L-Histidine

主要内容： 1、本研究整合上市产品与专利数据，探究制剂发展趋势及辅料使用偏好。 2、共分析6119条专利记录与108个已上市单抗产品（涵盖388个专利制剂与141个上市制剂）。比例检验显示： 3、抗体浓度与组氨酸、柠檬酸的使用存在显著相关性。高浓度产品更常使用组氨酸、精氨酸与透明质酸酶；低浓度产品则多用柠檬酸/磷酸、海藻糖与氯化钠。 4、给药途径同样影响辅料选择，尤以透明质酸酶最为显著。静脉给药制剂普遍采用磷酸盐/柠檬酸盐缓冲体系；皮下给药更偏好组氨酸、精氨酸、透明质酸酶与甲硫氨酸缓冲体系。 5、冻干制剂在上市产品（14.18%）与专利产品（14.69%）中占比均较低，蔗糖为最主要的冻干保护剂。 6、表面活性剂在各类制剂中均不可或缺，用于抑制表面诱导的聚集。专利数据分析可为制剂策略提供早期指标。 研究概况 数据截至2024年12月31日，分别取自Drugs@FDA数据库、CAS制剂数据库及德温特创新专利数据库。 经初步筛选后，共纳入294件专利文献，对应6119个INPADOC专利家族及388个专利单克隆抗体制剂。同时，从Drugs@FDA数据库中获取108个已上市单克隆抗体药物，得到141个上市制剂。 图2 单克隆抗体制剂专利与产品的发展趋势及组成。（a）单克隆抗体制剂专利申请与产品获批的时间趋势；（b）制剂专利与获批单克隆抗体产品的关联关系。 数据分析显示，2002年以前专利活动较为有限，此后迅速增长，并在2010—2020年达到峰值（图 2 (a)），反映出单克隆抗体制剂研发领域的创新与投入持续加大。 与之相对，FDA批准的单抗药物及其制剂增长更为平缓，相较于专利申请存在滞后性，这与生物制品漫长的研发周期相符。 在388个专利制剂中，仅有12个（约3.1%）转化为获批上市产品（图2 (b)）。这表明单抗制剂研发领域专利活动与临床转化之间存在潜在差距：尽管专利布局多样且数量丰富，但成功转化为临床获批制剂的比例仍然较低。 在分析的141个获批制剂中，有20个为冻干制剂（占14.18%）；而在388个专利制剂中，有57个（14.69%）将冻干作为可选剂型。 与液体制剂不同，冻干产品在生产过程中会经历冷冻浓缩与干燥应力，因此需要额外的稳定化策略。 对这些冻干制剂中辅料的分析显示，蔗糖是最主要的冻干保护剂：20个上市冻干产品中有15个（75%）使用蔗糖，57个专利制剂中有33个使用蔗糖。上述结果表明，蔗糖始终作为核心辅料用于减轻冻干过程特有的应力，从而保证蛋白质稳定性。 制剂分析 本研究考察了缓冲剂、稳定剂、表面活性剂及其他功能组分等制剂辅料在不同抗体浓度与给药途径下的使用情况。 通过对专利制剂与上市制剂的对比分析，旨在明确不同制剂中偏好的辅料类型及使用规律。研究重点关注高浓度与低浓度抗体之间，以及静脉注射（IV）、皮下注射（SC）等主要给药途径间的辅料选择趋势。 缓冲液 比例检验结果表明，已上市单克隆抗体制剂中缓冲液的选择与抗体浓度及给药途径均存在显著相关性。 图3 单克隆抗体制剂中缓冲液使用比例的对比。（a-c）高、低抗体浓度下的组氨酸、柠檬酸及磷酸盐缓冲液使用情况；（d-f）皮下与静脉给药途径下的组氨酸、柠檬酸及磷酸盐缓冲液使用情况。橙色：专利制剂数据；绿色：上市制剂数据。*p＜0.05，**p＜0.01。 如图 3所示，组氨酸缓冲液在高浓度抗体产品（HCAP，≥100 mg/mL）中的使用率为66.67%，而在低浓度产品中仅为34.52%（p=0.0017）。 同样，组氨酸缓冲液在皮下注射（SC）制剂中的使用频率（56.45%）显著高于静脉注射（IV）制剂（38.16%，p=0.0486）。 上述结果表明，在高浓度及皮下注射单克隆抗体制剂中，组氨酸缓冲液具有明显的使用偏好。 相比之下，柠檬酸盐缓冲液与磷酸盐缓冲液在低浓度及静脉注射（IV）产品中更为常用。 具体而言，柠檬酸盐在低浓度制剂中的使用率为22.62%，而在高浓度制剂中仅为5.26%（p=0.0047）；磷酸盐在低浓度产品中占17.86%，在高浓度产品中仅占1.75%（p=0.0071）。 从给药途径来看，柠檬酸盐用于23.68%的静脉注射制剂，仅用于6.45%的皮下注射制剂（p=0.0118）；磷酸盐则分别用于19.74%的静脉注射制剂与1.61%的皮下注射制剂（p=0.0024）。 值得注意的是，从专利中提取的制剂数据并未观察到此类趋势，表明专利文献中的实验性或概念性制剂与已上市商业化产品所采用的策略存在差异。 此外，在本研究收集的141个上市制剂中，仅发现1个高浓度抗体产品（Humira®）未添加缓冲液（占比＜1%）。该制剂依靠抗体自身提供缓冲能力，因此无需额外添加缓冲辅料。与之相对，本研究分析的所有专利制剂均明确含有缓冲液组分。 缓冲液调节下制剂pH的纵向变化如图4所示。 图4 所有上市与专利制剂的平均配方pH值年度叠加图。（a）抗体浓度：高浓度单克隆抗体（HCAP、HCAF，≥100mg/mL）、低浓度单克隆抗体（LCAP、LCAF，＜100mg/mL）；（b）给药途径。 由图4 (a)可见，已上市低浓度单克隆抗体制剂的pH随时间呈显著下降趋势。 但在过去五年中，高浓度与低浓度制剂（无论上市产品还是专利制剂）的pH均逐渐收敛至5.75–6区间。 图 4 (b)展示了不同给药途径下制剂的pH变化趋势，呈现相似规律：近五年来，静脉注射（IV）与皮下注射（SC）制剂的pH（上市与专利均一致）稳定收敛至5.75–6范围。 稳定剂 在稳定剂类辅料的选择上，单克隆抗体制剂在抗体浓度与给药途径方面均呈现出偏好规律（图 5）。 图5 单克隆抗体制剂中稳定剂使用比例的对比。（a-b）高、低抗体浓度下的精氨酸与海藻糖使用情况；（c-d）皮下与静脉给药途径下的精氨酸与海藻糖使用情况。橙色：专利制剂数据；绿色：上市制剂数据。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。 基于专利制剂数据的比例检验显示： ·精氨酸在高浓度制剂中的使用率（33.33%）显著高于低浓度制剂（17.12%）（p = 0.0002）； ·同样，其在皮下注射（SC）制剂中的使用率（33.02%）高于静脉注射（IV）制剂（21.94%）（p = 0.0273）。 这一偏好可能归因于精氨酸能够降低高浓度蛋白溶液的黏度，并提高溶解度。该特性对于存在给药体积限制的皮下注射给药尤为有利。 与之相反，海藻糖在低浓度制剂中的使用更为普遍（26.85%vs13.84%，p=0.0027）。该结果可归因于其通过优先排斥机制实现蛋白质稳定的公认作用。 尽管这些趋势在专利数据中十分显著，但在已获批单抗产品的处方组成中并未得到明显体现。这一发现进一步凸显了研发阶段实验制剂与最终获批临床使用制剂之间存在的差异。 表面活性剂 表面活性剂是单克隆抗体制剂中的关键辅料，主要用于减轻蛋白质在气-液界面的吸附并防止聚集。 在本研究分析的388个专利制剂中，有367个（94.6%）含有表面活性剂，最常用的为聚山梨酯80、聚山梨酯20和泊洛沙姆188。 上市产品中呈现相似规律：141个单抗制剂中有131个（92.9%）含有表面活性剂，使用频率最高的依次为聚山梨酯80（n=96）、聚山梨酯20（n=30）和泊洛沙姆188（n=5）。 对这三种表面活性剂的比例检验表明，其使用频率与给药途径或抗体浓度均无显著相关性（图 6）。 图6 单克隆抗体制剂中表面活性剂使用比例的对比。（a-c）高、低抗体浓度下的聚山梨酯80、聚山梨酯20及泊洛沙姆188使用情况；（d-f）皮下与静脉给药途径下的聚山梨酯80、聚山梨酯20及泊洛沙姆188使用情况。橙色：专利制剂数据；绿色：上市制剂数据。*p＜0.05，**p＜0.01。 其他辅料 通过本研究的比例检验发现，其他部分辅料在使用上仍与抗体浓度及给药途径存在偏好性，结果如图 7所示。 图7 单克隆抗体制剂中其他辅料使用比例的对比。（a-c）高、低抗体浓度下的氯化钠、重组人透明质酸酶PH20及甲硫氨酸使用情况；（d-f）皮下与静脉给药途径下的氯化钠、重组人透明质酸酶PH20及甲硫氨酸使用情况。橙色：专利制剂数据；绿色：上市制剂数据。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。 由图 7a可见，在已获批单克隆抗体制剂中，氯化钠（NaCl）在低浓度产品中使用更为频繁，低浓度与高浓度制剂中的使用率分别为38.10%和15.79%（p=0.0075）。 这一偏好可能归因于：NaCl能够在稀蛋白溶液中维持等渗性与离子强度，且在低浓度下不会显著影响蛋白的溶解度或稳定性。 与之相反，专利制剂数据显示，重组人透明质酸酶PH20（rHuPH20）在高浓度制剂中更为常用（高浓度制剂7.55%，低浓度制剂0.39%，P<0.0001）。这可能是因为其已知作用：通过瞬时降解细胞外基质中的透明质酸，促进皮下吸收，降低组织间黏弹性阻力，改善高浓度生物制品的分散性，并支持更大体积的皮下注射。 其他辅料未观察到明显的浓度依赖性趋势。 在给药途径方面，专利与上市单抗制剂数据一致显示，甲硫氨酸和透明质酸酶在皮下注射（SC）制剂中更受青睐。具体而言，甲硫氨酸在SC制剂中的使用频率显著高于IV制剂： ·专利数据：18.87%vs8.71%（p = 0.0075） ·上市产品：17.74%vs3.95%（p = 0.017） 这一结果可能源于甲硫氨酸作为抗氧化剂，可在皮下较长滞留期间保护蛋白质免受氧化。 同时，重组人透明质酸酶PH20（rHuPH20）呈现相似趋势，在SC制剂中使用比例更高： ·专利数据：7.55%vs1.61%（p = 0.0056） ·获批产品：8.06% vs 0%（p = 0.0167） 此外，在获批产品中，氯化钠（NaCl）在静脉注射（IV）制剂中更为常见（38.16%vs19.35%，p=0.027）。 另外，自2000年以来，无机盐（尤其是氯化物，如NaCl和KCl）的使用略有下降（图8）。近五年，无论在专利还是上市单抗制剂中，含NaCl和KCl的比例均稳定在20%–30%左右。 图8 氯化钠与氯化钾随时间变化的使用趋势。橙色：专利制剂数据；绿色：上市制剂数据。 专利数据作为早期信号 引入时间维度拓展了分析，以探究专利数据中的制剂趋势是否早于上市产品出现。 图9 制剂占比的年度变化趋势。（a、b）按抗体浓度分类的制剂占比（上市制剂（a）、专利制剂（b））；（c、d）按给药途径分类的制剂占比（上市制剂（c）、专利制剂（d））。橙色：专利制剂数据；绿色：上市制剂数据。 图 9 (a,b)显示：高浓度单克隆抗体制剂自2008年起在专利中持续被记载，并在2013年出现显著激增；而上市产品直至2015年才常规化出现，标志着高浓度制剂增长达到峰值。 类似地，对于皮下注射（SC）制剂（图 9 (c,d)）：尽管专利自2010年起便记录其持续应用，但市场上持续稳定的获批产品直到2015年才开始出现；专利活动在2013年达到顶峰，比商业市场增长提前约两年。 图10 辅料在专利制剂与上市制剂中的应用时间分布。（a）精氨酸；（b）醋酸盐缓冲液；（c）琥珀酸盐缓冲液；（d）赖氨酸。 如图 10所示，对比了四种辅料——精氨酸、醋酸盐缓冲液、赖氨酸、琥珀酸盐缓冲液在专利与上市制剂中的时间线。 精氨酸早在2005年就出现在专利中，但直至2011年才出现在获批产品中（图 10 (a)）。 醋酸盐缓冲液于2006年进入商业应用，但在2015年之后才得到广泛使用（图 10 (b)），尽管自2008年起几乎每年都有相关专利申请。 赖氨酸和琥珀酸盐缓冲液在上市制剂中出现的时间则晚得多，分别为2021年和2016年，而二者在专利申请中的使用时间均显著更早（分别为2013年和1996年；图10 (c,d)）。 此外，整体时间趋势表明，单克隆抗体制剂的专利活动峰值显著早于获批产品（图 2 (a)）。该结果进一步支持专利数据可作为制剂趋势早期指标的观点，这些趋势后续有望转化为商业化获批产品。 为进一步刻画专利申请与上市获批之间的时间关系，定量分析了代表性辅料或制剂特征在专利中首次稳定出现，到其在商业化产品中实际应用之间的时滞。基于精氨酸、醋酸盐缓冲液、赖氨酸、琥珀酸等所选案例，平均时滞约为7.4年，不过该间隔随辅料类型和制剂属性不同而存在差异。 这一结果进一步证实，专利数据可作为前瞻性依据，用于预判制剂发展趋势。 讨论 本研究通过系统分析6119项单克隆抗体制剂相关专利与141种上市制剂，阐明了在抗体浓度、给药途径及时间演变方面的制剂发展趋势。 2002年之后，专利活动显著增加，反映出单克隆抗体制剂技术的创新力度不断加大。高浓度制剂与皮下注射（SC）制剂呈现出明确的辅料偏好，凸显了不同制剂所面临的特有挑战。此外，早期专利申请与后续上市产品组成之间的一致性，凸显了专利数据在预示新兴制剂策略方面的潜力。 抗体浓度对制剂辅料选择的影响 分析表明，抗体浓度会影响专利及上市单克隆抗体制剂中的辅料选择。 高浓度单克隆抗体制剂面临着特殊挑战，如黏度升高、蛋白-蛋白相互作用增强、聚集风险增加以及溶解度受限等。因此，为解决这些问题，研究中会优先选用能够降低黏度或稳定蛋白结构的辅料。相反，在该条件下性质不佳的辅料使用频率较低，从而形成了明显的使用偏好。 如图 3 (a)和图5 (a)所示，结果进一步显示，组氨酸与精氨酸在高浓度单克隆抗体制剂中使用更为频繁，这可能与其理化性质优势有关。该结果与此前已报道的、证明此类辅料具有稳定作用的实验研究一致。 例如，组氨酸在pH 5.0–7.0范围内具有良好的缓冲能力，且不会对单克隆抗体产生去稳定作用。此外，Saurabh等人通过分子动力学模拟与接触自由能计算证实，组氨酸可与蛋白表面的疏水区域相互作用，从而减弱蛋白-蛋白相互作用并降低聚集。这些机制对于维持制剂稳定性、降低高浓度抗体产品的免疫原性风险尤为重要。 已有研究表明，盐酸精氨酸可减弱抗体分子间的静电吸引作用，进而抑制聚集与相分离——这是高浓度抗体制剂中的两大主要难题。 具体而言，Oki等人报道，在高浓度抗体制剂中，精氨酸在降低乳浊液浊度、抑制聚集方面的效果优于其他氨基酸类稳定剂。这些发现支持了组氨酸在高浓度抗体产品中的应用趋势。 已有部分不添加缓冲液的高浓度单克隆抗体制剂被开发。例如，Humira®最初的制剂浓度为50mg/mL，使用柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液；而后续推出的高浓度版本（100mg/mL）则去除了这类缓冲辅料。该策略利用了高浓度抗体溶液的自缓冲特性。然而，仅依赖抗体自身提供缓冲能力存在一定风险，包括pH稳定性下降与聚集增加。这或许可以解释为何大多数上市产品与专利制剂仍保留缓冲体系。 值得注意的是，在专利数据中未发现无缓冲液的案例。这可能与专利披露的特点有关：专利通常会明确记载所加入的辅料，却很少强调未添加的成分。相比之下，FDA药品说明书等监管文件要求完整披露所有制剂组分，因此是识别无缓冲液产品更可靠的信息来源。 与高浓度制剂不同，低浓度单克隆抗体制剂对辅料表现出明显偏好，如柠檬酸、磷酸、海藻糖和NaCl（图3 (b,c)、5 (b) 及7 (a)）。这种偏好可归因于它们在稀释环境中能够维持理化稳定性，尤其在抗体自身缓冲能力有限时。 例如，柠檬酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液在弱酸性至中性pH范围内效果突出，与众多治疗性抗体的稳定区间高度吻合。除维持缓冲体系外，这类辅料通常还能有效保持单克隆抗体制剂的稳定性并抑制抗体聚集。 海藻糖是应用广泛的稳定剂，可通过与Fab区形成氢键抑制抗体聚集。Deepika等人的计算研究表明，海藻糖与曲妥珠单抗（Tmab）的最佳质量比为0.2–2.4，对应于Tmab浓度21mg/mL、海藻糖55mM的稳定制剂。该浓度区间与本研究定义的低浓度制剂范围一致，不过仍需通过更多单克隆抗体进一步验证其普适性。 在低浓度单克隆抗体制剂中，NaCl常被用于调节离子强度与渗透压，从而提升胶体稳定性与构象稳定性。此外，有研究表明NaCl可降低Fv区高负电荷抗体的黏度与聚集。但也有个别报道指出，对于部分易聚集的单克隆抗体，NaCl反而可能减弱静电排斥，在胁迫条件下促进分子自缔合，加剧聚集。 除机制研究外，本研究观察到的辅料偏好也得到了已上市单克隆抗体产品制剂分析的支持。 例如，Ghosh等人对美国46个高浓度抗体制剂产品进行了调研，其中27个采用组氨酸缓冲液，而在30个使用氨基酸的制剂中，有6个添加了盐酸精氨酸。此外，Mieczkowski 2023年的综述指出，在过去三十年里，抗体制剂中氯化钠（NaCl）的使用呈显著下降趋势，这与本研究结果一致（图 8）。Mieczkowski还提到，制剂pH随时间呈下降趋势，其中低浓度制剂和静脉注射制剂的pH下降最为明显。这一趋势与我们对已上市及专利制剂pH变化的分析相符（图4）。实验数据与市场趋势的相互印证，提升了本研究统计结果的可靠性。 给药途径对制剂辅料选择的影响 给药途径是影响辅料选择的另一关键变量，皮下注射（SC）与静脉注射（IV）制剂在组成上呈现出明显差异。 皮下注射途径目前因更贴合以患者为中心的给药理念、可居家使用而受到青睐，但存在注射体积受限（≤2 mL）、黏度较高等限制，需要采用针对性的辅料方案。 本研究分析表明，皮下注射（SC）制剂更倾向于使用重组人透明质酸酶（rHuPH20）、组氨酸（histidine）和甲硫氨酸（methionine）等辅料（图 3、图7）。选用这些辅料旨在解决皮下注射给药面临的特有难题，包括注射体积受限、局部组织通透性、以及对高蛋白浓度与稳定性的要求。 具体而言，rHuPH20通过暂时解聚细胞外基质中的透明质酸，促进皮下注射大分子药物的扩散与吸收。这种酶解作用可显著降低整体液流阻力，从而实现更大注射体积或更高浓度单克隆抗体的给药，而这些在常规皮下注射途径中难以实现。 该策略已应用于近年获美国FDA批准的多款皮下注射制剂中，包括： ·Opdivo® Qvantig™（纳武利尤单抗，nivolumab） ·Tecentriq® Hybryza™（阿替利珠单抗，atezolizumab） 上述两款产品均添加了rHuPH20。在与静脉注射制剂的头对头临床研究对比中，含rHuPH20的皮下注射制剂疗效相当，同时展现出更高的生物利用度与更好的患者依从性。 这些结果凸显了rHuPH20在突破生物药皮下注射的体积与吸收屏障中日益重要的作用，使其成为新一代抗体药物制剂中的关键辅料。 组氨酸因其适宜的解离常数（pKa≈6.0），常被用作皮下注射（SC）单克隆抗体制剂的缓冲剂，可维持这类制剂常用的弱酸性pH环境。除缓冲作用外，研究表明组氨酸还可通过多种机制稳定单克隆抗体。具体而言，它能促进蛋白分子间的静电排斥，减少自缔合并降低溶液黏度——这两点是保证可注射性、减轻注射部位不适的关键因素。这些多功能特性使组氨酸成为研发稳定、患者友好型皮下注射抗体制剂的重要辅料。 磷酸在皮下注射制剂中的应用已逐渐减少（图 3）。例如，2023年1月已上市抗体药物的分析显示，磷酸在抗体制剂中的使用比例显著下降。这一趋势反映出制剂更倾向选择能更好适配皮下注射给药的替代缓冲体系。 甲硫氨酸作为牺牲型抗氧化剂，优先于治疗性蛋白中的甲硫氨酸残基发生氧化，从而保护蛋白结构完整性，被广泛用作单克隆抗体制剂的稳定剂。 本研究表明，甲硫氨酸在皮下注射制剂中使用更为频繁（图 7 (f)）。主要原因是：皮下注射需在小体积内达到治疗剂量，因此必须使用高浓度蛋白溶液。与稀释型静脉注射制剂相比，高浓度体系更易出现黏度上升、聚集及化学降解，其中氧化是主要降解途径。虽然直观上低浓度因分子运动性更强似乎更不稳定，但实际上高浓度下强烈的分子间相互作用会加剧氧化相关的不稳定性，这也解释了为何皮下注射制剂更依赖甲硫氨酸作为抗氧化辅料。 然而，目前尚缺乏系统研究阐明氧化在皮下注射生物药稳定性中的具体作用。未来研究应探讨氧化降解是否为皮下注射制剂稳定性的关键决定因素，从而为这一重要给药途径的制剂策略优化提供依据。 与皮下注射（SC）制剂优先使用的辅料不同，柠檬酸盐、磷酸盐等传统缓冲剂因其在皮下环境中存在不利的理化或生物学效应，正逐渐被避免使用。 柠檬酸盐缓冲液虽能有效维持pH稳定，但因易引发注射部位疼痛与局部刺激，目前在皮下注射单克隆抗体产品中已较少采用。这种不适被认为源于柠檬酸盐的钙螯合特性，以及其可激活皮下组织中与疼痛相关的感觉神经元。本研究数据也证实了这一趋势（图 3 (e)）：柠檬酸缓冲液在静脉注射（IV）制剂中的使用频率明显更高，因静脉直接入血可避免局部组织刺激。 等渗剂被添加至蛋白制剂中，以适配静脉注射，非等渗溶液可能导致组织损伤或注射部位疼痛。氯化钠（NaCl）作为常用等渗剂，在静脉注射单克隆抗体制剂中应用广泛（图7），与已有文献报道一致。 这一趋势反映出皮下注射制剂研发日益复杂，辅料选择需在分子稳定性与临床耐受性之间取得平衡。 其他制剂分析 本研究分析表明，与液体制剂相比，冻干粉针剂所占比例相对较小。 这与Mieczkowski的研究结果一致：2021年至2023年1月获批的抗体制剂中，冻干产品仅占7%。液体制剂（尤其是高浓度抗体）仍是研发的主流方向。 同时，本研究结果凸显了蔗糖在冻干制剂中的关键作用。其广泛应用源于双重功能：稳定抗体，并在冻干过程中作为冻干保护剂，这使蔗糖成为冻干单克隆抗体制剂中最重要的辅料之一。 其他多元醇（如山梨糖醇和甘露醇）也常用作单克隆抗体制剂中的稳定剂。它们主要通过促进优先水合作用减少蛋白质聚集，并通过水介导效应稳定蛋白，包括提高水的表面张力或表面自由能，从而间接增强蛋白质的热稳定性。此外，Abbas指出，多元醇还可通过直接与蛋白质表面暴露的疏水区域结合，降低分子间的相互吸引力。 表面活性剂是单克隆抗体制剂中不可或缺的稳定剂，可减少表面诱导的聚集，并保护蛋白质在生产、储存和给药过程中免受机械应力影响。这种广泛应用与以往研究一致，已有报道显示，超过95%的上市制剂含有聚山梨酯20或聚山梨酯80。尽管表面活性剂（如聚山梨酯80）的质量与不稳定性是该领域的研究热点，但其仍在上市产品中被广泛使用。 我们对专利和已上市单克隆抗体制剂的整合分析表明，专利文献可在产品上市前反映出制剂领域的新兴趋势。具体而言，皮下给药途径的日益普及、高浓度抗体制剂的开发以及新型辅料（如精氨酸、琥珀酸盐缓冲液）的应用等趋势，在相关产品上市前约7.4年的专利申请中就已稳定出现（图2、图9、图10）。 这一结论与以往强调专利作为创新早期指标的研究结果一致。例如，Wagner等人指出了专利活动在研发密集型行业中的预测价值，并将其与后续商业化成果相关联。同样，Zhang等人认为专利在金融市场中可作为信号，凸显了专利分析作为战略规划预测工具的价值。 在生物制剂领域，专利披露的细致性进一步提升了这一作用：专利通常会提供辅料组成、浓度范围和给药途径等细节，而这些技术属性在早期发表论文或临床试验数据库中并不总能看到。 值得注意的是，尽管我们的全面分析总体支持专利作为制剂创新早期信号的作用，但玻璃体内给药案例似乎是一个例外。在该领域，企业可能出于战略考虑隐瞒制剂细节（尤其是辅料组成），以保护专有技术并降低仿制药竞争风险。因此，此类信息可能作为商业秘密保留，而非在专利数据库中公开，这就导致出现已上市产品早于对应制剂专利的明显情况。 重要的是，本研究证实了将专利数据与商业数据相结合的方法学优势。市场数据反映了在监管和临床约束下的最终制剂决策，而专利文献则能更早、更细致地揭示制剂设计思路、辅料功能及浓度范围。这种双源策略比单一数据源更系统、更具时效性地刻画制剂发展趋势。 例如，部分辅料偏好（如在弱酸性皮下制剂中频繁使用精氨酸，图 5）最早出现在专利申请中；而另一些趋势（如组氨酸在获批皮下产品中占主导地位，图3）则在上市数据中更为明显。两类数据源之间的不一致，可能反映了专利策略性撰写、研发过程中的制剂优化或披露要求差异。这些差异并非局限，反而凸显了二者的互补性。 此外，本研究采用比例分析法定量考察辅料偏好，超越了描述性统计，为制剂策略提供了理论支撑。 单克隆抗体制剂中的辅料选择本质上取决于具体场景，受浓度、给药途径、剂型及时间等因素共同调控。 高浓度及皮下给药产品优先选用组氨酸、精氨酸、甲硫氨酸（以及适用时的 rHuPH20），以在体积受限条件下降低黏度、减少自身聚集并降低氧化风险；而低浓度及静脉给药产品则更常使用柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液、氯化钠和海藻糖。 冻干制剂虽占比较小，仍普遍以蔗糖（搭配其他多元醇）作为冻干保护剂，表面活性剂则几乎被普遍用于抵御界面应力。 专利与药品说明书之间的明显差异（如专利中极少披露无缓冲液体系），反映的是披露惯例与研发优化过程，而非真实矛盾。 在实际应用中，本研究数据支持以风险为导向的制剂设计思路：将辅料作用机制与主要失效模式（黏度/自身聚集、氧化、注射疼痛/体积限制、界面应力）相匹配，并结合多来源的一致证据来论证选择合理性。 未来研究应前瞻性地验证来自专利的信号，并在临床相关应力条件下评估新一代辅料与表面活性剂体系，为制剂设计和监管策略提供依据。尽管仍存在专利文献固有的公开滞后等问题，本研究采用的整合分析方法为理解辅料偏好提供了重要理论支持。更重要的是，该方法为预判制剂趋势、指导单克隆抗体研发中的辅料优化策略提供了实用框架。

01 引言 免疫球蛋白 G (IgG) 抗体及其片段已被广泛开发为针对细胞外和细胞表面靶标的治疗和诊断剂，然而它们的大尺寸和亲水性性质阻碍了其自主穿过细胞和亚细胞脂质双层，限制了其对细胞内靶标，尤其是长期以来被小分子认为"不可成药"的细胞质蛋白的效用。一个独特的天然和工程化全长 IgG 格式抗体子集能够从细胞外环境自主进入细胞质，这些被称为细胞质穿透抗体，或称cytotransmabs。Cytotransmabs遵循一个协调的多步骤途径，包括四个阶段：(i) 与特定细胞表面受体结合，随后是受体介导的内吞作用(Receptor-mediated endocytosis, RME)；(ii) 内体运输过程中受体解离以避免溶酶体降解；(iii) 从内体腔易位到细胞质，这是一个被称为内体逃逸的关键事件；以及 (iv) 细胞质积累和滞留以实现细胞内活性。在这些步骤中，内体逃逸是主要屏障，因为它需要亲水性大分子在能量上不利地穿过疏水性膜。在 RME 之后，大多数内化的抗体并未穿过内体膜，而是被回收到细胞表面或递送到溶酶体降解。与其他生物制剂类似，低效的内体逃逸仍然是实现有效细胞质进入的关键挑战，克服这一屏障对于实现基于抗体的细胞内应用策略的全部潜力至关重要。 在本综述中，我们总结了细胞质抗体递送的被动和主动策略，重点是通过 RME 随后内体逃逸将全长 IgG 递送到细胞质的主动方法，我们描述了携带内源性内体逃逸基序的工程化 cytotransmabs 的最新进展。临床转化的一个主要挑战是内体逃逸效率低，这限制了细胞内功效。为了提供未来理性设计cytotransmabs 的路线图，我们将逃逸途径沿着反应坐标分解为连续事件，并检查了每个过渡阶段的不同能量屏障：(i) 在内体内与受体解离，(ii) 内体膜结合，(iii) 膜结合中间体，(iv)协同簇集诱导的内体膜去稳定化，(v) 跨脂质双层转运。这一概念模型产生了结构和能量设计原则，有助于指导开发具有临床意义细胞质递送水平的下一代 cytotransmabs。此外，为了提供一个全面的视角，我们包含了一个专门讨论与内体逃逸基序工程相关的其他考虑因素的部分，包括细胞内部化的受体选择、潜在的免疫原性和可开发性风险，以及细胞质抗体递送的定量评估。 02 细胞质抗体递送的被动与主动方法 抗体的细胞内递送可以大致分为被动方法（抗体依赖外部载体或物理方法进入细胞质）和主动方法（赋予抗体内在自主的细胞穿透能力）（图 1）。被动方法可大致分为三类类别：(i) 细胞膜的物理破坏，如电穿孔、超声穿孔和微注射；(ii) 与细胞穿透肽(cell-penetrating peptides, CPPs)、细胞穿透聚（二硫化物）、内体逃逸增强剂或内体破坏性光敏剂共同处理；(iii) 脂质或聚合物基纳米载体递送系统（图 1A）。虽然物理破坏方法在体外应用中有效，但它们在体内环境中的应用仍然具有挑战性。抗体与 CPPs（包括脂质敏感的内体裂解肽）共同处理，通常在微摩尔 CPP 浓度下在体外促进抗体的细胞质递送，小分子内体逃逸增强剂（如糖基化三萜类化合物 SO1861）与抗体-毒素偶联物（免疫毒素）的组合已被证明在体内显著增强抗肿瘤活性。或者，光化学内化技术——其中内体定位的光敏剂被光激活以破裂内体膜并将共内化的大分子释放到细胞质中——已在免疫毒素的细胞质递送中证明了体内功效。光化学内化技术提供了对内体释放的时空控制；然而，其适用于深部肿瘤受限于光的穿透深度。更广泛地说，这些使用 CPPs、内体逃逸增强剂或光敏剂的共同处理策略缺乏与所递送大分子（例如抗体）的共价连接，并且表现出有限的靶细胞特异性。因此，在期望的靶细胞内不能保证共内化和内体共定位，这可能会降低全身给药下体内的治疗效果。 图 1. 细胞质抗体递送的被动与主动策略。 (A) 被动方法。依赖外部能量或载体瞬时绕过细胞屏障的方法，包括质膜物理破坏（例如，电穿孔、超声穿孔、微注射）、与 CPPs 或内体破坏剂共处理以促进细胞质进入，以及促进细胞摄取和膜融合的脂质或聚合物基纳米载体递送系统。 (B) 主动方法。具有内在细胞穿透活性的抗体，通过天然存在的具有细胞质进入能力的抗 DNA 自身抗体、与 CPPs 或内体逃逸肽 (EEPs) 偶联，或工程化具有内置内体逃逸基序的抗体实现。 RME 后，此类工程化抗体 (cytotransmabs) 从受体解离、结合内体膜、发生协同簇集使双层去稳定化，然后通过瞬时孔形成或通过囊泡出芽和坍塌进入细胞质。 表 1. 代表性的细胞质抗体递送主动策略。 策略 抗体 内体逃逸基序或 CPP 偶联 细胞表面受体a 内吞途径b 内体逃逸机制c 内体逃逸基序的 pH 依赖性d 内体逃逸效率e 细胞内靶标f 抗   DNA 自身抗体 9D7 CDRs 中的阳离子斑块 - X - X - - 2C10 HSPG O - X - - 3D8 HSPG O - X - - Tusamitamab Pep-1 基因融合在铰链区前，PEPth 基因融合在铰链区后 CEACAM5 O - X - - Trastuzumab hsLMWP 基因融合到 CL 或 CH3 域 C 端 HER2 O 瞬时内体破裂 O 2 % (0.1 μM) - Trastuzumab mLMWP2基因融合到CL或CH3域C端 HER2 O 瞬时内体破裂 O 1 %(0.1μM) - CPP 偶联抗体 9D11 TAT 基因融合到 CH3 域 C 端 - O - X - HBx Brentuximab, IGFP63, 2F8.1 (Arg)10 与抗体偶联 - X 直接穿过质膜易位 X - GFP, Tomm20 N86/38.1R L17ER4 酶促偶联到 CH3 域 C 端 - O - X - GFP TMab4 VL-CDR3 中的 YYH 基序 HSPG O 瞬时孔形成 O 4.3 %(1μM) KRS, α-tubulin epCT65 VH/VL-CDR3 中的 WYW 基序 EpCAM O 瞬时孔形成 O - - 内置内体逃逸基序抗体 inCT99 VH/VL-CDR3 中的 WYW 基序 整合素 αvβ3/5 O 瞬时孔形成 O 4.2 %(0.5μM), 6.0 %(1μM) - inRas37 VL-CDR3 中的 WYW 基序 整合素 αvβ3/5 O 瞬时孔形成 O - KRAS in2CT4.1, ER2CT4.1 CH3 和 CL 域中的 R-W/E 基序 整合素 αvβ3/5,   EGFR O 瞬时孔形成 O 12 %(0.5μM), 17 %(1μM) α-tubulin S4-CPAb VH-CDR3 中的 RRRRHFDYW  基序 HSPG O - X - - S4×scPv-RVRR VH-CDR3 中的 RRRRHFDYW  基序 HER2, CD22, 或 B7-H3 O - X - - 缩写：CPP，细胞穿透肽；HSPG，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖；CEACAM5，癌胚抗原相关细胞黏附分子 5；EpCAM，上皮细胞黏附分子；HBx，乙型肝炎病毒 X 蛋白a参与细胞内部化的细胞表面受体：·，未报道。b如果该方法细胞质穿透活性需要内吞途径："O"；如果不需要，"X"。c研究中提出或实验支持的内体逃逸机制："瞬时内体破裂" 指短暂、可逆的内体膜破坏导致细胞质释放；"直接穿过质膜易位" 表示不依赖内吞作用、不依赖能量的膜易位；"瞬时孔形成" 指可逆的孔开放随后膜重新闭合；–，未报道。d如果内体逃逸基序依赖内体酸性 pH："O"；如果不依赖，"X"。e使用 SLEEQ 实验或 split-GFP 互补实验定量内体逃逸效率。数值根据处理所用细胞外抗体浓度而变化，如括号内所示。–，未报道。f 细胞质穿透抗体靶向的细胞内蛋白。–，未报道。 用于细胞质抗体递送的脂质或聚合物介导的递送系统，其中货物抗体被递送脂质或聚合物包裹，具有优势，例如高负载能力和增强的膜穿透性。例如，阳离子脂质与阴离子多肽偶联的 IgG 抗体静电复合，能够在低至 500 nM 的 IgG 浓度下实现近 90% 的细胞质递送，同时保持 IgG 的功能。设计为响应内/溶酶体酸化或酶活性而具有内体逃逸功能的聚合物纳米载体已证明可有效递送细胞质抗体，例如，利用癌细胞中失调的内/溶酶体酸化的 pH 响应型聚合物纳米载体，在全身给药后，实现了抗 c-MYC 抗体的选择性细胞质递送和体内抗肿瘤功效。除了酸度之外，设计用于感知组织蛋白酶 B 的内/溶酶体酶活性的聚合物纳米载体也实现了在癌细胞中选择性细胞内抗体递送。然而，脂质或聚合物基递送系统的临床转化仍然具有挑战性，因为存在若干限制，包括低效的主动靶向、内体滞留、蛋白质冠形成以及质量控制困难。 相比之下，主动方法指的是赋予抗体内在能力以自主穿透活细胞并进入细胞质的策略（图 1B）。通常，这些策略分为两类：第一类利用天然存在的抗体子集，例如某些抗 DNA 自身抗体，它们具有进入细胞质的内在能力。第二种方法涉及对抗体进行工程化改造，赋予其内体逃逸能力。这主要通过两种不同的方法实现：(i) 将 CPPs（包括内体逃逸肽(EEPs)）基因融合或化学偶联到抗体上；(ii) 直接对抗体骨架进行工程化设计内体逃逸基序。与 RME 依赖方法不同，共价连接的硫代磷酸化 DNA 寡核苷酸允许抗体穿过质膜，并通过绕过内体滞留实现直接细胞质和核递送。总而言之，上述策略说明了实现抗体细胞质进入的设计原则的不断扩大。为了梳理这些进展，表 1 总结了迄今为止报道的具有代表性的细胞质抗体递送主动方法，突出了它们的设计原则、内体逃逸基序和机制、内体逃逸效率以及其他相关参数。以下章节将深入探讨这些主动方法，重点关注用于赋予抗体细胞质穿透特性的内体逃逸策略。 2.1 具有内在细胞质穿透能力的抗 DNA 自身抗体 在系统性红斑狼疮 (SLE) 患者和自身免疫倾向小鼠模型中发现，某些抗 DNA 自身抗体能够穿透细胞并定位于细胞核。这种细胞穿透活性在全长 IgG 抗体和抗体片段中均有观察到，包括重链可变区 (VH) 和轻链可变区 (VL) 单域以及单链可变区片段 (scFv)。因为 DNA 带负电荷，抗 DNA 自身抗体通常在VH 和 VL 域互补决定区 (CDRs) 内含有高密度的带正电残基（例如，Lys 和 Arg），这些阳离子斑块，通常被称为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (heparan sulfate proteoglycan, HSPG) 结合基序，通过非特异性静电相互作用与广泛表达于细胞表面的带负电 HSPGs 结合，从而促进内吞作用。代表性的 HSPG 结合基序包括 3D8 mAb 的 VL-CDR1 中的 RTRK (ArgL27F-LysL30)和CPAb 的 VH-CDR3 中的 ARRRRH (AlaH93-HisH98)。将鼠源抗 DNA 自身抗体的 CDRs 移植到人源抗体的相应区域中，已成功获得了人源化 cytotransmabs，证明这些 HSPG 结合基序是可转移的。这些抗 DNA 自身抗体通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞，利用细胞表面表达的 HSPGs 作为受体。一旦内化，这些抗体可以在内体中从 HSPGs 解离，这一过程由乙酰肝素酶催化，乙酰肝素酶以无活性的复合物形式与 HSPGs 结合在细胞表面，但在酸性内体腔中变得具有酶活性。此后，抗体易位到细胞质；然而，对于大多数抗 DNA 自身抗体，其内体逃逸的确切机制仍不清楚。 与 HSPG 介导的内吞作用不同，来自 SLE 患者的3E10 自身抗体结合细胞外 DNA 或其前体，并通过平衡核苷转运蛋白 ENT2 以不依赖 RME 的方式穿过质膜，随后进行核转位。最近，还发现了一类结合细胞内 RNA 的 SLE 源性自身抗体，它也可以作为非病毒载体将 RNA 递送到细胞内。 2.2 用于细胞质递送的 CPP 偶联抗体 CPPs 可以通过基因融合或化学偶联到抗体上来生成 CPP 偶联的 cytotransmabs，从而促进其递送到细胞质中。一项关键研究表明，CPP 介导的 IgG 抗体细胞质递送效率受到所用 CPP 类型和抗体结构中融合位置的强烈影响。在这项研究中，一种针对癌胚抗原相关细胞黏附分子 5 (CEACAM5) 的 IgG 抗体与一组 CPPs（包括两亲性 Pep-1 和阳离子PEPth）基因融合，位置包括重链 (HC) 和轻链 (LCs) 的 N 端和 C 端，以及铰链区之前 (BH) 和之后 (AH) 的位置。在这些构型中，BH 位点的 Pep-1 融合和 AH 位点的 PEPth 融合实现了最高水平的细胞质进入，尽管效率一般且仅在微摩尔浓度下，这已通过 split-GFP（绿色荧光蛋白）互补实验验证。这些格式还保留了良好的理化性质，包括热稳定性、单分散性和高表达产量。相比之下，TAT 融合的抗体由于生产过程中的蛋白水解降解和聚集而难以开发。这项研究强调了合理选择 CPP 类型和融合位点以优化细胞内递送效率和工程化 IgG 格式的整体可开发性的重要性。 另一项研究开发了一种通过用 His 取代 CPPs 中的 Arg/Lys 残基以生成富含His 的 CPPs（例如，hsLMWPs）的策略，这些CPP 表现出内体酸性 pH 依赖的膜扰动活性。hsLMWP 融合的抗 HER2 抗体曲妥珠单抗表现出约 2% 的内体逃逸效率，高于典型的 EEPs，如 HA2 和 GALA（约 0.7%）。为了绕过内体滞留，通过二硫键将硫醇反应性 CPP (TNB-R10) 与 IgG 抗体偶联，并添加过量的肽作为膜锚定添加剂，已被证明可以形成膜定位的 CPP 簇，即使在 4 °C 下也能通过非内吞途径实现 IgG 的直接细胞质易位。 尽管最近取得了进展，但 CPP 介导的细胞质抗体递送系统仍然存在相当大的局限性，包括较差的内体逃逸效率、制造复杂性、高浓度下的细胞毒性、有限的组织和细胞特异性，以及在生理和体内环境中验证不足。最近使用分裂荧光素酶内体逃逸定量 (SLEEQ) 实验对内体逃逸效率的测量表明，大多数 CPPs，包括 TAT 和多聚精氨酸 (Arg)，即使是在微摩尔级的细胞外剂量下，也表现出低于 1.5% 的低内体逃逸效率。因此，在高效的细胞摄取后，CPPs 仅将一小部分其内化的货物递送到细胞质中。这些观察结果强调了关键的区分：高细胞摄取与功能性细胞质进入并不相关，突出了在评估 CPPs 和基于 CPP 的平台时，需要严格区分总内部化和有效的细胞质递送。 CPP 偶联抗体和携带阳离子斑块的抗体的一个主要局限是缺乏靶细胞特异性，因为它们通常利用正常上皮细胞中普遍表达的 HSPGs 进入细胞。这可能导致全身毒性，类似于在系统性自身免疫性疾病中观察到的抗 DNA 抗体的病理表现。因此，实现靶细胞特异性对于克服潜在毒性至关重要。CPP 偶联抗体的未来进展可能依赖于 CPPs 或混合设计，这些设计将增强的内体逃逸与组织和细胞特异性以及降低的毒性结合起来，从而实现高效、选择性和临床可行的细胞质递送。或者，将阳离子或 CPP 偶联的抗体封装在聚合物或脂质基载体中可以改善生物相容性，通过屏蔽表面电荷并实现可控的内体释放，从而减轻全身毒性，同时保持细胞质递送效率。 2.3 在可变域中工程化具有内置内体逃逸基序的抗体 一类独特的 cytotransmabs 通过将内体逃逸基序直接嵌入抗体骨架中获得细胞质进入，从而消除了对 CPPs 或外部载体的需求。这些基序位于 CDRs 或恒定域中，通常表现出由两部分组成的结构：一个响应内体酸化的 pH 感应元件和一个结合脂质双层的膜相互作用元件。它们共同作用，在内吞作用后实现细胞质进入。 第一个证明在完整全长 IgG 抗体中生成 cytotransmab 的概念验证研究，命名为TMab4，是通过将人源化细胞质穿透 VL（称为 hT4 VL）整合到传统 IgG 分子的相应位置来实现的。这些携带 hT4 的 LC 与各种 HCs（包括来自临床批准疗法阿达木单抗和贝伐珠单抗的 HCs）共表达，产生了能够进入活细胞细胞质的完整 IgG 分子。后续研究表明，TMab4 的内体逃逸是由酸性内体环境特异性触发的。hT4 VL 包含一个内源性内体逃逸基序由两个元件组成：(i) 一个 pH 感应对，以及(ii) 一个由 VL-CDR3 中的 TyrL92、TyrL93 和 HisL94 组成的膜相互作用YYH 元件。pH 感应对在 N 末端的一个酸性残基（L1 位的 Asp 或 Glu）和 L95 位的一个疏水残基（通常是 Leu 或 Met）之间形成，在弱酸性内体腔中，AspL1 或 GluL1 的质子化增加了局部疏水性并促进了与 L95 的相互作用，缩短了 L1 到 L95 的距离，并触发局部重排，使 YYH 侧链定向成有利于膜结合的构象（图 2A）。然后 YYH 元件结合并插入内体膜，启动膜去稳定化、脂质翻转以及由 TMab4 和磷脂组成的瞬时环形孔的形成，这些孔足够大以允许整个 IgG 的易位。值得注意的是，这种孔形成活性严格依赖于 pH，在酸性内体中具有活性，但在中性质膜中不活跃，这种 pH 选择性是 TMab4 强效细胞内递送能力和最小细胞毒性的基础。 将 VL-CDR3 中的膜相互作用元件YYH 替换为 WYW（引入了比 Tyr 或 His 疏水性更强的 Trp 残基），使内体逃逸提高了约 3 倍（图 2A）。值得注意的是，这些 Trp 残基的精确定位，而非它们在元件中的数量，是 pH 依赖性孔形成的关键决定因素，这反映了 Trp 和 Arg 对富含 Arg 的 CPPs 膜相互作用的众所周知的依赖于位置的影响。此外，将 pH 感应对连同来自VL 的 WYW 元件移植到 VH 的相应区域，产生了一种在两条链中均带有双重内体逃逸基序的 IgG，与仅在一条链中包含该基序的变体相比，逃逸效率提高了约 2 倍。 图 2：在可变域和恒定域中具有内置内体逃逸基序的 cytotransmab 的内体逃逸机制。 (A) 1G CT。 1G CT 在 VL-CDR3 中含有一个内源性逃逸基序，由 pH 感应对（AspL1 与 MetL95）和位于 L92 到 L94 的膜相互作用 WYW 元件组成。酸性 pH 诱导局部重排，使 WYW 元件重新排列以促进环形孔形成。 (B) 具有条件掩蔽的 CPAb。 CPAb 变体含有介导 HSPG 结合和内体进入的阳离子 CDRs。在前体药物格式中，这些阳离子表面被一个通过 MMP-9 可切割连接子拴系的抗独特型 VL 空间掩蔽。肿瘤微环境中 MMP-9 的蛋白水解作用解除了 CPAb 的内体逃逸基序的掩蔽，并恢复了其结合内体膜和形成环形孔的能力。 (C) 2G CT。 2G CT 将工程化的 R-W/E 基序整合到 CH3 域的 AB 环、EF 环和 C 端区域。Arg-Trp (R-W) 对驱动阳离子-π 相互作用和膜去稳定化；相邻的 Glu 残基簇（E 斑块）充当 pH 门控的选择性模块。在中性 pH 下，带负电的 E 斑块静电排斥质膜并防止 R-W 对的非特异性结合。内体酸化时，E 斑块质子化减少了这种排斥并允许 R-W 介导的结合、局部去稳定化和孔形成。R-W 对和 E 斑块共同构成一个有效的 pH 响应型逃逸模块。 (A–C) 结构模型使用 AlphaFold 3 生成。质子化状态使用 H+服务器分配，静电表面电位使用 APBS 软件计算。 然而，TMab4 存在非特异性细胞内部化，因为它使用 HSPGs 作为细胞表面受体。为了减少脱靶摄取并增强肿瘤特异性，开发了一种双重工程化策略。首先，将 VL-CDR1 中负责 HSPG 相互作用的 RTRK (ArgL27F-LysL30) 阳离子斑块通过 Ala 取代进行中和。其次，将二硫键 (SS) 约束的环肽基因融合到 LC 的 N 端，以赋予对选定肿瘤相关抗原 (TAA) 的结合特异性，例如整合素 αvβ3 和/或 αvβ5以及上皮细胞黏附分子 (EpCAM)。这种工程化策略在靶向肽中加入了氧化还原敏感的二硫键以促进内体受体解离，产生了一个 TAA 特异性抗体平台，称为第一代 IgG 格式 cytotransmabs (1G CTs)。小鼠模型的体内研究验证了该平台的能力：1G CTs 表现出 TAA 依赖的细胞质递送、优先的肿瘤积累以及与传统 IgGs 相当的延长的血清半衰期。此外，该平台展示了巨大的多功能性，既能实现对细胞内靶标（如致癌 KRAS）的功能抑制，又能递送多种载荷（如 MHC-I 限制性抗原肽）。 另一种赋予 cytotransmabs 肿瘤选择性的策略涉及 HSPG 结合阳离子表面的条件掩蔽，生成蛋白酶可激活的"前体药物"格式。在一项研究中，负责 HSPG 结合的 CPAb cytotransmab 的阳离子 CDRs 通过一个基质金属蛋白酶-9 (MMP-9) 可切割的肽连接子连接的抗独特型 VL 域进行空间掩蔽，从而将激活限制在通常过表达 MMP-9 的肿瘤微环境 (TME)（图 2B）。尽管这一设计概念已在体外得到验证，但其体内功效尚未得到证实。基于这一原理，设计了一种更先进的双特异性格式，以实现肿瘤选择性和细胞内激活的双重控制。这种模块化构建体通过弗林蛋白酶可切割的连接子将掩蔽的 CPAb Fab 片段和肿瘤靶向 scFv 融合到 knob-into-hole 异二聚体骨架的每个 Fc 链上。在此配置中，TME 内的细胞外 MMP-9 解除细胞质穿透 Fab 的掩蔽，而细胞内弗林蛋白酶在内吞后切割 scFv 以释放活性细胞质穿透 Fab 用于细胞质递送。这种顺序蛋白酶激活设计在体外和体内肿瘤模型中实现了蛋白质载荷的靶向细胞质递送，凸显了其精确细胞内靶向的潜力。然而，这些研究中 CPAb 构建体的内体逃逸效率未被定量评估。 2.4 在恒定域中工程化具有内置内体逃逸基序的抗体 1G CT 的更广泛应用面临两个核心障碍：次优的内体逃逸和有限的靶向灵活性。后者源于将抗原结合 CDRs 重新用作逃逸基序，为了解决这些限制，已经开发了第二代 cytotransmab (2G CT)，以 in2CT4.1 为例。关键创新在于将 pH 响应型逃逸基序置于恒定域 CH3 和 CL 中，从而保留 VH 和 VL 用于高亲和力抗原识别（图 2C）。该基序包含两个功能组件：(i) 两到三个驱动膜相互作用和去稳定化的 Arg-Trp (R-W) 对，(ii) 相邻的三到五个 Glu 残基簇，即E 斑块，充当 pH 门控的选择性模块。R-W 对被置于 6 Å 以内以促进阳离子-π 相互作用，这在一定程度上掩盖了 Arg 的正电荷，并降低了将 Arg 和 Trp 插入内体膜疏水核心的能量成本，从而促进局部破坏和孔形成。相邻的 E 斑块在中性 pH 下抑制 R-W 对的非特异性结合，并赋予 pH 敏感性；Glu 残基簇集使表现 pKa 从约 4.3 上移至约 4.57-5.02，这与内体 pH 范围 5.5-6.5 相符。在中性 pH 下，带负电的 E 斑块静电排斥质膜并防止 R-W 对的混杂结合。内体酸化时，E 斑块质子化减少了这种排斥并允许 R-W 介导的结合、局部去稳定化和孔形成，R-W 对和 E 斑块共同构成一个有效的 pH 响应型逃逸模块。 这种设计转化为改进的性能：in2CT4.1 在 1 μM 时实现了约18% 的内体逃逸效率，比 1G CT 提高了 3 倍，并且显著高于传统 CPPs 报道的值。重要的是，2G CT 保留了良好的生物物理特性，包括热稳定性和与标准 IgG1/κ 抗体相当的新生儿 Fc 受体结合。该平台也被证明是模块化的，可容纳针对细胞内靶标和蛋白质载荷的 VH 和 VL 域，例如白喉毒素催化域。值得注意的是，基于靶向 EGFR 的 2G CT 的免疫毒素（携带白喉毒素催化域）在 EGFR 过表达肿瘤的异种移植小鼠模型中实现了近乎完全的肿瘤抑制，突显了其用于靶向癌症治疗的潜力。 03 克服内体逃逸屏障以实现 cytotransmabs 有效细胞质递送的设计策略 cytotransmabs 临床转化的主要障碍是其次优的细胞质递送，这阻止了它们在达到治疗效果所需浓度下的积累。在使用常规抗体治疗实体瘤的临床研究中，通常只有不到 1% 的给药剂量在肿瘤内积累。因此，尽管改善肿瘤归巢是必要的，但增加 cytotransmabs 从TME的细胞质渗透是一个更大的挑战。 细胞质递送通过一系列协调的细胞内事件进行，其中内体逃逸是最关键和限速的步骤。尽管其至关重要，但系统性地提高 cytotransmabs 内体逃逸的策略仍然有限，设计规则尚未明确定义。在本节中，我们提出一个整合 CPPs、抗菌肽 (AMPs) 和工程化 CTs 研究见解的工程化改进逃逸的机制原理。我们将cytotransmabs 的内体逃逸途径沿着反应坐标划分为连续的过渡阶段，定义了每个步骤的不同能量屏障：(A) 在内体内与受体解离，(B) 内体膜结合，(C) 膜结合中间体，(D)协同簇集诱导的内体膜去稳定化，(E) 跨脂质双层转运（图 3）。通过定义每个阶段的特定能量屏障，我们提出了克服这些障碍并开发具有增强和临床可转化内体逃逸的下一代 cytotransmabs 的分子工程策略。尽管如此，应该注意的是，图 3 中的能量分布是示意性的而非按比例绘制，并且内体逃逸每个连续阶段的能量屏障相对顺序是基于半定量和定性的观察。 3.1 Cytotransmab 与受体的解离 RME 后，cytotransmabs 必须从其受体解离，以避免被共运输到溶酶体降解。内体内持续的受体结合限制了横向运动性并有利于溶酶体运输，而及时的解离则释放了抗体以接触内体膜并启动逃逸。因此，内体逃逸的必要前提条件是 cytotransmabs 响应早期和/或晚期内体中存在的内体物理化学线索而与其受体解离（图 3A）。关键的物理化学触发因素包括由空泡质子 ATP 酶驱动的腔内 pH 值逐渐下降（早期内体从约 6.5 降至 5.5，晚期内体从 5.5 降至 4.5）、酸性条件下酶的激活（如蛋白酶弗林蛋白酶和糖苷内切酶乙酰肝素酶）、由于高谷胱甘肽水平导致的更还原的氧化还原电位，以及与酸化相关的钙外流。 几种设计利用了这些条件来促进解离：某些抗 DNA 抗体利用 pH 激活的内体乙酰肝素酶从 HSPGs 脱离，并且敲低乙酰肝素酶会减少细胞质递送。在将 cytotransmab 与抗 HER2 曲妥珠单抗 scFv 融合的双特异性格式中，将弗林蛋白酶可切割的连接子替换为不可切割的连接子显著降低了细胞质递送，这与蛋白酶介导的释放要求一致。或者，靶向整合素或 EpCAM 的二硫键约束环肽被设计为在内体环境中发生还原和切割，从而释放 1G 和 2G CTs。然而，这些环境触发解离反应的定量效率仍知之甚少。一种补充性且可能更稳健的策略是直接工程化 cytotransmab 与细胞表面受体的 pH 依赖性结合，在这里，cytotransmab 在中性细胞外 pH 下以高亲和力与其靶标结合，但在酸性内体中迅速释放，确保有效的细胞内解离。 3.2 内体膜结合与膜结合中间体 从受体解离后，cytotransmabs 必须与内体膜结合并维持一个膜结合中间体状态，以启动其逃逸到细胞质（图 3B,C）。cytotransmabs 的膜结合中间体相对稳定，这通过流式细胞术测量其在酸性内体 pH 下对脂质双层的持续结合得到证明，类似于对 CPPs 的实验观察。分子动力学 (MD) 模拟表明，(Arg)99 CPP 从溶液吸附到脂质双层表面的自由能约为 -24 kJ/mol，进一步支持了亚稳态膜结合中间体的存在。然而，启动 cytotransmabs 的膜结合需要克服几个能量屏障，包括极性残基的脱水、局部结构重排以及与残基有序化相关的熵损失（图 3B），这些与蛋白质-蛋白质结合过程中遇到的情况类似。因此，膜结合步骤由动态且可逆的结合与释放循环定义，其中更强的膜亲和力与更长的停留时间和增加稳定膜结合中间体的可能性相关。为了有效的膜结合，cytotransmabs 可以纳入膜相互作用的残基，特别是 Arg 和 Trp，它们协同结合脂质双层的极性头基和疏水核心。Arg 是核心，因为其胍基在内体条件下保持质子化，具有平面几何结构和离域正电荷，并与阴离子头基和其他极性组分形成多个双齿氢键，从而加强早期的静电结合（图 3B(i)）。Trp 通过其两亲性吲哚环发挥作用，该环疏水性很强且能够形成氢键。这种双重特性驱动其优先定位于膜-水界面，在那里 Trp 充当连接极性和非极性区域的界面锚（图 3B(ii)）。 Arg 和 Trp (R-W) 残基协同配对形成阳离子-π 相互作用也增强了 cytotransmab 与带负电膜的结合，密度泛函理论分析支持这一点，该分析显示 Trp 和 Arg 共同通过阳离子-π 相互作用与膜上的阴离子基团有利地相互作用，与单独使用 Arg 相比提供了约 12 kJ/mol 的额外焓稳定化（图 3B(iii)）。即使在这种结合状态下，Arg 仍保留一个动态水化壳，该水化壳穿透膜内部，减少了将带电基团置于非极性环境中的能量损失。与此机制一致，分子动力学模拟揭示，R-W 对在膜结合后重新定向成更有利于插入的构象（图 3B(v)），这种结构重组代表了实现稳定膜结合状态所需的能量投入。尽管具有功能益处，但随意添加 R-W 对可能会损害可开发性、降低表达产量并增加聚集和非特异性相互作用。因此，理性设计策略必须精细调整膜相互作用残基的数量和空间排列，以确保它们位于结构允许的区域，并能够在酸性内体环境中采用环境响应构象。 除了阳离子残基（如 Arg）和疏水残基（如 Trp）外，各种功能基团，如硫醇-二硫交换基团和可以被整合到抗体中以促进内体逃逸。例如，已显示含有战略性定位的二硫键的聚合物纳米凝胶通过硫醇-二硫交换与内体膜上的硫醇基团增强内体逃逸，同时也促进细胞摄取。尽管这种交换的物理后果尚未直接可视化，但有人提出，在弱酸性和还原性内体条件下，氧化还原驱动的二硫键重组会瞬时破坏内体膜内的局部交联，从而削弱其结构完整性。 为了实现内体膜选择性，cytotransmabs 通常包含 pH 依赖性可滴定残基，如 Glu、Asp 和 His，它们在酸性腔内质子化。这种质子化，连同成熟驱动的脂质重塑，触发了选择性膜结合（图 3B(iv)）。这些残基在中性细胞外 pH 下保持带负电，从而抑制非特异性质膜相互作用。在内体内质子化后，这些残基增加了局部疏水性或触发构象重排，暴露出先前埋藏的膜活性基序，从而充当 pH 依赖性分子开关（图 2A,C）。这一原理已在天然和工程化的 CPPs 中得到证明，包括HA2 和 GALA。随着内体成熟，膜组成的重塑——特别是阴离子脂质如双（单酰甘油）磷酸 (BMP) 的富集——进一步加强了与含 Arg 基序的静电和阳离子-π 相互作用。由此产生的局部酸性表面电位降低了膜附近的 pH，并促进了 Asp 和 Glu 侧链的质子化。尽管它们固有的 pKa 值较低，但这种局部酸化使得在弱酸性内体条件下发生质子化，从而加强了 pH 依赖的膜结合。 恶性和正常细胞之间的病理生理差异可用于实现内体逃逸的内吞后特异性，例如，许多癌细胞表现出较低的内体 pH 和较高的组织蛋白酶 B 活性，这已在聚合物纳米载体系统中被利用，以在肿瘤细胞内选择性触发 pH 或酶依赖性内体逃逸。类似地，整合了肿瘤特异性蛋白酶激活的 cytotransmab 设计，如 MMP-9 可切割的细胞质穿透基序掩蔽，即使是非靶细胞内化了 cytotransmab，也可以将内体逃逸限制在 TME（图 2B）。 总而言之，有效启动内体逃逸依赖于稳定且选择性的膜结合，这可以通过精心编排精确组合的 Arg、Trp 和可滴定残基来实现，这些残基被定位以响应内体环境线索。这种调整不仅提高了膜亲和力和停留时间以形成稳定的膜结合中间体，而且为下游协同簇集和膜去稳定化奠定了基础，从而提高了整体细胞质递送效率。 图 3. 内吞作用后 cytotransmabs 内体逃逸沿着反应坐标的拟议机制和能量屏障。 （左上）反应坐标和能量景观，示意图描绘了内吞作用后 cytotransmab 所经历的顺序中间体和过渡及其相关的能量屏障 (A-E)，沿单个反应坐标绘制。 (A) 与受体解离。酸性 pH、内体酶和还原环境促进 cytotransmab 从其受体释放，防止溶酶体共运输，并使 cytotransmab 游离以便进行膜结合。 (B) 膜结合。游离的 cytotransmabs 经历脱水和局部构象重排以结合内体膜。Arg 与阴离子头基形成双齿氢键，而 Trp 作为膜-水界面的界面锚。Arg 和 Trp 之间的协同阳离子-π 相互作用增强了结合。可滴定残基，如 Glu 和 Asp，在酸性和富含阴离子脂质的内体环境中提供条件性结合。2G CT 的分子动力学揭示了结构重排，其中 Arg-Trp (R-W) 对采用了有利于稳定结合的取向。构建体显示 Arg-Trp (R-W) 对重新定向为可插入的几何构型。 (C) 膜结合中间体。 cytotransmab 与内体膜的稳定结合，通过高亲和力相互作用增强，增加了表面停留时间和向内体逃逸进展的可能性。 (D) 协同簇集和去稳定化。延长的膜停留时间使 Trp 残基能够诱导局部脂质去紧密堆积和弯曲，从而创建招募额外 cytotransmabs 的成核位点。随着局部密度增加，Arg 更深入地插入，同时伴随着水和磷酸头基，放大堆积缺陷并减薄脂质双层，形成正反馈循环。Arg 和 Trp 之间的阳离子-π 偶联降低了插入损失并驱动协同簇集诱导的去稳定化。 (E) 跨脂质双层转运。一旦膜应力超过临界阈值，细胞质进入通过瞬时环形孔进行，孔的壁由脂质头基和 cytotransmab 的极性面排列。或者，在囊泡出芽与坍塌 (VBC) 模型中，簇集的 cytotransmabs 稳定出芽颈以形成腔内囊泡，随后该囊泡坍塌并将其内容物（即 cytotransmab）释放到细胞质中。 3.3 协同簇集诱导的膜去稳定化 在形成内体膜结合中间体后，cytotransmabs 使脂质双层去稳定化以获得细胞质进入，这一步需要局部和瞬时的膜完整性丧失，单个分子无法产生。相反，多个 cytotransmabs 必须簇集以使双层去稳定化并创建允许转运的状态（图 3D），这与 CPPs 的类似发现一致。这一过渡带来了高昂的能量成本，源于脂质有序性的破坏、抗体侧链部分插入疏水核心，以及将多个亲水性大分子浓缩在有限表面上的熵损失，这一阶段被广泛认为是限速步骤。MD 模拟表明，在从亚稳态膜结合中间体（图 3C）到成孔前状态（图 3D）的过渡期间，CPPs 遇到相当大的易位能量屏障，(Arg)9和穿膜肽约为 70-80 kJ/mol，TAT 则超过 300 kJ/mol，强调了膜去稳定化和孔形成所需的巨大能量需求。尽管如此，cytotransmab 逃逸基序（YYH、WWW 或 R-W）持续且局部的簇集逐渐使膜去稳定化并产生可测量的效应，如脂质翻转，从而将膜结合中间体转变为允许转运的状态。 当膜结合的 cytotransmabs 将其关键残基，特别是 Arg 和 Trp，插入其头基区域时，簇集开始。这种插入诱导弯曲并松动局部堆积，产生无序区域，招募额外的 cytotransmabs（图 3D(i)），这放大了去紧密堆积，从而吸引更多分子并建立正反馈循环。增加的膜应力促进更深的 Arg 插入并促进水和脂质头基向内迁移，导致膜变薄和允许转运的状态（图 3D(ii)）。在分子水平上，活性芳香族氨基酸如 Trp、Tyr 和外源性芘丁酸盐产生弯曲和堆积缺陷，这些缺陷充当成核位点。多聚 Arg 优先积聚在这些松动的区域，从而降低了进一步插入的屏障。一旦插入，Arg 由于其高 pKa 和电荷离域而保留正电荷。尽管将带电基团置于非极性环境中代价高昂，但 Arg 通过共转运水化壳并协调附近的磷酸头基部分抵消了这一代价。随着更深的渗透，来自内叶的磷酸基团被拉向双层中心。水和头基的联合流入产生堆积缺陷，导致膜变薄。Arg 和 Trp 之间的阳离子-π 配对部分掩盖了胍基电荷并降低了插入屏障（图 3D(iii)）。重要的是，参与阳离子-π 相互作用的 Arg 仍然形成氢键，维持水和头基募集进入双层内部。这种双重作用使得 Trp 能够实现静电屏蔽，而 Arg 则实现水化驱动的扰动，从而通过 R-W 组合产生强大的去稳定化作用。可以采用预组织策略进一步降低簇集的熵成本，例如，强制寡聚化 CPPs，如 TAT 肽三聚化，通过降低协同作用的阈值来增强膜破坏。类似地，cytotransmabs 可以配备经历 pH 依赖性多聚化的域——在中性 pH 下呈单体，但在酸性内体中寡聚化以驱动空间和时间受限的簇集。 总之，协同簇集是内体膜去稳定化的关键触发因素，也是细胞质进入的限速步骤。Arg 和 Trp 的战略定位，辅以结构原理和诱导多聚化机制，为克服这一障碍并实现有效的细胞质递送提供了理性途径。 3.4 跨脂质双层转运 一旦内体膜去稳定化，它会发生相当大的结构重排以允许货物逃逸，两种最突出的模型是环形孔形成和囊泡出芽与坍塌 (VBC)（图 3E）。目前的证据表明，cytotransmabs 通过瞬时且可逆的环形孔穿过内体膜（图 3E(i)），孔形成所需的大量脂质重排在基线生理条件下在能量上是不利的。当与膜相关 cytotransmabs 的高局部浓度产生的膜张力超过临界阈值时，可以克服这一屏障。超过这一点，孔形成在能量上比维持高度应力的双层更有利。这一模型得到了近期孔形成肽的 MD 模拟支持，模拟显示肽-脂质相互作用诱导局部膜变薄和弯曲，这些变化成为环形孔的成核点，并且这些脂质变形的弛豫降低了自由能垒，有利于形成亚稳态亲水孔。由此产生的亲水性环形孔理论上由 cytotransmabs 和磷脂共同组成，类似于某些 AMPs（如蜂毒肽和爪蟾抗菌肽）形成的环形蛋白脂质孔。这些孔足够大（能够通过 150 kDa 的 IgG 和更小的分子），以允许 cytotransmab 逃逸到细胞质中。与此模型一致，活细胞通透性测定，包括对 Ramos B 细胞的研究，检测到 cytotransmab 进入过程中的瞬时孔活性。 VBC 是 CPPs 和某些毒素提出的另一种途径，其中生物分子在拓扑上跨膜（从一侧到另一侧）而非物理上（不穿透）。Cytotransmab 诱导的弯曲，随后是 cytotransmabs 的簇集和出芽囊泡颈的稳定化，可以驱动形成包裹 cytotransmabs 的腔内囊泡（图 3E(ii)），随后囊泡的坍塌将其内容物释放到细胞质中。囊泡坍塌的确切触发因素尚不清楚，但可能反映了高度弯曲膜结构固有的不稳定性，可能被易位剂（即 cytotransmab）的高局部浓度放大。VBC 的一个定义特征是细胞质递送发生时不破坏主要内体膜，从而保留了细胞器完整性。 总之，转运可以通过环形孔形成或 VBC 进行，两种途径都需要先前的膜结合和协同簇集，以将膜应力提高到临界水平。通过阐明这些过渡的能量和结构决定因素，该框架支持通过结构引导的工程策略来增强细胞内递送，并推进具有细胞内作用机制的 cytotransmab 疗法。 04 与内体逃逸基序工程相关的其他考虑因素 除了上述工程原理外，还必须批判性地考虑几个其他因素以推进下一代 cytotransmabs 的发展。首先，cytotransmab 摄取所用细胞表面受体的选择决定了内化的程度和动力学、涉及的内吞途径以及随后的细胞内运输，从而影响内体逃逸效率。第二，嵌入非天然的膜活性基序可能会引入免疫原性和可开发性风险，必须在不影响功能的前提下加以缓解。第三，严格和标准化的细胞质抗体进入定量评估对于评估新设计以及区分有效的细胞质递送与总细胞摄取至关重要。仔细关注这些考虑因素对于准确评估细胞质递送效率、识别优异的 cytotransmab 变体以及预测临床应用中的潜在安全问题至关重要。 4.1 受体丰度、内吞途径和细胞内运输 除了 cytotransmabs 内部整合的内体逃逸基序的性能外，到达细胞质的量还受以下靶向细胞表面受体特性的影响：(i) 其在靶细胞上的丰度，(ii) 内吞作用的速率和模式，(iii) 回收与降解运输之间的平衡，所有这些共同塑造了内体逃逸效率。然而，使用 cytotransmabs 或 CPPs 直接关联受体特性、内吞途径和细胞内运输与细胞质递送的系统研究仍然很少。 一些观察表明，受体丰度是细胞质抗体递送的主要决定因素，正如先前针对抗体偶联药物 (ADCs) 所确立的那样。例如，表皮生长因子受体 (EGFR) 水平与配体诱导的内化能力相关，靶向 EGFR 的 cytotransmab-毒素偶联物表现出与 EGFR 丰度成比例的细胞毒性。同样，CPP 融合的抗 CEACAM5 抗体在 CEACAM5 阴性细胞中无法进入细胞质。对于 CPPs 和 cytotransmabs，内吞途径（无论是网格蛋白介导的、小窝介导的内吞作用还是巨胞饮作用）取决于细胞质穿透货物的分子背景，即使内化通过相同的细胞表面受体发生。例如，cytotransmab TMab4、抗菌蛋白 CAP18 衍生的 CPP (sC18)2、携带寡聚精氨酸的 CPP Pas2r12 都利用细胞表面 HSPGs 进行内吞；然而，它们遵循不同的内吞途径：TMab4 为网格蛋白介导的内吞作用，(sC18)2为巨胞饮作用，Pas2r12 为小窝介导的摄取。细胞内运输，包括回收与进展到晚期内体和溶酶体，不仅受内吞途径调控，还受受体固有的分选信号（如胞质尾基序和衔接子相互作用）调控。然而，特定的内吞途径和细胞内运输过程在多大程度上影响随后的内体逃逸仍有待阐明。 从治疗角度来看，cytotransmabs 的理想靶受体应是在肿瘤细胞中高表达或选择性表达、高效内化并避免主要回收，从而使受体-cytotransmab 复合物在内体中停留足够长的时间以发生逃逸。实验性地绘制受体密度、内化动力学、内吞途径和细胞内运输图应指导下一代 cytotransmabs 受体选择的协同优化。正如在 ADC 领域所证明的那样，双互补位或双特异性架构可能会进一步增强内化，从而提高细胞质递送效率。 4.2 免疫原性与可开发性 将带正电荷和/或芳香族残基以及其他非天然基序引入抗体的可变域或恒定域，不可避免地会扰乱其天然序列和结构，可能导致免疫原性后果。Trp、Tyr 和 Arg 在 B 细胞表位中显著富集，并且将非生殖系序列元件引入治疗性抗体与抗药物抗体形成风险增加相关。也有一些令人鼓舞的发现，包括对组氨酸转换 CPP 融合抗体的低 T 细胞免疫原性的计算机预测，以及报告称几种合成 CPPs 在基于细胞的测定中不会引起可测量的免疫激活。然而，这些结果主要局限于计算预测和体外研究。CPPs 和 cytotransmabs 的体内免疫原性数据仍然很少，因此难以就其总体风险得出明确结论。因此，在临床转化之前，应结合使用计算机预测、离体测定和体内研究来评估潜在的免疫原性。 免疫原性问题与可开发性密切相关，膜活性基序的插入可以改变翻译后修饰、降低构象稳定性、增加聚集倾向、扩大多特异性，和/或通过暴露的阳离子表面促进脱靶相互作用。这些缺陷可以通过亚可见颗粒或应激构象状态的形成而放大免疫反应，与序列无关。因此，工程化工作应力求在最大化功能增益的同时最小化取代数量，将修饰限制在结构允许和溶剂暴露的区域，并尽可能保留人源生殖系骨架。 4.3 细胞质抗体递送的定量评估方法学 准确量化细胞质递送仍然是 cytotransmab 开发中最具挑战性的方面之一。在细胞内化后，技术上很难区分内体滞留与真正的细胞质分布，也很难测定细胞质中的量以及内体逃逸效率。传统的荧光标记和共聚焦显微镜可以可视化细胞摄取，但通常无法区分点状腔内信号与弥散细胞质荧光。当前区分内化分子的细胞质池与内体池的方法学可根据其基本原理大致分组：(i) 基于成像的空间分析，区分局限于致密内体囊泡的分子（点状信号）与弥散在细胞质中的分子（弥散信号）；(ii) 环境响应探针，利用内体和细胞质之间的物理化学差异，如 pH 和氧化还原电位；(iii) 细胞分馏和生化定量，分离细胞质和囊泡组分用于后续测量；(iv) 细胞质特异性报告基因互补测定，仅在货物到达细胞质后产生信号。 基于成像的空间分析试图在活细胞中区分点状囊泡荧光与弥散细胞质信号，与内体或溶酶体标记物（例如 EEA1、Rab5、LAMP1）共定位以及跨细胞体的线剖面分析可以量化与囊泡无关的标记部分。先进的读数如荧光相关光谱进一步提供绝对细胞质浓度和扩散系数，这些方法已被用于比较 CPPs 如 TAT 和 (Arg)88 所达到的细胞质浓度。局限性包括强烈的内体点状信号掩盖了微弱的细胞质荧光、阈值化和分割带来的用户偏差、光漂白，以及在没有独立摄取测量的情况下将弥散荧光转换为定量"逃逸百分比"值的困难。 环境响应探针测定使用对 pH 和氧化还原电位等内体与细胞质之间物理化学差异敏感的荧光探针，其荧光在酸性内体中被淬灭但在中性细胞质中恢复的 pH 响应探针可以偶联到 CPPs 如 cFoRn、(Arg)n或 TAT，通过比较恢复的细胞质信号与使用 pH 不敏感示踪剂测量的总摄取量来量化细胞质进入。因为这些探针与板式阅读器分析兼容，它们允许更高的通量、时间分辨的定量和相对于总摄取的直接标准化。局限性在于庞大或疏水性荧光团可能会改变货物的物理化学性质和内化途径，可能使结果产生偏差。 结合生化定量的细胞分馏提供了一种正交的、非成像的策略，通过温和裂解，然后差速离心或密度梯度，将细胞质上清液与含膜的沉淀物分离。然后通过 Western blot 或基于荧光的测量对每个组分的抗体含量进行定量，并使用典型标记物（如 GAPDH（细胞质）和 LAMP1（内体/溶酶体））确认组分纯度。这种方法能得出绝对区室量，并可应用于全长 IgG。局限性包括裂解过程中可能的内体破裂（夸大细胞质信号）、膜吸附损失、相对较低的通量，以及需要进行严格的回收率和纯度控制。 细胞质特异性报告基因互补测定通过仅在货物到达细胞质时产生信号来直接报告内体逃逸。在分裂报告系统中，细胞表达一个局限于细胞质的发光或荧光蛋白的大片段，而递送的抗体携带互补片段。仅当两个组分在细胞质中相遇时才会产生信号，例如，当细胞外应用的带有小 GFP 片段 (GFPt1) 的抗体到达细胞质并与较大的细胞质片段 (GFP1-10) 互补以恢复荧光时，split-GFP 测定报告细胞质进入。当与定量 Western blotting 结合时，该测定允许估计 2G CT in2CT4.1 的细胞质进入，内体逃逸效率根据细胞外 cytotransmab 浓度在 8.4%-18.7% 之间变化。另一个高度敏感且稳健的测定是 SLEEQ 测定。在该系统中，NanoLuciferase 的一个无活性片段 (LgBIT) 在细胞质中表达，而大分子货物则标记有互补的 HiBIT 肽。仅当成功内体逃逸后，HiBIT 才会与 LgBIT 结合以重建有活性的 NanoLuciferase，产生与细胞质递送成比例的发光信号。SLEEQ 已证明具有 pM 级灵敏度，并揭示了 CPPs 如 TAT 的内体逃逸效率可能非常低（在 HEK293 细胞中 <2%）。这些细胞质特异性报告基因测定在活细胞中提供了卓越的灵敏度、宽动态范围和实时动力学能力。其局限性包括需要工程化报告细胞系、标记可能干扰货物的生物物理性质，以及需要仔细校准。 总而言之，没有任何单一测定可以全面验证 cytotransmab 递送。最佳实践是将细胞质特异性读数（例如，分裂报告基因或校准的 pH 探针）与独立的总摄取测量相结合，以报告绝对细胞质量量和已内化分子中逃逸的部分，并使用正交方法（如分馏）确认关键发现。这种多测定策略能够对细胞质递送进行严格、定量和可重复的评估，允许进行有意义的跨研究比较和对新 cytotransmab 设计的可靠验证。 05 结论 Cytotransmabs 代表了一种变革性模式，用于靶向传统基于抗体的疗法无法触及的广泛的细胞内疾病驱动因子，该平台可以直接抑制细胞质蛋白或递送多种细胞内载荷，包括毒素、酶、siRNA 和疫苗，从而在肿瘤学和其他领域开辟新的治疗途径。然而，其临床转化目前受到 cytotransmabs 低效细胞质递送的限制，内体逃逸在 RME 后成为主要的限速步骤。 本综述审视了工程化 IgG 抗体以到达细胞质的新兴策略，重点在于内源性内体逃逸基序及其机制基础。通过将内体逃逸构建为一系列能量控制的过渡——内吞后与受体解离、内体膜结合、膜结合中间体、簇集诱导的膜去稳定化以及易位进入细胞质——提供了一个分析和优化每个阶段的框架，该模型支持基于结构和能量的设计策略来克服主要障碍。开发有效 cytotransmabs 的进一步进展将需要抗体工程、细胞内运输生物学、膜生物物理学和抗体-膜相互作用的融合，这种整合对于克服当前限制细胞质进入的局限性，以及实现 cytotransmabs 在广泛生物医学应用中的全部治疗潜力至关重要。 有效的递送还取决于功能与可开发性的协调，膜相互作用元件，特别是 Arg、Trp 和 Tyr，必须整合到促进内体结合和逃逸的同时保留天然折叠、抗原结合、稳定性和可制造性的位点。过度的电荷或疏水性会增加聚集和免疫原性，并降低表达产量。将最小化、组织良好的基序战略性地放置在结构允许的区域，加上对生物物理特性和生产可行性的严格评估，对于推进 cytotransmabs 的临床应用至关重要。 参考文献 Antibody translocation into the cytosol: Mechanisms and engineering of endosomal escape. Journal of Controlled Release. 2025, 388: 114386. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2025.114386 免责声明：推文基于已公开的资料信息撰写，仅用于知识分享和传递，任何情况下本文的信息或所表述意见均不构成对任何人的建议。如因版权等存在疑问，请于本文刊发30日内联系本公众号删除，更多精彩内容欢迎关注和分享公众号。