善脂多糖诱导的肝脏炎症，栀子豉汤可显著降低肝组织中TNF-α、IL-6的mRNA表达，升高IL-10的mRNA表达，抑制脂多糖激活的PI3K/Akt信号通路，从而减轻炎症反应。栀子豉汤逆转了模型小鼠肠道菌群多样性降低，使理研菌科、芽孢杆菌科等有益菌丰度显著升高，普雷沃氏菌科丰度显著降低，恢复肠道菌群平衡，且改善肝和肠道的组织病理结构，如肝细胞排列恢复、肠道绒毛完整性提升。此外，分析粪便样本的代谢轮廓发现，栀子豉汤主要通过胆汁酸代谢途径、有机酸生物合成途径和氨基酸代谢途径调节肠道菌群代谢，增强肠道屏障功能从而减轻肝脏炎症。 在中医理论体系中，肝脏作为“主疏泄、调畅情志”的核心脏腑，其生理功能失常是精神类疾病（如郁证、不寐等）发生的关键病机，即肝疏泄有度则情志条达，提示该方在发挥安神除烦功效的同时，亦对肝脏具有潜在的保护作用。栀子归三焦经能疏泄肝热、清热解毒利湿，现代用于治疗黄疸肝炎等。现代药理研究表明栀子豉汤主要通过降低丙二醛、活性氧氧化应激指标，通过NLRP3、NF-κB、Caspase、IL-1β等多信号通路保护肝脏。 1.3  降血糖 糖尿病是一种多病因的代谢疾病，中医将其称为“消渴症”，特点是慢性高血糖，伴随胰岛素分泌缺陷引起的代谢紊乱，并且会引起心、脑、肾和神经等病变，消渴病患者因饮食不节，热邪扰动上焦肺（“上消”多饮）、中焦胃（“中消”多食），栀子豉汤清泻胸膈及三焦郁热，畅利气机，加速津液与糖的消耗，改善糖转运，中医可使用栀子豉汤治疗糖尿病的症状及并发症，栀子豉汤活性成分主要通过保护胰岛细胞、改善胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）、抑制消化酶活性等途径降低血糖达到治疗糖尿病的作用。 1.3.1  抑制胰岛细胞凋亡 胰岛细胞的代谢状态在糖尿病的发病过程中发挥重要作用[28]，胰岛β细胞能够分泌胰岛素，促进机体对葡萄糖的摄取，抑制肝脏糖异生和糖原分解，因此胰岛细胞的凋亡影响糖尿病患者体内糖代谢[29]。栀子豉汤被证明具有抑制细胞凋亡和保护胰岛β细胞的作用。谭小梅[30]发现栀子豉汤中的栀子苷，能够抑制链脲佐菌素诱导的大鼠糖尿病模型的胰岛细胞凋亡，通过抑制NF-κB和Bax通道，提高Bcl-2基因表达，明显抑制胰岛细胞凋亡，同时还可能抑制Caspase-3和Caspase-9蛋白酶活性减轻了胰岛细胞的凋亡；并且通过观察胰岛组织切片发现栀子苷能有效改善胰岛的形态结构，促进胰岛β细胞增殖。姚冬冬等[31]观察高脂联合链脲佐菌素的糖尿病小鼠模型的胰腺组织切片，发现栀子苷给药的糖尿病小鼠胰岛素表达量恢复，并且可以检测到胰岛细胞增殖的标志，即Ki67阳性表达的胰岛β细胞，证明栀子苷具有促进胰岛β细胞增殖的作用。 1.3.2  改善IR  2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）[32]发病的主要原因是IR，即胰岛素介导的葡萄糖利用率降低。栀子豉汤能够提高胰岛素利用率，恢复胰岛素分泌治疗T2DM。田义龙等[33]用链脲佐菌素加高脂饲料方法，建立T2DM大鼠模型，探讨栀子豉汤对IR的改善作用及其机制。大鼠分别ig栀子豉汤4、8、16 g/kg，连续给药8周，并进行采血测定胰岛素及肝组织胰岛素受体（insulin receptor，InsR）mRNA表达测定，发现栀子豉汤高剂量组可显著降低空腹血糖、血清胰岛素、糖化血红蛋白，并且上调了肝脏组织中InsR的mRNA表达，增强了胰岛素敏感性从而减轻IR。赵静[34]发现栀子豉汤能够有效修复损伤的胰腺组织，通过降低丙二醛水平，提高SOD水平，改善氧化应激，提高T2DM大鼠的胰岛素敏感性；同时下调血管紧张素II 1型受体（angiotensin II type 1 receptor，AT1R）mRNA的表达，通过阻断肾素-血管紧张素系统改善IR。亢丽娟等[35]建立妊娠糖尿病大鼠模型，发现栀子豉汤中的主要活性成分栀子苷能显著降低孕鼠血脂指标，栀子苷干预后能显著升高血清C1/q肿瘤坏死因子相关蛋白3和葡萄糖转运蛋白4的水平，且通过抑制高迁移率族蛋白1-晚期糖基化终产物受体信号通路，发挥降低妊娠期糖尿病大鼠的IR作用。 1.3.3  抑制消化酶活性  α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是治疗糖尿病的重要靶点，其抑制剂在治疗糖尿病中占据重要作用[36]，α-淀粉酶抑制剂能有效降低机体的血糖和血脂水平，阻碍机体内碳水化合物的代谢。α-葡萄糖苷酶抑制剂能防治餐后高血糖和缓解高胰岛素血症。任顺成等[37]发现栀子豉汤中的栀子黄色素对消化酶具有显著的抑制作用，通过研究栀子黄色素对酶结合方式、作用位点及抑制强度等因素，证明栀子黄色素通过竞争性抑制的方式显著抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的活性，主要作用于酶的酪氨酸残基和色氨酸残基，引起氨基酸残基的构象变化。栀子黄与酶-底物结合位点竞争形成复合物，通过减少底物与酶的结合来降低酶促速率；栀子黄对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的竞争性抑制常数分别为1.47、0.58 mg/mL，说明栀子黄对α-葡萄糖苷酶的结合亲和力更高。全吉淑等[38]将糖尿病大鼠血糖和大鼠糖耐量作为抑制酶活性的指标，发现大豆异黄酮和大豆皂苷通过抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶，显著降低糖尿病大鼠空腹血糖，改善大鼠葡萄糖负荷后血糖升高趋势，甚至影响正常大鼠的葡萄糖耐量。Zhou等[39]通过探究栀子豉汤中西红花苷I治疗糖尿病的体外抑制酶活性和作用机制，发现西红花苷I可通过主要治疗靶点α-葡萄糖苷酶来发挥降糖作用，且西红花苷I为非竞争型抑制剂，对α-葡萄糖苷酶的抑制是可逆的。 1.3.4  其他 栀子豉汤不仅可通过改善IR、调节血管紧张素、促进胰岛细胞增值、抑制酶活性等机制治疗T1DM、T2DM和妊娠期糖尿病，此外，其活性成分也有防治糖尿病并发症的潜力，如治疗糖尿病心血管病变、糖尿病肾病。戴标等[40]发现栀子豉汤中的栀子苷通过调控Toll样受体4/转化生长因子-β1信号通路，改善糖尿病肾病小鼠模型的空腹血糖值和餐后血糖，降低肾组织的炎症反应，保护肾功能。张伟萍等[41]进行体内外实验并观察心脏组织，发现栀子苷能通过抑制血管过氧化物酶1表达及细胞外调节蛋白激酶磷酸化，改善大鼠糖尿病心肌病引起的心肌凋亡和心肌纤维化形成。李琛等[42]以自发性高血压大鼠为模型，观察大鼠血压和检测主动脉组织AT1R的mRNA表达，研究结果表明栀子豉汤可明显下调主动脉组织中AT1R的mRNA表达，且血压明显降低，栀子豉汤能抑制血管紧张素II介导的直接收缩血管及促血管平滑肌细胞增殖作用，降低外周血管阻力，从而使血压下降，防治糖尿病心血管病变。 1.4  调节肺损伤 中医认为“肺居胸中”，胸膈是肺脏发挥“宣发肃降”功能的空间载体，肺部疾病常见热郁胸膈，气机不通，故见胸中窒闷，栀子苦寒清泻胸膈郁热，淡豆豉辛凉宣发郁气，恰好契合“清宣郁热、疏通气机”的需求，使肺气得展，因此现代临床也可将栀子豉汤用于治疗呼吸系统疾病及肺组织损伤[43]。陈超等[44]以痰热壅肺证候积分和临床肺部感染评分作为治疗标准，结合患者血样检测，结果显示经栀子豉汤治疗后的肺炎患者血清C反应蛋白与降钙素原含量显著降低，说明具有降低体内炎性因子水平，抑制肺部炎性反应的潜力。孙立燕等[45]建立急性呼吸窘迫综合征大鼠模型，研究栀子豉汤对于呼吸道疾病的治疗及调节肺损伤的作用机制。通过大鼠肺组织病理切片观察到栀子豉汤治疗后肺组织炎症浸润、水肿等损伤得到改善，可以激活AMPK/ SIRT1/NF-κB信号通路，降低肺组织炎症因子水平，改善大鼠肺损伤状况。杭文地等[46]研究发现栀子豉汤中的栀子苷能够调节肺缺血再灌注引起的肺损伤，其保护的机制激活PI3K/Akt信号通路、提高Akt磷酸化水平、降低NF-κB的表达有关。 栀子豉汤方中的栀子性寒，善于开宣上焦的热，味苦能清肺气；淡豆豉归肺经，性凉味辛能宣散邪热，可使肺部气机通畅，肺主一身之气，从而使三焦行气。原方作用于肌表和呼吸道，古时常用于治疗郁热带来的胸脘痹闷等症状，肺部疾病患者常出现胸闷、胸中窒、心中结痛或烦扰不得眠等症状，因此现代临床也可将此方用于治疗外感和肺部疾病，如气管炎、肺炎、肺结核。 1.5  心肌保护 心肌损伤是心血管疾病发展的关键病理生理过程之一，因此栀子和淡豆豉作为保护心肌细胞的药物对防治心血管疾病有重要意义。马慷等[47]通过网络药理学发现栀子豉汤中的大豆苷可以延缓细胞衰老，染料木素可以提高大鼠心肌H9c2细胞存活率，结合栀子豉汤对缺氧/复氧诱导的H9c2细胞形态的影响，发现栀子豉汤干预后，皱缩的受损心肌细胞形态逐渐恢复，细胞数量增多，栀子豉汤处理后损伤细胞线粒体膜电位的逐渐升高，证明栀子豉汤可以减轻心肌细胞损伤导致的线粒体功能障碍。吴永刚等[48]发现心绞痛患者予以化学药联合栀子豉汤治疗后，心绞痛改善有效率为95.24%高于化学药治疗，心肌细胞受损后心肌肌钙蛋白T、肌酸激酶会被释放入血，栀子豉汤治疗后二者水平低于化学药组，说明栀子豉汤治疗心绞痛能有效改善患者的心肌指标。朱亚文等[49]建立T1DM模型小鼠，通过观察小鼠心肌组织病理学的变化和体外实验，分析栀子豉汤中的栀子苷调节心肌损伤的机制，结果表明栀子苷能激活H9c2细胞中AMPK介导的自噬，减少胶原沉积，改善糖尿病引起心肌结构损伤和心肌纤维化，维持心脏功能的稳态。Luo等[50]研究了栀子苷对心肌缺血再灌注模型和H9c2细胞在缺氧/复氧期间的影响，能通过调控Akt/mTOR信号通路，上调p-mTORSer2448和p-AktSer473的表达，抑制自噬表达和自噬体积累，减少心肌梗死面积，并调节了细胞凋亡相关蛋白，抑制心肌细胞在缺氧/复氧期间凋亡。 中医理论认为胸膈与心脉直接相关，栀子豉汤治疗的“热郁胸膈”“心中结痛”是常见于心肌梗死、心绞痛的胸痛症状。栀子豉汤中大豆异黄酮和环烯醚萜苷类可调控Akt/mTOR、AMPK介导的自噬信号通路抑制自噬，从多通路发挥对心肌细胞的保护作用；栀子色素类可通过减轻氧化应激、减少炎症因子等多方面发挥保护心肌细胞的作用，未来仍需从多通路方面研究其作用机制。 1.6  抗炎护膜 中医理论中消化系统疾病的核心病机为饮食不节、情志失调引起的阳明郁热、气机阻滞，表现为心中懊憹（烧灼不适）、胸中窒（食管堵塞感）、黄疸等症状。栀子豉汤及类方治疗消化系统疾病的依据源于《伤寒论》，栀子豉汤主治发汗吐下后的反复颠倒和心中懊憹，“心中懊憹”对应反流性食管炎的食管烧灼不适，“反复颠倒”为反流致生理不适的表现。吴昊等[51]基于网络药理学探讨栀子豉汤治疗反流性食管炎的作用机制，发现栀子豉汤中环烯醚萜类（如栀子苷）、栀子色素类（如西红花苷）、黄酮类（如槲皮素）、异黄酮类（如大豆苷）等关键成分，通过p38和NF-κB信号通路等核心调控通路，从源头减少炎性因子分泌，缓解食管黏膜的炎症浸润与糜烂损伤。刘小河等[52]发现栀子豉汤对反流性食管炎大鼠的糜烂食管黏膜结构具有修复作用，相较于模型组，栀豉组显著升高胃泌素和胃动素，降低血管活性肠肽，使黏膜充血减轻，糜烂面积缩小，并增强了食管抗反流能力，保护食管黏膜。 2  临床应用 栀子豉汤主治“心中懊憹”“郁热”，因此临床常用其治疗抑郁症、失眠等神经系统疾病。有研究认为栀子豉汤主治“热郁”“心中懊侬”实乃胃中嘈杂，邪热乘虚入于胃中，其病位在于胃中[53]，现代临床也使用栀子豉汤治疗消化系统疾病。 2.1  神经系统疾病 2.1.1  抑郁症  栀子豉汤主治证候多与临床中抑郁症所表现的症状相似，石景洋等[54]对比了栀子豉汤疗法和氟西汀疗法对郁症患者的临床疗效，结果表明栀子豉汤可明显改善郁症患者的抑郁状态，对患者的睡眠状态、身体疼痛异常、精神状态、社交状态等神经功能紊乱症状方面调节存在优势。冯美珍[55]发现加味栀子豉汤治疗抑郁症的疗效显著优于帕罗西汀，不仅能更有效地改善抑郁症状及中医证候，以其安全有效、低不良反应等优势，更适于临床。临床上栀子豉汤还常与针灸疗法联用共同用于抑郁症的治疗，林汉芳等[56]运用栀子豉汤联合针刺合温胆汤治疗抑郁症患者，总有效率94.28%显著高于单服用中药的对照组73.33%，提示栀子豉汤联合针刺治疗抑郁症具有更优的疗效。 2.1.2  失眠 失眠障碍是一种以频繁而持续的睡眠起始或维持困难并导致睡眠满意度不足为特征的睡眠障碍，导致机体阴气耗竭，阳气相对过剩，频繁出现烦躁症状，中医基础理论认为属于阴虚内热证范畴。成涛[57]将84例失眠患者作为研究对象，随机分成2组，对照组给药劳拉西泮片，观察组给药栀子豉汤联合酸枣仁汤，结果显示观察组总有效率95.24%，显著高于对照组80.95%，能更有效改善睡眠质量、缩短入睡时间、延长睡眠时间及提高睡眠效率，且安全性更高，并且无明显不良反应。谭晓宁[58]针对肝郁化火型失眠，回顾性分析近5年内使用栀豉舒眠方治疗的失眠症患者病例资料，涵盖不同年龄、性别及病程阶段，临床疗效表明，栀豉舒眠方显著降低匹兹堡睡眠质量指数（Pittsburgh sleep quality index，PSQI）和失眠严重程度指数量表评分，缩短睡眠潜伏期，延长总睡眠时间，提高睡眠效率。多导睡眠监测显示，患者觉醒次数减少，非快动眼睡眠期N3期比例增加，快动眼睡眠期比例优化，睡眠结构趋于正常，其作用机制是栀子中的栀子苷和淡豆豉中的异黄酮成分可上调GABA水平，增强抑制性神经传导，减少觉醒信号。栀豉舒眠方治疗后有效缓解肝郁化火相关症状，如烦躁易怒、胸胁胀痛、口苦咽干、多梦易醒等，汉密尔顿焦虑量表（Hamilton anxiety scale，HAMA）评分显著下降，说明患者焦虑情绪及抑郁状态明显改善，与增加5-HT合成，抑制多巴胺过度释放，调节情绪与睡眠周期有关。耿伟富等[59]将60例热郁胸膈型焦虑性失眠患者随机分为对照组（曲唑酮）与观察组（酸枣仁加味栀子豉汤联合曲唑酮），在降低PSQI、HAMA、入睡困难和中医症状总积分等方面，观察组均显著优于对照组，且观察组明显减少了觉醒次数、非快动眼睡眠期N1、N2期比例，缩短了睡眠潜伏期，增加了非快动眼睡眠期N3期比例和快动眼睡眠期比例，延长睡眠总时间，提高睡眠效率。此外，栀子豉汤还用于治疗焦虑症、小儿睡惊症等精神类疾病。 2.2  消化系统疾病 2.2.1  胃食管反流病 胃食管反流病包括反流性食管炎、非糜烂性反流病等，临床表现为反酸嗳气和胸骨后疼痛，目前临床主要使用质子泵抑制剂治疗，雷贝拉唑、兰索拉唑是主要的治疗药物，长期使用质子泵抑制剂会带来胃肠道不适、癌症等严重的并发症。徐庆等[60]分析加味栀子豉汤治疗反流性食管炎的临床疗效，发现栀子豉汤可通过降低降钙素基因相关肽和IL-17水平，抑制炎症反应和神经敏感性，并且提升食管下括约肌功能，抑制胃酸过度分泌和增强食管抗反流屏障，减少夜间及餐后酸反流的频率和持续时间，从而缓解烧心、胸骨后灼痛等症状，且观察组复发率远低于化学药治疗组。黄飞霞等[61]在对照组接受常规化学药治疗基础上，加用栀子豉汤。观察组在反酸、烧心、嗳气、胃脘胀满等症状评分上改善更显著，且胸骨后烧心感、疼痛感、口中酸苦味及胃内容物上涌的发作频率和严重程度均低于对照组，栀子豉汤提供了一种安全、有效的中药治疗选择，尤其适用于常规化学药治疗效果不佳的难治性病例。张俊等[62]运用柴胡栀子豉汤联合奥美拉唑治疗患者，治疗后患者各项症状评分、食管感觉神经纤维末梢释放神经肽P物质、降钙素基因相关肽及脂质过氧化物水平试验组均显著降低，神经纤维末梢释放神经肽P物质和降钙素基因相关肽是参与食管黏膜损伤和内脏高敏感的重要神经肽，其水平降低提示柴胡栀子豉汤可能通过抑制神经源性炎症发挥作用。以上临床试验说明栀子豉汤与西医结合产生协同作用，一方面迅速抑酸，另一方面清除病因病机，实现标本兼治、缓急结合，以促进患者康复，充分证明中西医结合在治疗各类型食管炎应用价值。 2.2.2  胃炎 苏然[63]分析了68例完成全部治疗周期的慢性非萎缩性胃炎患者的治疗结果，给予治疗组患者柴胡疏肝汤合栀子豉汤，治疗组总有效率为97.06%显著高于对照组85.29%，且患者治疗前后进行用药安全性检查、治疗后复查、不良反应鉴定后，治疗组和对照组均未出现异常的病例，说明加味栀子豉汤的疗效和安全性在临床用药上能够对标治疗慢性非萎缩性胃炎的药物。叶茂高等[64]使用雷贝拉唑联合加味栀子豉汤治疗胆汁反流性胃炎患者，在中医证候积分上，联合用药在反酸、烧心、腹胀、口苦等症状上显著优于化学药，尤其在胸骨后烧灼感、胃内容物上涌等典型反流症状的发作频率和程度上改善更突出，且降低血清IL-6、IL-8和胃泌素水平，减轻胃黏膜的炎症损伤、减少胆汁反流。 2.2.3  黄疸 陈明丽[65]使用大黄加味栀子豉汤联合双歧杆菌三联活菌肠溶胶囊与蓝光照射治疗新生儿病理性黄疸，总有效率显著高于常规治疗，有效降低血清胆红素和炎症因子（超敏-C反应蛋白）水平、能通过中西医协同作用，快速降低新生儿病理性黄疸的胆红素水平，中药与益生菌的协同作用可能改善新生儿肠道微环境，降低黄疸复发风险，尤其对母乳性黄疸等易反复类型是一种安全有效的综合治疗方案。相较于常规化学药治疗，魏雯佳等[66]发现加味栀子豉汤联合柴胡疏肝散在黄疸消退、胁痛缓解、食欲恢复等时间更短，其改善肝功能指标、退黄效果更优，栀子豉汤兼顾“清利湿热”与“疏畅气机”，符合黄疸型肝炎“湿热郁肝”的核心病机。 2.3  配伍在临床中的应用 中医临床的核心原则是“辨证论治”，即根据患者的具体证型调整方药[67]，基础方栀子豉汤的功效无法覆盖兼夹证，临证需详加辨别，因此临床使用时通过加味实现“方证对应”的精准化治疗。酸枣仁加味栀子豉汤[68]以酸枣仁养心肝阴血、收敛安神，以栀子豉汤清宣郁热、除烦宁心，其独特价值在于同时解决“热扰”与“失养”，尤其适用于现代生活中因情绪压力、熬夜等导致的“郁热兼失养”型失眠。柴胡加味栀子豉汤[69]的临床价值在于和解与清宣并举，改善消化系统合并情绪障碍（如功能性消化不良伴焦虑），少阳失和，胃气上逆（胃脘胀闷、食管反流病）的症状，尤其适用于现代临床中“功能性胃肠病伴焦虑”等虚实夹杂、寒热并存的复杂病症。在栀子豉汤清宣郁热基础上加味炙甘草[70]，兼顾补益气津、调和中气，适用于郁热兼气不足者，慢性消耗性疾病伴郁热，长期郁热影响脾胃运化，出现心烦、胸胁胀闷，因中气不足，郁热更难透散，形成“热郁气虚”的恶性循环，临床常用栀子甘草豉汤治疗胃肠道疾病。大黄促进胆汁分泌与排泄，疏通肝胆气机，间接辅助栀子豉汤清利湿热的作用，大黄加味栀子豉汤[71]通过攻下通腑、导热下行、利胆退黄3方面，既清除胃肠实热积滞，又辅助清解胸膈与肝胆湿热，多用于湿热黄疸，肝炎等疾病。 临床上栀子豉汤在神经系统疾病、消化系统疾病均有应用，特别是在失眠、抑郁症等疾病的治疗上疗效突出。栀子豉汤现代临床研究在研究设计、剂量标准、安全性验证及疗效评价等方面仍存在明显不足。首先，目前多数临床研究以小样本观察性研究、个案报道为主，缺乏多中心、大样本试验，栀子豉汤主治的情志病受到患者心理状况影响，而部分研究未设置安慰剂对照，难以排除“安慰剂效应”及个体差异对疗效的干扰；其次，临床剂量标准化尚未建立，原方剂量换算栀子14枚质量在15 g左右，淡豆豉约47.6 g，均远超《中国药典》指导剂量（栀子6～10 g、淡豆豉6～12 g），但现代临床常用剂量（栀子10～30 g、淡豆豉10～30 g）缺乏统一依据，剂量选择依赖医师经验；最后，剂量与毒性的关联研究不足，栀子高剂量可能引发肝毒性，且随淡豆豉配伍比例降低增加毒性风险，但目前尚未明确“有效且安全”的剂量范围，也缺乏不同剂量下的长期毒性监测数据。仅使用栀子豉汤的治疗效果难以达到预期，未来临床应不拘泥一方一证一治，联合化学药或其他方剂治疗最大程度发挥中药的药性。 3  现代研究及应用前景 传统复方中药通常经过煎煮，制成汤剂口服饮用，具有操作简单，服用方便的优势，但是由于中药汤剂气味特殊难以服用、煎制耗时长、煎液不方便携带和难以储存。随着中药制剂工艺发展创新，有必要将栀子豉汤制成现代制剂，以适应现代临床和医疗的需求，提高患者的用药依从性，以便推动中医药事业的现代化发展。为了保持制剂的质量稳定，优化栀子豉汤的提取工艺，有研究者使用现代的提取技术，既保留了有效成分，又高效去除了杂质。目前已有将栀子豉汤制成颗粒剂、口服液等中成药的研究，及运用新技术将栀子煎液作为发酵淡豆豉的基质，制成固体发酵菌质。 3.1  现代提取技术 栀子豉汤的主要活性成分为环烯醚萜苷类和大豆异黄酮类，使用传统提取方法（如水煎煮、回流提取）存在杂质多、有效成分损失等问题，史雨等[72]利用相分离理论，通过调控溶剂体系的物理化学性质，实现目标成分的选择性富集与分离，相分离技术为栀子豉汤提取物的制备提供了高效、绿色的技术路径，通过优化溶剂体系、耦合膜分离与树脂吸附等手段，实现了有效成分的精准分离与纯化，在栀子豉汤现代化生产中具有重要的应用潜力，为其他复方中药的提取工艺开发提供了参考。 3.2  栀子豉汤口服液 刘国辉等[73]将栀子豉汤制成口服液，并结合紫外可见分光光度法和高效液相色谱测定了总黄酮和栀子苷含量，总黄酮和栀子苷的平均加样回收率分别为97.42%和96.97%，有效控制口服液的质量，栀子豉汤口服液剂量小、服用方便，是接近于传统汤剂的现代制剂，值得在现代临床推广应用。 3.3  栀子豉汤颗粒 栀子豉汤颗粒在临床上主要用于治疗失眠症，许光亚等[74]建立对氯苯丙氨酸诱导的失眠症大鼠模型，发现栀子豉汤颗粒能够改变大鼠海马区组织内的神经递质含量，使5-HT含量显著升高，NE、多巴胺含量显著降低，并且降低炎性因子含量，显著减少移动距离和站立次数，明显改善模型大鼠的失眠症状，其机制可能与大鼠脑内神经递质和炎性因子对机体的调节作用有关。胡钟姣等[75]探究了栀子豉汤提取工艺和栀子豉汤颗粒的成型工艺，应用网络药理学预测栀子豉汤颗粒主要活性成分，并且研究栀子豉汤颗粒对失眠模型大鼠初步分子机制，发现栀子豉汤颗粒有效改善模型大鼠的神经递质和炎性因子，说明栀子豉汤颗粒制备工艺和质量标准明确，保留了原方汤剂的药效，方便患者储存携带。栀子豉汤颗粒剂为缓解和治疗失眠提供了积极的治疗前景，但仍需要进一步进行临床研究，以确保与其他药合用药效和不良反应。 3.4  发展前景 双向固体发酵技术是中药新药的新开发途径，陈丽艳等[76]根据栀子豉汤活性成分的代谢转化，以栀子、青蒿、桑叶水煎液浸泡黑豆作为发酵基质制备栀子豉，确定了最佳发酵工艺及成分含量变化，发酵后的栀子豉中的脯氨酸、组氨酸和谷氨酸的含量增加，协同多种酶作用促进栀子苷的转化及京尼平-氨基酸的结合，有效的发挥了栀子豉汤的抗抑郁机制。张志伟等[77]基于栀子豉汤制备了栀子发酵豆粕，饲料中添加5%～10%的栀子发酵豆粕的大口黑鲈的增重率提高了15%～20%，病理学观察显示，饲料中添加栀子发酵豆粕的大口黑鲈肝细胞空泡化、脂肪变性程度显著减轻，肝窦结构更完整。通过调节肝脏脂质代谢相关基因的表达，减少三酰甘油和胆固醇的合成，预防脂肪肝形成；同时，其添加可降低大口黑鲈烂鳃病、诺卡氏菌病等的发病率，增强肝脏免疫功能和抑制病原菌感染，栀子发酵豆粕为绿色高效养殖提供了新的技术方案，对推动水产饲料添加剂的创新应用具有重要意义。“制曲工艺”是中药特有的生物制药工艺，由此工艺可得知在发酵基质中添加中药材的方法历史悠久。栀子与淡豆豉是药食同源的中药，将栀子豉汤联合双向固体发酵技术制成栀子豉，提高了药效并实现成分的体外生物转化，为中药食疗和新剂型开发提供了新思路，但发酵后是否对中药的性味归经、功效等有影响，且工艺中涉及多种自然发酵的菌种，对栀子豉的发酵菌种控制和有效成分稳定性需要更深入研究。 现有研究表明，可将栀子中的京尼平和淡豆豉中的大豆蛋白交联制成纳米颗粒，其为中药现代化新型递药系统提供新的思路。大鼠体内实验发现封装在该纳米颗粒中的姜黄素表现出缓释和持续吸收，生物利用度提高了8.11倍[78]，此外还发现京尼平交联可以显著提高纳米颗粒的抗酶解能力，能抵抗酶诱导的聚合和解聚，有利于细胞的黏附、迁移和增殖，使纳米颗粒在胃肠道消化后保持完整，明显增强药物生物有效性和细胞吸收。Xiao等[79]采用创新绿色的方法，通过京尼平与大豆蛋白基质纳米颗粒交联，由纳米颗粒包裹亚麻籽油制成水包油Pickering乳化液，注入基于聚丙烯酸/瓜尔豆胶的自愈水凝胶中，发现添加Pickering乳化液的水凝胶具有显著的自愈能力和力学性能，提高水凝胶的耐久性，为解决植入人体的组织支架和递药系统的水凝胶断裂问题提出了新的解决方法。口服疏水性化合物难以通过胃肠道屏障，限制了药物在体内的生物利用度，京尼平结构中有羟基、羧基等多个活性官能团，能和氨基酸残基的自由氨基进行交联，是天然的交联剂，也被用于凝胶微胶囊；大豆蛋白作为稳定剂能够显著提高Pickering乳液稳定性，大豆蛋白组装纳米颗粒在促进黏液渗透和细胞吸收方面表现出巨大潜力。以上研究表明京尼平交联大豆蛋白纳米颗粒提高疏水性药物的生物利用度和治疗效果，提高内相乳液的稳定性和纳米颗粒在胃肠道的稳定性，并且具有细胞毒性低和生物相容性好等优点，是具有广阔前途的现代递药系统。 4  结语与展望 现代药理研究表明，栀子豉汤在神经系统调节、肝脏保护、降糖、调节肺损伤和保护食管黏膜等方面具有一定的活性，临床上主要治疗神经系统疾病和消化系统疾病，但在呼吸系统疾病和心血管疾病方面的报道相对较少。这些生物学效应协调不同细胞群体之间的相互作用，为栀子豉汤临床应用提供了理论依据，但栀子豉汤复方涉及通路复杂，调节代谢相关研究仍旧较匮乏。栀子的成分虽然具有保肝利胆的作用，但栀子单独使用时会导致肠道菌群多样性下降，淡豆豉中的异黄酮成分可通过选择性促进有益菌增殖，从源头减少肠道菌群紊乱介导的肝毒性触发因素，并且淡豆豉配伍后减少肠道菌群毒性代谢产物积累，通过减少肠道毒素向肝脏的转移，抑制肝脏炎症反应，降低其对肝脏的直接损伤。目前已从淡豆豉配伍能够减少栀子单独使用造成的肠道菌群结构失衡，肠道菌群代谢物紊乱，肝细胞代谢应激，肝脏炎症反应等方面，揭示了淡豆豉与栀子配伍后没有造成明显的肝毒性原因。未来，可以研究栀子和淡豆豉配伍合煎的化学成分及含量变化，探究配伍合煎的组分自组装行为，从相态角度探究栀子豉汤配伍减毒的药效机制，为栀子豉汤药效多维性研究提供新的思路。 栀子豉汤作为临床广泛运用于治疗抑郁的传统名方，具有良好的安全性和疗效，未来可从多个关键方面对栀子豉汤展开深入研究。在作用机制探究层面，近年有关研究栀子豉汤“成分-靶点-机制”的方法更新，如中药数据库预测靶点和筛选活性成分、多组学研究等，结合传统中医证候，为栀子豉汤药效物质基础和药理作用靶点提供了新的科学依据，还需借助网络药理学、分子生物学等手段，深度解析栀子豉汤中各成分在体内的作用靶点与信号通路，明确多成分-多靶点-多通路间协同或拮抗关系。在成分与疗效关系方面，建立动物模型，如基于人工智能技术疾病动物模型、基因编辑动物模型，人为调控关键代谢物水平，观察疾病表型变化，明确代谢物与疾病因果关联，紧密关联栀子豉汤成分变化与药效、安全性，建立科学的量效关系模型。 栀子与淡豆豉作为兼具药用价值与食用属性的传统植物，在多领域的开发应用拥有广阔前景，二者的药食同源优势可转化为针对性的健康解决方案。针对现代人群常见的睡眠障碍、情绪焦虑等问题，可基于栀子清热除烦、淡豆豉宣发郁热的传统功效，开发复方保健产品，结合现代提取技术（如超临界萃取、膜分离技术）富集活性成分，确保产品有效成分含量稳定；针对高血糖、高血脂等慢性疾病预防需求，可利用栀子中的环烯醚萜类成分与淡豆豉中的异黄酮类成分的协同作用，开发具有辅助调节代谢功能的保健饮品或代餐食品，契合“治未病”的健康理念，为亚健康人群提供天然、安全的调理选择。 利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献（略） 来  源：茅雯怡，田郑妍斐，王诗琪，洪  怡，贺建华，卢  山，张桂芝，郭瑜婕．栀子豉汤药理作用及临床应用的现代研究进展  [J]. 中草药, 2026, 57(2): 737-748.