Cocarboxylase

生物催化是指利用酶或有机体（细胞、细胞器）作为催化剂进行化学转化的过程，也称生物转化。其中，生物催化的不对称合成就是指利用酶或有机体催化无手性或潜手性的底物生成手性产物的过程。 人类利用细胞内酶作为生物催化剂实现生物转化已有几千年的历史。酶这一术语在1878年由库内（Kuhner）创造用以表述催化活性。1894年费歇尔（Fischer）提出了“锁钥学说”用来解释酶作用的立体专一性，1896年德国学者布赫奈纳（Buchner）兄弟发现用石英砂磨碎的酵母细胞或无细胞滤液和酵母细胞一样将1分子葡萄糖转化成2分子乙醇和2分子CO2，他把这种能发酵的蛋白质成分称为酒化酶，表明酶能以溶解状态、有活性状态从破碎细胞中分离出来，从而说明了上述化学变化是由溶解于细胞液中的酶引起的而非细胞本身。这些工作为近代酶学研究奠定了基础。 生物催化之所以在有机合成特别是在不对称合成中得到快速的发展，其原因与生物催化的特点有关。酶是生物催化剂，它们是经过进化而具有专一性催化的结构，具有化学催化剂的一般特征，即加快反应的速率。通常酶催化速率是化学催化剂的106～1013 倍，有时高达1017 倍，酶催化时，催化剂的用量少。在化学催化反应中，催化剂用量一般为0.1%～1%（摩尔比），而酶催化反应中酶的用量为10-4%～10-3% （摩尔比）。除此之外。酶还有以下显著的特点。 ① 反应条件温和。化学催化反应经常在强酸、强碱或高温条件下进行，在这样的条件下进行反应，很难避免发生分解、消除、重排、异构化、消旋等副反应。酶催化反应则不同。酶催化反应温度一般在20～40℃；pH 值为5～8，通常为pH=7左右。这样的反应条件，可以减少不必要的副反应。 ② 高度的专一性。酶通常与底物特异性地结合在一起，从而表现出高度的区域、立体和对映选择性。即酶催化一种立体异构体发生某种化学反应，而对另一种立体异构体则无作用。例如乳酸脱氢酶只能催化（R ）-乳酸脱氢变为丙酮酸；对（S）-乳酸无作用。在催化反应中，虽然底物本身没有手性但反应却是立体专一的。例如延胡索酸酶催化延胡索酸生成苹果酸时，水以立体专一的方式加成到底物。正是因为酶催化剂具有高度的对映体选择性，才使得不对称合成成为生物催化最具吸引力的应用领域。 生物催化剂有各种不同的类型，包括离体酶、固定化酶、微生物细胞、固定化形式使用的微生物细胞、植物及动物细胞等。酶是由生物细胞产生的具有催化化学反应的一类生物催化剂。在生物体内存在两类生物催化剂，一类以蛋白质为主要成分，称为酶（enzyme），另一类则以核糖核酸为主，称为核酶（ribozymes）。迄今人们已经发现和鉴定的酶约有8000多种，其中有200多种得到了结晶。但用于催化有机合成的酶为数还不多，有待进一步开发利用。 根据酶催化反应的类型，可将酶分为6大类。 ① 氧化还原酶（oxidoreductase）———催化分子发生氧化还原反应。 ② 转移酶（transferase）———催化分子间基团的转移。 ③ 水解酶（hydrolase）———催化水解反应。 ④ 裂解酶（lyase）———催化分子裂解成两个部分，其中之一含有双键，这与水解酶不同。这类酶催化的反应具有可逆性，裂解的键可以是C—C、C—O、C—N、C—S、C—X、P—O 等键。 ⑤ 异构化酶（isomerase）———催化分子进行异构化反应。 ⑥ 合成酶（ligase）———催化两分子连接成一个分子。 合成化学与生物科学交叉融合，推进生命科学基础研究并将成果转化为药物，如抗体偶联药物（ADCs）、蛋白质定点修饰物等。利用特定功能酶催化进行药物合成也卓有成效，2018年诺贝尔化学奖颁发给了发明“酶的定向进化”的弗朗西斯·阿诺德。生物催化作为药物发现以及实现结构功能快速模拟合成的一种工具，也是药物代谢产物合成的一种有价值的方法，变得越来越普遍。例如，近年研究很热的肿瘤免疫靶点STING，其内源性激动剂2＇，3＇-cGAMP是在环状GMP-AMP合成酶（cGAS）作用下高效合成的。 如果要开发其类似物并研究它们的构效关系，对传统的化学合成来说极具挑战，而利用cGAS催化则能快速构建化合物库。生物催化合成新型环状双核苷库反应如下所示。 有时用酶解的方法将外消旋体分开，因为酶对底物具有非常严格的立体选择性。例如合成的丙氨酸经乙酰化后，通过由猪肾内取得的一种酶，由于该酶水解L型丙氨酸的乙酰化物的速率要比D型的快得多，因此，就可以把乙酰化物变为L-丙氨酸和D-乙酰丙氨酸。由于这二者在乙醇中的溶解度区别很大，故可以很容易地分开。 另外，磷酸奥司米韦合成时采用O-莽草酸经酯化、丙酮保护、甲磺酰化、缩酮交换、还原开环和闭环反应得中间体环氧化合物，之后经叠氮开环、Staudinger反应合成氮丙啶中间体，然后再用叠氮开氮丙啶环、氨基乙酰化，还原叠氮基后与磷酸成盐得到。 但采用上述方法的一个缺点是磷酸奥司米韦终产物中氨基部分来自易爆的叠氮化物。这就促使人们寻找一条无叠氮化物参与的替代途径，后来报道了一个新的合成途径，无叠氮化物参与，而且比常规商业合成途径步骤要少。该途径首先通过两个微生物转化过程把葡萄糖转化为氨基莽草酸，然后再以氨基莽草酸为起始物合成磷酸奥司米韦。 生物催化的另一个经典的例子如西格列汀（sitagliptin）的工艺优化。美国默克公司最初是利用Mitsunobu反应引入手性氨基的，不仅原子利用率低，而且由于使用三苯基膦会产生大量副产物三苯基氧膦。后来引入不对称氢化技术（[Rh（COD）Cl]2 和t-BuJosiPhos），大大降低了副产物的产生，同时使成本下降70%，并无工业废水的排放。为此，美国默克西格列汀的化学工艺团队荣获2006年度“美国总统绿色化学挑战奖”。考虑到不对称氢化所使用的贵金属铑是稀有贵金属，生产成本受市场波动影响很大，例如从2006年初到2008年7月，铑的价格就从每盎司3000美元涨到每盎司10000美元。基于以上因素，美国默克公司和Codexis公司合作开发出了人工改造的转氨酶，直接将酮转化成所需要的手性胺，避免了高压反应和重金属使用。2010年，美国默克公司再一次荣获“美国总统绿色化学挑战奖———更绿色的反应条件奖” 。 生物催化水解反应 有机底物（最常见的为酯和酰胺）的生物催化水解或转酯化反应是应用最广的反应。这里介绍一些手性有机酸的制备，通过微生物或酶水解有机酸酯，由于分子中手性中心靠近有机酸酯，它的各种光学异构的酯对微生物或酶的水解速度不同。若水解速度差别够大时，经一次发酵就能获得光学活性纯的酸及酯。 已发现许多酶，如乙酰胆碱酯酶、猪胰脂肪酶（PPL）、南极假丝酵母脂肪酶可用于从1制备对映体纯的环戊烯醇（+）-2，通过在有机介质中与乙酸异丙烯酸酯进行SP-435酶催化的乙酰化反应，从二醇4制得了对映体（-）-2。因此，经过常规的化学转化，从3和5可以得到许多天然产物分子制备中有用的关键中间体环戊酮衍生物（+）-6、（-）-6、7和8。 生物催化不对称还原反应 微生物内部含有多种氧化-还原酶，可利用它来进行氧化及还原反应，微生物还原的特点是立体选择性还原，可引进手性中心。前手性羰基官能团的不对称还原反应在有机合成中是极有用的生物转化反应，能进行不对称还原的微生物很多，有细菌、根霉、酵母等，其中以酵母应用最多，例如周维善等利用啤酒酵母进行羰基的选择性不对称还原反应。 微生物不对称还原得到产物的构型可由Prelog经验规则确定。 前手性羰基化合物可由酵母等微生物还原为手性产物，底物中R1 和R2 的结构不同，则产物的构型及ee 值也不同。 1965年Prelog根据实验情况提出经验规律：当R2＞R1 到一定程度，分子前面部分与酶结合，氢原子从后面进攻，还原后获得S 型产物。 甾体化合物熊去氧胆酸（UDCA），又名3α，7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，是一种亲水胆酸，存在于正常人体胆汁中，约占人体总胆酸量的3%。熊去氧胆酸也是中药熊胆的有效成分之一，具有明目、清热、平肝等重要功效，几个世纪以来，熊去氧胆酸一直用于治疗肝胆疾病，尤其针对治疗胆固醇型胆结石有其独特的功效，能维持体内肠肝循环的动态平衡。至今为止，熊去氧胆酸是由美国FDA 批准的唯一可用于治疗原发性胆汁性肝硬化的药物。鹅去氧胆酸（CDCA）也被称为3α，7α-二羟基-5β-胆烷-24-酸，是熊去氧胆酸的差向异构体，唯一结构区别是7-位的羟基构型不同。鹅去氧胆酸来源较丰富，且价格相对便宜，可作为制备熊去氧胆酸的原料。在整个鹅去氧胆酸转化为熊去氧胆酸的过程中，采用温和并且安全有效的、具有较高选择性的氧化剂以及高立体专一性的还原剂是合成的关键。通过7α-羟基类固醇脱氢酶（7α-HSDH）和7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）的克隆、表达以及纯化来获得高纯度的酶反应制剂，接着采用一个两步级联反应，利用生物酶促转化法制备熊去氧胆酸。 生物催化酯化反应 1984年Zaks和Klibanov等人发表了在有机溶剂中用脂醇对羧酸进行酯化反应的研究论文，打破了传统酶学思想的束缚，将酶引入非水介质中催化反应，极大地拓宽了生物酶的应用范围。 某些内酯化合物具有重要药物价值，也可作为香料，而利用常规方法环化羟基酸合成内酯化合物则非常困难，产率很低，利用酶法在有机介质中完成环化过程则要容易得多，这无疑为这类内酯的大规模市场化提供了良好的途径。Yamada等人用酶法成功合成了许多有价值的大环内酯，并且研究了酶催化的条件、特点和催化机制。它们主要研究了长链羟基烷酸酯的分子内酯交换反应，通过对一系列不同来源的脂肪酶进行对比研究，发现只有假单胞菌脂肪酶和猪胰脂肪酶具有较高的催化合成大环内酯的活力；最适条件下转化率能达80%。他们还研究了溶剂对酶促内酯化的影响以及酶对底物结构的选择性，认为非极性溶剂适合于内酯化。Motion研究了33种脂肪酶催化16-羟基烷酸内酯化的情况，发现只有一部分脂肪酶能在微水环境中催化内酯化反应，固定化的南极假丝酵母脂肪酶催化单内酯合成的活性最高。 Gatteld等人用解脂假丝酵母（Candida Lipolytica）发酵（未经分离的酶），经过β-氧化等一系列连续进行的反应，由蓖麻油酸（ricinoleic acid）制得了γ-癸内酯。Cardilio等人则用柯扔酸（corinnic acid）在枝孢霉菌（Cladosporium suaveolens）分泌酶作用下，经β-氧化等过程得到了δ-内酯。其过程如下： 辅酶催化 维生素B1 又称硫胺素或噻胺，它是一种辅酶，作为生物化学反应的催化剂，在生命过程中起着重要作用。其结构为： 在生化过程中，维生素B1 主要在α-酮酸脱羧和形成偶姻（α-羧基酮）等酶促反应中发挥辅酶的作用。维生素B1 分子中最重要的部分是噻唑环。噻唑环上的氮原子和硫原子之间碳上的氢有较大酸性，首先在碱作用下，易被除去形成碳负离子，即N-杂环卡宾成为反应中心。碳负离子和邻位带正电荷的氮原子形成稳定的两性离子，称内盐或叶立德（ylide）。N-杂环卡宾亲核加成到羰基碳上，导致该碳原子发生极性反转，生成一个负电中心，此时再由另一分子羰基化合物的碳正中心进攻该碳负离子，得到了由两分子羰基化合物与一分子催化剂组成的配合物，再脱去催化剂分子，最终生成含有一个新的立体中心的两分子缩合产物。 噻唑盐催化下醛羰基碳对α，β-不饱和化合物的1，4-加成反应，生成1，4-二羰基化合物及其类似物。Stetter 反应是一种羰基的极性转换反应，在反应条件下，醛从一个亲电体转换为亲核试剂，在催化剂噻唑盐活化作用下完成。 噻唑盐催化的Stetter 反应机理如下： 活性催化剂噻唑盐在碱的作用下可以形成两种共振形式，即叶立德或卡宾，两种均具有亲核性。噻唑叶立德可以进攻底物醛形成Breslow 中间体。一旦“亲核醛”合成子形成，稳定的噻唑叶立德催化反应可以两个途径进行。较快的途径是与另一分子醛缩合生成安息香产物。但是，安息香缩合是完全可逆的，因此不会干扰Stetter反应产物的形成。实际上，安息香可以代替醛作为实现同样完全的Stetter转换的底物，因为在反应条件下安息香可以恢复为醛。生成Stetter产物的理想途径是Michael型受体亲核醛的1，4-加成。在1，4-加成后，反应是不可逆的，最终，形成1，4-二羰基，并重新生成催化剂噻唑叶立德。在反应条件下，安息香缩合反应是最主要的竞争反应，但安息香缩合是可逆的，而 Stetter 反应导向更稳定的产物，因而是主产物。 阿托伐他汀钙 （HMG-CoA 还原酶选择性抑制剂）是一种降胆固醇药物。Stetter反应用于阿托伐他汀钙中间体的合成。 还原胺化反应，又称鲍奇还原[Borch reduction，区别于Birch （伯奇）还原反应]，是一种简便的把醛、酮转换成胺的方法。首先是胺与羰基加成、缩合，生成羰基的结构类似物Schiff碱，后者接受硼氢化钠或者氰基硼氢化钠氢供体的氢传递生成最终产物胺。 反应应在弱酸条件下进行，因为弱酸条件一方面使羰基质子化，增强了亲电性，促进了反应，另一方面也避免了胺过度质子化造成亲核性下降。用氰代硼氢化钠比硼氢化钠要好，因为氰基的吸电诱导效应削弱了硼氢键的活性，使得氰代硼氢化钠只能选择性地还原Schiff碱而不会还原醛、酮的羰基，从而避免了副反应的发生。用NaBH（OAc）3 作还原剂，用ClCH2CH2Cl作溶剂可以缩短反应时间并显著提高产率。 生物体内存在类似的过程，是由辅酶维生素B6 （吡哆醛/胺）和NADPH （相当于硼氢化钠）来介导的，氨基酸经此可以和酮体相互转换。 转氨基作用是α-氨基酸与酮酸之间的氨基转移作用，在构成蛋白质的氨基酸中，除甘氨酸、赖氨酸、苏氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸外，都能不同程度参加转氨作用，这一过程在氨基酸的分解代谢中占有重要地位。磷酸吡哆醛和相关的磷酸吡哆胺是包括氨基酸代谢在内的许多酶促转化反应的重要辅酶，它们能催化氨基酸或醛、酮进行一系列反应。首先，α-氨基酸与磷酸吡哆醛反应生成磷酸吡哆醛亚胺，此亚胺异构化成另一种酮亚胺，水解后可以得到α-酮酸和新的辅酶磷酸吡哆胺。此反应以相反的方向进行，则可以由不同的α-酮酸得到新的α-氨基酸。在生物体内，转氨酶能利用其蛋白质部分结合底物，并促进中间体醛亚胺与酮亚胺的相互转化，在α-碳上进行转氨反应。 磷酸吡哆醛也作为辅酶可用于氨基酸的脱羧合成相应的胺。如用苯丙氨酸制备苯乙胺。