Ginger extract

本期简介 Brief 文章阐述了PELNs的生物发生、分离和纯化方法、结构组成、稳定性、安全性、功能以及面临的挑战。 图1  文献截图 摘要 近年来，关于外泌体的相关研究日益增多。大多数研究集中在哺乳动物来源的外泌体上，证实了外泌体在细胞通讯中发挥的重要作用。植物作为一种天然成分，其来源的外泌体已被证实与哺乳动物来源的外泌体具有相似的结构和功能。植物来源的外泌体样纳米颗粒（PELNs）是含有如miRNA、mRNA、蛋白质和脂质等生物活性成分的脂质双分子层膜纳米囊泡，这些纳米颗粒从植物细胞中获得，能够参与细胞间通讯并介导跨界通讯，具有高生物利用度和低免疫原性，相对安全，并且已显示出在维持细胞内稳态以及预防和治疗多种疾病方面发挥重要作用。在这篇综述中，我们阐述了PELNs的生物发生、分离和纯化方法、结构组成、稳定性、安全性、功能以及面临的挑战。主要描述了PELNs在抗炎、抗氧化、抗肿瘤和药物递送方面的功能，并概述了中草药外泌体样纳米颗粒的研究现状。总体而言，我们总结了PELNs的重要性以及该领域的最新研究成果，为PELNs未来的研究和临床应用提供了理论基础。 一、概述 细胞分泌的各种生物活性物质在细胞通讯中起着关键作用。细胞外囊泡（EVs）存在于各种生物体中，是细胞释放到细胞外空间的脂质双分子层膜纳米囊泡。细胞外囊泡含有一系列生物活性成分，如蛋白质、脂质和核酸，能够介导细胞间通讯，并具有疾病治疗、药物递送等功能。根据大小，细胞外囊泡可分为三类：外泌体（30～150nm）、微囊泡（100～1000nm）和凋亡小体（大于1000nm）。随着研究的进展，基于其起源和生物发生过程，人们还发现了其他亚型的细胞外囊泡，包括微粒、外切体和肿瘤小体。 近年来，动物源外泌体（ADEs）的研究逐渐发展，在药物递送和作为生物标志物方面展现出良好的前景。然而，由于成本高、产量低，以及存在一定程度的免疫原性等缺点，它们仍未大规模开发和应用。因此，植物细胞外囊泡进入了研究人员的视野。1967年，Halperin等人首次在胡萝卜的植物细胞壁中发现了分泌囊泡的存在。2009年，人们首次从向日葵种子中提取出了外泌体样纳米颗粒。目前的研究已经从水果、蔬菜、种子、根茎、叶子、花朵、树皮、茶叶和坚果等植物来源的细胞中分离出了外泌体样纳米颗粒。在过去十年中，相关研究呈指数级增长，研究发现靠近质膜的细胞中存在多囊泡体（MVBs），它们可以被细胞吞噬和释放，不仅参与植物细胞内的通讯，还参与调节植物、动物和微生物之间的跨界通讯。此外，植物细胞外囊泡中含有的miRNA也被认为能有效参与跨界调节。植物源外泌体样纳米颗粒还具有容易获得、成本低、免疫原性低和相对安全等多种优势，非常值得探索和研究。 已有许多研究证实了植物细胞外囊泡在炎症、肿瘤、皮肤创伤、药物递送等多种生物活动中的有益作用。例如，研究最广泛的植物样本生姜细胞外囊泡，能够有效改善炎症性肠病，影响肠道微生物群的组成，负载化疗药物和核酸制剂以实现有效的药物递送。以往的研究发现，生姜提取物在胃肠道、炎症和感染性疾病方面显示出良好的治疗效果。如今，生姜细胞外囊泡被认为比生姜提取物具有更好、更广泛的治疗效果，能够被巨噬细胞或单核细胞优先摄取，从而发挥相应的靶向作用。此外，从古老而有效的中药中也分离出了细胞外囊泡，研究得出它们比单纯的中药补品具有更强的抗炎和抗纤维化作用。然而，其具体的分子机制仍需要通过各种基础实验进一步阐明。 尽管对植物细胞外囊泡的相关研究不断增加，但快速有效地分离高纯度的细胞外囊泡仍然是一个巨大的挑战，各种分离方法仍在不断研究中，尚未形成标准化的流程和方法。植物细胞外囊泡的稳定性和安全性也存在争议。因此，有必要对植物细胞外囊泡的当前研究状况进行综述。在本文中，我们对与植物源外泌体样纳米颗粒相关的当前研究进行了回顾、总结和分析，并从植物细胞外囊泡的分离、表征、成分、功能和挑战等方面进行了详细阐述。旨在了解该领域的研究现状和挑战，为未来与植物细胞外囊泡相关的研究提供依据和建议。 国际细胞外囊泡协会（ISEV）目前仍未对植物细胞外囊泡制定详细的命名规则。文献中使用了各种不同的命名，如外泌体、外泌体样纳米囊泡、细胞外微囊泡和囊泡样纳米颗粒等。黄革教授的研究团队将通过搅拌研磨和植物汁液提取获得的植物细胞外囊泡命名为“外泌体样纳米颗粒”，随后的许多研究都采用了这一命名，因此本文也使用“外泌体样纳米颗粒”这一名称。 图2  植物源外泌体样纳米颗粒（PELNs）的生物发生过程 从各种植物中分离纯化得到的植物细胞外囊泡可能含有其他直径相似的囊泡以及细胞器和细胞膜，这些统称为植物源外泌体样纳米颗粒（PELNs）。植物源外泌体样纳米颗粒的大小在50～1000nm之间，其尺寸会因来源和分离方法的不同而有所差异。目前的研究表明，植物源外泌体样纳米颗粒的分泌有三条途径（图2）：（1）多囊泡体途径，与哺乳动物外泌体的起源类似，多囊泡体与质膜融合，将细胞外囊泡释放到细胞壁外；（2）外囊体阳性细胞器（EXPO）途径，外囊体阳性细胞器是一种球形的双膜结构，能够与质膜融合释放膜囊泡，这是植物特有的非传统途径；（3）液泡途径，中央液泡与质膜融合，将液泡蛋白和水解酶释放到细胞外，以攻击细胞外的细菌病原体，这也是植物源外泌体样纳米颗粒的一个可能来源。 二、PELNs的分离和纯化方法 植物源外泌体样纳米颗粒（PELNs）的分离和纯化是开展相关研究和应用的第一步。目前已通过多种方法从植物汁液、果肉、根茎、种子和干燥植物材料中分离出PELNs，但尚未有标准化的分离纯化方案。超速离心和蔗糖密度梯度离心仍是大多数PELNs研究的主要方法。 2.1 超速离心和蔗糖密度梯度离心 超速离心和蔗糖密度梯度离心是基于待分离颗粒的大小和密度进行分离的方法（图3）。具体操作流程是先将植物研磨成汁并过滤，然后在不同离心力（1000～10,000×g）下离心20～60分钟，以去除大的沉积物、细胞碎片和死细胞，接着将上清液进行超速离心（100,000～150,000×g）1～2小时。为获得纯化的PELNs，将得到的沉淀物重新悬浮，然后轻轻铺在蔗糖密度梯度层上，再次进行超速离心（100,000～150,000×g）1～2小时。在离心力的作用下，不同密度和大小的成分会在密度梯度的各个区域形成明显的条带。这种方法用于提取大多数的PELNs。虽然操作过程并不复杂，且PELNs的纯度较高，但该方法繁琐、耗时，需要专业的超速离心机和离心管。经过多次离心步骤后，不仅设备和仪器成本高，而且一些纳米颗粒囊泡在这个过程中可能会丢失和受损，导致最终可使用的PELNs的产量降低。 图3    超高速离心和蔗糖密度梯度离心法   2.2 聚乙二醇（PEG）沉淀法 PEG沉淀法利用PEG能竞争性结合水分子的特性，将PELNs从溶液中分离出来（图4-A），这是一种低成本且高效的方法，但得到的PELNs纯度较低，会混有其他蛋白质杂质，可能会影响后续实验。Kalarikkal等人通过PEG-6000从生姜中获得PELNs，分离得到的生姜外泌体样纳米颗粒（ELNs）与通过超速离心分离得到的具有相同特征，回收率为超速离心法的60%，且不影响ELNs的活性。然而，在分离得到的生姜ELNs中仍残留4～8%安全剂量的PEG-6000。与超速离心法相比，得到的生姜ELNs中的RNA、蛋白质和脂质基本相似，且成本更低。 图4  PELNs的分离和纯化方法 2.3 超滤离心（UC） 超滤离心是一种基于尺寸的分离方法，它利用具有特定孔径的超滤膜的微孔结构，对样品施加一定压力，从而分离不同大小和尺寸的纳米颗粒（图4-B）。该方法操作简单、成本低且耗时少，但压力可能会对外泌体造成损伤，超滤膜的微孔容易被大分子不可逆堵塞，影响超滤结果，导致与外泌体颗粒大小相同的纳米颗粒聚集，从而降低外泌体的纯度。Vergauwen等人使用不同孔径和类型的膜分离外泌体，发现孔径为10kDa的再生纤维素膜对细胞外囊泡（EVs）的回收率更高。Ko等人设计了两种不同孔径（50nm和150nm）的二维微超滤SiNx膜过滤器，用于分离50～150nm的外泌体囊泡。同时，采用电泳振荡清除堵塞在150nm孔径处的较大杂质，减少孔径堵塞，提高超滤速度和超滤膜的使用寿命。 2.4 尺寸排阻色谱法（SEC） SEC是一种基于颗粒流体动力学体积的分离方法（图4-C）。植物样品通过含有不同大小孔隙的排阻色谱固定相凝胶，根据样品的大小扩散情况，小尺寸物质扩散进入孔隙，洗脱速度较慢，最后流出柱子。通过这种方法获得的PELNs纯度较高，来自蛋白质和其他非纳米颗粒大分子物质的杂质较少，结构更完整，相关物理性质和生物活性保存更完好，但产量较低，需要特定的仪器设备，不易实现。You等人通过超速离心、PEG沉淀和SEC从卷心菜中分离ELNs，结果证实使用SEC获得的ELNs纯度更高，受其他蛋白质的污染更少。 2.5 毛细管通道聚合物法（C-CP） Jackson等人使用C-CP方法对20多种蔬菜水果进行分离提取，获得纳米囊泡（图4-F），评估了PELNs的大小和纯度，证实PELNs具有良好的完整性和纯度，且耗时少、成本低，适合后续的基础研究和应用。 2.6 其他方法 Yang等人创新性地将电泳技术与截留分子量为300kDa的透析袋相结合（命名为ELD）来分离PELNs（图4-D）。结果证实，通过该方法分离得到的PELNs与通过超速离心分离得到的具有相同的形态和大小，并且还显示出相应的抗炎和抗肿瘤能力。此外，还有许多用于分离动物源外泌体（ADEs）的方法，但目前这些方法尚未应用于PELNs的分离。 已有许多研究证明了不同的PELNs分离方法。Del Pozo等人证明，将超速离心与尺寸排阻色谱相结合可提高外泌体的产量，且获得的外泌体纯度更高、完整性更好。Bokka等人比较了通过超速离心结合蔗糖密度梯度离心与超速离心结合SEC分离纯化PELNs得到的番茄ELNs，结果表明蔗糖密度梯度离心在基于密度分离不同囊泡群体方面更有用，而SEC在去除共纯化的蛋白质和其他杂质方面更有效。因此，结合不同的分离方法以获得更高浓度和更好质量的PELNs，为未来PELNs的分离纯化提供了新思路，提高了获得的囊泡的纯度和产量，为后续研究奠定了基础。 三、植物源外泌体样纳米颗粒的表征 3.1 形态 使用电子显微镜（EM）或原子力显微镜（AFM）观察植物源外泌体样纳米颗粒（PELNs）的形态。透射电子显微镜（TEM）是评估纳米颗粒囊泡超微结构的重要方法，也是获取PELNs纳米级分辨率图像最常用的技术，它可以观察到样品的内部结构和形态。但该方法不仅耗时，还可能改变样品的实际形态，产生假象，在显微镜下可观察到PELNs呈近球形或小体样形态。冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）可以在低温条件下观察速冻颗粒，能有效避免上述问题。AFM是一种具有较高分辨率的扫描显微镜，可分析单个PELNs的囊泡大小和结构，观察样品的三维形态，并获取有关样品粘附性和硬度的信息。在显微镜下可以看到，外泌体样纳米颗粒（ELNs）呈孤立的圆形。 3.2 粒径电位 使用动态光散射（DLS）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）测量PELNs的粒径和zeta电位。不同的PELNs粒径有所差异，且zeta电位大多为负值。不同区域来源的同一类PELNs，或通过不同方法分离得到的同一PELNs，其粒径和电位大小可能不同。DLS测量的是样品被单色光源照射后散射光的情况。当颗粒进行布朗运动时，所有颗粒的散射光会相互干涉并随时间波动。根据散射光强度分布可以计算出颗粒的粒径。DLS灵敏度高，仅需少量样品就能快速评估ELNs的大小和电荷。然而，它的分辨率较低。NTA记录单个颗粒的布朗运动轨迹，确定其平均速度和扩散系数，并对颗粒的粒径和浓度进行定量计算，但需要足够的轨迹长度和最佳的浓度范围。De等人通过激光透射光谱（LTS）技术分析了蓝莓中ELNs的密度，与DLS方法相比，该方法可以测量纳米颗粒的空间尺寸分布，得出每毫升溶液中纳米囊泡的总数和密度分布，是一种更准确、分辨率更高的表征PELNs的方法。 3.3 表面蛋白 细胞外囊泡（EVs）的表面标记蛋白在EVs的识别和表征中起着非常重要的作用。在动物源外泌体（ADEs）中，CD63、CD81、CD9和TSG101是最常见的生物标志物，但PELNs的蛋白质含量比ADEs低，蛋白质种类也较少。不同的植物物种含有不同的囊泡群体和生物学特性，具有很大的异质性。Pinedo等人分析了四项已发表的关于植物EV表面蛋白的研究，得出植物中常见的蛋白家族是热休克蛋白70（HSP70）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和S-腺苷高半胱氨酸酶。人们认为这些蛋白质可能是PELNs的表面标记蛋白。Rutter等人的一项研究证实，拟南芥EV富含Syntaxin PEN1和ATP结合盒转运蛋白PEN3蛋白。四跨膜蛋白8（Tetraspanin-8，TET8）的结构与哺乳动物来源的CD63相似；同时，在植物EVs中也能检测到TET8的聚集，因此它也可以作为植物EVs的标记蛋白。然而，目前对植物EVs的蛋白质组学分析研究仍然较少，也没有统一的标准。具体的蛋白标记物仍不明确，需要更多的研究来探索PELNs相关特征蛋白的鉴定。 四、植物源外泌体样纳米颗粒的组成 4.1 蛋白质 蛋白质参与生物体的各种活动。动物源外泌体通常含有1000多种蛋白质；然而，在葡萄外泌体样纳米颗粒中检测到28种蛋白质，在柠檬外泌体样纳米颗粒中检测到243种蛋白质。与动物源外泌体的特定表面蛋白（如CD63、CD9和TSG101）相比，目前的相关研究尚未确定植物源外泌体样纳米颗粒的特定表面蛋白。目前的研究表明，PEN1和TET8可能是植物源外泌体样纳米颗粒的候选蛋白标记物。对芹菜外泌体样纳米颗粒的蛋白质组分析显示，它们主要包含膜蛋白、核糖体蛋白以及参与不同生物过程的酶。柑橘外泌体样纳米颗粒含有不同的膜转运蛋白，如水通道蛋白、ATP酶和ABC转运蛋白，以及四跨膜蛋白家族（CD9、CD63和CD81），这些蛋白在不同大小和类型分子的跨膜运动中发挥着不同作用。Pocsfalvi等人在柑橘植物源外泌体样纳米颗粒中发现了大约600-800种蛋白质，这些蛋白质与囊泡运输密切相关。大蒜外泌体样纳米颗粒表面的甘露糖特异性结合凝集素II蛋白是影响细胞是否能摄取该颗粒的主要蛋白质成分。用胰蛋白酶消化表面蛋白后，在固定时间点检测HepG2细胞对大蒜外泌体样纳米颗粒的摄取情况，结果显示消化后摄取显著减少，这证实了外泌体样纳米颗粒的表面蛋白参与了细胞摄取过程。不同植物源外泌体样纳米颗粒中包裹的蛋白质因其物种、囊泡粒径和制备方法而具有独特的特征，未来需要进行更深入广泛的相关研究分析，以确定它们在囊泡通讯过程中发挥的作用。 4.2 核酸 研究通过琼脂糖凝胶电泳证实了植物源外泌体样纳米颗粒中存在核酸。高通量小RNA测序确认了miRNA的存在。一些研究报道，源自食物和可食用植物的外源miRNA存在于哺乳动物的血清和组织中，这些miRNA被包裹在细胞分泌的细胞外囊泡中，进入人体循环系统进行跨界通讯。许多来自植物源外泌体样纳米颗粒的miRNA能够进入人体，通过2'-OH基团的甲基化维持特定的耐酸性和稳定性，在人体胃酸中长时间存活。因此，研究细胞外囊泡中包裹的miRNA的功能并寻找其特定的靶基因，可能为疾病的诊断和治疗提供新思路。目前，许多关于miRNA的研究已经证实，它们可以参与多种生物过程，在疾病的诊断和治疗中发挥关键作用。 水稻来源的miR168a已被证实可以通过小鼠的胃肠道进入循环系统，并与小鼠低密度脂蛋白受体衔接蛋白1（LDLRAP1）上的mRNA结合，抑制肝脏中LDLRAP1的表达，从而减少小鼠血浆中低密度脂蛋白的清除，这一过程涉及跨界通讯。Xiao等人研究了来自11种不同水果和蔬菜的植物源外泌体样纳米颗粒中的miRNA谱，证明存在大量能够调节哺乳动物mRNA的靶基因。除了在调节肠道内稳态方面的作用外，植物源外泌体样纳米颗粒还具有抗炎、抗癌和药物递送功能。金银花中的miRNA2911可抑制甲型流感病毒的产生。因此，外泌体样纳米颗粒和其中包裹的miRNA具有潜在的药用和促进健康的作用。然而，植物源外泌体样纳米颗粒中包裹的miRNA对人体相应靶基因的作用和机制仍不清楚。一些研究认为，外泌体样纳米颗粒中含有数百种miRNA，一种miRNA可以靶向数百种mRNA。因此，当外泌体样纳米颗粒的浓度达到一定基线水平时，将会产生明显的调节作用。此外，不同植物源外泌体样纳米颗粒表面的脂质在miRNA内化过程中也起着重要作用。Teng等人的研究表明，生姜外泌体样纳米颗粒中的miRNA可以特异性结合肠道细菌的mRNA，从而调节肠道菌群。因此，为了充分了解其转运调节机制，需要进行一定的基础研究来探索和证实。 4.3 脂质 脂质是植物源外泌体样纳米颗粒的重要组成部分之一，对于肠道细胞吸收这些颗粒至关重要。与富含胆固醇和鞘脂的动物源外泌体不同，植物源外泌体样纳米颗粒富含磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酸（PA）、磷脂酰胆碱（PC）、单半乳糖基二酰甘油（DGMG）、双半乳糖基二酰甘油（DGDG）和单半乳糖基二酰甘油（MGDG）。不同来源的外泌体样纳米颗粒含有不同的脂质，PA是外泌体样纳米颗粒的主要脂质成分之一，它会影响外泌体样纳米颗粒的摄取和吸收。不同的脂质组分影响外泌体的靶向位点，这对于植物源外泌体样纳米颗粒能够稳定靶向细胞并作为天然药物载体至关重要。脂质组学研究证实，葡萄外泌体样纳米颗粒含有一定量的脂质，包括PA和PE。橙子来源的外泌体样纳米颗粒含有40%的PE、25%的PC和5%的PA。不同的脂质执行不同的功能，为受体细胞识别提供信号，并在维持结构稳定性和细胞通讯过程中发挥关键作用。 4.4 生物活性物质 多项研究发现，植物源外泌体样纳米颗粒中还含有一些来自同源植物的生物活性物质，如维生素C、多酚、黄酮类化合物和类胡萝卜素等，它们可能也发挥着相应的作用。此外，还有一些未知的生物活性物质，需要进一步通过代谢组学分析和实验来明确它们的作用和机制（图5）。 图5  PELNs的组成  五、稳定性研究 植物源外泌体样纳米颗粒（PELNs）能在一定程度上保持稳定性和完整性，这对未来的基础研究和临床应用至关重要。其中，PELNs的胶体稳定性是维持其后续功能的关键因素，而zeta电位是评估胶体稳定性的重要指标。Buranasukhon等人证实，在不同温度和储存时间下，飞机草叶来源的PELNs的zeta电位变化较小且始终为负值，这可以防止纳米颗粒聚集，维持其稳定性。同时，他们将飞机草叶PELNs与含血清的细胞培养基共培养24小时，测定培养基成分对PELNs粒径和多分散指数的影响，结果表明，虽然粒径和多分散指数有所增加，但对稳定性的影响较小。 许多研究通过测量PELNs在模拟胃液（pH2）和模拟肠液（pH6.5）中悬浮一段时间后的粒径和zeta电位变化，来表征其在不同pH环境中的稳定性。Chen等人报道，茶树来源的PELNs在胃液、小肠液和结肠液中粒径和zeta电位均未发生变化。相比之下，生姜来源的PELNs在模拟胃液中孵育30分钟后，粒径从243nm减小到228nm，在模拟肠液中减小到216nm，并且在模拟胃液的酸性环境中zeta电位呈弱正电荷（0.26mV），在中性环境和模拟肠液中呈负电荷（分别为-14.2mV和-7.3mV），这证实了生姜PELNs可以根据环境改变其物理性质，以确保不被降解。虽然山药来源的PELNs粒径发生了变化，但其囊泡数量并未改变，仍能发挥相应的靶向和通讯作用。这些研究评估了PELNs在不同pH值储存介质中的形态和大小变化，结果均未显示出显著变化，表明PELNs能维持相对稳定的结构 Chen等人采用了不同的方法证实PELNs可以进入胃肠道参与跨界通讯。他们用DIR标记茶叶来源的PELNs并进行灌胃，利用IVIS光谱成像处理系统观察DIR在胃中的分布情况，证实部分PELNs能够稳定地通过胃的酸性环境到达小肠，并通过空肠回肠吸收进入人体血液循环。对茶叶PELNs的脂质分析结果表明，其所含的脂质分子具有两亲性，这也为PELNs的稳定性奠定了结构基础。 然而，PELNs能否保持足够的稳定性，使其内容物直接被胃肠道吸收，这一点仍存在一定争议。一些研究在动物模型中未能检测到植物来源的miRNA。也有研究评估了外源miRNA的存活情况，发现只有1%的miRNA能够在胃肠道中抵抗降解。因此，还需要进一步的研究。 除了评估粒径和电位外，PELNs的成分组成、活性和功能也是评估其稳定性的重要部分。Görgens等人研究了不同温度、储存介质和时间下动物源外泌体（ADEs）的蛋白质含量和RNA浓度变化，结果表明，在PBS中储存的外泌体的回收率会随着储存时间的延长而显著降低。然而，目前对于PELNs还没有类似的系统研究，仍需进一步探索以确定PELNs的稳定性。Kim等人使用BCA法测定了不同温度和储存时间下叶来源PELNs的总蛋白水平，结果显示，随着储存时间的增加，叶来源PELNs的蛋白水平在4周内显著下降，尤其是在-20°C储存时，蛋白浓度在第一周内就呈现出明显的下降趋势，而在4°C储存时下降速度较慢。他们还比较了新鲜获得的叶来源PELNs和冻融后的叶来源PELNs的细胞摄取率，结果表明，随着冻融循环次数的增加，PELNs会发生聚集，导致细胞摄取率下降。Hwang等人比较了新鲜获得的山药PELNs和储存1年后的山药PELNs对成骨细胞MC3T3-E1中碱性磷酸酶活性的影响，结果表明，在-80°C储存1年后的山药PELNs仍具有碱性磷酸酶活性，并能促进成骨细胞的增殖和分化，这从另一个角度证明了山药PELNs的成分没有发生重大变化。Umezu等人比较了外源miRNA、针叶樱桃外泌体样纳米颗粒-miRNA复合物在酸性、碱性和RNA降解酶环境中的降解情况，结果表明，针叶樱桃外泌体样纳米颗粒-miRNA复合物中的miRNA在任何环境中都不会完全降解，证实了针叶樱桃外泌体样纳米颗粒（AELNs）能够有效地保护其内容物不被降解。 因此，PELNs在酸性和中性环境中都具有一定的稳定性，并且能够进入胃肠道而不被完全消化。PELNs的稳定性是后续实验的基础。在PELNs的粒径、形状和形态没有明显变化的情况下，其所含的成分和一些生物活性物质是否发生改变，还需要进行一系列深入研究，这些研究对于PELNs未来的临床应用具有重要意义。 六、功能特性 植物源外泌体样纳米颗粒（PELNs）已显示出天然的治疗潜力，能够通过细胞吞噬、网格蛋白介导的内吞作用、小窝蛋白介导的内吞作用和胞饮作用内化进入哺乳动物细胞，发挥相应的生物学功能。生姜外泌体样纳米颗粒可以进入小鼠的胃肠道，进而到达肝脏发挥作用。Hwang等人发现，山药外泌体样纳米颗粒能够穿过肠道紧密连接蛋白ZO-1，被肠上皮细胞吸收，进入血液循环和肝肠循环，参与细胞间通讯。此外，在不同农业环境中生长的同一类型植物，其外泌体样纳米颗粒发挥的功能也有所不同。从中国合肥分离的生姜根茎外泌体样纳米颗粒可以被肠道细胞吸收，并下调炎症因子水平。而Kumar等人的研究发现，夏威夷生姜外泌体样纳米颗粒能够预防高脂饮食诱导的小鼠肥胖和胰岛素抵抗。作为PELNs的关键活性成分，miRNA可以被PELNs包裹进入受体细胞。苦瓜外泌体样纳米颗粒中的miRNA5266有效降低了基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达，减轻了缺血再灌注诱导的血脑屏障损伤。鱼腥草外泌体样纳米颗粒中的miR168b-3p、miR166a-3p和miR159a对SARS-CoV-2具有显著的抑制作用。 对于PELNs的内化程度，Chen等人用DIO绿色荧光标记茶叶外泌体样纳米颗粒，与乳腺癌细胞（1T4细胞）孵育5小时后，观察到大多数细胞显示出明显的绿色荧光信号，证实茶叶外泌体样纳米颗粒成功内化进入细胞。同时，通过流式细胞术对细胞摄取率进行定量分析，结果显示摄取率随孵育时间的增加而增加，5小时内摄取率超过80%。因此，该研究证实细胞能够内化PELNs并发挥相应的功效。除了上述支持植物生物活性物质具有跨界通讯能力的研究外，也有许多相反的研究，这些研究在小鼠体内均未检测到具有生物可利用性的植物miRNA。也有人认为，目前在公共数据库中检测到的植物miRNA可能并非宿主来源，而是由于污染所致。因此，PELNs的跨界通讯能力仍需进一步探索，探究不同PELNs的生物利用度和靶向功能可能是未来研究的重点。本综述总结并讨论了目前关于PELNs功能的相关研究。 6.1 抗炎作用 炎症是机体对外界刺激的一种防御反应，但可能导致许多急性或慢性疾病的发生。已有研究证明，PELNs可以调节与炎症发生相关的基因，改善炎症反应。生姜是日常生活中广泛使用的可食用植物根茎，姜黄素和姜辣素等生物活性物质是其具有抗氧化和抗炎作用的主要成分。生姜外泌体样纳米颗粒对肠道炎症，如炎症性肠病（IBD）和克罗恩病具有有益作用，不仅可以被肠道巨噬细胞吸收，还能降低DSS诱导的结肠炎小鼠体内促炎细胞因子的水平，产生相应的抗炎效果。它们还可以被肠上皮细胞吸收，改善DSS诱导的大鼠急性结肠炎，增强肠道修复能力，并在一定程度上预防慢性结肠炎。Teng等人的研究证实，生姜外泌体样纳米颗粒中包裹的miRNA主要靶向鼠李糖乳杆菌单加氧酶ycnE的mRNA，增加吲哚-3-甲醛（I3A）的产生，影响肠道微生物群的丰度和种类，并通过芳香烃受体（AHR）途径诱导抗炎因子IL-22的产生，从而改善结肠炎。Yin等人也得出结论，生姜外泌体样纳米颗粒中的miRNA下调了Caco-2细胞中促炎因子IL-6和IL-8的表达，这些因子参与炎症反应的调节。所有这些发现为未来肠道相关炎症性疾病的研究提供了新的思路。除了生姜外泌体样纳米颗粒具有强大的抗炎作用外，茶叶外泌体样纳米颗粒处理巨噬细胞后，降低了促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-12的水平，并显著增加了抗炎细胞因子IL-10的水平，能够有效预防或减轻炎症。 PELNs还通过阻断NLRP3炎性小体的激活和释放来调节炎症反应。NLRP3炎性小体调节白细胞介素相关炎症因子的释放，其激活会促进炎症，因此是改善炎症反应的关键靶点。Liu等人发现，香菇来源的外泌体样纳米颗粒也具有抗炎活性，能够阻断NLRP3炎性小体的形成，抑制IL-6等促炎因子，还能保护小鼠免受药物诱导的急性肝损伤。韭菜外泌体样纳米颗粒抑制原代小鼠巨噬细胞中NLRP3炎性小体的激活，减轻急性肝损伤期间的炎症反应。其他类型的PELNs与NLRP3炎性小体之间的关系值得进一步研究，其作用机制也有待探索。 研究发现，大蒜外泌体样纳米颗粒可以通过调节糖酵解的关键酶PFKFB3蛋白，抑制巨噬细胞的炎症反应。降低TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA水平，也能减少促炎因子，通过巨噬细胞-肝细胞的相互作用抑制高脂饮食小鼠的炎症反应。许多研究得出结论，PELNs作为一种天然生物制剂，能够有效穿过体内的各种生物屏障。大蒜外泌体样纳米颗粒的实验证实，它们可以被脑小胶质细胞摄取，并通过双加氧酶1介导的AHR途径和Myc介导的c-GAS/STING炎症途径，改善高脂饮食诱导的肥胖小鼠的脑部炎症。研究还发现，燕麦外泌体样纳米颗粒也能穿过血脑屏障，被脑小胶质细胞摄取，改善酒精诱导的脑部炎症。 此外，生姜外泌体样纳米颗粒还具有一定的抗菌特性，已有研究表明，生姜外泌体样纳米颗粒可以剂量依赖性地抑制牙龈卟啉单胞菌的活性。 因此，基于上述研究基础，可以进一步探索其他PELNs在抗炎、抗菌方面的作用，为炎症性疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。 6.2 抗氧化作用 氧化应激是由体内活性氧（ROS）的过度积累引起的，这会导致细胞损伤甚至死亡，进而引发各种病理状态。许多药用植物长期以来被认为具有良好的抗氧化性能，从不同植物中提取的多种抗氧化剂已在临床上得到应用，如维生素C、维生素E和姜黄素。一些实验测定了葡萄柚汁和番茄汁及其来源的外泌体样纳米颗粒的抗氧化活性，结果显示外泌体样纳米颗粒的活性明显低于相应的果汁。但现在许多研究表明，PELNs可以发挥显著的抗氧化能力。将从芦笋、樱桃、葡萄、猕猴桃、橙子、血橙、柠檬、芒果、木瓜、葡萄柚、佛手柑和番茄的混合果汁中提取的PELNs口服给予过氧化氢诱导氧化应激的C57BL/6J雌性小鼠，测定发现口服PELNs的小鼠体内ROS和丙二醛（MDA）水平显著降低。同时比较了处理前后小鼠骨髓和脾细胞中ROS和MDA的水平，以及骨髓和脾细胞中的线粒体膜电位和超氧化物水平，结果证实PELNs具有很强的抗氧化能力，能够恢复体内的氧化还原平衡。对桑黄外泌体样纳米颗粒中包裹的miRNA进行高通量测序，并转染到紫外线诱导衰老的人表皮角质形成细胞（HaCaT）中，结果显示这些miRNA可以靶向单加氧酶Mical2的3'-UTR末端，这一过程涉及跨界通讯，能够保护细胞活力，降低基质金属蛋白酶1（MMP1）的表达，降低ROS水平和MDA含量，并增加超氧化物歧化酶（SOD）的活性，从而发挥抗氧化抗老化作用。 综上所述，从富含抗氧化生物活性化合物的多种植物中提取的PELNs在不同程度上发挥抗氧化作用，它们可以通过清除ROS来改善机体的氧化应激状态，进而修复机体的病理状态，达到治疗疾病的目的。 6.3 抗肿瘤作用 近几十年来，关于肿瘤的研究越来越多，出现了不同的诊断和治疗方法，但肿瘤的治疗仍然是一个巨大的挑战。相关研究得出结论，PELNs可以干预肿瘤生长，发挥一定的抗肿瘤作用，受到了许多研究人员的关注。在Raimondo等人的一项研究中，发现柑橘外泌体样纳米颗粒可以被人肺癌细胞系和慢性髓性白血病细胞系摄取，从而抑制肿瘤细胞的生长和增值能力。柠檬外泌体样纳米颗粒可以被胃癌细胞摄取，改变细胞周期，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，发挥抗癌活性。因此，不同植物来源的外泌体样纳米颗粒可以包裹不同的生物活性物质，靶向多种癌细胞发挥抗肿瘤作用。PELNs还可以通过改变癌细胞的细胞分裂周期来实现抗癌效果，生姜外泌体样纳米颗粒中的miRNA被认为可以通过降低结肠炎发展小鼠模型中促炎细胞因子和增殖标记细胞周期蛋白的水平，减少体内结肠肿瘤的发生。茶树外泌体样纳米颗粒被认为可以诱导线粒体损伤，导致细胞周期停滞和细胞凋亡，进而抑制乳腺肿瘤生长和肺转移。 在Sasaki等人的一项研究中，将colon26细胞皮下注射到BALB/c小鼠的背部，当肿瘤体积达到一定大小时，将玉米外泌体样纳米颗粒注射到肿瘤体内，结果显示注射后的小鼠肿瘤大小受到显著抑制，且未诱导任何毒性。Chen等人通过口服或静脉注射的方式将茶叶外泌体样纳米颗粒给予乳腺癌模型小鼠，结果显示无论采用哪种给药方式，外泌体样纳米颗粒都会在肿瘤组织中积累，并且都具有显著的促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长和发育的作用，高剂量的外泌体样纳米颗粒对肿瘤细胞的抑制效果更好，这表明PELNs的生物学功能可能受其剂量的影响。 在肿瘤发展过程中，肿瘤微环境中的癌细胞和肿瘤相关巨噬细胞相互作用，在肿瘤发生早期实现致癌抑制，在肿瘤中晚期促进肿瘤生长。肿瘤相关巨噬细胞有两种极化状态，分别对不同的刺激做出反应，M1型极化参与抗肿瘤过程，M2型极化则促进肿瘤生长、迁移和血管生成。人参外泌体样纳米颗粒通过改变TLR4和MyD88信号通路，促进肿瘤相关巨噬细胞向M1型极化，从而抑制黑色素瘤的生长，发挥相应的抗肿瘤作用。 研究证实，PELNs对乳腺和皮肤肿瘤细胞具有细胞毒性，但对正常细胞没有毒性。因此，它有望成为未来癌症治疗的一种潜在疗法。 总之，PELNs主要通过促进肿瘤细胞凋亡、改变癌细胞分裂周期和调节肿瘤微环境这三条途径发挥作用，在肿瘤相关的预防和治疗中可以起到跨界调节的作用，有望成为肿瘤预防和治疗的新策略。然而，关于其被肿瘤细胞摄取的相关机制以及与靶基因的作用方式，仍需要更多的研究来探索。 6.4 维持肠道微生物和免疫稳态 人体肠道微生物群是一个处于平衡状态的动态生态系统，在保护宿主和调节免疫方面发挥着非常重要的作用。饮食可以改变肠道微生物群的组成，调节菌群的种类、丰度和多样性。肠上皮细胞是维持肠道屏障的重要组成部分，它控制着致病微生物的进入，同时释放肠道内微生物产生的物质。肠道屏障的破坏会导致肠道微生物群失调，改变肠道的完整性和通透性，进而引发代谢相关疾病。研究证实，PELNs在维持肠道共生和稳态方面发挥着重要作用。PELNs可以增强肠道屏障，进而改善与肠道菌群改变相关的免疫和代谢紊乱。PELNs中的miRNA可以被肠道细菌吸收，改善肠道微生物的组成，进而参与宿主生理过程的调节。不同种类的肠道细菌内化和吸收具有不同脂质谱的PELNs，PA决定了PELNs在肠道中的保留量，PC则促进PELNs从肠道向肝脏的迁移。荞麦来源的外泌体样纳米颗粒可以靶向大肠杆菌和鼠李糖乳杆菌的相关基因，促进它们的生长，增强肠道微生物的多样性，增加短链脂肪酸的水平，维持肠道稳态。西兰花外泌体样纳米颗粒可以被肠道树突状细胞吸收，调节肠道树突状细胞中腺苷单磷酸活化蛋白激酶（AMPK）的活性，调节肠道的免疫稳态。 目前的这些研究表明，一些PELNs可以在肠道中相对稳定地存在，被肠道共生微生物吸收和内化，改变肠道菌群的组成，但仍需要更多关于不同种类PELNs的研究来证实这一点。 6.5 修复皮肤创伤和改善皮肤状况 伤口愈合是一个复杂且耗时的过程，包括止血、抗炎、细胞增殖和迁移以及组织重塑四个步骤。研究证实，PELNs在伤口愈合过程中可以发挥积极有效的作用。葡萄柚外泌体样纳米颗粒可以提高HaCaT细胞的活力，促进伤口愈合相关基因和蛋白质COL1A1、纤连蛋白、波形蛋白、层粘连蛋白以及促迁移细胞因子CCL5/RANTES、EGF-1、IGF-1、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子的表达，同时降低抗迁移细胞因子TIMP-1的表达，促进伤口愈合，还可以增强人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的血管生成能力，进一步促进伤口恢复。小麦外泌体样纳米颗粒促进内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞的增殖和迁移，增加I型胶原蛋白的mRNA水平，促进胶原蛋白的产生，促进内皮细胞的血管生成，有助于伤口愈合。 Abraham等人通过差速离心和尺寸排阻色谱法分离纯化黄瓜外泌体样纳米颗粒，并将亲脂性活性物质负载到其中，结果显示皮肤通透性显著增加，这为PELNs在美容领域的发展奠定了基础。人参外泌体样纳米颗粒改善了人皮肤成纤维细胞的衰老状况，实验通过将不同剂量的人参外泌体样纳米颗粒与诱导衰老的人皮肤成纤维细胞模型共孵育进行验证。结果显示，衰老相关β-半乳糖苷酶活性呈剂量依赖性降低，其他标记物，如p53（TP53）、p21Cip1（CDKN1A）、p16INK4a（CDKN2A）、MMP1和IL-8的mRNA表达水平也随着人参外泌体样纳米颗粒浓度的增加而逐渐下调，从而改善衰老状况。刺五加叶和根茎外泌体样纳米颗粒能够以浓度依赖的方式降低小鼠黑色素瘤细胞中的黑色素含量，抑制黑色素形成相关基因和蛋白质小眼畸形相关转录因子（MITF）、TYR、TRP-1和TRP-2的表达，提亮肤色，在一定程度上发挥美白作用。尽管目前关于PELNs与皮肤相关性的基础实验取得了有前景的结果，但要将其应用于人体皮肤仍有很长的路要走。 6.6 药物递送载体 PELNs不仅可以将包裹在其中的生物活性物质转移到特定的靶细胞，还可以作为天然的药物转运纳米载体，运输亲水性和疏水性生物活性物质以及亲脂性药物跨越体内的屏障，这些物质被受体细胞内化，发挥药物的治疗作用。与人工合成的药物载体相比，PELNs具有良好的稳定性、安全性、跨物种生物相容性、低致敏性和较长的半衰期，能够负载外源生物分子，如sRNA、DNA和蛋白质。其脂质双分子层结构不仅便于进行修饰和加工以实现轻松负载，还能保护包裹的内容物不被完全降解。动物源外泌体通常通过细胞培养获得，这需要大规模的细胞培养才能获得高产量的外泌体，此外，细胞培养过程中使用的胎牛血清等物质可能会对其临床应用带来一定的安全问题。因此，PELNs具有很大的优势。 目前，将生物分子负载到PELNs上有两种方式：被动负载和主动负载。被动负载技术是将PELNs与生物分子在一定温度下共孵育，生物分子通过脂质双分子层扩散进入；主动负载则是使用超声处理的方法短暂破坏外泌体的膜结构，在生物分子进入后，膜结构会恢复完整，研究表明主动负载优于被动负载。负载方法包括化学转染、电穿孔、超声处理、共孵育、渗透、挤压等。葡萄柚外泌体样纳米颗粒已被证明可用于纳米药物递送，包裹甲氨蝶呤（MTX）后产生更好的抗炎效果，且毒副作用显著降低。另一项研究还表明，葡萄柚外泌体样纳米颗粒可以将阿霉素（DOX）运输到肿瘤细胞中，增强药物靶向性。Yang等人发现，生姜外泌体样纳米颗粒可以将特定的sRNA递送到结肠组织中，减轻炎症反应。将阿霉素负载到脂质分布改变的生姜外泌体样纳米颗粒中，并与结肠癌细胞共孵育，结果证实生姜外泌体样纳米颗粒具有良好的生物相容性，能够高效发挥阿霉素的作用，与现有的阿霉素脂质体相比，具有更好的靶向释放效果，对肿瘤细胞的抑制作用更强。通过NTA分析发现，将阿霉素包裹到卷心菜外泌体样纳米颗粒中后，外泌体样纳米颗粒的大小没有明显变化，将包裹阿霉素的外泌体样纳米颗粒与结肠癌细胞共孵育后，细胞存活率下降，充分证明阿霉素负载成功并发挥了相应的细胞毒性作用。Lorena等人证明，西兰花外泌体样纳米颗粒可以作为有效的纳米载体负载外源miRNA，不仅能够抵抗RNA酶的消化以保持一定的稳定性，还能使负载的miRNA被有效吸收和利用，参与细胞间的分子通讯。 葡萄柚来源的纳米载体可以将化疗药物、siRNA、DNA表达载体和蛋白质运输到不同类型的细胞中。向怀孕小鼠尾静脉注射荧光标记的纳米颗粒后发现，这些纳米颗粒不会穿过胎盘屏障，这表明它们可以作为孕妇的药物递送载体，不会引起细胞毒性反应或诱导炎症反应。 尽管植物源外泌体样纳米颗粒（PELNs）在药物递送方面已取得良好效果，但构建各种工程化外泌体已成为提高药物负载率和靶向性的趋势。许多研究通过调整和修饰PELNs表面的生物活性物质来提高负载药物的疗效。Zhang等人发现，用聚乙二醇（PEG）结合外泌体脂质膜进行表面修饰后，PEG修饰的纳米囊泡（PEG-ACNVs）的血液保留时间明显延长，对肿瘤细胞生长的抑制作用也更好。此外，在外泌体表面负载与靶细胞特异性受体结合的配体有助于药物的靶向递送。例如，高亲和力叶酸受体在许多人类肿瘤细胞上高表达，而在非肿瘤细胞上很少表达，葡萄柚外泌体样纳米颗粒（ELNs）可以包裹叶酸，并将抗癌药物运输到表达叶酸受体的癌细胞中，从而提高靶向效率。相比之下，Wang等人利用炎症环境中的白细胞膜包裹葡萄柚外泌体样纳米颗粒，使其能够靶向炎症部位，且不会被免疫淋巴细胞清除，这为未来利用葡萄柚外泌体样纳米颗粒进行靶向药物递送提供了理论基础。肝素具有良好的抗补体激活功能，与细胞外囊泡（EVs）结合时可以提高其生物利用度。将阿霉素（DOX）负载到基于肝素的纳米颗粒中，再将负载阿霉素的肝素纳米颗粒固定在葡萄柚外泌体样纳米颗粒表面，制备出一种穿透血脑屏障能力有限的合成纳米颗粒，可有效递送药物，提高药物对抗胶质瘤的能力。 已有研究表明，由于PELNs具有较高的细胞内化率、较低的降解敏感性、可被胃肠道吸收，且因其天然成分具有较低的免疫原性，所以可作为mRNA疫苗的递送平台。PELNs还能够负载疫苗mRNA，与之前的腺病毒和脂质体负载的疫苗相比，天然产物的免疫原性更低，摄取率更高。Pomatto等人将新冠病毒（SARS-CoV-2）mRNA疫苗分别用不同的mRNA分子负载到柑橘外泌体样纳米颗粒中，这些mRNA可免受RNA酶和模拟胃液的降解和消化，并被递送到特定的靶细胞中，翻译为蛋白质，激活淋巴细胞产生抗体，从而发挥特定作用。此外，口服给药还可在口腔黏膜引发免疫反应，产生特异性抗体。这些研究为mRNA疫苗的更好开发和利用指明了方向。 此外，大多数植物源生物活性物质，如多酚、黄酮类化合物和萜类化合物，具有良好的抗炎、抗氧化和抗癌作用，日常用于疾病的预防和治疗。然而，这些生物活性物质存在水溶性差、不稳定、易降解、无法穿过血脑屏障以及存在潜在毒性等问题，导致其生物利用度较低。尽管以前的化学修饰方法在一定程度上可以提高它们的稳定性，但可能会改变其原有的生物活性。PELNs作为一种新型的纳米级载药平台，也可用于包裹这类物质，使其靶向病变区域，发挥更稳定、更有效的作用。 PELNs作为递送生物活性物质的纳米载体，优点众多且毒副作用少，为促进健康、预防和治疗疾病提供了更多可能，具有广阔的应用前景。 七、安全性 纳米囊泡的安全性是广泛研究和临床转化的必要前提。植物源外泌体样纳米颗粒（PELNs）含有一些复杂的未检测出的核酸、蛋白质和脂质代谢物，但它们是天然成分，生物危害性较小，免疫原性低，能够穿过肠道屏障，靶向特定器官，并发挥与动物源外泌体相同的功能。目前尚无关于植物外泌体引发免疫反应的文献报道，这表明它们具有相对的安全性和生物相容性。与合成脂质体相比，使用外泌体负载药物具有更高的生物相容性和安全性。PELNs从安全来源的植物细胞中提取，不携带人畜共患或人类病原体，无毒且无毒性作用，具有高度的生物相容性和安全性。但也有研究给小鼠注射茶叶外泌体样纳米颗粒4次后，发现小鼠体重下降，对小鼠进行AST/ALT（谷草转氨酶/谷丙转氨酶）和尿素氮肌酐检测，结果显示茶叶外泌体样纳米颗粒产生了潜在的肝肾毒性，导致血象改变，且与健康组相比，炎症因子TNF-α和补体C3浓度升高。也有观点认为，外泌体样纳米颗粒中含有的miRNA可能存在一些不良影响，但这仍需更深入的研究来探索。植物中还存在一些未知的生物活性物质，在PELNs的提取或储存过程中可能面临的一些安全问题，也需要进一步探索和研究。 PELNs对肿瘤细胞有抑制作用，但对正常细胞无毒性。Stanly等人证明，柑橘外泌体样纳米颗粒可抑制乳腺癌、肺癌和黑色素瘤细胞的增殖，但对正常的HaCaT细胞无毒性，能够安全有效地作用于靶细胞以发挥特定作用。 在药物的体内应用中，与直接注射给药相比，口服给药是一种方便且依从性好的给药方式。一项比较茶树外泌体静脉注射和口服给药的研究表明，两种给药方式的抑瘤率相当，但静脉注射可能会诱导免疫系统活性和潜在的肝肾毒性，相比之下口服给药更安全。Zhuang等人探索了经鼻给药的安全性，观察到荧光标记的负载药物的外泌体样纳米颗粒在经鼻给予葡萄柚外泌体样纳米颗粒12小时后能够进入小鼠大脑，并且在实验期间未检测到小鼠生命体征和神经功能的变化，这证实了经鼻给予葡萄柚外泌体样纳米颗粒也是一种安全有效的治疗途径。Di等人通过腹腔、舌下和灌胃等给药途径评估PELNs的潜在毒性，结果显示在所有剂量和给药途径下均未表现出毒性。 因此，PELNs是一种安全有效的天然纳米级颗粒，可加强相关研究，为更好的临床应用奠定基础，但PELNs的安全给药剂量以及不同给药途径的安全性仍需进一步探索和研究。 八、保存 完整的脂质双分子层是确保植物源外泌体样纳米颗粒（PELNs）有效发挥功能的重要介质。因此，合适的温度、pH值、储存介质、时间以及储存方法对于维持PELNs的功效至关重要。一些研究证实，生姜外泌体样纳米颗粒能够耐受反复冻融，并且在室温下可保持7天的稳定性。然而，大多数研究得出结论，反复冻融可能会在结构上影响外泌体囊泡，并影响其性质。Nemidkanam等人对小花山柰外泌体样纳米颗粒进行多次冻融循环后，发现其粒径增大，负电荷减少。 目前大多数研究认为，-80°C是保存和运输PELNs的最佳温度条件，但超低温储存和运输成本高昂，难以广泛应用。已有研究采用冷冻干燥技术储存细胞外囊泡（EVs），并且认为冷冻保护剂海藻糖能有效防止纳米颗粒聚集，同时不影响EVs的蛋白质和RNA含量。然而，选择合适的冷冻保护剂非常重要。研究表明，蔗糖和磷酸钾缓冲液有助于提高EVs的稳定性，而中性pH保护剂能有效维持EVs的形态。 因此，在PELNs的生产、储存和运输过程中，采用合适的保存方法可以最大限度地发挥PELNs的作用。 九、目前的局限性 尽管植物源外泌体样纳米颗粒（PELNs）前景广阔，但现有的PELNs分离和纯化方法要求苛刻，生产规模有限，无法满足大量基础研究所需的剂量和纯度，获取方法需要优化，以进一步满足各类科研和实验需求。就目前可用的鉴定方法而言，表面标记蛋白仍未完全确定，大多数相关文献并未使用表面标记蛋白的鉴定方法，因此需要对不同PELNs的蛋白质组成进行更多研究，以改进鉴定方法。此外，不同植物中存在不同的生物活性物质，例如生姜中的姜辣素、胡萝卜中的类胡萝卜素、酚类物质以及其他一些未表征的物质，这些生物活性物质的作用仍然未知。而且，PELNs潜在的作用机制尚未完全明确，仍需要大量基础实验进行探索。 十、草药来源的细胞外囊泡 药用植物在许多疾病的治疗中发挥着抗炎、抗氧化等作用。草药中不仅含有多糖、萜类、黄酮类、生物碱等小分子化合物，还包括肽、核酸等具有生物活性的大分子物质。然而，草药的复杂成分仍存在许多未知之处，其中许多成分需要经过加工才能在有效治疗中发挥作用。因此，目前大多数研究围绕中药材的干燥和脱水展开，但许多新鲜药材也具有非常重要的临床功能，比如青蒿素用于治疗疟疾。 一些研究证实在炮制后的中药中存在纳米颗粒。Li等人发现，红景天和蒲公英的煎剂中存在包裹脂质、蛋白质、核酸等生物活性物质的外泌体样纳米颗粒（ELNs），并发挥相应的治疗作用。将红景天和蒲公英浸泡后煮沸得到草药汤，通过差速离心和低温超速离心获得相应的ELNs。通过TEM（透射电子显微镜）、DLS（动态光散射）以及对miRNA的高通量测序，再结合体内外实验来验证其作用，证实红景天和蒲公英发挥作用的主要是ELNs中所含的成分。红景天ELNs能够有效改善MRC-5细胞的纤维化以及小鼠的肺纤维化发病率，蒲公英ELNs能够降低A549细胞中促炎因子的产生。研究还发现，ELNs的抗纤维化和抗炎作用比单纯的草药补品更强。因此，需要更多实验来证实炮制后的草药分子进入机体发挥相应作用与它们来源的细胞外囊泡之间是否存在关联。 对新鲜草药的细胞外囊泡研究比对干燥和炮制草药的研究更多。新鲜草药可以研磨榨汁，从中提取ELNs。小花山奈是泰国常见的药用植物，其根茎具有抗炎、抗癌和抗氧化作用，其煎剂可用于缓解胃胀和胃溃疡。研究证实，小花山奈ELNs能够进入人胃癌细胞并降低癌细胞活性，这为未来研究药用植物细胞外囊泡在肿瘤疾病治疗或参与药物递送方面提供了参考。地黄是一种临床常用的中药材，含有多种萜类和糖苷，具有抗炎以及抑制肿瘤细胞增殖和血管生成的作用。对新鲜地黄汁中的ELNs进行高通量测序鉴定，并预测其中丰度较高的miRNA的靶基因。体外研究证实，它可以降低脂多糖（LPS）诱导的炎症反应，抑制促炎因子的释放；体内实验证实，它可以改善LPS诱导的小鼠肺损伤和肠道菌群分布，实现对肠道稳态的调节。新鲜姜黄ELNs已被证明可以降低细胞内促炎因子的表达，体内实验表明，ELNs可以穿过肠道屏障，调节肠道菌群，改善结肠炎。药用植物青蒿常用于治疗疟疾，Liu等人证明青蒿ELNs能够有效发挥抗肿瘤作用。这些对新鲜草药细胞外囊泡的研究为新鲜草药及其可能发挥功效的活性成分的应用提供了新的研究方向。 因此，草药细胞外囊泡可能是其发挥治疗作用的重要因素之一，有望作为一种新型的口服治疗药物应用于临床，但这一想法仍需大量的草药细胞外囊泡研究来证实。 十一、挑战 目前，关于植物源外泌体样纳米颗粒（PELNs）的研究还不够深入，但已经有许多令人振奋的发现，为未来疾病的预防、诊断和治疗提供了新的思路和见解，也为纳米医学材料在疾病诊疗中的应用开辟了新途径。目前也有相应的临床试验正在进行中。编号为NCT03493984的临床试验旨在证实生姜ELNs和芦荟ELNs可用于改善多囊卵巢综合征（PCOS）患者的生殖功能，但该临床试验尚未获批，因此距离其临床应用仍有很长的路要走。与动物源外泌体（ADEs）相比，PELNs作为天然产物，来源丰富、生物相容性较好、安全、具有一定的靶向性，既可以作为药物递送载体，又能发挥抗炎和抗肿瘤作用。目前已有一些研究证实，它们可以从肠道进入人体循环系统，重塑肠道稳态并参与跨界通讯，在生物医药研发中具有巨大潜力。在可控条件下，这是一种安全、有效且经济的新策略。然而，PELNs也存在纯度低、易受损、难保存、易降解、纳米颗粒不均一等问题。目前仍需探索新的分离和纯化方法，以满足大规模开发的需求，实现高效、经济且可应用于临床的目标，为未来的有效应用奠定基础。同时，细胞分泌外泌体的能力有限，先前的研究表明，应用含有各种化合物的支架可以增加外泌体的分泌，因此探索支架在外泌体生产中的潜在能力也很重要。PELNs的吸收和摄取机制、摄取率仍不明确，其靶向的特定基因需要大规模研究。此外，不同PELNs的剂量和最低有效剂量也各不相同，这仍需进一步的基础实验进行研究和验证。是否所有类型的PELNs都能在无任何毒性的情况下到达靶细胞并发挥可能的生物学效应，仍有待进一步探索，从不同种类和属的植物中分离得到的PELNs的浓度和纯度也是必须考虑的问题。此外，仍有许多未知领域有待探索，尽管目前大多数关于PELNs的研究都取得了积极成果，但可能也有许多研究人员得到了未发表的阴性结果。因此，为了使PELNs在未来能够广泛应用，进一步的研究是十分必要的。 参考文献： Bai C, Liu J, Zhang X, Li Y, Qin Q, Song H, Yuan C, Huang Z. Research status and challenges of plant-derived exosome-like nanoparticles. Biomed Pharmacother. 2024 May;174:116543. doi: 10.1016/j.biopha.2024.116543. Epub 2024 Apr 11. PMID: 38608523. 百瓴因生物 微信号｜15021639579 www.biolinkin.cn 公众号推送文章仅为学术交流使用，仅供读者参考。公众号“原创”标识仅代表原创编译之作，不代表本公众号对文本主张版权。版权归文章作者所有。