CAR-NK-CD19 Cells(Simnova)

靶向蛋白降解（TPD）作为新兴的治疗策略，为攻克传统小分子抑制剂难以靶向的蛋白靶点带来了新希望，其中蛋白酶体靶向嵌合体（PROTACs）更是凭借催化性作用机制、高选择性等优势，已有多个候选药物进入临床开发阶段。但当前绝大多数 PROTACs 都依赖已有的小分子抑制剂作为靶结合部分（TBM），这一局限性直接导致其可靶向的蛋白范围被严格限制，而人类基因组编码的 2 万多种蛋白质中，仅有少数拥有可用的化学探针，传统的药物发现思路又仅能针对具备明确可药位点的蛋白，因此科学界始终无法确定蛋白质组中究竟有多少蛋白能被小分子降解策略靶向，这也成为了 TPD 领域亟待解决的关键难题。 为了突破这一困境，Scripps研究所Christopher G. Parker团队开发出了一类名为 “AgnoTACs” 的新型双功能降解分子，并建立了一套无偏倚的化学蛋白质组学策略，旨在全蛋白质组范围内发现可降解的蛋白。AgnoTACs 本质上是靶标无关的 PROTACs，其设计核心是将沙利度胺基的 CRBN E3 连接酶配体，通过四种不同的连接子（PEG2、PEG3 两种聚乙二醇连接子，以及 C2、C5 两种脂肪族连接子）与 18 种结构多样的类药小分子靶结合头基相连，连接子的选择则考虑到了构象灵活性和在 PROTACs 中的应用普遍性，而靶结合头基则通过分子量、脂水分配系数、氢键供体 / 受体数量等多个类药参数筛选，确保了化学多样性和类药特性。这类分子的作用原理与 PROTACs 类似，都是通过双功能结构诱导 E3 连接酶与目标蛋白（POI）靠近，进而促进 POI 的泛素化修饰和蛋白酶体降解，但与传统 PROTACs 不同的是，AgnoTACs 无需依赖已知的靶蛋白配体，实现了 “无靶标偏向” 的降解探索。进一步的机制研究发现，AgnoTACs 的作用方式并非单一，多数降解事件遵循经典的 CRBN - 蛋白酶体途径，即依赖 Cullin-RING 泛素连接酶（CRL）的活性，而部分案例如 5a 降解癌源性转录因子 ETS-1、8d * 降解跨膜蛋白 TMEM205，则仅依赖蛋白酶体却不依赖 CRL，推测是 AgnoTACs 直接结合靶蛋白导致其构象不稳定，或是通过尚未被阐明的替代机制实现降解；此外，AgnoTACs 还会通过破坏蛋白复合物引发 “旁侧降解”，比如 1c 直接结合 UFD1 后，不仅导致 UFD1 的 CRBN 介导降解，还会破坏 UFD1-NPL4 蛋白复合物，进而引发 NPL4 的蛋白酶体降解，这一途径此前尚未被报道。同时，连接子的设计对 AgnoTACs 的降解活性影响显著，PEG 连接子的 AgnoTACs 对 BRD2 的降解效果远优于脂肪族连接子，而 UFD1 和 NPL4 的降解则高度依赖 1c 中的特定连接子，这也证明连接子的长度和组成是决定 AgnoTACs 降解选择性和效力的关键因素。 研究团队在溶液表征与筛选中取得了一系列关键数据，首先合成了 72 个 AgnoTACs 分子，在 MDA-MB-231 三阴性乳腺癌细胞中进行筛选时，针对片段样头基的 F01-F09 采用 100μM 浓度，针对高分子量头基的 F10-F18 采用 50μM 浓度，通过 TMT 定量蛋白质组学技术共定量了 8037 种蛋白。排除因细胞毒性导致非特异性下调的 2a 后，最终鉴定出 60 种被独特下调的蛋白，其中超过 87% 的靶蛋白缺乏已知的生物活性配体，功能覆盖酶、转录因子、适配器蛋白、转运蛋白等多个类别，打破了传统可药靶标的范畴。对代表性 AgnoTAC - 靶标对的降解活性检测显示，其半最大降解浓度（DC50）在 9.9-28.5μM 之间，最大降解率（Dmax）为 51-78%，例如 1c 对 UFD1 的 DC50 为 28.5μM、Dmax 为 54%，2d 对 PLOD2 的 DC50 低至 9.9μM、Dmax 为 51%。为验证 AgnoTACs 与靶蛋白的直接结合，研究还采用了细胞热位移分析（CETSA），发现 2d 处理后 PLOD2 的热稳定性显著提升，1c 仅能稳定 UFD1 而无法稳定 NPL4，直接证明了 1c 与 UFD1 的特异性结合。 在细胞水平的生物学评价中，研究团队首先评估了 AgnoTACs 的细胞毒性，结果显示多数分子对 MDA-MB-231 细胞的活力无明显影响，且高浓度下也不会诱导应激颗粒形成，排除了因细胞毒性或应激反应导致的蛋白丰度变化。通过将 AgnoTACs 与蛋白酶体抑制剂 MG132、NEDD8 抑制剂 MLN4924 共孵育，验证了降解机制的特异性：1c 降解 UFD1 可被两种抑制剂显著挽救，证明依赖 CRL 和蛋白酶体；而 5a 降解 ETS-1 仅能被 MG132 挽救，说明其不依赖 CRL 活性。功能实验方面，由于 PLOD2 参与胶原蛋白交联和肿瘤细胞的上皮 - 间质转化（EMT），2d 介导的 PLOD2 降解显著降低了 MDA-MB-231 细胞的迁移能力，证实 AgnoTACs 可作为研究蛋白功能的有效化学探针；此外，1c 对 UFD1/NPL4 的降解效应在多种人类细胞系中均能重现，说明这一作用并非局限于特定细胞模型。不过需要注意的是，本次研究暂未开展动物水平的生物学评价，后续还需进一步验证 AgnoTACs 在体内的活性和安全性。 这项研究的核心价值在于开发了 AgnoTACs 这一新型靶标无关降解分子，并结合化学蛋白质组学实现了全蛋白质组范围内可降解蛋白的无偏倚发现，共鉴定出 50 余种可被降解的蛋白，其中多数缺乏已知的化学探针，极大地拓展了 TPD 策略的潜在靶标库。研究不仅阐明了 AgnoTACs 兼具经典 CRBN - 蛋白酶体途径和非经典 CRL 非依赖途径的作用机制，还揭示了连接子设计对降解选择性和效力的关键影响，为后续双功能降解分子的优化提供了重要依据。尽管目前 AgnoTACs 的降解效力仍有提升空间（DC50 多在 10-30μM），但其展现出的高选择性使其成为研究蛋白功能的优质工具。未来通过优化靶结合头基、连接子结构以及 E3 连接酶配体，有望开发出更高效的 AgnoTACs 衍生物，突破传统 PROTACs 依赖已知配体的限制，进一步拓展可降解蛋白质组的范围，为针对难治性靶标的药物研发提供新的思路和起点，推动 TPD 策略在肿瘤、神经退行性疾病等领域的临床转化。 原文链接： https://doi.org/10.1021/acscentsci.5c01594

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