Raxibacumab

摘要:抗体-药物偶联物（ADCs）是由单克隆抗体（mAb）与小分子药物结合而成的复杂分子。抗体可以特异性地将细胞毒性剂引导至病变细胞，同时避免对健康组织造成伤害，从而显著提高治疗指数。本章描述了ADCs的多个方面，从ADCs的最初构想到关键发展、缺点以及目前有多种分子被批准用于治疗的情况。之后，我们将关注ADCs的关键组成部分，并描述用于ADCs的mAbs的特殊要求、作为ADC弹头应用的不同类型药物，以及连接mAb与药物的不同类别的连接子。此外，还将回顾用于将小分子连接到mAbs的偶联技术。文中包括了来自临床以及临床前开发和早期研究的多个例子，以说明每个部分描述的不同概念和分子机制。 1.ADCs简介 尽管过去几十年取得了巨大进步，但癌症治疗仍然是一个艰巨的任务。尤其是肿瘤的极大异质性以及开发能够选择性针对癌细胞而不影响健康组织的药物治疗是一个主要挑战。例如，传统化疗利用了大多数癌细胞快速分裂和增殖的事实。因此，干扰细胞分裂（有丝分裂）的细胞毒性化疗药物通常会导致肿瘤退缩。然而，一些正常的细胞类型，如骨髓或消化道中的细胞，也在快速分裂，因此对抗有丝分裂药物敏感，最终导致化疗期间观察到的常见副作用。因此，开发新癌症疗法的一个主要挑战是提高药物的治疗指数（TI）。TI反映了引起有益治疗效果的药物剂量与引起毒性的剂量之间的比率（图1）。换句话说，药物的TI不足意味着这种化合物无法在不引起不可接受的毒性的情况下根除肿瘤。专注于提高TI的下一代癌症疗法开发的学科是靶向癌症疗法领域。靶向癌症疗法是精准医疗的基石，旨在通过干扰肿瘤进展中涉及的特定分子靶标来阻断癌症的生长和扩散。在这个学科中，正在采用多种方法更具体地针对病变组织。例如，信号传导抑制剂干扰不适当的细胞信号传导，基因调节剂允许修改蛋白质表达水平，免疫疗法，抗体-药物偶联物（ADCs）等等。在本章中，我们希望关注ADCs（图2），它们结合了单克隆抗体的优越选择性和一些细胞毒性剂的高效力。ADCs的基本概念相当简单（图3）。前提是一个抗原，可以在分子基础上区分癌细胞和健康细胞。例如，这可能是在肿瘤细胞中高度上调的特定细胞表面受体。针对这种抗原的抗体可以作为高效细胞毒性剂的靶向载体。为了形成ADC，细胞毒性剂需要通过连接子与抗体共价连接，该连接子在循环中稳定，以避免过早释放毒素。在患者中给予ADC后，它遍布全身，一旦接近肿瘤，就会与细胞表面的抗原结合。然后，抗体-抗原复合物被细胞内化，并通过内源性细胞内运输途径定向到溶酶体。到达溶酶体后，ADC被降解，从而释放其有毒有效载荷。游离毒素然后可以结合其细胞内靶标，从而诱导凋亡并杀死癌细胞。在某些情况下，毒素可以离开癌细胞并作用于相邻的，理想情况下也是癌细胞。这个过程称为旁观者效应，其程度取决于应用的连接子和药物。另一方面，健康细胞主要被保留，因为抗体应该只与表达抗原的癌细胞结合并传递毒素。 图 1 治疗指数 (TI) 及其通过 ADC 改善的情况。治疗指数的特征是超过最大剂量会出现毒性（最大耐受剂量，MTD）和达到治疗效果所需的最低剂量（最小有效剂量，MED）。ADC 通过结合目标特异性单克隆抗体和强效有效载荷，同时增加 MTD 并降低 MED，从而最终提高治疗指数。 图2 ADC 的模块化设计和关键参数。ADC 由单克隆抗体、有效载荷和连接子组成。抗体作为偶联的有毒有效载荷的载体，介导特异性抗原结合以及长的血清半衰期。连接子确保在血清中具有高稳定性，但在细胞内有效释放有效载荷。 图3 ADC 作用模式的图解概览。当与癌症特异性表面受体（浅蓝色）结合后，产生的 ADC-受体复合物被内化并运输到内质网。虽然受体循环可以使 ADC 返回到表面，但预期的途径是内质体成熟为溶酶体。随后的溶酶体降解导致药物（红色）的释放，根据所使用的毒素类别，通过不同机制诱导细胞死亡：微管抑制剂与微管结合，DNA 损伤药物扩散到细胞核以诱导 DNA 损伤。根据连接子和药物的类型，细胞内释放的药物可以离开目标细胞并对相邻细胞也起作用（旁观者效应）。 2.ADC发展的里程碑 历史上，ADC的概念起源于Paul Ehrlich在1900年左右进行的工作（图4）。他设想了一种药物，像“魔法子弹”一样只伤害病变组织，同时保留健康细胞。Ehrlich在开发了一种选择性杀死引起昏睡病的寄生虫锥虫的染料后，能够证明他的概念。此外，Paul Ehrlich也是抗体发现的先驱之一，因此为ADC发展奠定了一些基石。然而，在20世纪初引入“魔法子弹”概念后，直到1980年代ADC的发展才缓慢推进。这主要归因于难以生产选择性抗体，因此几乎不可能获得大量特定抗体，可以作为ADC的基础。这一点在Georges Köhler和César Milstein在1975年报告他们的杂交瘤技术后发生了变化。从这一点开始，单克隆抗体的可用性不再是问题，为治疗性抗体以及ADC铺平了道路。Muromonab-CD3（OKT3®）是第一种治疗性单克隆抗体，于1986年被食品药品监督管理局（FDA）批准为免疫抑制药物。然而，由于Muromonab-CD3是一种小鼠抗体，其治疗应用与较高的免疫原性风险相关。因此，患者在接受治疗一段时间后通常会发展出抗药物抗体（ADAs），使他们对这种药物产生抗性。然而，重组DNA技术允许生产嵌合体，以及在后期，人源化抗体，从而可以大幅减少免疫原性问题。这些技术进步最终导致了第一种mAb（利妥昔单抗）在1997年被批准用于治疗癌症。利妥昔单抗是一种嵌合抗体，与大多数B细胞淋巴瘤表面表达的CD20结合。由于抗体是ADC的一个组成部分，抗体领域的技术进步也意味着ADC领域的进步，上述里程碑对ADC的发展做出了重大贡献。 图4 从 1900 年首次构想到 7 种获批 ADC 的 ADC 发展里程碑。 除了抗体，ADC的另一个重要组成部分显然是附着在其上的细胞毒性有效载荷。一些最早研究的ADCs包含了众所周知的具有极高效力的化疗药物，如甲氨蝶呤、阿霉素或长春碱。这些药物通过本章稍后将详细讨论的不同连接子类型和偶联技术与抗体偶联。然而，在小鼠中进行的人体肿瘤异种移植研究中，第一代偶联物的体内评估显示出比相应的未偶联药物更优越的抗肿瘤活性。受到这些数据的鼓舞，启动了两项临床I期试验，使用基于小鼠KS1/4抗体与甲氨蝶呤偶联的ADC。不幸的是，在这些研究中未能观察到令人信服的治疗效果，最终导致这些研究的终止。失败的一个原因归因于对小鼠mAb产生ADAs，导致ADC的快速清除。更成功的是抗体阿霉素偶联物BR-96-Dox，它进入了治疗转移性乳腺癌的II期临床试验。然而，这种偶联物也没有显示出显著的治疗效果，因此停止了进一步的开发。第一代偶联物的缺乏成功抑制了对ADCs的初步兴奋，虽然在1990年代FDA批准了七种mAbs，但第一个ADC的批准却迟迟未来。最终，随着gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®)在2000年获得FDA批准用于治疗急性髓细胞性白血病（AML），第一个ADC获得了FDA的批准。gemtuzumab ozogamicin的基础是gemtuzumab，这是一种针对髓系细胞表达的跨膜受体CD33的人源化IgG4型抗体。作为细胞毒性有效载荷的是calicheamicin，一种高效的DNA损伤剂。不幸的是，由于缺乏对患者的益处，gemtuzumab ozogamicin在2010年被撤出市场。尽管如此，它是ADC发展史上的一个里程碑，最终，由于推荐剂量降低和不同的剂量计划导致风险-效益比改善，gemtuzumab ozogamicin在2017年重新获得批准。ADC作为治疗药物的真正突破随着2011年brentuximab vedotin (Adcetris®)和2013年trastuzumab emtansine (Kadcyla®)的批准而来。这两种ADC为整个领域带来了全新的动力，导致许多不同公司的开发活动，新技术的兴起和多项人类临床试验。我们将在本章中回顾这些下一代技术和发展。对ADCs来说，2019年尤其令人兴奋，因为随着brentuximab vedotin和trastuzumab emtansine的批准，最终有三项晚期临床试验成功结束，并获得三项ADC的批准。今天市场上总共有七种ADC（这里列出了国际非专利名称(INN)，随后是商品名，批准年份和公司）：gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®, 2001/2017, Pfizer/Wyeth)，brentuximab vedotin (Adcetris®, 2011, Seattle Genetics/Millennium)，trastuzumab emtansine (Kadcyla®, 2013, Genentech/Roche)，inotuzumab ozogamicin (Besponsa®, 2017, Pfizer/Wyeth)，polatuzumab vedotin-piiq (Polivy®, 2019, Genentech/Roche)，enfortumab vedotin-ejfv (Padcev®, 2019, Astellas/Seattle Genetics)，和trastuzumab deruxtecan (Enhertu®, 2019, Daiichi Sankyo/AstraZeneca)。这些ADCs的关键参数在表1中描述，接下来的部分将引用其中的一些。 表 1 2020 年初获批用于治疗的 ADC 的关键参数 3.ADCs使用的靶标和抗体 ADC的设计是一项跨学科的努力，因为它们由大型生物技术生产的生物分子和化学合成的高效小分子药物组成。这两种实体分别生产，然后结合成一个高度复杂的混合分子。因此，从设计各个组成部分到最终生产偶联物的整个ADC开发过程伴随着巨大的技术挑战。第一道障碍是确定适合ADC方法的靶标。该靶标应允许通过肿瘤特异性靶标过表达或通过其他机制（如肿瘤细胞上突变蛋白变体的专有呈现）来区分癌细胞和健康组织。它也应该对抗体可接近，这基本上限制了空间到细胞外靶标。此外，靶标在ADC结合后的快速内化对于达到细胞内细胞毒性剂的关键浓度很重要。一个符合这些标准的靶标示例是CD30。CD30是激活的T和B细胞呈现的受体，在癌细胞上表现出高、均匀的表达，在正常组织中表达低，并且在抗体结合后迅速内化。针对CD30的单克隆抗体是brentuximab vedotin (Adcetris®)的基础，这是一种用于治疗复发或难治性霍奇金淋巴瘤（HL）和系统性间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）的ADC。相反，并非每个ADC靶标都必须满足所有这些标准。trastuzumab emtansine (Kadcyla®)的靶标HER2在乳腺癌组织中表达水平高，并且在抗体结合后迅速内化。然而，它也在其他组织中表达，如皮肤、心脏、胃肠道（GI）、呼吸、生殖和泌尿道。尽管如此，ADC仍然具有良好的耐受性，因为健康细胞上的HER2表达量远低于癌细胞。抗体是ADC的第二个关键组成部分，因为它代表了整个分子的靶向和药代动力学（PK）的主要决定因素。因此，mAb应该具有高亲和力和选择性地结合其靶标，以确保细胞毒性弹头被传递到正确的细胞。然而，抗体不仅与抗原结合，还与多种Fc受体进行额外的多种相互作用。特别重要的是与新生儿Fc受体（FcRn）的结合，使抗体受到一种称为FcRn循环的机制的影响。这个过程导致抗体的半衰期显著改善，除了高分子量外，也是抗体非凡长血清半衰期的主要原因之一。考虑到小分子细胞毒性剂通常只表现出几个小时的半衰期，对于ADCs来说，保持FcRn结合是非常理想的，因为与抗体的结合可以将毒素的半衰期延长到几天甚至几周。因此，必须特别注意不要通过例如细胞毒性剂的偶联来损害mAb-FcRn相互作用。一些工程方法甚至旨在增强FcRn相互作用，以进一步改善抗体的PK特性。除了FcRn受体外，还存在许多其他Fc受体类别，它们负责Fc效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。尽管这些机制通常有助于mAbs的治疗效果，但与这些受体的相互作用可能对ADC方法不利。这些次要免疫功能的参与可能会意外地减少偶联物在肿瘤中的定位或增加健康细胞对表达Fc受体的ADC的摄取。因此，用于gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®)的mAb属于IgG4亚类，没有ADCC或CDC活性，而通常用于治疗性抗体的免疫活性IgG1亚类。因此，使用效应沉默的抗体亚类可能是一个有效的策略，或者进行旨在避免上述问题的抗体工程。 4.ADC细胞毒性有效载荷 ADC最终产生治疗效果的元素是偶联的细胞毒性剂，通常被称为“有效载荷”或“弹头”。到目前为止，已有多种分子类别在ADC环境中证明是成功的，还有更多具有巨大潜力的分子正在研究中。今天用作ADC有效载荷的一些毒素，如美登素、奥瑞他汀和卡利霉素，是因为它们极高的效力而被发现，这使它们成为可能的新抗癌药物的非常吸引人的选择。然而，这些毒素的治疗指数不利，实现抗癌效果所需的剂量伴随着严重的毒性，最终排除了它们作为独立抗癌药物的进一步开发。然而，随着ADC的出现，这些毒素的治疗应用经历了复兴。今天正在开发的大多数ADC携带细胞毒性有效载荷，但值得一提的是，最近的方法也利用了其他药物，如免疫刺激性有效载荷或抗生素。在接下来的部分中，我们将关注不同类别的细胞毒性ADC有效载荷，并仔细看看已经作为目前批准的ADC组成部分取得最终成功的有效载荷。 美登素是一种从非洲灌木美登斯树皮中分离出来的安莎霉素大环内酯。它是一种非常强效的抗有丝分裂药物，通过抑制微管聚合从而在G2/M阶段阻止细胞周期，最终通过凋亡导致细胞死亡。美登素及其衍生物，美登素类，在低皮摩尔浓度范围内对不同的癌细胞系显示出强烈的体外活性。这些化合物最常见的剂量限制性毒性是神经毒性、呕吐和恶心。然而，最初分离的美登素结构并不适合与抗体共价连接。因此，必须开发允许与mAb偶联的衍生物。这些活动中产生的一个化合物是DM1（图5），最终用于曲妥珠单抗emtansine（Kadcyla®）的有效载荷。有趣的是，将DM1作为ADC组成部分使用，将其最大耐受剂量（MTD）至少提高了一倍，证实了将细胞毒性剂纳入ADC可以改善治疗指数的概念。 图 5 DM1 的化学结构，DM1 是曲妥珠单抗艾美汀（trastuzumab emtansine）所使用的有效载荷。 奥瑞他汀是肽基分子，其中第一个描述的这类剂，多拉司他丁10，是从海蛞蝓Dolabella auricularia中分离出来的。奥瑞他汀抑制微管聚合并抑制依赖于微管的鸟苷-50-三磷酸（GTP）水解。这导致有丝分裂受到干扰，最终导致细胞周期在G2/M阶段停止，最终导致细胞死亡。奥瑞他汀最常见的剂量限制性毒性是周围神经病变（PN）、疲劳、恶心和腹泻。 今天，主要使用两种多拉司他丁10类似物，即单甲基奥瑞他汀E（MMAE）（图6）和单甲基奥瑞他汀F（MMAF）作为ADC有效载荷。然而，到目前为止，只有含有MMAE作为活性药物的ADC被批准用于治疗，即brentuximab vedotin (Adcetris®)、polatuzumab vedotin-piiq (Polivy®)和enfortumab vedotin-ejfv (Padcev®)。 图 6 单甲基奥瑞他汀 E（MMAE）的化学结构，它是 Brentuximab Vedotin、Polatuzumab Vedotin 和 Enfortumab Vedotin 中的细胞毒性成分。 卡利霉素是含有内炔的抗癌抗生素，具有特殊的结构元素，如甲基三硫化物基团和糖基化的羟基氨基糖。它们最初是从Micromonospora echinospora calichensis中分离出来的，显示出非凡的高抗肿瘤活性。例如，卡利霉素γ1I在小鼠肿瘤中显示出抗肿瘤活性，剂量低至0.5-1.5 μg/kg。卡利霉素构成gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®)和inotuzumab ozogamicin (Besponsa®)的有效载荷（图7），其中它通过酸敏感连接子与mAb共价连接。它是一种非常强效的DNA损伤剂，与DNA次要沟中的特定区域结合，在那里它诱导双链断裂，最终导致凋亡和细胞死亡。卡利霉素最常见的剂量限制性毒性包括血小板减少症和中性粒细胞减少症。 图7 在临床上批准的 ADC 药物吉妥珠单抗奥扎米星（gemtuzumab ozogamicin）和伊诺珠单抗奥扎米星（inotuzumab ozogamicin）中发现的卡利切阿霉素（calicheamicin）的化学结构。 喜树碱是一种五环喹啉酮碱，最初从亚洲树喜树中分离出来。它抑制DNA拓扑异构酶I，从而有效阻止S期的DNA复制，最终导致肿瘤细胞的凋亡细胞死亡。然而，最初的化合物因水溶性差和在生理条件下其内酯转化为无活性的羧酸形式而受到影响。因此，进行了许多旨在改善喜树碱特性的活动。这些努力导致了拓扑替康和伊立替康的开发，它们已被FDA批准为抗癌药物。喜树碱的另一个重要衍生物是取代的exatecan Dxd（图8），它是用于曲妥珠单抗deruxtecan (Enhertu®)的有效载荷。在喜树碱治疗期间观察到的最严重的副作用包括中性粒细胞减少症和白细胞减少症。 图 8 已批准的 ADC 药物曲妥珠单抗德鲁替康（trastuzumab deruxtecan）中 Dxd 的化学结构。 5.ADC连接子 根据“抗体-药物偶联物”这个术语，ADC的主要成分是药物和抗体。然而，要将这两种实体偶联起来，需要一个连接子，将mAb与药物（图9）连接起来。仔细选择这种连接子，同时考虑mAb和有效载荷，对于最终ADC的效力和安全性至关重要。在血液中，连接子应尽可能稳定，以防止过早释放有效载荷，否则可能导致系统性非靶向毒性。但是一旦ADC到达目标细胞，有效载荷必须在不受到连接子的阻碍下活跃。此外，连接子的长度和化学性质可以对ADC的药代动力学和药效动力学产生强烈影响。 图9 ADC 连接子的图解说明。ADC 连接子通过共价键将细胞毒性有效载荷与抗体连接起来，通常与有效载荷一起合成，形成结合的连接子-有效载荷结构。所有连接子都携带一个反应性基团，使其能够与抗体偶联。许多连接子还包含一个切割位点，这允许在目标细胞内改善有效载荷的释放。一些切割机制需要一个额外的自消除模块，以确保有效载荷的无痕释放。 用于ADC的连接子主要分为不可切割和可切割两类。不可切割连接子在循环和细胞中都稳定，而可切割连接子设计为在目标细胞内被特定的细胞内机制降解。下面描述的连接子的示意图在图10中描述。 图 10 常用 ADC 连接子概览。ADC 连接子可以分为两类：不可切割（上部）和可切割（下部）连接子。通过可切割连接子从 ADC 中释放的有效载荷仍然与用于连接子-有效载荷连接的氨基酸相连。可切割连接子通过酶或化学环境降解。卡特普辛 B 连接子包含肽序列（例如，缬氨酸-瓜氨酸），而葡萄糖醛酸酶连接子包含葡萄糖醛酸。两者都与自消除的 PABC 模块结合，这使得药物可以无痕释放。酸敏感连接子和二硫键连接子分别通过酸性和还原条件降解。 使用不可切割连接子的ADC的释放依赖于抗体被完全蛋白水解降解为其组成的氨基酸。因此，最终释放的药物代谢物仍然连接到它们最初偶联的连接子和氨基酸（例如，赖氨酸或半胱氨酸）。这种修饰可能会干扰细胞毒性药物的活性，因此不可切割连接子只与作为氨基酸加合物仍然活跃的药物结合。此外，由于氨基酸的电荷，这些加合物相当亲水，导致膜透性降低，从而降低了旁观者活性。另一方面，不可切割连接子在循环中非常稳定，从而降低了意外药物释放的风险。一个带有不可切割连接子的ADC的突出例子是曲妥珠单抗emtansine (Kadcyla®)。在这里，弹头通过不可切割的硫醚键连接到mAb，产生DM1-赖氨酸加合物作为最终释放的活性药物。 可切割连接子旨在在肿瘤部位特异性释放药物，最好只在癌细胞内。理想情况下，这种释放是无痕的，使药物没有任何残留的取代基，如连接子或氨基酸的部分，这在许多情况下也有助于改善旁观者效应。典型的切割机制通常利用循环和细胞内区间不同的因素，主要是化学环境或特定的细胞内酶。 一类依赖于化学环境变化触发的切割的连接子是含有腙键的连接子系统。这些连接子被设计为在血液的中性pH下稳定，但在酸性环境中水解。正如前面已经描述的，ADCs的内化通常导致运输到内涵体和溶酶体区间。这些区间呈现出越来越酸性的环境（pH < 5），最终触发药物的释放。尽管这种类型的连接子已与非特异性药物释放相关联，但成功的应用证明了其功能性。实际上，gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®)和inotuzumab ozogamicin (Besponsa®)都依赖于pH敏感的腙键连接子。 含有二硫键的连接子是另一类化学可切割的连接子。这些连接子的好处在于，细胞内区间通常比血液中更具还原性。细胞内区间的还原环境是由谷胱甘肽（1-10 mM）和还原酶的浓度升高创造的，与循环相比（< 5 μM）。值得注意的是，作为对实体瘤中发现的低氧水平的响应，这些效应在癌细胞中可能更加明显。因此，含有二硫键的连接子主要在肿瘤细胞的细胞内空间释放药物。通过在二硫键旁边引入空间位阻取代基，可以微调这些连接子的稳定性，以进一步防止过早的药物释放。 肽连接子旨在通过选择性酶促切割释放药物。由于血液中的蛋白水解活性较低，这些连接子在循环中可以非常稳定，而它们在内化后被溶酶体蛋白酶如半胱氨酸蛋白酶切割。一个经常应用的肽连接子包括二肽基序缬氨酸-瓜氨酸（Val-Cit），在溶酶体中迅速水解。它最初是为半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸蛋白酶B的有选择性切割而设计的，但已显示药物释放也可以由其他蛋白酶触发。进一步成功应用的肽基序是Val-Ala或Gly-Gly-Phe-Gly；后者用于曲妥珠单抗deruxtecan (Enhertu®)。这类连接子-药物经常应用的一个是由Val-Cit肽通过自毁性的对氨基苯甲氧羰基（PABC）间隔物连接到药物MMAE。已经显示取代基可以大幅降低MMAE的效力。因此，已经做出了很多努力来开发这种允许无痕释放MMAE的连接子系统：Val-Cit的蛋白水解切割创造了一个PABC-MMAE中间体，随后PABC部分的自毁，从而释放未修饰的药物。然后MMAE可以在相同细胞内活跃，或者扩散到邻近细胞并引起旁观者效应。这种连接子-药物是brentuximab vedotin (Adcetris®)、polatuzumab vedotin-piiq (Polivy®)和enfortumab vedotin-ejfv (Padcev®)的一部分。 β-葡萄糖醛酸酶可切割连接子代表了另一类酶可切割连接子。β-葡萄糖醛酸酶在溶酶体中大量存在，但也在一些肿瘤中过表达。它选择性地水解带有β-葡萄糖醛酸作为核心单元的连接子的糖苷键，从而触发自毁机制，确保未修饰的有效载荷的释放。有趣的是，由于β-葡萄糖醛酸作为不可分割的一部分，这些连接子更亲水，并允许部署通常会影响ADC的生物物理性质的异常疏水药物。 除了确保药物释放的切割位点外，还开发了额外的连接子组件以产生具有改进属性的ADC。特别是，追求了亲水连接子的概念，类似于β-葡萄糖醛酸连接子，作为可溶性增强剂掩盖有效载荷的疏水性。为此，将非带电聚合物（例如，基于多聚乙醛或聚乙二醇）或带负电的基团（例如，磺酸盐）整合到连接子结构中。有趣的是，这些修饰对ADC稳定性产生积极影响，允许更高的细胞毒素载荷，并导致具有改进的药代动力学和改进的治疗指数的ADC。 6.ADC生成的偶联技术 虽然ADC的三个部分——抗体、连接子和细胞毒性有效载荷——决定了最终偶联物的关键属性，但同样重要的参数是这些组件的组装方式。连接子和有效载荷是通过化学合成产生的，要么作为直接偶联到mAb的联合连接子-有效载荷结构，要么作为在ADC生成期间依次组装的单独组件。 在这两种情况下，都需要将小分子偶联到mAb上，而不影响其有利属性，这是一个主要的技术挑战。在ADC生成过程中需要控制的主要参数是每个抗体偶联的连接子-药物数量，称为药物-抗体比率（DAR），以及结构附着在抗体表面的位点（偶联位点）。这两个参数可以决定性地影响ADC的几个属性，包括其稳定性和药代动力学行为，最终也影响其毒性和效力概况。一方面，用于ADC的弹头大多是疏水性的，DAR的增加可以显著改变整体疏水性，并严重干扰最终偶联物的蛋白稳定性。另一方面，根据其效力，需要一定量的药物，以达到足够活跃的ADC。然而，不仅DAR，而且偶联位点和化学也严重影响这些参数。例如，一些研究表明，某些位点对具有挑战性的有效载荷表现出优越的耐受性，并通过在抗体表面提供有利的微环境和空间屏蔽，比其他位点产生更稳定的偶联物。因此，找到连接子、药物和mAb的有利组合以及合适的DAR、偶联策略和偶联位点对于开发高效安全的治疗药物至关重要。以下，我们将回顾ADC生成的最成熟的偶联策略，并描述一些目前正在开发中的技术。图11提供了这些技术的图形概述。 图11 用于 ADC 生成的偶联技术。传统方法依赖于非工程化抗体的表面赖氨酸或铰链半胱氨酸的修饰，但通常会产生相当异质的产品（除了使用耗尽半胱氨酸偶联的偶联物）。为了增加 ADC 的均质性，已经开发了几种位点特异性偶联策略。重组抗体工程允许引入半胱氨酸（“硫代抗体”）或作为连接子-有效载荷附着位点的非天然氨基酸。同样，遗传引入的肽标签可以通过不同的酶进行修饰，例如，Sortase A、甲酰甘氨酸生成酶或微生物转谷氨酰胺酶（MTG）。相比之下，最近的方法旨在对非工程化的天然单克隆抗体进行位点特异性偶联。通过预定位赖氨酸反应基团可以实现区域选择性赖氨酸偶联。此外，去除 mAb 糖蛋白允许 MTG 介导的偶联，而重塑的糖蛋白本身可以作为附着位点。 抗体是携带大量化学基团的大分子，这使得以目标化的方式偶联连接子-药物变得困难。根据预期的偶联化学，连接子-药物在化学合成期间就需要装备所需的化学基团和结构。传统上，偶联是使用经典的蛋白质化学方法进行的，这些方法针对赖氨酸或半胱氨酸残基的侧链——这些氨基酸自然存在于每一个mAb中。赖氨酸残基在mAb表面大量存在，至少有40个可供偶联。对于赖氨酸偶联，连接子通常配备有N-羟基琥珀酰亚胺酯，与赖氨酸的ε-氨基集团反应形成稳定的酰胺键。遵循这种方法生产的几种ADC（例如，gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®)）已经上市，证明了这是一种可行的策略，可以产生有效的分子。然而，由于分布在整个mAb表面的可接近赖氨酸残基数量众多，这种方法产生了含有不同DAR和附着位点的大量ADC物种的异质混合物。这些物种在几个方面（例如，效力、毒性、聚集和稳定性）具有不同的特征。此外，可接近的赖氨酸理论上甚至可以位于mAb的功能区域，偶联可能会影响关键属性，如对目标的亲和力或mAb特异性受体。 与针对赖氨酸残基不同，连接子-有效载荷通常偶联到mAb的半胱氨酸残基。半胱氨酸比赖氨酸少得多，通常不易于偶联，大大减少了理论上的偶联位点数量。实际上，IgG类型的mAbs包含32个保守的半胱氨酸，形成每个12个结构域内特征性二硫键以及连接mAb链的铰链区域的4个键。传统的半胱氨酸偶联，如基于马来酰亚胺的Michael加成，针对的是半胱氨酸侧链的硫醇基，当硫醇基被二硫键困住时不具反应性。因此，与mAb半胱氨酸的偶联需要二硫键还原，以产生与马来酰亚胺功能化连接子偶联的反应性硫醇。有趣的是，温和的还原条件允许仅还原IgGs的铰链间二硫键，从而将偶联位点数量限制为8个。尽管这个过程部分去除了共价链间连接，但最终的ADC通过非共价相互作用足够稳定。几种半胱氨酸偶联ADC的批准，如brentuximab vedotin (Adcetris®)，以及正在进行的几项临床研究证实了这一过程产生的ADC的完整性和效力。 尽管针对半胱氨酸的偶联位点数量减少导致比赖氨酸偶联更少的异质ADC，但产品通常仍然是由于预期的DAR在大多数情况下低于8，因此仍然是随机混合物。Trastuzumab deruxtecan (Enhertu®)是一个例外，它通过完全装载所有链间半胱氨酸来生产，产生DAR接近8的均匀偶联物。此外，由于天然半胱氨酸在mAb内固定位置，因此没有偶联位点的选择。然而，几项出版物表明，偶联位点可以对ADC稳定性和体内特性产生巨大影响，链间半胱氨酸不一定是最佳选择。因此，已经开发了几种下一代偶联技术，允许将连接子-药物精确地附着到选定位置，从而产生量身定制的均匀ADC。 一种经常应用的位点特异性技术也基于半胱氨酸，但这种情况下半胱氨酸是通过重组工程放置到mAb一级结构中的。表达后，这些mAbs（通常称为“硫醇mAb”）在预期位置将工程化半胱氨酸作为mAb序列的一部分。不幸的是，表达介质中的硫醇基化合物与这些工程化半胱氨酸形成二硫键，从而阻止了直接偶联。为了去除这些硫醇帽并启用偶联，mAbs必须被还原，这不仅去除了帽子，也打开了链间二硫键。因此，在随后的步骤中，链间二硫键被重新氧化，留下工程化半胱氨酸作为唯一的游离硫醇。然后，这种预处理的mAbs与例如马来酰亚胺连接子-有效载荷偶联，这些连接子-有效载荷专门与工程化半胱氨酸残基反应。 与链间和工程化半胱氨酸的偶联通常使用马来酰亚胺功能化连接子进行。然而，几项研究表明，在马来酰亚胺偶联期间形成的硫代琥珀酰亚胺键可能因经历逆Michael加成或其他硫醇交换反应而遭受不稳定性，导致连接子-有效载荷过早释放。这种不稳定性的程度强烈依赖于偶联位点的微环境。因此，大量工作投入到寻找工程化半胱氨酸的完美位置。几个确定的位置不仅允许生产均匀的ADC，而且在偶联物稳定性和药代动力学行为方面也带来了额外的有利属性。作为替代方案，已经描述了几种稳定马来酰亚胺衍生偶联物的策略以及允许形成更稳定产品的替代硫醇化学。 除了与工程化半胱氨酸的偶联外，还存在多种位点特异性ADC生成技术，其中几种依赖于形成键的酶。一个突出的例子是细菌酶微生物转谷氨酰胺酶（MTG），它自然催化谷氨酸和赖氨酸残基之间形成异肽键。尽管IgG抗体在其一级结构中有几个谷氨酸和赖氨酸残基，但通常没有这些被MTG修饰。然而，已经开发了允许高效和位点特异性MTG驱动的ADC生成的策略。最常用的策略依赖于两个原则之一：首先，可以通过重组技术将包含谷氨酸残基的某些肽标签（例如，LLQG）插入到抗体序列中。这些标签随后可以被MTG识别，MTG专门将连接子-有效载荷偶联到肽标签谷氨酸。其次，通过酶促裂解或基因工程从297位点（欧盟编号）去除保守的IgG N-糖蛋白（要么通过酶促裂解或基因工程），暴露相邻的谷氨酸Q295。一旦去除糖蛋白，这个残基就成为一个非常好的MTG底物。在这两种情况下，连接子必须配备有主要氨基集团，将其标记为酶的底物。这两种策略都已成功应用于生产具有良好体内特性的均匀ADC。 与去除保守的N-糖蛋白用于MTG偶联不同，它们本身可以作为连接子-药物附着位点。为此，现有的糖蛋白可以通过化学氧化进行修饰，以允许随后的连接子-药物偶联。或者，糖蛋白可以在重组mAb表达期间通过代谢工程或翻译后使用糖蛋白修饰酶进行重塑。这两种方法最终都产生带有糖蛋白衍生结构的mAbs，这些结构配备了反应性基团。这些基团作为特定连接子-药物偶联的锚点。通常选择的反应性基团来自不断增长的生物正交化学工具箱。ADC的常见选择是叠氮基团，它们可以与紧张的炔烃在无铜点击化学中轻松反应。因此，功能化有这种炔烃的连接子-药物与引入到mAb糖蛋白的叠氮锚点特异性反应。 其他基于引入非天然氨基酸（UAA）的位点特异性ADC生成技术。这些氨基酸不是自然编码的蛋白质氨基酸的一部分，因此不会出现在蛋白质中。然而，扩展遗传密码允许在重组mAb表达期间精确地将UAA并入选定位置。这通常是通过使用一组特定的工程tRNA和tRNA合成酶以及合适的正交表达系统来实现的。与前述重塑的糖蛋白类似，UAA可以配备生物正交反应性基团（例如，叠氮基团），作为连接子-药物的附着位点。 除了描述的技术外，还开发了多种位点特异性ADC生成策略。例如，几种方法依赖于修饰mAbs的酶，这些酶要么在翻译过程中要么在翻译后进行。与MTG类似，这些酶（例如，Sortase A、甲酰甘氨酸生成酶或磷酸泛酰转移酶）识别必须在表达前工程化到mAb序列中特定的氨基酸序列。就像其他描述的方法一样，这些过程可以生成在体外和体内都具有优异特性的ADC。然而，大多数位点特异性生成技术要求操纵mAb序列或糖蛋白。尽管这不一定是主要问题，但它确实存在某些风险（例如，免疫原性），并且需要工程化mAb序列，从而排除了已经批准的具有既定GMP生产过程的抗体。因此，一些研究小组正在寻找允许在不需要序列或糖蛋白修饰的情况下与天然mAb进行位点特异性偶联的方法。例如，一种技术利用亲和肽预先定位胺反应性基团到特定的赖氨酸残基，从而限制在这些位置的偶联。其他研究小组在半胱氨酸偶联期间重新桥接铰链半胱氨酸残基，或工程化MTG变体，允许在不需要肽标签或去除mAb糖蛋白的情况下偶联天然mAb。 总结，有大量不同的ADC生产偶联策略可用，并且正在开发更多技术。目前批准的ADC是通过经典的半胱氨酸或赖氨酸偶联方法生产的，这些方法大多产生异质产品。多个临床前研究表明，位点特异性偶联方法定制的ADC具有更优越的行为，并且其中一些ADC目前正在临床试验中进行研究。然而，将临床前数据转化为有益的治疗效应仍有待证明。偶联策略的选择取决于几个因素，包括连接子、药物和预期的DAR。因此，每种偶联技术都有其各自的优缺点，并且必须考虑多个因素来为每个ADC单独选择合适的偶联策略。 要点信息 ADC由单克隆抗体、连接子和细胞毒性有效载荷组成。 抗体特异性和药物效力的结合导致治疗指数的提高。 目标抗原需要对癌细胞具有特异性，并且在ADC结合后通常发生内化。 抗体介导对目标抗原的高特异性有利的药代动力学。 大多数ADC有效载荷是微管抑制剂或DNA损伤剂。 连接mAb与药物的连接子可以是不可切割的或可切割的。 可切割连接子在目标细胞内通过化学或酶促机制降解以释放药物。 目前批准的ADC是通过经典偶联方法生产的，这些方法大多产生异质产品。 几种最近开发的位点特异性偶联技术能够生成均匀的ADC。 下章预告：替代性结合框架：用于基础研究和治疗应用的多功能结合剂 往期内容： 第二章：抗体：发现及特性的历史 第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞 第四章：抗体展示系统 第五章：转基因动物用于产生人类抗体 第六章：抗体在治疗、诊断和科学中的应用 第七章：双特异性抗体 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。