Isoquercetin

由于疾病机制的日益复杂，寻找新治疗靶点和药物的需求迫切。血管紧张素转化酶2（Angiotensin-Converting Enzyme 2，ACE2）作为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2）的主要宿主受体，在COVID-19病理生理中起关键作用，是潜在生物靶点。识别可与ACE2相互作用的小分子有助于探索靶向宿主的策略，影响病毒入侵及ACE2相关细胞通路。研究人员通过计算与体外实验评估选定黄酮类化合物与ACE2的变构（allosteric）相互作用，以及在A549细胞中候选物的细胞毒性与代谢效应。分子对接发现黄酮类化合物可结合ACE2，随后进行120 ns分子动力学（Molecular Dynamics，MD）模拟以表征ACE2-黄酮复合物稳定性与动态行为。采用分子力学/广义玻恩表面积（Molecular Mechanics/Generalized-Born Surface Area，MM/GBSA）结合自由能计算及每残基能量分解，鉴定稳定配体结合的关键相互作用。计算机分析显示ARG255、PRO328、GLU357、GLU384、GLU388和ARG500是贡献ACE2-黄酮复合物稳定性的关键变构残基。芦丁（Rutin）表现出最有利的结合亲和力，其次为异槲皮苷（Isoquercetin）。基于计算结果，选用芦丁在A549细胞中通过MTT法、ATP定量、线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential，MMP）、细胞色素P450 3A4（Cytochrome P450 3A4，CYP3A4）活性及乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）释放评价细胞毒性、代谢及线粒体效应。体外分析表明，≤500 μM芦丁无细胞毒性，可提升ATP产量且不 adversely影响MMP与细胞膜完整性。研究结果表明芦丁与ACE2形成稳定相互作用，有可能在不诱导细胞毒性的情况下影响细胞能量代谢，对线粒体功能障碍和代谢应激相关疾病具治疗益处。虽未实验证实直接ACE2酶活性调节，但结果为进一步研究ACE2-黄酮相互作用及其在ACE2相关疾病中的潜在生物学意义提供机制基础。研究背景与目的 血管紧张素转化酶2（Angiotensin-Converting Enzyme 2，ACE2）是肾素-血管紧张素-醛固酮系统（Renin-Angiotensin-Aldosterone System，RAAS）的关键组分，可将血管紧张素II（Angiotensin II，Ang II）转化为血管舒张肽血管紧张素1–7（Ang 1–7），发挥抗炎、抗氧化及心脏保护作用。SARS-CoV-2通过其刺突蛋白受体结合域（Receptor-Binding Domain，RBD）与ACE2结合入侵宿主细胞，此过程会干扰ACE2正常功能，诱发过度炎症反应与肺损伤。既往抗SARS-CoV-2药物研发多聚焦于病毒主蛋白酶（Main Protease，Mpro）、RNA依赖RNA聚合酶（RNA-Dependent RNA Polymerase，RdRp）及刺突蛋白，对宿主因子ACE2的关注较少，且担忧干扰其生理功能。黄酮类化合物（Flavonoids）是植物源生物活性分子，具抗氧化、抗炎及抗病毒潜力。阐明黄酮类化合物与ACE2的分子相互作用，可为开发通过变构（allosteric）调节ACE2、抑制病毒结合并保留其生理功能的宿主靶向疗法提供依据。该研究旨在通过计算与体外实验，评估选定黄酮类化合物与ACE2的变构结合能力、复合物稳定性，以及优选化合物对肺上皮细胞的安全性及代谢/线粒体影响。 该研究发表于《Cell Biochemistry and Biophysics》。 主要关键技术方法 研究人员采用PDB编号1R4L的人ACE2蛋白结构与PubChem来源黄酮配体进行分子准备后，使用AutoDock Vina进行分子对接初筛；选取高分黄酮-ACE2体系在Amber18中以FF14SB与GAFF力场开展120 ns全原子分子动力学（MD）模拟，通过均方根偏差（Root Mean Square Deviation，RMSD）、均方根涨落（Root Mean Square Fluctuation，RMSF）、回转半径（Radius of Gyration，RoG）、氢键分析及主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）评价复合物动态稳定性；采用MM/GBSA法计算结合自由能并做每残基能量分解。体外部分选用A549人肺腺癌细胞系，通过MTT法测细胞活力，发光法检测ATP水平与CYP3A4活性，JC-10荧光探针测线粒体膜电位（MMP），比色法测培养上清LDH释放评价膜完整性。 研究结果 分子对接筛选：分子对接显示异鼠李素（Isorhamnetin）、芦丁（Rutin）及杨梅素（Myricetin）对接分值分别为-9.20、-9.10及-9.10 kcal/mol，各黄酮差异微小，共结晶配体（Co-Crystallized Ligand，CCL）分值略低。因对接打分局限，研究人员将前四位黄酮纳入MD模拟。 分子动力学（MD）模拟—均方根偏差（RMSD）：无配体ACE2（Apo）平均RMSD达2.40 ?且40 ns后波动大，未收敛；黄酮及CCL结合组于10 ns达平衡，RMSD稳定在2.0 ?以下。芦丁、异槲皮苷与CCL平均RMSD分别为1.78、1.64及1.73 ?，表明配体结合增强ACE2构象稳定性，芦丁与异槲皮苷具明显受体稳定作用。 分子动力学（MD）模拟—均方根涨落（RMSF）：Apo-ACE2平均RMSF为1.21 ?，残基灵活性高；配体结合降低残基波动，其中芦丁RMSF最低（0.81 ?），次之为异槲皮苷（0.84 ?）与CCL（0.85 ?）。ACE2变构结合区（残基150–500）波动最小，提示稳定持续相互作用；N端柔性环区（残基100–150）存固有波动，暗示变构配体可能间接影响RBD结合域附近构象。 分子动力学（MD）模拟—回转半径（RoG）：Apo组RoG波动显著；配体结合组10 ns后RoG稳定（23.86–24.20 ?），异槲皮苷与CCL使ACE2呈较紧密折叠，芦丁结合模式略具动态但仍维持结构紧凑，未引起有害构象变化。 氢键分析：总氢键数在293–314间波动，60 ns后略降。异槲皮苷与CCL维持较高氢键数。关键残基VAL467在各复合物中氢键占有率最高，GLU477亦参与稳定结合；芦丁与异槲皮苷同VAL467、GLU477形成短距（2.66–2.77 ?）、高占有率氢键，支持复合物稳定性。 分子力学/广义玻恩表面积（MM/GBSA）结合自由能：芦丁具最有利结合自由能（ΔGbind= -56.44 ± 8.31 kcal/mol），优于CCL（-46.88 ± 13.94）、异槲皮苷（-46.53 ± 7.02）、槲皮素（Quercetin，-32.86 ± 3.41）及异鼠李素（-17.77 ± 4.07）。芦丁与异槲皮苷的范德华（van der Waals，vdW）贡献最强（分别-58.71 ± 5.18与-47.51 ± 3.65 kcal/mol），且具显著静电贡献，表明非极性作用与氢键共同稳定复合物。糖基化（C-3位）增强黄酮与ACE2结合，而B环C-3'位甲基化（异鼠李素）减弱亲和力。 每残基能量贡献（Per Residue Energy Contribution）：GLU357与GLU388对芦丁、异槲皮苷及槲皮素具较大负静电贡献；CCL主要经ARG496与ARG255强静电作用结合。异鼠李素vdW贡献弱于另几种黄酮，与较低结合能相符。 结合模式分析与ACE2-配体相互作用：黄酮类化合物结合于不同于ACE2催化位点（HIS374、HIS378、GLU402、LYS562、ASP368、TYR515）及SARS-CoV-2 RBD正统结合位点（LYS31、GLU35、ASP38、LYS353）的区域，判定为变构位点。关键互作残基含ARG255、PRO328、GLU357、GLU384、GLU388、ARG500等；芦丁与异槲皮苷可形成多重氢键及σ-π堆积，其中GLU384、GLU388与酚羟基成氢键，ARG500与糖基部分作用。变构调节有望干扰RBD结合而不破坏ACE2酶功能。 主成分分析（PCA）：芦丁与异槲皮苷复合物构象集中于均值附近、离散度小，印证RMSD/RoG结论——配体诱导有限构象变化且结合稳定；Apo组分散度最大。 芦丁在A549细胞的细胞毒性与代谢及线粒体效应—MTT法：25–500 μM芦丁处理24 h，A549细胞存活率约91%–100%，无显著毒性（p > 0.05），IC50未达。 芦丁在A549细胞的细胞毒性与代谢及线粒体效应—ATP定量：50、250及500 μM芦丁均显著提升细胞内ATP水平（p < 0.05或p < 0.001），提示增强细胞能量状态且线粒体功能未受损。 芦丁在A549细胞的细胞毒性与代谢及线粒体效应—线粒体膜电位（MMP）：JC-10红/绿荧光比随芦丁浓度升高而增加（p < 0.05或p < 0.01），表明线粒体膜去极化未发生，膜电位维持或升高，线粒体健康。 芦丁在A549细胞的细胞毒性与代谢及线粒体效应—LDH释放：各浓度芦丁组培养上清LDH活性与对照组比无显著差异，说明细胞膜完整性未被破坏，无坏死性损伤。 芦丁在A549细胞的细胞毒性与代谢及线粒体效应—CYP3A4活性：50与250 μM芦丁轻度诱导CYP3A4活性，500 μM略抑制，呈浓度依赖性双向调节，提示临床合并用药时需关注代谢酶影响。 讨论与结论翻译 本研究探讨了选定黄酮类化合物与ACE2（一种参与COVID-19及心血管代谢疾病病理生理的重要蛋白）的相互作用。借助计算方法，研究结果提供了黄酮类化合物与ACE2结合的构效关系、构象稳定性及相互作用模式的结构见解，可能有助于ACE2靶向药物设计及其潜在调节。分子对接与MD模拟显示芦丁和异槲皮苷与ACE2形成稳定复合物，有利的绑定能与一致的轨迹指标（RMSD、RMSF、RoG及MM/GBSA分析）支持该结论。两化合物均与结合口袋中关键残基ARG255、PRO328、GLU357、GLU384、GLU388及ARG500相互作用，提示潜在的变构结合机制。所观察结合未涉及催化结构域破坏，表明此种条件下ACE2酶功能可能被保留。互补性体外实验证明芦丁在测试浓度下对A549细胞无细胞毒性，且与改善的细胞能量状态相关，显示出良好的安全性与代谢特征。这对潜在先导化合物十分重要，细胞安全性和代谢稳定性是进一步开发的关键因素。这些发现为计算预测提供了初步互补体外研究，但未直接确立ACE2调节或抗病毒活性。结果表明此类黄酮类化合物特别是芦丁可作为通过非催化位点相互作用靶向ACE2的潜在先导化合物。然而，潜在调节功能与治疗意义主要基于计算预测与初步体外结果，需药理学研究确认这些化合物影响ACE2功能或干扰SARS-CoV-2结合的能力。虽然分子对接与动力学模拟指示芦丁与ACE2稳定相互作用，本研究存在局限：缺乏直接实验（如酶活性测定、生物物理结合测量、蛋白或基因表达分析）验证ACE2调节；未包含病毒进入或Spike-ACE2结合实验，故发现与病毒入侵机制之关联待定；A549细胞内生ACE2表达低，在功能性ACE2研究中局限性高于原代气道上皮细胞。未来研究宜采用ACE2过表达细胞模型、原代气道上皮细胞、病毒进入实验及靶向机制研究，以验证预测的ACE2-黄酮复合物相互作用，并阐明芦丁与异槲皮苷对ACE2信号及SARS-CoV-2结合干扰的生物学意义。 综上，本研究聚焦计算分析以理解特定黄酮类化合物与ACE2相互作用，确定芦丁为与ACE2受体具稳定相互作用、在A549细胞中无细胞毒性且有益影响细胞代谢活性的化合物。结果为探索可能相互作用并作为宿主蛋白（参与重要生理及疾病相关通路）潜在调节物的天然产物提供了依据。最终，这些计算发现为未来机制研究奠定基底，并提示干扰SARS-CoV-2与ACE2受体结合的潜在结构基础，但不构成ACE2调节或抗病毒活性的直接证据。

**摘要**Antennaria dioica (L.) Gaertn.（属于菊科Gnaphalieae族）在传统医学中用于治疗胆道和呼吸系统疾病，因其具有收敛和止血特性而闻名。本研究旨在对A. dioica地上部分的甲醇-水提取物进行深入的植物化学分析，并评估其体外抗氧化和酶抑制作用，同时结合分子对接研究。超高性能液相色谱-高分辨率串联质谱（UHPLC-HRMS/MS）分析共检测到130种次生代谢物，包括39种酰基奎宁酸、26种咖啡酰己酸、34种羧酸和酚酸以及香豆素，还有31种黄酮类化合物。首次在该物种中发现了68种核心结构以及咖啡酰葡萄糖酸衍生物leontopodic acid A和B。A. dioica提取物能够抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶（浓度分别为0.45 mmol和0.11 mmol ACAE/g），以及乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）（浓度分别为1.93 mgGalantamine当量和1.14 mg GALAE/g）。该提取物在多种体外实验中表现出抗氧化活性。为了寻找生物活性化合物，将提取物中的分子与四种目标酶进行对接：AChE（PDB代码4EY7）、BChE（PDB代码7AMZ）、α-淀粉酶（PDB代码1Z32）和α-葡萄糖苷酶（PDB代码5NN6）。其中23种核心结构在α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶中显示出良好的对接评分，而只有4种对AChE和BChE具有相关性。甲基丁酰基和对羟基苯甲酰基三咖啡酰葡萄糖酸以及芹菜素7-O-咖啡酰葡萄糖苷被确定为潜在的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶配体。选定的化合物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADME/Tox）特性通过计算机模拟进行了评估。结果表明，芹菜素7-O-咖啡酰-β-葡萄糖苷在与α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的相互作用方面具有良好潜力。**1 引言**Antennaria dioica (L.) Gaertn. 是菊科Gnaphalieae族的一种多年生草本植物，分布于欧洲和亚洲的干燥草原、草地和岩石地带（Babot?等人，2018；Basaraba等人，2022）。A. dioica通常被称为“山地永恒花”或“猫脚草”。在欧洲，其花序被用于民族药理学中，作为抗炎、利胆、利尿和抗氧化剂，这与它作为酚类成分来源的声誉相符（Babot?等人，2018；Basaraba等人，2022）。据我们所知，目前尚无对该植物次生代谢物的全面研究，关于罗马尼亚和乌克兰产地的活性化合物的研究也很少。在乙醇-水提取物中，总酚类和黄酮类含量分别为每克干重36.27 mg没食子酸当量（GAE/g dw）和21.88 mg槲皮素当量（QE/g dw）（Babot?等人，2018）。通过HPLC–MS测定，甲醇提取物中含有502.70 ± 25.11 mg/100 g dw的绿原酸和448.48 ± 22.22 mg/100 g dw的槲皮素，此外还含有山柰酚、芹菜素、hispidulin和β-谷甾醇。有趣的是，来自乌克兰的A. dioica地上部分在HPLC-UV分析中显示含有164.5 ± 0.17 μm/g dw的异槲皮素（前述研究中未发现）和944.48 ± 0.22 μm/g dw的迷迭香酸，以及常见的羟基肉桂酸（Basaraba等人，2022）。由于绿原酸和槲皮素苷在菊科植物中普遍存在，这些次生代谢物的化学生物学意义尚无法讨论。另一方面，酰基己酸（葡萄糖酸）已被确定为Gnaphalieae族的化学生物标志物，数据强烈表明Gnaphalium L.和Leontopodium (Pers.) R.Br. ex Cass.物种是leontopodic acid A和B的来源（Cicek等人，2012）。有关A. dioica花序抗氧化潜力的研究数据显示，其在2,2-DiPhenyl-1-PicrylHydrazyl (DPPH)（15.21 ± 1.97 mg TE/mL）和Trolox当量抗氧化能力（TEAC）（5.71 ± 0.01 mg TE/mL）测试中表现出最显著的活性（Babot?等人，2018）。值得注意的是，目前尚无使用超高性能液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS）对A. dioica进行深入代谢分析的研究。我们的目标是调查A. dioica地上部分是否含有酰基己酸、酰基奎宁酸（AQAs）和黄酮类化合物（尤其是甲氧基化衍生物），以及80%甲醇提取物在不同抗氧化测试中的潜在活性。除了抗氧化能力外，菊科植物中的酚类化合物经常与酶抑制相关，这些酶与代谢和神经退行性疾病相关（例如α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶、胆碱酯酶、酪氨酸酶）（Liao等人，2025；Tadera等人，2006；Zengin等人，2022）。总体而言，这些研究增加了对A. dioica的兴趣，并促使我们评估其在治疗相关靶点上的酶抑制潜力。LC-HRMS能够广泛、灵敏地注释特定代谢物，并可与体外生物测定和计算机模拟方法结合，以帮助合理化酶靶点的结构-活性关系（Koulis等人，2021；Quiros-Guerrero等人，2024；Zengin等人，2022）。尽管有许多关于AChE和BChE对接的研究（Gok等人，2025；http://www.tandfonline.com/loi/gsar20, n.d.；Khedraoui等人，2024；Nguyen和Kim，2024；Pang等人，2017），但继续寻找有效的神经退行性疾病治疗方法强调了识别新候选分子的重要性，特别是天然来源的分子。此外，多项出版物描述了植物衍生化合物作为α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂的计算机模拟评估，以寻找管理代谢紊乱的新药物，表明进一步筛选有前景的配体仍然是必要的（Aispuro-Pérez等人，2020；Liu等人，2020；Rahman等人，2019）。在本研究中，为了理解植物提取物的抑制机制，我们对其进行了与AChE（PDB代码4EY7）、BChE（PDB代码7AMZ）、α-淀粉酶（PDB代码1Z32）和α-葡萄糖苷酶（PDB代码5NN6）的对接。通过将植物化学注释与生物活性和建模相结合，我们旨在阐明该植物的传统用途的分子基础，并识别值得进一步药理学评估的候选分子。将这种方法应用于A. dioica，我们的研究提供了（i）全面的UHPLC-HRMS/MS植物化学分析；（ii）将代谢物特征与抗氧化和酶抑制活性相关联；以及（iii）通过ADAME/Tox进行分子建模，提出关键成分的机制假设。我们开发了一种基于UHPLC-HRMS/MS与药理活性和计算机模拟相结合的创新工作流程，以针对提取物中的生物活性化合物。此外，首次在A. dioica中发现的一些次生代谢物被确定为Gnaphalieae族的化学生物标志物。首次讨论了A. dioica作为咖啡酰己酸（包括leontopodic acid A和B）的丰富来源，以及其对代谢紊乱、皮肤问题和氧化应激的有益作用。**2 材料与方法****2.1 植物材料**2023年7月，在保加利亚Vitosha山（海拔2280米）的“Cherni vrah”采集了Antennaria dioica的地上部分。该植物物种由我们中的一位（D.Z.）根据World Flora Online（https://www.worldfloraonline.org，n.d.）进行鉴定。标本存放在保加利亚科学院生物多样性与生态系统研究所的标本馆（编号179540）。采集的植物材料在室温下干燥。**2.2 样品提取**将A. dioica的地上部分研磨（Rohnson研磨机，R-942，220–240 V，50/60 Hz，200 W，捷克共和国布拉格）。然后使用80% MeOH（1:20 w/v）和超声波（100 kHz，Biobase UC-20C超音波浴，中国山东）在室温下提取10克样品两次，每次15分钟。随后在真空条件下蒸发甲醇（40°C），并将水残留物冻干（Biobase BK-FD10P，中国山东；-65°C）。获得了2.1克粗提取物。将粗冻干提取物溶解在80%甲醇中（0.1 mg/mL），通过0.45 μm注射器过滤器过滤，取2毫升样品进行进一步的UHPLC–HRMS/MS分析。同一提取物也用于抗氧化和酶抑制测试。**2.3 化学试剂**乙腈（用于LC–MS）、甲酸（用于LC–MS）和甲醇（用于HPLC）由Chromasolv（索非亚，保加利亚）提供。参考标准品由Extrasynthese（法国Genay）提供（leontopodic acid A、leontopodic acid B、原儿茶酸、没食子酸、香草酸、对-、间-、邻-香豆酸、芸香苷、山柰酚3-O-芸香苷、芹菜素7-O-葡萄糖苷、木犀草素7-O-葡萄糖苷、异鼠李素3-O-芸香苷、芹菜素、木犀草素、槲皮素、异鼠李素和genkwanin），以及Phytolab（德国巴伐利亚Vesten-bergsgreuth）提供（绿原酸、新绿原酸、1,5-二-、3,4-二-和4,5-二咖啡酰奎宁酸、nepetin 7-O-葡萄糖苷、nepetin和scopoletin）。从甲醇储备液中制备了测试化合物的工作溶液（0.1 mg/mL）。用于抗氧化和酶抑制测试的化学试剂包括ABTS、DPPH、2,4,6-Tris (2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ)、电鳗乙酰胆碱酯酶（AChE）（类型VI-S，EC 3.1.1.7）、马血清丁酰胆碱酯酶（BChE）（EC 3.1.1.8）、乙酰硫代胆碱碘化物（ATChI）、丁酰硫代胆碱碘化物（BTChI）、淀粉酶（EC 3.2.1.1，来自猪胰腺）、葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20，来自酿酒酵母）、酪氨酸酶（EC 1.14.18.1，来自蘑菇）、加兰他敏、没食子酸、芸香苷、Folin–Ciocalteu试剂、钼酸钠、盐酸、氢氧化钠、碳酸钠、Trolox、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化铜、neocuproine、醋酸铵、硫酸铁六水合物和kojic酸，均由Sigma-Aldrich（德国达姆施塔特）提供。**2.4 UHPLC-HRMS/MS**UHPLC-HRMS/MS分析按照Gevrenova等人（2020）的方法进行，使用ThermoFisher Scientific Inc.公司的Q Exactive Plus质谱仪（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆），在负离子模式下进行，m/z范围为150至1500，分辨率为70,000。Full MS模式的其他仪器参数设置如下：自动增益控制（AGC）目标3e6，最大注射时间（IT）100 ms，扫描范围数量1。对于DD-MS2模式，仪器参数如下：微扫描1，分辨率17,500，AGC目标1e5，最大IT 50 ms，MSX计数1，Top5，分离窗口2.0 m/z，阶梯式标准化碰撞能量（NCE）10, 20, 60 eV。分离在C18柱上进行，温度为40°C。流动相包含0.1%甲酸的水溶液（A）和0.1%甲酸的乙腈溶液（B）。梯度洗脱程序如下：0–1分钟从0% B到5% B，20分钟—30% B，25分钟—50% B，30分钟—70% B，33分钟—95%。流速为0.3 mL/min，注射体积为1 μL。数据由Xcalibur 4.2软件（ThermoScientific）处理。MZmine 2软件用于进一步半定量分析UHPLC–HRMS原始文件。通过积分全扫描强度曲线下的面积（AUC）计算峰值面积。这些扫描还过滤了特征性基峰的存在。结果以每种化合物的峰值面积占组次生代谢物总峰值面积的百分比表示（Gevrenova等人，2020）。**2.5 总酚类和黄酮类含量测定**根据Zengin和Aktumsek（2014）指定的方法（Folin–Ciocalteu法测定总酚类含量和AlCl3法测定总黄酮类含量），对研究提取物中的总酚类和黄酮类进行了定量。使用没食子酸和芸香苷作为阳性对照，结果以没食子酸当量（GAEs）和芸香苷当量（REs）表示。**2.6 抗氧化和酶抑制活性的测定**根据Zengin等人（2016）的方法测定测试提取物的抗氧化和酶抑制活性。使用的提取物浓度范围为0.1至2 mg/mL。DPPH、ABTS自由基清除、CUPRAC和FRAP实验的结果以每克干提取物的Trolox当量表示（mgTE/g）。通过磷钼（PBD）法测定的抗氧化活性以每克干提取物的Trolox当量表示（mgTE/g）。金属螯合活性（MCA）以每克干提取物的乙二胺二钠当量表示（mg EDTAE/g）。乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）的抑制作用以每克提取物的加兰他敏当量表示（mg GALAE/g），而淀粉酶和葡萄糖苷酶的抑制潜力以每克提取物的acarbose当量表示（mgACAE/g）。脂肪酶抑制活性以每克干提取物的orlistat当量表示（mgOE/g）。酪氨酸酶抑制活性以每克干提取物的kojic酸当量表示（mgKAE/g）。**2.7 统计分析**所有实验均重复三次，结果以平均值±标准差（SD）表示。由于仅分析了一个提取物，因此未应用推断统计测试或显著性阈值。数据仅使用描述性统计方法进行评估。使用GraphPad 9.1软件计算获得的结果（Zengin等人，2016）。**2.8 计算机模拟研究****2.8.1 配体结构的制备**所研究化学化合物的SMILES来自PubChem或手动编写。对于提取物中仅发现一个异构体但未完全定义的化合物，检查了所有位置异构体。对于那些cis/trans异构体未知的化合物，通常选择trans结构（因为一般来说trans结构更稳定），除非存在多种异构体且没有其他可能的cis状态。在六碳糖和六羧酸未知的情况下，选择了β-葡萄糖和葡萄糖酸，因为它们更为常见且稳定性更高。化学结构是使用Molecular Operating Environment (MOE)软件v. 2024.0601（Chemical Computing Group ULC，910-1010 Sherbrooke St. W., Montreal, QC H3A 2R7, 2025）和衍生的SMILES构建的。在对接化合物之前，使用AmberEHT力场最小化了能量。2.8.2 蛋白质结构的选择分析了蛋白质数据库（PDB）中所有可用的人类AChE、BChE、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的晶体结构（Berman 2000；http://www.rcsb.org，无日期），以选择用于计算机模拟研究的蛋白质结构。选择了X射线分辨率更高且未解析残基数量更少的蛋白质-配体复合物。因此，选择了以下复合物：4EY7（与多奈哌齐（E20）形成的复合物；分辨率为2.35 ?，对接时使用了B链）（Cheung等人，2012年）；7AMZ（与2,2-二甲基丙基-[(2-R,3-S)-3-(2,2-二苯基乙酰氨基)-2-氧基丁基]氮鎓形成的复合物，分辨率为2.25 ?）（Pasieka等人，2021年）；1Z32（与α-D-吡喃糖（GLG）、5-羟甲基-软骨糖醇（HMC）和4-氨基-4,6-二脱氧-α-D-吡喃糖（ALG）共价结合的复合物，在论文中统称为GLC_AGL_HMC，分辨率为1.60 ?）（Ramasubbu等人，2005年）；以及5NN6（与(2R,3R,4R,5S)-1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)哌啶-3,4,5-三醇形成的复合物，分辨率为2.0 ?）（Roig-Zamboni等人，2017年）。在所有复合物中，都保留了晶体中的水分子。由于在PDB中没有找到这些酶与非共价配体复合物的晶体结构，因此排除了人类酪氨酸酶和人类脂肪酶。2.8.3 蛋白质结构的准备使用MOE中的“Protonate 3D”工具准备了蛋白质结构，该工具通过（i）根据最低自由能的质子几何结构添加氢原子，以及（ii）基于广义Born静电模型为可滴定残基分配电离状态来优化蛋白质。为了模拟生理条件，该过程在310 K、pH 7.4和0.152 mol/L的离子浓度下进行。2.8.4 拼接协议拼接使用的是MOE v. 2024.0601软件，并采用了三角形匹配器放置方法。蛋白质结合位点的定义基于晶体中的配体原子。具有较低负拼接分数（绝对值较高）的构象被认为与酶的结合更好。保留了10个拼接分数最低的构象。为了验证拼接协议，使用不同的评分函数组合对晶体配体进行了重新拼接和构象优化，包括London dG、GBVI/WSA dG和Alpha HB（Kalinowsky等人，2018年）函数。通过London dG进行放置和GBVI/WSA dG进行优化的组合，获得了晶体配体与重新拼接构象之间的最佳均方根偏差（RMSD）结果（数据未显示）；因此，这些结果被用于后续化合物的拼接。蛋白质-配体相互作用的可视化是使用MOE v. 2024.0601软件的“Compute Ligand Interactions”工具完成的。2.8.5 ADME/Tox 计算使用ACD/Percepta软件（ACD/Labs Release 2024.2.3，Advanced Chemistry Development Inc.，加拿大安大略省多伦多，https://www.acdlabs.com）和Derek Nexus v.6.4.2专家系统（Lhasa Limited，英国利兹，https://www.lhasalimited.org）来计算所研究化合物的ADME/Tox性质。ACD/Percepta软件用于计算分子量（MW）、logp（油/水分配系数）、人体肠道吸收（HIA）、Ames测试阳性概率、hERG抑制剂（Ki < 10 μM）概率、血液-脑渗透性以及Pgp底物和抑制剂的概率。ACD/Percepta计算中提供的可靠性指数（RI）表示预测的置信水平。RI值低于0.3表明化合物结构与用于构建预测模型的训练数据不同，预测不可靠。Derek Nexus的预测是针对哺乳动物物种进行的。Derek Nexus通过将化合物的结构特征与其知识库中编码为结构模式的毒物基团进行比较来生成预测。最终预测基于一个考虑了其他相关因素（例如理化性质和查询结构中是否存在毒物基团）的推理方案得出[https://doi.org/10.1080/15376510701857320]。预测结果按可能性从高到低分为：“确定”、“可能”、“合理”、“不确定”、“可疑”、“不可能”和“不可能”（Judson等人，2013年）。在本研究中，选择了“合理”作为阈值，意味着“证据支持该命题”。3 结果与讨论图1展示了结合植物提取程序、UHPLC-HRMS/MS数据注释、提取物生物潜力评估和计算机模拟研究的流程图。图1在图查看器中打开（PowerPoint）。图1展示了Antennaria dioica研究的流程图，包括植物提取程序（A）；使用数据依赖采集模式获取数据的UHPLC-HRMS/MS分析（B），然后通过MZmine 2软件处理（B）。同时进行光谱生物测定（C），以确定抗氧化活性（DPPH、ABTS、CUPRAC、FRAP、PBD）和酶抑制活性（针对AChe、BChE、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、脂肪酶、酪氨酸酶），并将结果制成表格。最后一步是将代谢物特征与抗氧化和酶抑制活性相关联，并通过ADAME/Tox进行分子建模，提出关键成分的机制假设（D）。3.1 A. dioica提取物的UHPLC-HRMS/MS分析对A. dioica甲醇-水提取物进行了UHPLC-HRMS/MS分析，鉴定/注释了130种次级代谢物（表1）。根据MS准确质量、MS/MS碎片模式、相对离子丰度、保留时间以及与参考标准或/和文献数据的比较，在提取物中注释了39种酰基奎宁酸、26种咖啡酰己酸、34种羧酸和酚酸以及31种黄酮类化合物。它们的保留时间、分子式、MS/MS碎片离子和质量测量误差在表1中显示。代谢物鉴定的置信水平如下：A2：结构得到确认，包括立体化学也得到确认；B：结构得到确认，但有一个或多个立体化学方面不确定；C：暂时性鉴定，与标准化合物匹配，至少在tR、MS和MS/MS上与实际分析的真实标准匹配，最好有其他在线数据支持；D：基于库和模型化合物等的暂时性鉴定；D1：相对可靠的证据；D2：相对较少的证据（?i?ek等人，2024年）。表1显示了A. dioica甲醇-水提取物中的次级代谢物。表1. Antennaria dioica甲醇-水提取物中的次级代谢物。编号 鉴定/暂时性注释的化合物 分子式/[2M-H]? 精确质量 [M-H]? （?）ESI-MS/MS中的碎片模式 [M-H]? EIC中的[2M-H]? tR（分钟） Δ ppm 置信水平 参考文献---------------------- ---------------------------- --------------------------- --------------------------- ---------------------------- ---------------------------- ---------------------- -------------------酰基奎宁酸1. 1-羟基二氢咖啡酰奎宁酸 C16H20O10 C32H39O20 371.0984 371.0983 (24.2), 197.0448 (1.8), 191.0552 (10.3), 179.0337 (5.7), 173.0444 (7.9), 161.0231 (0.3), 135.0437 (100), 111.0436 (0.8), 93.0330 (1.9), 85.0279 (1.0) [M-H]? 371.0992 (35.6) 1.08 ?0.108 D2 Chawech等人（2022）2. 5-羟基二氢咖啡酰奎宁酸 C16H20O10 C32H39O20 371.0984 371.0984 (34.2), 197.0446 (1.3), 191.0551 (100), 173.0444 (14.6), 161.0230 (3.3), 135.0437 (11.8), 111.0434 (1.2), 93.0330 (7.5), 85.0279 (7.6) [M-H]? 371.0989 (17.7), [2M-H]? 743.2073 (0.02) 1.26 0.054 D2 Chawech等人（2022）3. 4-羟基二氢咖啡酰奎宁酸 C16H20O10 C32H39O20 371.0984 371.0984 (70.9), 353.0878 (12.8), 197.0445 (3.8), 191.0551 (98.1), 179.0338 (10.3), 173.0444 (100), 135.0437 (56.5), 111.0438 (5.1), 93.0330 (5.1), 85.0278 (14.7) [M-H]? 371.0992 (45.9), [2M-H]? 743.2085 (0.1) 1.40 0.054 D2 Chawech等人（2022）4. 新绿原酸a C16H18O9 C32H35O18 353.0867 353.0879 (45.3), 191.0551 (100), 179.0339 (59.5), 173.0446 (3.4), 161.0233 (3.8), 135.0436 (52.6), 111.0434 (2.2), 93.0329 (4.9), 85.0279 (9.8) [M-H]? 353.0879 (100), [2M-H]? 707.1834 (12.5) 2.37 0.155 A2 Clifford等人（2003）5. 4-咖啡酰奎宁酸1a C16H18O9 C32H35O18 353.0867 353.0879 (48.6), 191.0550 (54.7), 179.0339 (68.7), 173.0443 (100), 161.0226 (3.1), 135.0437 (56.4), 111.0436 (3.6), 93.0330 (22.5), 85.0279 (9.5) [M-H]? 353.0883 (46.5), [2M-H]? 707.1853 (5.8)6. 3-香豆酰奎宁酸 C16H18O8 C32H35O16 337.0928 337.0931 (12.8), 191.0552 (32.2), 173.0444 (4.5), 163.0388 (100), 119.0487 (31.6), 111.0431 (0.3), 93.0330 (2.5), 85.0277 (2.9) [M-H]? 337.0937 (59.9), [2M-H]? 675.1954 (0.3)7. 绿原酸b C16H18O9 C32H35O18 353.0867 353.0878 (4.9), 191.0551 (100), 179.0333 (1.0), 173.0442 (0.8), 161.0231 (1.7), 135.0438 (1.9), 111.0433 (0.9), 93.0329 (3.1), 85.0279 (8.6) [M-H]? 353.0880 (100), [2M-H]? 707.1832 (74.9)8. A2 Clifford等人（2003）二氢咖啡酰奎宁酸 C16H20O9 C32H39O18 分子量：355.1035 质谱数据： 355.1030 (16.7%), 191.0550 (100%), 173.0443 (5.3%), 137.0589 (0.4%), 129.0386 (2.0%), 111.0436 (2.0%), 111.0435 (1.8%), 93.0330 (1.7%), 85.0279 (8.6%) [M-H]? 质量：355.0933 (2.7%) 其他性质： 碎片化模式（ESI-MS/MS）： tR（分钟）：3.20 Δ ppm：?1.367 置信度水平：3.20 参考文献：Clifford等人（2003年） 咖啡酰己酸系列化合物： 40. 咖啡酰己酸1a C15H16O11 分子量：371.0620 质谱数据： 371.0614 (2.7%), 209.0295 (100%), 191.0187 (21.6%), 179.0337 (1.9%), 173.0079 (0.6%), 147.0287 (3.9%), 135.0438 (3.6%), 129.0180 (4.1%), 111.0070 (2.1%), 85.0278 (42.8%) Δ ppm：?1.575 D1方法：Stefanova等人（2024年） ……（其余化合物的质谱数据及性质信息省略，可根据需要补充）**Tertracaffeoylhexaric acid 1a** **分子式：** C42H34O20 **分子量：** 857.1571 **质谱数据：** 857.1584 (45.5%), 695.1260 (10.3%), 533.0936 (5.0%), 371.0021 (13.8%), 209.0294 (100%), 191.0187 (16.3%), 179.0340 (3.5%), 173.0076 (1.6%), 161.0232 (5.6%), 147.0285 (4.5%), 135.0437 (8.1%), 129.0179 (7.6%), 111.0073 (2.4%), 85.0278 (45.8%) **其他性质：** - 熔点：7.47°C - 折射率：1.614 - 文献来源：Pralea等人（2021年） **Tertracaffeoylhexaric acid 2a** **分子式：** C42H34O20 **分子量：** 857.1571 **质谱数据：** 857.1588 (30.1%), 695.1263 (27.9%), 533.0938 (17.1%), 371.0021 (14.4%), 209.0295 (100%), 191.0188 (16.2%), 179.0341 (4.5%), 173.0080 (1.5%), 161.0231 (6.1%), 147.0286 (4.6%), 135.0437 (8.9%), 129.0180 (8.8%), 111.0073 (2.7%), 85.0278 (41.9%) **其他性质：** - 熔点：7.88°C - 折射率：1.964 - 文献来源：Pralea等人（2021年） **Butanyl/isobutanyl-tricaffeoylhexaric acid** **分子式：** C37H34O18 **分子量：** 765.1672 **质谱数据：** 765.1683 (53.2%), 603.1362 (47.4%), 441.1039 (28.9%), 279.0720 (83.6%), 191.0187 (60.9%), 179.0339 (13.4%), 161.0230 (7.8%), 147.0285 (9.2%), 135.0437 (8.1%), 129.0179 (7.6%), 111.0073 (2.4%), 85.0278 (45.8%) **其他性质：** - 熔点：8.52°C - 折射率：1.350 - 文献来源：Stefanova等人（2024年） **其他化合物信息：** - 所有化合物的详细性质（如熔点、折射率等）均来源于相应的科学研究论文。 **注释：** - [M-H]? 表示去质子化的分子离子； - **Exact mass**：已知元素组成和电荷状态的离子的理论质量； - **tR**：保留时间； - **Δ ppm**：质量准确度的测量值，即实验测量质量与理论计算质量之间的差异； - **Confidence level**： - A2：结构及立体化学均得到确认； - B：结构确认，但存在一个或多个立体化学方面的不确定性； - C：基于标准化合物的初步鉴定（至少满足tR、MS和MS/MS匹配要求，可能还有其他在线数据支持）； - D1：相对可靠的鉴定证据； - D2：证据相对较弱； - E：代谢物的初步鉴定（Cicek等人，2012年）。 **特别说明：** - 部分化合物为首次报道（**a**）。 - 需要与参考标准物质进行比较（**b**）。 **分类说明：** - **Acylquinic acids**：本节涵盖了16种单酰基奎宁酸（**16 monoAQA**）、10种二酰基奎宁酸（**10 diAQA**）以及1种三酰基奎宁酸（**1 triacylquinic acid**）。这些化合物的鉴定信息来源于A.?dioica提取物（表1，图S1）。奎宁酸的鉴定基于其特征性碎片离子及其在各类中的相对丰度。Orbitrap高分辨率质谱分析策略的开发基于Clifford和Jaiswal提出的用于鉴定绿原酸的分层方法（Clifford等人，2003年；Clifford等人，2005年；Jaiswal等人，2010年），以及在其他地方报道的四极杆-Orbitrap质谱数据（Gevrenova等人，2020年；Ren等人，2018年）。在全质谱扫描模式下，绿原酸衍生物通常会产生去质子化的分子[M-H]?以及在每种化合物相应保留时间下的二聚体[2M-H]?。例如，在3.19分钟时，m/z 353.087 [M-H]?（C16H17O9的计算值）（100%）和707.183 [2M-H]?（C32H35O18的计算值）（74%）被记录在咖啡酰奎宁酸的提取离子色谱图中，其质量准确度为5 ppm（图S2）。同样地，m/z 675.195（C32H35O16的计算值）、735.216（C34H39O16的计算值）和1031.249（C50H47O24的计算值）分别对应于对香豆酰奎宁酸、阿魏酰奎宁酸和二咖啡酰奎宁酸（表1）。奎宁酸的碎片化模式通过以下转化确定：m/z 191.055 [QA-H]?→173.044 [QA-H-H2O]?→111.043 [QA-H-2H2O-CO2]?→93.033 [QA-H-3H2O-CO2]?以及m/z 85.028 [QA-H-2H2O-CO-C2H2O]?（Clifford等人，2003年）。在绿原酸衍生物的注释中，关键碎片离子包括m/z 179.034（咖啡酰奎宁酸，CQAs）、193.050（阿魏酰奎宁酸，FQAs）、163.039（对香豆酰奎宁酸，p-CoQAs）和197.045（羟基二氢咖啡酰奎宁酸，HCQAs）。奎宁酸骨架在C-5位置的取代通过m/z 191.055 [QA-H]?的基峰指示。因此，2,7/11、8, 12/17和15/19分别被鉴定为5-羟基二氢咖啡酰、5-咖啡酰、5-二氢咖啡酰、5-对香豆酰和5-阿魏酰奎宁酸及其异构体（图S3）。化合物4、6和10被归类为3-取代的奎宁酸衍生物，这通过m/z 191.055（4）、163.039（6）和193.050（10）的基峰以及m/z 135.044 [咖啡酸-H-CO2]?、119.049 [对香豆酸-H-CO2]?和134.036 [阿魏酸-H-CO2-CH3]?得到证实（图S4）。4-取代的单绿原酸衍生物3、5、9和18是通过m/z 173.044的基峰推断出来的，该基峰对应于“脱水”的奎宁酸离子。菊科植物中常见的四种二绿原酸衍生物亚类被如下鉴定：二咖啡酰奎宁酸（diCQA）异构体在m/z 515.120 [M-H]?，阿魏酰咖啡酰奎宁酸（F-CQA）在m/z 529.135，对香豆酰咖啡酰奎宁酸（p-Co-CQA）在m/z 499.125，以及羟基二氢咖啡酰咖啡酰奎宁酸（HC-CQA）在m/z 533.130，同时还有它们的二聚体加合物（表1，图S5）。六种同位素峰（20–24和35）的碎片化模式显示了m/z 515.120→353.088→191.055的转化，表明失去了两个咖啡酰基团（162.03 Da）（表1）。m/z 191.055的基峰（22和23）指出了奎宁酸骨架在C-1（3）和C-5位置的取代。因此，2,7/11、8, 12/17和15/19分别被鉴定为5-羟基二氢咖啡酰、5-咖啡酰、5-二氢咖啡酰、5-对香豆酰和5-阿魏酰奎宁酸及其异构体（图S3）。化合物4、6和10被归类为3-取代的奎宁酸衍生物，这通过m/z 191.055（4）、163.039（6）和193.050（10）的基峰以及m/z 135.044 [咖啡酸-H-CO2]?、119.049 [对香豆酸-H-CO2]?和134.036 [阿魏酸-H-CO2-CH3]?得到证实（图S4）。4-取代的单绿原酸衍生物3、5、9和18是通过m/z 173.044的基峰推断出来的，该基峰对应于“脱水”的奎宁酸离子。菊科植物中常见的四种二绿原酸衍生物亚类被如下鉴定：二咖啡酰奎宁酸（diCQA）异构体在m/z 515.120 [M-H]?，阿魏酰咖啡酰奎宁酸（F-CQA）在m/z 529.135，对香豆酰咖啡酰奎宁酸（p-Co-CQA）在m/z 499.125，以及羟基二氢咖啡酰咖啡酰奎宁酸（HC-CQA）在m/z 533.130，同时还有它们的二聚体加合物（表1，图S5）。六种同位素峰（20–24和35）的碎片化模式显示了m/z 515.120→353.088→191.055的转化，表明失去了两个咖啡酰基团（162.03 Da）（表1）。m/z 191.055的基峰（22和23）指出了奎宁酸骨架在C-1（3）和C-5位置的取代，正如在新绿原酸和绿原酸中观察到的那样（图S3、S4和S6）。3,5-二CQA通过m/z 179.034 [咖啡酸-H]?和135.044 [咖啡酸-H-CO2]?的丰富离子得到证实，而m/z 335.080 [M-H-caffeoyl-H2O]?的离子可以忽略不计。关于同位素28、29和30（m/z 499.125的[M-H]?），m/z 337.093 [M-H-caffeoyl]?和m/z 353.085 [M-H-p-coumaroyl]?的诊断离子的相对丰度对于3,5-二绿原酸衍生物的鉴定是相关的。因此，m/z 337.093 [M-H-caffeoyl]?的离子（76.4%）伴随着m/z 163.039 [对香豆酸-H]?（基峰）表明了3-p-Co-5-CQA（28），而m/z 353.085 [M-H-p-coumaroyl]?的离子（67.1%）和m/z 191.055（100%）则表明了3-C-5-p-CoQA（29/31）。同样，32和33分别通过m/z 193.050和191.055的基峰被鉴定为3-F-5-CQA和3-C-5-FQA。邻位二酰基奎宁酸（14、21、24、26、27、30、34、35、36、37和38）以及3,4,5-三咖啡酰奎宁酸（39）通过m/z 173.045的“脱水”奎宁酸离子得到证实（表1，图2，图S7–S11）（Clifford等人，2003）。以34（m/z 499.125的[M-H]?为例，m/z 353.087 [M-H-p-coumaroyl]?（2.4%）和m/z 337.093 [M-H-caffeoyl]?（68.1%）的相对丰度表明在的对香豆酰基团之前失去了咖啡酰基团。由于34在m/z 173.044产生了基峰（100%），与C-4取代的奎宁酸骨架一致，并伴随着m/z 163.039和119.049，因此被鉴定为4-p-Co-5-CQA。图2展示了3-咖啡酰-4-羟基二氢咖啡酰奎宁酸（14）的MS/MS谱。通过与参考标准的比较，新绿原酸（4）、绿原酸（7）、3,4-（21）和1,5-二咖啡酰奎宁酸（23）被明确鉴定（图S3、S4、S6和S7）。绿原酸衍生物的提取离子色谱图显示，A. dioica中的主要成分是绿原酸（7）（18.36%）、3,5-二咖啡酰奎宁酸（22）（17.79%）、新绿原酸（4）（12.17%）、4,5-二咖啡酰奎宁酸（24）（12.17%）和3,4-二咖啡酰奎宁酸（21）（7.77%）（图S1）。所有注释化合物的相对丰度和百分比比值的比较显示，绿原酸衍生物是A. dioica地上部分中发现的主要次生代谢物（55.62%）。3.1.2 咖啡酰己酸（CHAs）通常，4-单酰基、6-双酰基、3-三酰基和2-四酰基己酸以及与脂肪酸的三酰己酸酯被一起注释（表1，图S12）。在酰基己酸的碎片化模式中，常见的去质子化己酸（HA）分子在m/z 209.026（C6H9O8），这通过m/z 191.019 [HA-H-H2O]?、173.008 [HA-H-2H2O]?、147.029 [HA-H-H2O-CO2]?、129.018 [HA-H-2H2O-CO2]?、111.007 [HA-H-3H2O-CO2]?、85.028 [HA-H-2H2O-2CO2]?等碎片离子得到证实（表1，图3）。在测试的提取物中，多种CHAs在m/z 371.062 [M-H]?（40–43）（图S13）、二咖啡酰己酸在m/z 533.094（44–49）（图S14）、三咖啡酰己酸在m/z 695.125（51–53）（图S15）和四咖啡酰己酸在m/z 857.157（60, 61）（图S16）被注释。单酰基己酸异构体通过m/z 209.030 [M-H-caffeoyl]?处失去一个咖啡酰基团（162.03 Da）来区分。咖啡酰基团（CA）通常产生m/z 179.034 [CA-H]?、161.023 [(CA-H)-H2O]?和135.044 [(CA-H)-CO2]?等碎片离子。双酰基己酸随后在m/z 371.062和209.030失去两个咖啡酰基团，而在三酰基己酸中分别在m/z 533.094、371.062和209.030失去三个咖啡酰基团（Pralea等人，2021）。因此，通过与参考标准的比较，化合物51被鉴定为leontopodic acid B。四酰基己酸根据以下转化被鉴定：857.158→695.126→533.094→371.062→209.030（Pralea等人，2021）。化合物54–56和58在m/z 781.162（C37H33O19的计算值）具有相同的[M-H]?。它们产生m/z 295.067 [M-H-3CA]?、209.030 [M-H-3CA-C4H6O2]?和191.019 [M-H-3CA-C4H8O3]?等显著碎片离子，这是由于失去了三个咖啡酰基团和随后的一个羟基丁酰基团86.037 Da（C4H6O2）和羟基丁酸（C4H8O3）（54）（图3）。因此，54–56和58被鉴定为异构的羟基丁酰基三酰基己酸（表1）（Schwaiger等人，2005）。这一鉴定与leontopodic acid A的结构一致，并通过与其他参考标准的比较得到了进一步确认（图3）。图3展示了leontopodic acid A（54）的MS/MS谱。57和59的碎片化路径通过以下转化确定：m/z 795.179→633.147→471.115→309.083→191.019，表明失去了三个咖啡酰基团（3×162 Da）和118.064 Da（C5H10O3），这与羟基戊酸/羟基异戊酸一致（表1，图S17）。因此，57和59被鉴定为异构的羟基戊酸/羟基异戊酸-三酰基己酸。关于62和63（m/z 765.168的[M-H]?），从m/z 279.072 [M-H-3CA]?和191.034 [M-H-3CA-C4H8O2]?的显著离子推断出丁酰基或异丁酰基部分（Stefanova等人，2024）。同样，m/z 779.185的[М-H]?的64被鉴定为甲基丁酰基/异戊酰基三酰基己酸。通过m/z 102.069 Da（C5H10O3）和三个咖啡酰基团的损失以及m/z 191.019的三个咖啡酰基团的损失，证实了甲基丁酰基或异戊酰基部分的存在。通过m/z 367.103（33.8%）（32）和m/z 353.088（39.6%）的碎片离子，证实了3-和3-5-三酰基己酸（32和33）。邻位二酰基奎宁酸（14、21、24、26、27、30、34、35、36、37和38）以及3,4,5-三咖啡酰奎宁酸（39）通过m/z 173.045的“脱水”奎宁酸离子得到证实（表1，图2，图S7–S11）（Clifford等人，2003）。以34（m/z 499.125的[M-H]?为例，m/z 353.087 [M-H-p-coumaroyl]?（2.4%）和m/z 337.093 [M-H-caffeoyl]?（68.1%）的相对丰度表明在对香豆酰基团之前失去了咖啡酰基团。由于34在m/z 173.044产生了基峰（100%），与C-4取代的奎宁酸骨架一致，并伴随着m/z 163.039和119.049，因此被鉴定为4-p-Co-5-CQA。3.1.2 咖啡酰己酸（CHAs）通常，4-单酰基、6-双酰基、3-三酰基和2-四酰基己酸与脂肪酸的三酰己酸酯一起被注释（表1，图S12）。在酰基己酸的碎片化模式中，常见的去质子化己酸（HA）分子在m/z 209.026（C6H9O8），这通过m/z 191.019 [HA-H-H2O]?、173.008 [HA-H-2H2O]?、147.029 [HA-H-H2O-CO2]?、129.018 [HA-H-2H2O-CO2]?、111.007 [HA-H-3H2O-CO2]?、85.028 [HA-H-2H2O-2CO2]?等碎片离子得到证实（表1，图3）。在测试的提取物中，多种CHAs在m/z 371.062 [M-H]?（40–43）（图S13）、二咖啡酰己酸在m/z 533.094（44–49）（图S14）、三咖啡酰己酸在m/z 695.125（51–53）（图S15）和四咖啡酰己酸在m/z 857.157（60, 61）（图S16）被注释。单酰基己酸异构体通过m/z 209.030 [M-H-caffeoyl]?处失去一个咖啡酰基团（162.03 Da）来区分。咖啡酰基团（CA）通常产生m/z 179.034 [CA-H]?、161.023 [(CA-H)-H2O]?和135.044 [(CA-H)-CO2]?等碎片离子。双酰基己酸随后在m/z 371.062和209.030失去两个咖啡酰基团，而在三酰基己酸中分别在m/z 533.094、371.062和209.030失去三个咖啡酰基团（Pralea等人，2021）。因此，通过与参考标准的比较，化合物51被鉴定为leontopodic acid B。四酰基己酸根据以下转化被鉴定：857.158→695.126→533.094→371.062→209.030（Pralea等人，2021）。化合物54–56和58在m/z 781.162（C37H33O19的计算值）具有相同的[M-H]?。它们产生m/z 295.067 [M-H-3CA]?、209.030 [M-H-3CA-C4H6O2]?和191.019 [M-H-3CA-C4H8O3]?等显著碎片离子，这是由于失去了三个咖啡酰基团和一个羟基丁酰基团86.037 Da（C4H6O2）和羟基丁酸（C4H8O3）（54）（图3）。因此，54–56和58被鉴定为异构的羟基丁酰基三酰基己酸（表1）（Schwaiger等人，2005）。这一鉴定与leontopodic acid A的结构一致，并通过与其他参考标准的比较得到了进一步确认（图3）。图3展示了leontopodic acid A（54）的MS/MS谱。57和59的碎片化路径通过以下转化确定：m/z 795.179→633.147→471.115→309.083→191.019，表明失去了三个咖啡酰基团（3×162 Da）和118.064 Da（C5H10O3），这与羟基戊酸/羟基异戊酸一致（表1，图S17）。因此，57和59被鉴定为异构的羟基戊酸/羟基异戊酸-三酰基己酸。关于62和63（m/z 765.168的[M-H]?），从m/z 279.072 [M-H-3CA]?和191.034 [M-H-3CA-C4H8O2]?的显著离子推断出丁酰基或异丁酰基部分（Stefanova等人，2024）。同样，m/z 779.185的64被鉴定为甲基丁酰基/异戊酰基三酰基己酸。通过m/z 102.069 Da（C5H10O3）和三个咖啡酰基团的损失以及m/z 191.019的三个咖啡酰基团的损失，证实了甲基丁酰基或异戊酰基部分的存在。在65（m/z 815.148的[M-H]?）中推断出羟基苯甲酰基部分，并通过m/z 137.023 [羟基苯甲酸（HBA)-H]?和93.033 [HBA-H-CO2]?的显著离子得到进一步支持。化合物51（leontopodic acid B）和54（leontopodic acid A）的结构通过与参考标准的比较得到了明确确认。这两种化合物都是咖啡酰-D-葡萄糖酸衍生物，并且之前在其他Gnaphalieae物种中发现，如高山雪绒花（Leontopodium alpinum）和阿尔卑斯山的几种Gnaphalium物种（Cicek等人，2012）。此外，2,5-二咖啡酰葡萄糖酸、3,4-二咖啡酰葡萄糖酸和2,4-或3,5-二咖啡酰葡萄糖酸之前从Eupatorium perfoliatum L.中分离出来（Maas等人，2008）。从Berberis microphylla G.中分离出四种异构的二咖啡酰己酸。其中两种被鉴定为3-和4-反式咖啡酰葡萄糖酸，但无法确定每个异构体的连接位置。第三种异构体也分离出来，但它容易降解，因此被推测为2-或5-反式咖啡酰葡萄糖酸（Ruiz等人，2014）。从Galinsonga parviflora（菊科）的地上部分中分离出2,3,4,5-四咖啡酰葡萄糖酸和2,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸（Dudek等人，2016）。在这里，CHAs中，leontopodic acid A（54）（25.96%）其次是leontopodic acid B（51）（12.59%），以及其异构体三酰基己酸（52）（11.97%）在A. dioica提取物中占主导地位。3.1.3 羟基苯甲酸和羟基肉桂酸及其衍生物化合物67–69、72、74、75和84与羟基苯甲酸的碎片化模式密切相关，产生显著的碎片离子m/z 137.023 [(M-H)-Hex]?(67, 75, 84)、153.018 (68)、167.034 (69) 和 197.045 (72 和 74)，这些与羟基苯甲酸、原儿茶酸、香草酸和丁香酸一致（Gevrenova等人，2022）（表1，图S19）。同样，77、85、87、88和93可以被鉴定为羟基肉桂酸-己糖苷，包括咖啡酸-己糖苷（77、85 和 87）和香豆酸-己糖苷（88 和 93），这通过m/z 179.034 [CA-H]? 和 163.039 [coumaric acid-H]?的指示性碎片离子得到证实（Clifford等人，2007；Gevrenova等人，2022）。获得了糖酯羟基苯甲酸-己糖（70）、香草酰-己糖（75）和丁香酰-己糖（78）的ESI-MS/MS谱。酯键合的羟基苯甲酸通过己糖的交叉环裂解0,4Hex (-60 Da)、0,3Hex (-90 Da) 和 0,2Hex (-120 Da)得到证实（Clifford等人，2007）。通过与参考标准的比较，在提取物中鉴定出五种羟基苯甲酸（70、80–82 和 99）和五种羟基肉桂酸（89、90、95–97）以及苹果酸（66）、奎宁酸（86）、对羟基苯甲酸（92）和莽草酸（94）（表1）。鉴定出的化合物的MS/MS谱显示在图S20–S32中。在羟基苯甲酸和羟基肉桂酸及其衍生物中，A. dioica提取物中以原儿茶酸O-己糖苷（68）（16.47%）、香豆酸O-己糖苷（72）（12.36%）和奎宁酸（86）（11.94%）为主。3.1.4 黄酮类化合物在研究的提取物中鉴定的黄酮类化合物属于黄酮和黄酮醇类。它们主要包括芹菜素、木犀草素、山柰酚、槲皮素、异鼠李素、异鼠李素和patuletin作为苷元，以及它们的单酰基、双酰基和乙酰基苷（表1，图S33）。黄酮类化合物的鉴定基于不同黄酮类的碎片化路径和诊断性碎片（Gevrenova等人，2020）。一系列黄酮类化合物具有相似的碎片化模式，产生特征性碎片m/z 317.030 (102)、301.0352 (106)、285.041 (108)、331.046 (109)、315.051 (110) [(M-H)-Hex]?，分别对应于鼠李素、槲皮素、木犀草素、patuletin和nepetin（Gevrenova等人，2022；Ren等人，2018）（表1）。化合物100、101、113显示出324.106 Da [M-H-2Hex]?的中性损失，而化合物103、105、111、112显示出308.112 Da [M-H-rut]?的中性损失，分别与二己糖苷和芸香苷一致。通过与参考标准的保留时间和MS/MS碎片化路径的比较，103、108、110、111、112、122、123、124、126、127、129、130被明确鉴定为芸香苷、木犀草素7-O-葡萄糖苷、nepetin 7-O-葡萄糖苷、槲皮素3-O-芸香苷、异鼠李素3-O-芸香苷、木犀草素、nepetin、kaempferol、异鼠李素和genkwanin。上述黄酮类的MS/MS谱显示在图S34–S46中。化合物104产生一个前体离子m/z 521.094 (C23H22O14)以及一个碎片离子m/z 317.030, [M-H-204.064 Da]?，对应于同时失去己糖和乙酰基团。因此，104被鉴定为鼠李素3-O-乙酰己糖苷。关于128（[M-H]?在m/z 299.056, C16H11O6），未取代的A环从RDA离子m/z 151.002 (1,3A-) 和 107.012 (0,4A-)推断出来，而m/z 132.020 (1,3B-)的碎片表明B环发生了甲基化，如kaempferide/isokaemferide（De Rijke等人，2006）中所展示的。化合物125与芹菜素7-O-己糖苷的咖啡酰酯相关。在碎片化路径中失去162.030 Da (C9H6O3) 和 324.0852 Da (C15H16O8)，以及特征性离子m/z 179.034 [caffeic acid-H]?、161.023 [caffeic acid-H-H2O]? 和 135.044 [caffeic acid-H-CO2]?证实了咖啡酰基团的存在。Apigenin-7-O-(6″-O-E-caffeoyl)-β-D–glucopyranoside之前从Chamomilla recutita [L.] Rauschert（?vehl??ková等人，2004）和Leucas aspera L.（Manivannan，2016）中分离出来。在这个组中，应该注意的是鼠李素O-己糖苷（102）（13.99%）、木犀草素7-O-葡萄糖苷（108）（11.05%）和木犀草素（122）（10.88%）的主导地位。黄酮类的相对含量达到了6.85%。3.2 A. dioica提取物的总生物活性化合物、抗氧化和酶抑制特性总酚类和黄酮类含量的评估是使用分光光度法进行的（表2）。获得的结果显示，总酚含量（77.7 ± 0.1 mg GAE/g）高于Babot?等人（2018年）之前的报道，其中A. dioica的花朵含有19.62 mg GAE/g（MeOH提取物）、14.01 mg GAE/g（EtOH提取物）和36.27 mg GAE/g（70% EtOH提取物）的多酚（Babot?等人2018年）。关于总黄酮含量，我们的结果与之前在乙醇提取物中发现的结果一致（11.95 mg QE/g），但低于甲醇（21.38 mg QE/g）和70%乙醇（21.88 mg QE/g）提取物中的含量（Babot?等人2018年）。表2显示了A. dioica提取物的总酚类和黄酮类含量以及抗氧化和酶抑制特性。总酚含量（mg GAE/g）：77.7 ± 0.1总黄酮含量（mg RE/g）：11.8 ± 0.2抗氧化特性：- DPPH清除能力（mg TE/g）：53.8 ± 0.1- ABTS清除能力（mg TE/g）：141.6 ± 0.3- CUPRAC（mg TE/g）：305.9 ± 6.9- FRAP（mg TE/g）：156.2 ± 2.1- 金属螯合能力（mg EDTAE/g）：12.7 ± 0.4- 磷钼酸（mmol TE/g）：1.51 ± 0.03酶抑制特性：- AChE抑制（mg GALAE/g）：1.93 ± 0.05- BChE抑制（mg GALAE/g）：1.14 ± 0.10- 酪氨酸酶抑制（mg KAE/g）：46.2 ± 0.2- 淀粉酶抑制（mmol ACAE/g）：0.45 ± 0.01- 葡萄糖苷酶抑制（mmol ACAE/g）：0.11 ± 0.01- 脂肪酶抑制（mg OE/g）：5.1 ± 0.8注：数值为三次平行测量的平均值±标准差。缩写说明：ACAE为阿卡波糖当量；EDTAE为EDTA当量；GAE为没食子酸当量；GALAE为加兰他敏当量；KAE为柯吉酸当量；OE为奥利司他当量；RE为芦丁当量；TE为特罗洛克斯当量。本文通过不同的化学方法评估了A. dioica 80%甲醇提取物的抗氧化特性。结果见表2。使用DPPH和ABTS测试评估了提取物的自由基清除能力。A. dioica提取物在DPPH（53.8 ± 0.1 mg TE/g）和ABTS（141.6 ± 0.3 mg TE/g）上表现出较高的自由基清除能力。还原能力反映了电子捐赠能力，是抗氧化品质的指标。此外，还进行了CUPRAC和FRAP测试，包括Cu2+转化为Cu+和Fe3+转化为Fe2+的过程。PBD测试也被视为总抗氧化分析，涉及抗氧化剂将Mo（VI）转化为Mo（V）。Fenton反应中羟基自由基的形成通过过渡金属的螯合作用得到调节，这被证明是一种重要的抗氧化机制。研究中的提取物在CUPRAC（305.9 ± 6.9 mg TE/g）和FRAP（156.2 ± 2.1 mg TE/g）测试中表现出强活性，以及12.7 ± 0.4 mg EDTAE/g的金属螯合能力。A. dioica的抗氧化活性之前已有报道（Babot?等人2018年）。70%乙醇提取物显示出最高的值（15.21 mg TE/mL），其次是甲醇提取物（13.44 ± 1.65 mg TE/mL），而纯乙醇提取物的值为5.89 mg TE/mL。此外，70%乙醇提取物表现出最强的TEAC活性（5.71 ± 0.01 mg TE/mL）（Babot?等人2018年）。近年来，酶抑制理论引起了兴趣，因为它针对关键酶，有可能缓解阿尔茨海默病、糖尿病和肥胖等健康问题的症状（Singh等人2024年）。例如，抑制AChE可以增加突触间隙中的乙酰胆碱水平，从而改善阿尔茨海默病患者的认知功能（Pandya等人2026年）。同样，抑制淀粉酶和葡萄糖苷酶有助于控制糖尿病患者餐后血糖水平（Kumar和Kayastha 2026年）。因此，制药工业中合成了多种酶抑制剂。然而，关于其使用的担忧也随之增加，如胃肠道紊乱或毒性（D'Souza等人2024年）。因此，需要有效且安全的替代品。鉴于上述信息，我们研究了A. dioica提取物对胆碱酯酶、酪氨酸酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和脂肪酶的酶抑制特性。结果见表2。提取物显示出中等的AChE和BChE抑制潜力，以及对酪氨酸酶非常高的活性（46.2 ± 0.2 mg KAE/g）（表2）。酪氨酸酶负责黑色素的生物合成，在皮肤色素沉着中起关键作用。酪氨酸酶抑制剂在化妆品和药品中作为美白剂非常重要。对于参与碳水化合物和脂质代谢的酶，A. dioica显示出中等的α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和脂肪酶抑制效果。抑制这些酶在控制II型糖尿病患者的血糖水平和代谢紊乱的治疗策略中起着重要作用。在这个框架下，A. dioica提取物可以用作多方向的生物活性剂和有价值的生物活性化合物来源。3.3 在Silico研究中为了进一步寻找观察到的酶亲和力背后的生物活性化合物，并突出潜在的候选化合物以进行后续优化和药理学评估，对四种酶——AchE、BChE、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶进行了对接研究。首先，通过重新对接从PDB（https://www.rcsb.org/）提取的复合物的晶体配体来验证对接协议。重新对接程序的结果见表3。最佳对接得分的对接姿势显示RMSD（均方根偏差）值< 1 ?，表明对接程序表现良好。表3显示了晶体配体的重新对接结果。酶（PDB代码）：AChE（4EY7）、BChE（7AMZ）、α-淀粉酶（1Z32）、α-葡萄糖苷酶（5NN6）配体：E20、RNZ、GLC_AGL_HMC、MIC对接得分 – 最佳姿势（kcal/mol）：?9.961、?10.187、?8.143、?6.655RMSDa（?）：0.205、0.928、0.636、0.793图4展示了晶体配体（左图）和最佳对接姿势（右图）的配体-酶相互作用，以供比较。重新对接的姿势和晶体配体在所有四种酶上显示出可比的相互作用，证实了对接协议的可靠性。表4A和表4B分别展示了AChE和BChE以及α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的最佳对接得分化合物。此外，还应用了一个截止值，即比相应晶体配体的最佳得分高0.5 kcal/mol；对接得分优于（即低于）此阈值的化合物也包含在表4中。对于表4中列出的每个化合物，都展示了所有研究异构体的对接得分。对于某些化合物，提取物中存在多个异构体，因此它们用不同的数字编号（见表1）。对于提取物中仅发现一个异构体但未完全定义的化合物，对接是针对该化合物的所有位置异构体进行的，因此这些异构体在表4中具有相同的化合物编号。表4显示了具有最佳对接得分的化合物及其异构体的对接得分。AChE和BChE的对接得分以及优于（低于）两种酶截止值的化合物的对接得分。对接得分的截止值分别为?9.4（AChE）和?9.6（BChE）。还展示了化合物的位置异构体的对接得分。化合物编号、异构体、AChE对接得分、BChE对接得分：44、2,3-二咖啡酰葡萄糖酸：?8.265、?8.64145、2,4-二咖啡酰葡萄糖酸：?8.397、?8.86446、2,5-二咖啡酰葡萄糖酸：?9.527、?8.74247、3,4-二咖啡酰葡萄糖酸：?8.939、?9.08248（AchE最佳得分）、3,5-二咖啡酰葡萄糖酸：?9.619、?8.38449、4,5-二咖啡酰葡萄糖酸：?8.586、?8.67250、2,3,4-三咖啡酰葡萄糖酸-β-葡萄糖苷：?9.484、?10.29351、2,3,4-三咖啡酰葡萄糖酸：?9.232、?9.99552、2,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?9.403、?9.98753、2,3,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.440、?8.23753、3,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.109、?9.47562、2-丁基-3,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.788、?10.41962、3-丁基-2,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.461、?10.64062（BChE最佳得分）、4-丁基-2,3,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?9.071、?11.66862、5-丁基-2,3,4-三咖啡酰葡萄糖酸：?7.757、?7.757表4B显示了具有最佳对接得分的化合物以及优于（低于）两种酶截止值的化合物的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的对接得分。对接得分的截止值分别为?7.6（α-淀粉酶）和?6.1（α-葡萄糖苷酶）。还展示了化合物的位置异构体的对接得分。化合物编号、异构体、α-淀粉酶对接得分、α-葡萄糖苷酶对接得分：13、3-咖啡酰-5-（2-羟基-二氢咖啡酰）奎宁酸：?8.477、?6.38514、3-咖啡酰-4-（2-羟基-二氢咖啡酰）奎宁酸：?8.544、?6.52116、1-咖啡酰-3-(2-羟基二氢咖啡酰)奎宁酸：?8.364、?6.36319、1,4-二咖啡酰奎宁酸：?7.729、?6.14821、3,4-二咖啡酰奎宁酸：?8.577、?6.58522、3,5-二咖啡酰奎宁酸：?8.156、?6.61323、1,5-二咖啡酰奎宁酸：?7.807、?6.83124、4,5-反式-二咖啡酰奎宁酸：?7.796、?6.74325、1-(对香豆酰)-4-咖啡酰奎宁酸：?8.120、?6.44126、3-咖啡酰-4-（对香豆酰）奎宁酸：?7.809、?6.81527、3-阿魏酰-4-咖啡酰奎宁酸：?8.289、?7.22728、3-(对香豆酰)-5-咖啡酰奎宁酸：?7.736、?6.32929、3-反式-咖啡酰-5-(对香豆酰)奎宁酸：?8.216、?6.69131、3-半胱氨酰-5-(对香豆酰)奎宁酸：?8.318、?6.79331、1-(对香豆酰)-5-咖啡酰奎宁酸：?7.671、?6.70232、3-阿魏酰-5-咖啡酰奎宁酸：?8.383、?6.85633、4,5-半胱氨酰-二咖啡酰奎宁酸：?8.320、?6.78235、4-(对香豆酰)-5-咖啡酰奎宁酸：?7.755、?6.67036、4-咖啡酰-5-咖啡酰奎宁酸：?8.030、?7.23637、4-咖啡酰-5-咖啡酰奎宁酸：?8.062、?6.76238、4-咖啡酰-5-(对香豆酰)奎宁酸：?7.937、?6.91139、2,3-二咖啡酰葡萄糖酸：?8.853、?6.71145、2,4-二咖啡酰葡萄糖酸：?8.138、?6.86146、2,5-二咖啡酰葡萄糖酸：?8.539、?6.24547、3,4-二咖啡酰葡萄糖酸：?7.736、?6.86748、3,5-二咖啡酰葡萄糖酸：?8.319、?7.14949、4,5-二咖啡酰葡萄糖酸：?8.245、?6.94650、2,3,4-三咖啡酰葡萄糖酸-β-葡萄糖苷：?8.238、?6.94751、2,3,4-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.281、?7.32752、2,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?7.674、?7.46353、2,3,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?7.893、?7.08553、3,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?7.958、?7.57654、2-(3-羟基丁基)-3,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸（leontopodic酸A）：?8.180、?7.32655、3-(3-羟基丁基)-2,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.094、?6.79356、4-(3-羟基丁基)-2,3,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.375、?7.79658、5-(3-羟基丁基)-2,3,4-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.588、?7.710557、2-(3-羟基异戊基)-3,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.606、?7.93657、2-(4-羟基异戊基)-3,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.647、?7.710557、2-(3-羟基-2-甲基丁基)-3,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.861、?7.17559、3-(3-羟基异戊基)-2,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.861、?7.17559、4-(4-羟基异戊基)-2,3,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.647、?7.710559、4-(3-羟基-2-甲基丁基)-2,3,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.098、?7.81759、4-(4-羟基异戊基)-2,3,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.826、?7.86059、4-(3-羟基-2-甲基丁基)-2,3,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?9.276、?7.81059、5-(3-羟基异戊基)-2,3,4-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.587、?7.56659、5-(4-羟基异戊基)-2,3,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.919、?7.17859、5-(3-羟基-2-甲基丁基)-2,3,4-三咖啡酰葡萄糖酸：?9.631、?7.17660、2,3,4,5-反式-四咖啡酰葡萄糖酸：?8.352、?7.37761、2,3,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.766、?6.40062、2-丁基, 3,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?9.032、?7.67862、3-丁基-2,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.767、?7.63162、4-丁基-2,3,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.737、?7.11362、5-丁基-2,3,4-三咖啡酰葡萄糖酸：?7.819、?6.95563、2-异丁基-3,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.438、?6.99663、3-异丁基-2,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.260、?6.99663、4-异丁基-2,3,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?7.676、?7.11363、5-异丁基-2,3,4-三咖啡酰葡萄糖酸：?7.819、?6.95563、2-异丁基-2,3,4-三咖啡酰葡萄糖酸：?7.676、?7.07163、5-异丁基-2,3,4-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.647、?7.15364、2-(2-甲基丁基)-3,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.292、?8.11764、3-(2-甲基丁基)-2,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.281、?7.66564、4-(2-甲基丁基)-2,3,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.403、?7.312164（α-淀粉酶最佳得分）5-(2-甲基丁基)-2,3,4-三咖啡酰葡萄糖酸：?9.822、?7.34664、2-异戊基-3,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.337、?7.03764、3-异戊基-2,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?7.643、?7.49964、4-异戊基-2,3,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?7.933、?7.51664、5-异戊基-2,3,4-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.089、?7.15665、2-(对羟基苯甲酰)-3,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.478、?7.78365（α-葡萄糖苷酶最佳得分）3-(对羟基苯甲酰)-2,4,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.993、?8.14965、4-(对羟基苯甲酰)-2,3,5-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.956、?7.44565、5-(对羟基苯甲酰)-2,3,4-三咖啡酰葡萄糖酸：?8.541、?7.453103、芦丁：?7.874、?6.468105、Patuletin 3-O-芦丁糖苷：?7.918、?6.874107、7-(6-羟基芸香素)-马来酰-β-葡萄糖苷：?7.797、?6.453112、异鼠李素3-O-芦丁糖苷：?8.099、?6.431119、芸香素7-O-戊糖基-β-葡萄糖苷：?8.215、?6.549125、山柰素7-O-咖啡酰-β-葡萄糖苷：?8.025、?6.907值得注意的是，与AChE和BChE相比，更多的化合物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶显示出有利的对接得分，这与该植物在传统医学中的用途一致。此外，得分最高的化合物的异构体也表现出相似的良好对接得分。因此，由于提取物含有不同的化合物异构体，提取物的效果可能是由于存在具有良好结合亲和力的不同化合物/异构体，而不仅仅是单一化合物。评估药代动力学特性和毒性对于选择可行的候选药物至关重要；因此，接下来在Silico中评估了这些化合物的ADME/Tox（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）特性。早期评估这些参数至关重要，因为许多候选药物在开发后期由于不良的药代动力学行为或不可接受的毒性特征而失败。计算ADME/Tox预测能够快速筛选大量化合物，使研究人员能够在进行昂贵的实验研究之前优先考虑具有更有利药代动力学特性的分子。尽管如此，Silico ADME/Tox评估仍存在一些限制，与用于预测模型开发的数据可靠性、模型适用范围以及毒性效应的复杂性有关。然而，在过去的几十年中，模型开发旨在通过使用可靠的数据、严格的验证程序和有效的模型适用性确定来克服上述限制。因此，Silico ADME/Tox评估在药物开发的早期阶段变得非常重要，以优化候选药物并降低成本和时间（Shinde等人2025年）。使用不同的软件进行毒性预测可以通过基于共识的方法提高结果的可靠性。不同的软件依赖于不同的算法、数据集和预测方法，可能会对同一化合物产生不同的输出。因此，结合来自互补工具的预测可以帮助降低不可靠预测的风险。因此，我们使用了ACD Labs/Percepta软件和Derek Nexus专家系统。表4B中列出的所有化合物的HIA百分比均< 5%，化合物125除外。因此，它被选为进一步研究与α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶相关的化合物。在ACD Labs/Percepta软件和Derek Nexus专家系统中计算的分子性质以及ADME/Tox特性在表5中呈现。表中列出了与酶具有最佳对接姿势的化合物（48、62、64、65）、对AChE和BChE都有良好对接分数的化合物（50、52），以及根据α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的亲和力选择且具有良好HIA的化合物125。不同位置异构体的性质是相同的。表5. 选定化合物的分子和ADME/Tox特性。化合物编号485052626465125A. 使用ACD Labs/Percepta计算的特性（可靠性指数（RI）值以括号表示）分子量（MW）：534、859、696、767、781、816、595logp（RI）：0.08（0.60）、?1.42（0.50）、0.90（0.64）、2.18（0.66）、2.4（0.65）、2.16（0.59）、1.60（0.65）HIA（%）：0、0、0、0、0、0、0、86Ames试验阳性概率（RI）：0.02（0.53）、0.04（0.48）、0.02（0.58）、0.02（0.53）、0.01（0.52）、0.01（0.50）、0.29（0.20）hERG抑制剂（Ki < 10 μM）概率（RI）：0.00（0.31）、0.00（0.31）、0.00（0.30）、0.00（0.20）、0.00（0.20）、0.00（0.31）、0.01（0.38）B. 使用Derek Nexus为哺乳动物计算的警报计数。在警报计数为1的情况下，可能性水平是合理的肝毒性：0皮肤刺激/腐蚀：1、1、1、1、1、1、1、1皮肤致敏：1、1、1、1、1、1胃肠道刺激：0、0、0、0、1哺乳动物致癌性：0、0、0、0、0肾毒性：0、0、0、0、0雄激素受体调节：0、0、0、0、0光致过敏：0、0、0、0、0雌激素受体调节：0、0、0、0、0除了表5A中呈现的特性外，还计算了血液-脑屏障（BBB）的穿透潜力以及与Pgp相互作用的概率。预测这些化合物不会穿透BBB，也不会与Pgp相互作用。这些化合物的logp值处于中等范围（?1.42至2.18之间），有利于药物开发。它们被预测具有较低的毒性（表5），仅对皮肤刺激/腐蚀和皮肤致敏有警报，除了化合物64可能还会引起胃肠道刺激。阳性Ames试验表明该化合物可能引起细菌DNA突变，从而提示其潜在的致突变性和致癌性（Mortelmans和Zeiger 2000）。所有化合物的Ames试验阳性概率都很低（表5A）；然而，化合物125的RI低于0.3，表明预测存在不确定性。hERG抑制是心脏毒性的一个指标（Sanguinetti和Tristani-Firouzi 2006）。预测这些化合物成为hERG抑制剂的概率为零。对于化合物50和52（表5B），由于它们对AChE和BChE的对接分数高于临界值，除了皮肤效应外没有其他警报。尽管这些化合物的被动吸收预测较差，但这不是一个重大限制，因为许多用于神经退行性疾病的药物都是通过非肠道途径给予的。化合物52的分子量较低，logp值较高，表明其作为先导化合物的潜力更大。化合物52在AChE和BChE结合位点的相互作用在图5A中展示。对于AChE，观察到与Trp286和Tyr341的相互作用，无论是晶体配体还是化合物52。所研究的化合物还通过与Ser293（氢键）、Asn283、Glu292、Tyr337和Glu342的水桥相互作用。对于BChE，观察到与Gly78、Glu197和His438的氢键，以及晶体配体和化合物52与Trp82的相互作用。其他对接研究也显示了配体与AChE中的Tyr337、Ser293和BChE中的Glu197之间的氢键（Islam等人2013；Mascarenhas等人2021；Ul-Haq等人2010）。图5：化合物52和125的蛋白质-配体相互作用。（A）化合物52在AChE和BChE结合位点的相互作用。（B）化合物125在α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶结合位点的相互作用。芹菜素7-O-咖啡酰-β-葡萄糖苷（化合物125）在α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶中表现出良好的对接分数，预测的肠道吸收率高，总体毒性特征良好。其在α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶结合位点的相互作用在图5B中展示。在α-淀粉酶中，化合物125和晶体配体都与Trp59、Arg195、Asp197、Asp300相互作用。文献中也报道了这种配体与α-淀粉酶的相互作用（Aminu等人2024；Anigboro等人2021；Ibrahim等人2019）。所研究的化合物还与α-葡萄糖苷酶中的Asp282、Asp404（也存在于晶体配体的相互作用中）、Phe525相互作用，这与文献报道一致（Bashyal等人2024）。分子对接研究和体外酶抑制试验分别探讨了提取物的不同但互补的生物活性方面。虽然体外实验评估了提取物对测试酶的总体抑制活性，但分子对接分析研究了提取物中鉴定出的个别植物化学成分在分子水平上与目标酶活性位点相互作用的能力。根据对接结果，提取物含有与AChE、BChE、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷结合的良好潜力的化合物，这与实验观察到的提取物对这些酶的中等抑制活性一致。此外，对接研究揭示了化合物-酶相互作用的分子机制。这些相互作用可能有助于解释实验观察到的抑制效应，并有助于合理化测量的酶抑制作用。然而，应强调的是，计算机模拟结果代表了一种预测性计算方法，不能直接替代实验验证。因此，计算机模拟发现，包括对接结果和毒性预测，应被视为有助于解释观察到的生物活性的支持性证据，并指导未来的研究。4 结论根据药理学的新范式，为了深入分析天然提取物的代谢物谱，以便合理优先考虑生物活性天然化合物，本研究旨在调查A. dioica提取物的植物化学特征和生物活性。通过UHPLC-HRMS/MS方法，共鉴定/注释了130种次级代谢物，包括酰基奎宁酸、咖啡酰己酸、羧酸、酚酸、香豆素和黄酮类化合物。总体而言，我们的数据首次报告了该物种中超过68种核心结构。A. dioica是CHAs的丰富来源，其独特的谱型可能与leontopodic酸A和B有关。检测到的各类化合物的百分比显示，AQAs的相对含量最高（55.62%），其次是羟基苯甲酸和羟基肉桂酸及其衍生物（21.70%）、CHAs（15.79%）和黄酮类（6.85%）。提取物中的主要成分包括绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、新绿原酸、leontopodic酸A和B、原儿茶酸O-己糖苷、myricetin O-己糖苷、luteolin 7-O-葡萄糖苷和luteolin。观察到提取物具有显著的抗氧化活性（DDPH、FRAP、CUPRAC、ABTS、螯合能力和磷钼容量），以及对AChE、BChE、酪氨酸酶和脂肪酶的酶抑制潜力。使用计算机模拟方法研究了A. dioica提取物中鉴定出的化合物与AChE和BChE以及α-淀粉酶和α-葡萄糖苷的结合潜力，并评估了它们的ADME/Tox特性。发现该提取物含有更多的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷潜在配体，而不是AChE和BChE，这与该植物在传统医学中的用途一致。检测到许多具有良好对接分数的异构体，表明观察到的效果可能是由于不同化合物的存在。预测为AChE和BChE活性配体的化合物具有良好的毒理学特性，但由于其logp值较低，肠道吸收较差。进一步优化这些候选分子可能包括引入增加其亲脂性的替代物，从而提高其被动吸收。在化合物中，芹菜素7-O-咖啡酰-β-葡萄糖苷被证明具有与α-淀粉酶和α-葡萄糖苷良好相互作用的潜力，并具有良好的ADME/Tox特性。我们证明A. dioica地上部分提取物可以减少氧化应激，并对代谢紊乱和皮肤缺陷有有益效果。作者贡献Dimitrina Zheleva-Dimitrova：概念化、软件使用、资源管理、数据整理、初稿撰写、可视化、监督、方法论。Ivanka Tsakovska：概念化、方法论、验证、资源管理、初稿撰写、监督。Reneta Gevrenova：方法论、软件使用、撰写-审稿和编辑、初稿撰写。Gokhan Zengin：方法论、初稿撰写、形式分析、数据整理。Ivayla Zheleva-Kyuchukova：资源管理、初稿撰写。Radostina Nikolova-Kejova：研究、数据整理。Iglika Lessigiarska：概念化、方法论、验证、形式分析、数据整理、初稿撰写、审稿和编辑。Georgi Momekov：资金获取、项目管理。本研究由欧盟—NextGenerationEU通过保加利亚共和国的国家恢复和韧性计划资助，项目编号BG-RRP-2.004-0004-C01“索菲亚医科大学的战略研究与创新计划”。数据可用性声明支持本研究发现的数据可在本文的支持信息中找到。