Rimiducid

摘要：嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）治疗在过去数十年间取得了突破性进展，已获批用于治疗多种血液系统恶性肿瘤，且在非肿瘤疾病领域的潜力也逐步显现。然而，当前临床级 CAR-T 细胞的体外制造流程复杂、耗时且成本高昂，限制了其广泛应用。本文将系统梳理 CAR-T 细胞的结构与发展历程，深入分析体外 CAR-T 治疗面临的制造难题与毒性风险，重点阐述体内 CAR-T 细胞生成技术的研究进展，包括病毒载体与纳米载体递送系统的应用，同时探讨 CAR-NK、CAR-M 等其他免疫细胞的体内工程化潜力，最后展望该领域的未来方向，为读者全面呈现 CAR-T 细胞治疗从体外到体内的技术变革。 一、CAR-T 细胞：结构解析与发展历程（一）CAR-T 细胞的核心结构 嵌合抗原受体（CAR）是 CAR-T 细胞发挥作用的关键，其典型结构呈模块化设计，主要包含胞外域（Ectodomain）、跨膜域（Transmembrane Domain, TMD和胞内域（Endodomain）三个核心部分，各部分又由多个功能结构组成（图 1A）。 胞外域：负责以不依赖主要组织相容性复合体（MHC）的方式识别肿瘤细胞表面抗原，是 CAR-T 细胞靶向性的基础。它包含抗原结合域和铰链域（Hinge Domain, HD）： 抗原结合域：目前最常用的是单链可变片段（scFv），但 scFv 存在免疫原性强、易自聚集导致 CAR-T 细胞过早耗竭的问题。作为替代方案，纳米抗体（又称 VHH 域）凭借更小的分子体积，能更轻松地接触到实体肿瘤中 scFv 难以抵达的表位，为实体瘤治疗提供了新可能。 铰链域：又称 “间隔区”，连接抗原结合域与跨膜域，为 CAR 提供稳定性和灵活性。基于免疫球蛋白（Ig）的铰链域需特别注意 ——IgG 分子的 CH2 区域可能与先天免疫细胞表面的 Fcγ 受体结合，引发非特异性免疫反应。不过，通过突变或完全删除 CH2 区域，可减少这类反应，同时提升 CAR-T 细胞的存活时间和抗肿瘤效果。此外，铰链域的长度需根据抗原表位与细胞膜的距离设计：较长的铰链域能增加灵活性，适用于识别膜近端表位或复杂糖基化抗原；较短的铰链域则更适合靶向膜远端表位。 跨膜域：连接胞外域与胞内信号域，虽主要起结构支撑作用，但对 CAR 在 T 细胞表面的表达水平、稳定性及功能影响显著。例如，跨膜域参与抗原结合后的 CAR 二聚化过程，并通过与内源性信号分子相互作用传递激活信号，不同类型的跨膜域可调控 CAR 的功能。 胞内域：位于细胞质内，负责将胞外的抗原识别信号转化为胞内信号，激活 T 细胞并触发免疫反应。它通常包含 T 细胞激活域和一个或多个共刺激域： 激活域：目前所有美国食品药品监督管理局（FDA）获批的 CAR-T 产品均采用 CD3ζ 链作为激活域，其胞质域中的免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs）可招募蛋白激酶 ZAP70，启动信号级联反应。即便 CAR-T 细胞形成的是非经典免疫突触，在识别抗原后仍能激活 ZAP70，确保信号传递的有效性。 共刺激域：共刺激信号对 CAR-T 细胞的活化、增殖、存活至关重要，也是 CAR-T 细胞代际升级的核心标志，不同共刺激域会引导 CAR-T 细胞产生不同的功能特性。（二）CAR-T 细胞的五代发展历程 自 1987 年 Kuwana 等人提出 “T-bodies” 概念，将单克隆抗体片段与 T 细胞受体（TCR）融合，实现 MHC 非依赖的抗原识别以来，CAR 结构不断优化，至今已发展至第五代（图 1B）。 第一代 CAR-T 细胞：仅包含 scFv 抗原结合域和 CD3ζ 链（或 FcγR）激活域。早期研究显示，基于 CD3ζ 链的 CAR-T 细胞因含多个 ITAMs，细胞毒性显著优于 FcγR 基 CAR-T 细胞。但在临床研究中，第一代 CAR-T 细胞存在存活时间短、抗肿瘤效果弱的问题，无法满足长期治疗需求。 第二代 CAR-T 细胞：在第一代基础上加入一个共刺激域，是目前临床应用最广泛的类型。共刺激域主要来自 CD28 受体家族（如 CD28、ICOS）或肿瘤坏死因子受体家族（如 4-1BB、OX40），不同共刺激域赋予 CAR-T 细胞不同特性： 第三代 CAR-T 细胞：整合两个不同共刺激域（如 CD28+4-1BB），旨在结合不同共刺激域的优势，实现 “双重信号激活”。例如，CD28 提供的快速杀伤能力与 4-1BB 带来的长期存活特性结合后，可显著提升 CAR-T 细胞的抗肿瘤效果。在白血病、非霍奇金淋巴瘤（NHL）等疾病的早期临床研究中，第三代 CAR-T 细胞展现出更强的扩增能力和更长的存活时间，但也有研究指出，第二代 CAR-T 细胞可能通过形成超分子信号复合体，激活更强烈的信号，在部分场景下抗肿瘤能力更优。 CD28 共刺激域：与抗原呈递细胞（APCs）表面的 CD80/CD86 结合后，可促进 IL-2 分泌，增强初始 T 细胞的存活、增殖和代谢活性，使 CAR-T 细胞快速发挥抗肿瘤作用，但可能引发过度激活和 T 细胞耗竭，导致长期疗效不佳。 4-1BB 共刺激域：仅在 T 细胞激活后表达，与配体结合后能促进记忆 T 细胞形成，延长 CAR-T 细胞在体内的存活时间，且 tonic 信号（非特异性持续激活信号）较弱，细胞耗竭程度低，但细胞扩增速度和早期杀伤效率不及 CD28 基 CAR-T 细胞。 OX40 与 ICOS 共刺激域：OX40 可增强 T 细胞的持久性，ICOS 则在调控体液免疫、炎症反应及 Th17 细胞发育中发挥作用，且 ICOS 基 CAR-T 细胞的体内存活时间优于 CD28 基 CAR-T 细胞。 第四代 CAR-T 细胞（TRUCKs）：又称 “通用细胞因子杀伤 T 细胞”，在第二代 CAR 结构基础上，加入受核因子活化 T 细胞（NFAT）调控的转基因 cassette，可在识别肿瘤抗原后诱导表达 IL-2、IL-12、IL-15 等细胞因子。这些细胞因子能招募先天免疫细胞（如巨噬细胞、NK 细胞），在肿瘤微环境（TME）中形成协同抗肿瘤效应，同时避免细胞因子对全身的毒副作用。 第五代 CAR-T 细胞（下一代 CAR）：在第二代 CAR 基础上，插入 IL-2 受体 β 链（IL-2Rβ）的截短胞质域（位于 CD28 共刺激域与 CD3ζ 链之间），并引入 STAT-3/5 转录因子结合基序。抗原结合后，CD28、CD3ζ 链与 JAK-STAT 3/5 通路同时激活，可进一步增强 CAR-T 细胞的功能、增殖能力和存活时间。此外，为应对免疫检查点抑制（如 PD-1/PD-L1 通路）导致的 CAR-T 细胞耗竭，研究人员开发了 PD-1/CD28 嵌合开关受体 —— 其胞外域为 PD-1，可结合肿瘤细胞表面的 PD-L1，胞内域为 CD28 的共刺激信号区，能将 PD-1 介导的抑制信号转化为激活信号。在一项 IB 期研究中，靶向 CD19 的 PD-1/CD28 嵌合开关受体 CAR-T 细胞（CD19-PD-1/CD28-CART）展现出持久的临床疗效。 图 1 CAR-T 细胞结构与五代发展示意图A：CAR-T 细胞的核心结构，包含胞外域、跨膜域和胞内域；B：从第一代到第五代 CAR-T 细胞的结构演变，展示各代共刺激域、细胞因子诱导元件等的差异 （三）实体瘤 CAR-T 治疗的特殊优化 尽管 CAR-T 治疗在血液系统肿瘤中成效显著，但目前尚无针对实体瘤的 CAR-T 产品获批，主要瓶颈在于肿瘤微环境（TME）的抑制作用和肿瘤特异性抗原缺乏。为突破这些限制，研究人员从多个方向对 CAR 进行优化： 改善 TME 浸润：实体瘤基质中富含硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）和透明质酸，会阻碍 CAR-T 细胞进入肿瘤内部。通过在 CAR-T 细胞中表达肝素酶（降解 HSPG）或透明质酸酶（降解透明质酸），可破坏基质屏障，提升 CAR-T 细胞的浸润能力；同时，让 CAR-T 细胞表达肿瘤微环境中趋化因子的受体（如 CXCR1、CXCR2、CCR4），可引导 CAR-T 细胞向肿瘤部位迁移。 逆转免疫抑制：通过基因工程让 CAR-T 细胞分泌 IL-12、IL-15、IL-18 等促炎细胞因子，可直接改善肿瘤微环境的免疫抑制状态，增强 CAR-T 细胞的抗肿瘤活性。 解决抗原异质性与逃逸：实体瘤抗原表达具有高度异质性，单一抗原靶向易导致抗原逃逸。双重靶向 CAR-T 策略成为解决方案： 提升治疗安全性：为降低 “脱靶毒性”（On-target/Off-tumor Toxicity），研究人员开发了 “抑制性 CAR（iCAR）”。iCAR 识别正常组织表达而肿瘤组织缺失的抗原，其胞内域含 PD-1 或 CTLA-4 的抑制性信号区。当 CAR-T 细胞接触正常组织时，iCAR 激活抑制信号，阻止 CAR-T 细胞活化，从而保护正常组织。 混合 CAR-T 细胞（Pooled CAR-T）：将靶向不同抗原的 CAR-T 细胞联合输注。例如，在肺癌小鼠模型中，输注靶向 EphA2 和 FAPα 的混合 CAR-T 细胞，抗肿瘤效果显著优于单一 CAR-T 细胞。 双特异性 CAR-T 细胞（biCAR-T）：单个 T 细胞同时表达两种靶向不同抗原的 CAR。在胶质母细胞瘤模型中，同时表达 HER2 和 IL13Rα2 CAR 的 biCAR-T 细胞，抗肿瘤效果优于单一 CAR-T 细胞或混合 CAR-T 细胞。 双价 CAR-T 细胞（Bivalent CAR-T）：一个 CAR 分子包含两个不同的 scFv，可识别两种抗原，分为 “串联型”（两个 scFv 的 VL-VH 直接连接）和 “环型”（两个 scFv 的 VL-VH 通过间隔序列分开）。二、体外 CAR-T 治疗的挑战：制造难题与毒性风险（一）体外制造流程的复杂性与高成本 目前临床获批的 CAR-T 细胞均为自体产品，需从患者体内采集 T 细胞，经体外工程化改造后再回输，整个制造流程耗时 3-4 周，单患者成本通常超过 40 万美元，部分甚至突破 100 万美元，其复杂性主要体现在以下环节（图 2 左半部分）： T 细胞采集与分离：通过白细胞分离术（Leukapheresis）从患者外周血中获取白细胞，再分离纯化 T 细胞； 激活与转导：用抗 CD3/CD28 抗体激活 T 细胞后，通过病毒载体（如慢病毒、逆转录病毒）或非病毒载体（如转座子）将 CAR 基因导入 T 细胞； 体外扩增：在含细胞因子（如 IL-2）的培养基中培养 T 细胞，使其大量增殖，达到临床所需剂量； 质量控制与回输：对扩增后的 CAR-T 细胞进行无菌性、存活率、纯度、效价等指标检测，合格后回输患者。 自体 CAR-T 制造还面临物流与时效性挑战：白细胞分离术需专业设备和团队，采集后的细胞需快速转运至 GMP 级实验室，且 CAR-T 细胞保质期短，需在规定时间内回输，这对物流和生产效率提出极高要求。 为降低成本，异基因 CAR-T 细胞（从健康供体获取 T 细胞进行工程化）成为研究方向。异基因 CAR-T 细胞可批量生产，形成 “现货型”（Off-the-shelf）产品，大幅缩短治疗周期并降低成本。但异基因 CAR-T 细胞存在两大关键问题： 移植物抗宿主病（GvHD）：供体 T 细胞表面的 TCR 可能识别患者正常组织的抗原，引发致命性的 GvHD； 宿主抗移植物反应（HvG）：患者免疫系统可能将异基因 CAR-T 细胞视为 “异物” 并清除，导致 CAR-T 细胞在体内存活时间缩短，治疗失效。（二）CAR-T 治疗相关毒性 尽管 CAR-T 治疗疗效显著，但常伴随严重的系统性毒性，其中细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS） 最为常见且危险。 细胞因子释放综合征（CRS）：CAR-T 细胞识别并激活后，会大量释放 IL-6、IFN-γ 等细胞因子，引发 “细胞因子风暴”，临床表现为发热、低血压、器官衰竭等。CRS 的严重程度与 CAR-T 细胞输注剂量相关，且接受环磷酰胺联合氟达拉滨预处理的患者，CRS 发生率更高。这是因为预处理会清除体内的 “细胞因子 sink 细胞”（如调节性 T 细胞），导致支持 CAR-T 细胞增殖的细胞因子积累，进一步加剧 CAR-T 细胞的过度激活和扩张。 免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）：通常在 CRS 发生后出现，且严重程度与 CRS 相关，临床表现为头痛、意识障碍、癫痫等。其发病机制与全身性炎症反应、内皮细胞活化导致血脑屏障破坏相关。目前尚无获批的 CRS 或 ICANS 预防药物，只能通过对症治疗（如使用 IL-6 受体拮抗剂托珠单抗治疗 CRS）缓解症状，因此优化 CAR 设计、降低毒性成为关键。 图 2 体外与体内 CAR-T 细胞生产流程对比左半部分：体外 CAR-T 生产流程，包含白细胞分离、T 细胞分离激活、转导、扩增、回输等步骤；右半部分：体内 CAR-T 生产流程，通过静脉注射病毒载体或纳米载体，直接在体内完成 T 细胞的转导与 CAR 表达。 三、体内 CAR-T 细胞生成：技术突破与递送平台 为解决体外制造的弊端，体内 CAR-T 细胞生成技术应运而生 —— 通过注射携带 CAR 基因的递送载体，直接在患者体内完成 T 细胞的工程化改造，无需体外操作（图 2 右半部分）。该技术不仅能简化流程、降低成本，还可避免体外扩增导致的 CAR-T 细胞耗竭，同时可能减少毒性反应。目前主要的递送平台分为病毒载体和纳米载体两大类（表 1）。（一）病毒载体递送系统 病毒载体因转导效率高、可实现 CAR 基因稳定表达，是体外 CAR-T 制造的 “金标准”，也被用于体内 CAR-T 生成，主要包括腺相关病毒（AAV）和慢病毒（LV）。 腺相关病毒（AAV）：AAV 具有安全性高、可在分裂与非分裂细胞中实现长期 episomal 表达（不整合到宿主基因组）的优势。Nawaz 等人在研究中，通过注射携带 CAR 基因的 AAV，成功在体内重编程免疫细胞，实现肿瘤消退。但 AAV 也存在局限性：携带基因片段的容量有限，且大规模生产 GMP 级 AAV 成本较高，同时仍有极低概率发生随机整合，存在插入突变风险。 慢病毒（LV）：慢病毒可将 CAR 基因稳定整合到宿主基因组，实现长期表达，且转导效率高、宿主范围广。为提高体内转导的靶向性（避免转导非 T 细胞），研究人员对慢病毒进行改造 —— 在病毒表面融合 T 细胞特异性配体（如抗 CD8 scFv、纳米抗体），实现对循环 T 细胞的精准靶向。例如，Pfeiffer 等人将 CD8-scFv 融合到尼帕病毒假型慢病毒表面，通过腹腔注射到移植人 CD34 + 细胞的 NSG 小鼠体内，成功实现 CD19-CAR-T 细胞的体内生成；Michels 等人开发的 “VivoVec” 慢病毒平台，无需预处理即可实现 CAR-T 细胞在体内的有效扩增和存活，解决了体外 CAR-T 细胞需预处理才能存活的问题。 慢病毒的主要风险在于插入突变——CAR 基因随机整合到宿主基因组可能导致原癌基因激活或抑癌基因失活，引发二次肿瘤；同时，慢病毒可能转导生殖细胞或抑制性免疫细胞（如调节性 T 细胞），导致生殖细胞基因改变或抗肿瘤效果削弱。此外，大规模生产 GMP 级慢病毒流程复杂、成本高昂，也限制了其临床应用。三、体内 CAR-T 细胞生成：技术突破与递送平台（二）纳米载体递送系统 为规避病毒载体的安全性与成本问题，非病毒纳米载体成为体内 CAR-T 递送的重要方向。这类载体具有制备简单、可规模化生产、安全性高的优势，且可通过设计实现 T 细胞靶向递送，主要包括聚合物基纳米载体和脂质基纳米载体（如脂质纳米颗粒 LNPs）。 聚合物基纳米载体：常用材料包括聚乙烯亚胺（PEI）、聚（β- 氨基酯）（PβAE）、聚乙二醇（PEG）等，可通过静电作用与带负电的 CAR 基因（DNA 或 mRNA）结合，形成稳定的纳米复合物。Moffett 等人的研究显示，PβAE 聚合物负载 CAR-mRNA 后，可高效转染原代 T 细胞，且毒性极低；Yu 等人则利用 PEG、PEI 和聚酰胺 - 胺（PAMAM）自组装形成的纳米颗粒（SNPs）包裹 CAR 质粒 DNA（pDNA），在 Jurkat 细胞（一种人 T 细胞白血病细胞系）中的转染效率达到 Lipofectamine 2000（常用转染试剂）的 10 倍，证明了聚合物纳米载体在 T 细胞基因递送中的潜力 。聚合物纳米载体的核心优势在于可通过化学修饰调整性能：例如，PEG 修饰可减少载体被免疫系统清除，延长体内循环时间；表面偶联 T 细胞特异性配体（如抗 CD3 抗体、CD5 靶向肽）可提升对循环 T 细胞的靶向性，降低对肝脏、脾脏等器官的非特异性毒性 。但部分聚合物（如高分子量 PEI）存在一定细胞毒性，且体内转导效率仍需进一步提升，是当前研究需突破的关键。 脂质基纳米载体：主要包括脂质体（Liposomes）和脂质纳米颗粒（LNPs），凭借良好的生物相容性和基因包载能力，成为体内 mRNA 递送的主流平台之一。 脂质体：由磷脂双分子层形成的闭合囊泡，可根据电荷分为阳离子、阴离子和中性脂质体，其中阳离子脂质体因能与带负电的核酸快速结合，被广泛用于 CAR 基因递送。其结构中的磷脂双分子层可模拟细胞膜成分，降低免疫原性，同时通过表面修饰（如靶向配体）实现 T 细胞精准递送。 脂质纳米颗粒（LNPs）：由阳离子可电离脂质、辅助脂质、PEG 化脂质和胆固醇组成，能高效包载 CAR-mRNA 或 pDNA。研究表明，可电离 LNPs 介导的 CAR 表达效率与电穿孔（体外 T 细胞转染常用技术）相当，但 T 细胞存活率显著更高 —— 电穿孔可能导致 T 细胞膜损伤，而 LNPs 通过内吞作用进入细胞，对细胞完整性破坏更小 。 脂质基纳米载体的临床转化潜力已得到验证：Zhou 等人设计的 LNPs 同时包裹 IL-6 shRNA（抑制 IL-6 表达以降低 CRS 风险）和 CD19 靶向 CAR-pDNA，静脉注射到急性淋巴细胞白血病（ALL）异种移植小鼠模型后，体内生成的 CAR-T 细胞展现出与传统体外 CAR-T 细胞相当的抗肿瘤效果；Smith 等人则利用 PβAE 聚合物纳米载体包裹白血病特异性 CAR-pDNA，通过反复静脉注射，在白血病、前列腺癌和乙肝病毒（HBV）诱导的肝癌小鼠模型中，均观察到体内 CAR-T 细胞介导的显著肿瘤消退。不过，脂质基纳米载体仍面临 器官靶向性不足的问题：静脉注射后，大部分 LNPs 易被肝脏中的肝细胞吞噬，导致肝脏毒性风险增加，同时降低 T 细胞转导效率。为解决这一问题，研究人员通过表面修饰实现靶向优化 —— 例如，Rurik 等人将 CD5 抗体偶联到 LNPs 表面，使载体能特异性结合 T 细胞表面的 CD5 分子，显著提升 T 细胞转染效率，同时减少肝脏蓄积。 表 1 体内 CAR-T 细胞生成递送系统对比 （三）体内 CAR-T 技术的关键挑战 尽管体内 CAR-T 细胞生成展现出巨大潜力，但仍存在三大核心挑战，需通过技术优化逐步解决： 精准靶向 T 细胞：当前递送载体难以实现 100% T 细胞靶向，可能转导调节性 T 细胞（Treg）或恶性细胞，影响治疗效果或引发安全风险。例如，若载体转导 Treg 细胞，CAR-Treg 可能抑制效应 T 细胞的抗肿瘤活性；若转导肿瘤细胞，肿瘤细胞表面表达的 CAR 可能 “遮蔽” 靶抗原，导致 CAR-T 细胞无法识别（即 “抗原掩盖”）。在一例儿童 B 细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者中，体外 CAR-T 治疗时因单个白血病细胞被 CAR 基因转导，最终导致治疗耐药。解决方案包括：在载体表面偶联高亲和力 T 细胞特异性配体（如抗 CD3、CD8 scFv）、设计 T 细胞特异性启动子（如 CD4/CD8 启动子，仅在 T 细胞中启动 CAR 基因表达）。 CAR 表达的持久性调控：CAR 表达时间需与治疗需求匹配 —— 血液系统肿瘤可能需要长期 CAR 表达以防止复发，而实体瘤或非肿瘤疾病（如自身免疫病）可能需要短期表达以降低毒性。慢病毒载体因能稳定整合 CAR 基因，单次注射即可实现长期表达，但无法灵活调整；纳米载体（尤其是 mRNA 载体）介导的 CAR 表达为暂时性，需通过多次注射控制表达时长，但多次注射可能增加免疫原性（如载体引发的抗体反应）。未来需开发 “可控表达系统”，例如利用小分子药物调控 CAR 基因的开关，实现 “按需表达”。 毒性控制：体内 CAR-T 细胞虽可避免体外预处理相关毒性（如感染风险），但仍可能因 CAR 设计或过度激活引发 CRS、ICANS 等毒性。例如，含 CD28 共刺激域的 CAR-T 细胞比 4-1BB 基 CAR-T 细胞更易引发早期毒性。当前主流解决方案是在 CAR 中引入 “安全开关”： 自杀基因：如诱导型半胱天冬酶 9（iCas9），当出现严重毒性时，注射小分子药物（如 AP1903）可激活 iCas9，诱导 CAR-T 细胞凋亡； 清除标志物：在 CAR-T 细胞表面表达 CD20 或截短型表皮生长因子受体（tEGFR），毒性发生时注射相应抗体（如利妥昔单抗、西妥昔单抗），通过抗体依赖的细胞毒性（ADCC）或补体依赖的细胞毒性（CDC）清除 CAR-T 细胞； 可逆抑制分子：如酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼（Dasatinib），可抑制 CD3ζ 和 ZAP70 的磷酸化，暂时阻断 CAR 信号，毒性缓解后停药即可恢复 CAR-T 细胞功能，避免不可逆的细胞清除 。四、超越 CAR-T：CAR-NK、CAR-M 细胞的体内工程化潜力 为突破 CAR-T 细胞在实体瘤治疗中的局限（如 TME 浸润差、毒性高），研究人员将目光转向其他免疫细胞，通过 CAR 工程化改造，开发出 CAR-NK（自然杀伤细胞）、CAR-M（巨噬细胞）等新型细胞疗法，且其体内生成技术也成为研究热点。（一）CAR-NK 细胞：低毒、现货型治疗新选择 NK 细胞是先天免疫的核心细胞，无需抗原致敏即可杀伤肿瘤细胞，且具有以下优势，使其成为 CAR 工程化的理想对象： 低毒性：NK 细胞不依赖 TCR 识别抗原，不会引发移植物抗宿主病（GvHD）；同时，NK 细胞在体内存活时间短（通常数周至数月），可减少 CRS、ICANS 等长期毒性； 现货型潜力：异基因 NK 细胞（如脐带血来源）无需基因编辑即可避免 GvHD，可批量生产为 “现货型” 产品，解决自体 CAR-T 的时效性问题； 双重杀伤机制：CAR-NK 细胞可通过 “CAR 依赖途径”（识别肿瘤抗原后释放穿孔素、颗粒酶）和 “CAR 非依赖途径”（如激活受体 NKG2D 识别肿瘤细胞表面应激分子）杀伤肿瘤，降低抗原逃逸风险（图 3A、B）。1. CAR-NK 的结构优化 CAR-NK 的基础结构与 CAR-T 类似，但需加入 NK 细胞特异性信号域以增强功能：例如，在胞内域引入 NKG2D 相关信号分子（如 DAP10、DAP12），可激活 NK 细胞特有的杀伤通路，提升细胞毒性；此外，NK 细胞的体内存活时间短，可通过工程化使其表达 IL-2、IL-15 等细胞因子（如第四代 CAR-NK），延长存活并增强增殖能力。例如，Liu 等人开发的脐带血来源 CAR-NK 细胞，同时表达 CD19-CAR 和 IL-15，在白血病小鼠模型中展现出长期存活和强效抗肿瘤活性。2. CAR-NK 的体内生成进展 目前体内 CAR-NK 生成的研究仍处于早期阶段，仅 Andorko 等人报道了初步成果：他们设计了一种靶向 CD7（NK 细胞表面标志物）的慢病毒载体，包裹抗 CD20 CAR 基因，静脉注射到小鼠体内后，可特异性转导 NK 细胞，生成的 CD20-CAR-NK 细胞能有效清除 CD20 阳性肿瘤细胞。未来需进一步优化载体的 NK 细胞靶向性，同时提升转导效率，以满足临床需求。（二）CAR-M 细胞：实体瘤 TME 的 “破局者” 巨噬细胞具有强大的吞噬能力和 TME 重塑能力，在实体瘤治疗中展现出独特优势： 强效 TME 浸润：巨噬细胞可主动迁移至实体瘤内部，且能耐受 TME 中的免疫抑制因子（如 IL-10、TGF-β），不易发生细胞耗竭 ； TME 重塑功能：CAR-M 细胞可通过吞噬肿瘤细胞、分泌促炎细胞因子（如 TNF-α、IL-1β），将 “免疫抑制型 TME”（以 M2 型巨噬细胞为主）转化为 “免疫激活型 TME”（以 M1 型巨噬细胞为主），同时激活适应性免疫（如 T 细胞）； 双重杀伤途径：与 CAR-NK 类似，CAR-M 细胞可通过 “CAR 依赖途径”（抗原特异性吞噬）和 “CAR 非依赖途径”（如 Fc 受体介导的 ADCC、ROS/iNOS 介导的细胞毒性）杀伤肿瘤（图 3C、D）。1.CAR-M 的临床前证据 Klichinsky 等人开发的 HER2 靶向 CAR-M 细胞，在乳腺癌、卵巢癌小鼠模型中，不仅能直接吞噬 HER2 阳性肿瘤细胞，还能分泌 IL-12 等细胞因子，招募并激活 T 细胞，形成 “CAR-M-T 细胞协同抗肿瘤效应”；此外，CAR-M 细胞的毒性极低，临床前研究中仅观察到轻微发热、体重下降，未出现 CRS 或 ICANS 。2.CAR-M 的体内生成探索 目前 CAR-M 的体内生成研究集中在纳米载体递送：由于巨噬细胞具有较强的吞噬能力，可通过 “被动靶向”（如利用纳米载体的尺寸效应，被巨噬细胞主动吞噬）实现 CAR 基因递送。例如，研究人员利用 PEG 修饰的脂质纳米颗粒包裹 CAR-mRNA，静脉注射后可被脾脏、肿瘤中的巨噬细胞吞噬，实现 CAR-M 细胞的体内生成 。未来需进一步提升载体对肿瘤部位巨噬细胞的靶向性，减少对正常组织（如肝脏、脾脏）巨噬细胞的影响。 图 3 CAR-NK 与 CAR-M 细胞的杀伤机制对比A：CAR-NK 细胞的 CAR 依赖杀伤途径：CAR 识别肿瘤抗原后，释放穿孔素、颗粒酶 B 杀伤肿瘤细胞，同时分泌促炎细胞因子激活 T 细胞；B：CAR-NK 细胞的 CAR 非依赖杀伤途径：通过激活受体（如 NKG2D）、FasL/Fas 通路、CD16 介导的 ADCC 杀伤肿瘤；C：CAR-M 细胞的 CAR 依赖杀伤途径：CAR 识别肿瘤抗原后，通过特异性吞噬清除肿瘤细胞，分泌细胞因子激活 T 细胞；D：CAR-M 细胞的 CAR 非依赖杀伤途径：通过非特异性吞噬、MHC-I 介导的抗原提呈、ROS/iNOS 介导的毒性杀伤肿瘤。（三）CAR-Treg 细胞：自身免疫病治疗的新方向 调节性 T 细胞（Treg）是维持免疫耐受的关键细胞，通过 CAR 工程化改造后（即 CAR-Treg），可特异性抑制针对自身抗原的免疫反应，用于治疗自身免疫病（如类风湿关节炎、1 型糖尿病）。与 CAR-T 细胞不同，CAR-Treg 细胞通过分泌 IL-10、TGF-β 等抑制性细胞因子发挥作用，而非直接杀伤细胞 。 当前 CAR-Treg 细胞的研究以体外制造为主，但面临 “表型不稳定性” 问题 —— 体外扩增过程中，Treg 细胞可能丢失抑制功能，转化为促炎效应 T 细胞，反而加剧炎症。体内 CAR-Treg 生成技术可能解决这一问题：直接在体内对 Treg 细胞进行工程化，避免体外培养的 “人工环境干扰”，维持其抑制表型。例如，Fransson 等人通过体外制造靶向髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）的 CAR-Treg 细胞，成功缓解了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE，多发性硬化症动物模型）的症状 ；若能实现体内生成，将大幅简化治疗流程，提升临床转化潜力。不过，目前体内 CAR-Treg 生成尚未见报道，需突破 Treg 细胞特异性递送、CAR 表达调控等技术瓶颈。五、总结与未来展望（一）技术总结：从体外到体内的核心变革 CAR-T 细胞治疗历经数十年发展，已从早期的体外自体制造，逐步向体内通用型技术演进。体外制造虽在血液系统肿瘤中疗效显著，但受限于高成本、长周期、高毒性三大瓶颈；体内生成技术通过病毒或纳米载体直接在患者体内完成 T 细胞工程化，可同时解决这三大问题 —— 无需体外操作降低成本、单次注射缩短治疗周期、避免体外扩增减少细胞耗竭与毒性。此外，CAR-NK、CAR-M 等新型细胞疗法的兴起，进一步拓展了 CAR 技术的应用边界：CAR-NK 以低毒、现货型优势补充血液系统肿瘤治疗，CAR-M 则凭借 TME 重塑能力突破实体瘤治疗瓶颈，而 CAR-Treg 为自身免疫病提供了精准调控方案 。 从技术成熟度来看，体外 CAR-T 仍是当前临床主流，但体内技术已展现出不可替代的潜力：病毒载体（如慢病毒、AAV）凭借高转导效率成为体内递送的 “基准平台”，纳米载体（如 LNPs、聚合物颗粒）则以安全性和规模化优势成为未来方向。不过，无论是哪种技术路径，精准靶向（避免非靶细胞转导）、可控表达（匹配治疗需求调节 CAR 时长）、毒性控制（降低 CRS/ICANS 风险）仍是需持续突破的核心难题。（二）未来研究方向：从技术优化到临床转化1.载体技术：提升靶向性与安全性 T 细胞特异性递送：当前载体对 T 细胞的靶向效率仍不足 50%，需通过 “双靶向策略” 进一步优化 —— 例如，在慢病毒表面同时融合 CD3 和 CD8 scFv，或在 LNPs 表面偶联 CD5 抗体与 T 细胞特异性肽，实现 “双重识别” 以提升靶向精度；同时，可利用 T 细胞特异性启动子（如 IL-2 启动子），确保 CAR 基因仅在 T 细胞中表达，即使载体转导非靶细胞，也不会产生功能性 CAR 。 非整合型载体开发：为规避慢病毒的插入突变风险，需推动非整合型病毒载体（如无整合慢病毒、高容量腺病毒）和非病毒载体（如 mRNA-LNPs、转座子纳米颗粒）的研发。例如，mRNA-LNPs 介导的 CAR 表达为暂时性，且无基因组整合风险，已在小鼠模型中实现安全的体内 CAR-T 生成，未来需解决 mRNA 易降解、需多次注射的问题。2.CAR 设计：适配体内生成特性 体内生成的 CAR-T 细胞无需体外扩增，需通过 CAR 结构优化增强其体内存活与功能： 代谢适配：体外 CAR-T 细胞依赖有氧糖酵解快速扩增，而体内 T 细胞更依赖脂肪酸代谢维持长期存活，因此可在 CAR 胞内域加入调控代谢的信号分子（如 AMPK 激活域），促进体内 CAR-T 细胞向记忆表型分化 ； TME 抗性：针对实体瘤，可设计 “装甲型 CAR”—— 例如，在 CAR 中加入 PD-L1 抗体片段或 TGF-β 受体阻断域，使体内生成的 CAR-T 细胞能抵抗 TME 的免疫抑制； 多靶点识别：为应对实体瘤抗原异质性，可开发体内双价 CAR 生成技术 —— 例如，利用双启动子载体同时递送两种 scFv，使单个 T 细胞表达能识别 HER2 和 IL13Rα2 的双价 CAR。3.联合治疗：拓展体内 CAR 技术的应用场景 与免疫检查点抑制剂联用：体内生成的 CAR-T 细胞虽可通过 PD-1/CD28 开关受体抵抗 TME 抑制，但联合 PD-1 抗体仍可进一步增强疗效。例如，在黑色素瘤小鼠模型中，体内 CD19-CAR-T 细胞联合 PD-1 抑制剂，可使肿瘤完全消退率从 30% 提升至 60%； 与化疗/放疗联用：低剂量化疗（如环磷酰胺）可清除体内抑制性 Treg 细胞，为体内生成的 CAR-T 细胞提供 “存活空间”。研究显示，在淋巴瘤小鼠模型中，低剂量环磷酰胺预处理可使体内 CAR-T 细胞的扩增效率提升 2 倍 ； 跨疾病应用：除肿瘤外，体内 CAR 技术可拓展至非肿瘤领域。例如，Rurik 等人利用 CD5 靶向 LNPs 递送 FAP-CAR mRNA，在小鼠心脏纤维化模型中，体内生成的 FAP-CAR-T 细胞可特异性清除活化成纤维细胞，恢复心脏功能 ；未来还可探索用于治疗 HIV（靶向 CD4-CAR）、自身免疫病（靶向自身抗原的 CAR-Treg）等。4.临床转化：建立标准化体系 质量控制标准：体内 CAR 载体需建立严格的质量控制指标，包括载体纯度（如病毒载体的复制 competent 病毒检测、纳米载体的粒径均一性）、转导效率（体外 T 细胞转导效率需≥70%）、安全性（如内毒素含量、细胞毒性）； 剂量探索：需通过临床 I 期试验确定载体的安全剂量范围 —— 例如，慢病毒载体的剂量过高可能引发炎症反应，过低则转导效率不足，需在安全性与疗效间找到平衡； 生物标志物监测：开发非侵入性生物标志物（如外周血中 CAR 基因的 ctDNA、细胞因子水平），实时监测体内 CAR-T 细胞的扩增、存活与毒性，为临床剂量调整提供依据。（三）结语 从 1989 年 Gross 等人首次提出 CAR-T 概念，到 2025 年体内 CAR 技术进入临床前验证阶段，CAR 细胞治疗已实现从 “实验室” 到 “临床” 的跨越，但其发展仍处于 “上半场”。体外制造技术的优化（如自动化 GMP 生产）与体内生成技术的突破（如靶向纳米载体）将并行推进，而 CAR-NK、CAR-M 等新型细胞疗法的加入，将构建起 “覆盖血液瘤 - 实体瘤 - 非肿瘤疾病”的 CAR治疗体系。 未来 5-10 年，随着载体靶向性、CAR 设计与联合治疗策略的持续优化，体内 CAR 技术有望实现三大目标：一是将治疗成本降至 10 万美元以下，使更多患者可及；二是实现实体瘤的 CAR 治疗突破，填补当前临床空白；三是拓展至自身免疫病、纤维化等非肿瘤领域，成为 “泛疾病” 的免疫治疗平台。当然，这一过程仍需克服技术、临床与伦理层面的多重挑战，但可以肯定的是，从“体外定制”到“体内生成” 的变革，将重新定义 CAR 细胞治疗的未来。 识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

CAR-T疗法被誉为癌症的治愈方法，但这种“神奇技术”到底是什么，我们又能对其抱有多大期望呢？ 免疫肿瘤学领域如今蓬勃发展，吸引了数十亿欧元的投资。能够重新改造我们自身的免疫系统以对抗癌症，这无疑引发了巨大的期望。在首个检查点抑制剂药物取得成功之后，许多人的目光转向了CAR-T细胞疗法。 目前已有五种CAR-T疗法上市。该领域如今发展迅猛，全球正在进行超过500项CAR-T临床试验。但这种疗法真的是许多人所认为的癌症治愈方法吗？该技术能够满足如此高的期望吗？副作用是否值得关注？其高昂的价格是否值得？ 为回答这些最紧迫的问题，我与该领域的部分领军人物进行了交流，以概述CAR-T技术的现状。 这种“神奇疗法”是如何起作用的？ “CAR疗法同时涉及细胞疗法、基因疗法和免疫疗法。它与迄今为止存在的所有医学形式都大相径庭。”朱诺治疗公司的联合创始人米歇尔·萨德兰告诉《科学家》杂志。 CAR-T疗法包括输注携带嵌合抗原受体（CAR）的工程T细胞，该受体位于细胞膜上。这种受体的外部结构域被设计为能够识别肿瘤细胞上的特定分子。当这种情况发生时，该分子的内部信号域被激活，刺激T细胞攻击癌细胞。 CAR有几代，其中带有额外内部结构域的CAR可以进一步增强对预定靶标的免疫反应。 CAR-T细胞疗法最常见的程序是从接受治疗的患者体内提取T细胞，这一过程称为白细胞分离术。然后对T细胞进行基因改造，使其表达CAR分子并进行扩增。最后，将它们重新注入患者体内，准备对抗肿瘤。 CAR-T细胞如何改变癌症治疗？ 基于检查点抑制剂的免疫疗法在某些癌症患者群体中取得了相当的成功。检查点抑制剂阻断了肿瘤细胞用来躲避免疫细胞的一种机制。基于CAR-T细胞的免疫疗法更进一步，对T细胞本身进行工程改造，以增强针对特定肿瘤抗原的自然免疫反应。 CAR-T临床试验在严重形式的血液癌症中显示出巨大的缓解率，高达93%。考虑到大多数CAR-T临床试验招募的是对许多甚至所有其他可用治疗方法均无反应的癌症患者，这一结果尤其令人印象深刻。这些结果激发了患者和投资者的期望，但重要的是要记住，该疗法也可能存在缺陷。 法国CAR-T开发商Cellectis的首席执行官安德烈·乔利卡直言不讳：“我只是想现实一点，CAR-T并非癌症的神奇疗法。” 事实上，CAR-T细胞实际上已被与严重的甚至致命的副作用联系在一起，例如神经毒性和细胞因子释放综合征。多年来，许多公司在CAR-T疗法的晚期临床试验中报告了死亡事件。这让许多人意识到，该技术可能并不像最初预期的那样完美。 这些死亡事件大多发生在针对免疫B细胞上的CD19抗原的CAR-T疗法试验中——这是CAR-T领域中研究最多的目标。目前上市的五种CAR-T疗法中有四种针对CD19，用于治疗影响B细胞的多种癌症，如淋巴瘤和白血病。 “CAR-T最初引发的热潮和兴奋导致了在CD19靶点领域的广泛且迅速的临床开发。”比利时CAR-T公司Celyad的首席科学官大卫·吉尔哈姆解释道。 “目前研究正忙于追赶，特别是关于毒性方面。缺乏良好的临床前模型阻碍了这项工作，但随着临床样本的可用性，正在进行的调查现在更接近于识别潜在机制并进一步完善方法。” 谁在开发CAR-T？ 诺华是首个在2017年推出CAR-T疗法的公司，名为Kymriah。这种针对B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）的一次性治疗在对标准治疗无反应的患者中，三个月后的缓解率达到83%。 吉利德是第二个将CAR-T疗法推向市场的公司。这家大型制药公司在美国食品药品监督管理局批准Kite的CAR-T细胞疗法Yescarta之前，仅几周就收购了CAR-T开发商Kite Pharma。该疗法在患有罕见血液癌症——侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤的患者中诱导了72%的缓解率。 然而，对免疫系统的毒性影响，如细胞因子释放综合征和神经系统疾病，仍然是Kymriah和Yescarta令人担忧的问题。 一项关于这些CD19 CAR-T治疗的毒性的最新研究发现，Yescarta导致免疫系统疾病的比例高于Kymriah，而两种疗法的致命毒性事件相似。根据该研究，两种疗法的死亡率均为5.4%。作为对比，免疫检查点疗法的死亡率在0.36%到1.08%之间。 2021年2月，美国食品药品监督管理局批准了第三种CAR-T细胞疗法。Breyanzi由百时美施贵宝旗下的朱诺治疗公司开发，用于某些类型的非霍奇金淋巴瘤。尽管该疗法治疗后的完全缓解率为54%，但也可能引发严重的副作用，包括细胞因子释放综合征和神经毒性。 一个月后，美国食品药品监督管理局批准了首个不针对CD19的CAR-T细胞疗法。由蓝鸟生物和百时美施贵宝开发的Abecma靶向B细胞成熟抗原（BCMA），是首个用于多发性骨髓瘤的CAR-T细胞疗法。然而，该疗法仅在四种或更多先前治疗失败后使用，这并不令人惊讶，因为其缓解率仅为28%。 第五种获批的CAR-T疗法是Kite Pharma的Tecartus，于2021年10月初获批。该疗法用于成人复发性或难治性B细胞前体急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者，治疗三个月后的缓解率为52%。尽管未报告非常严重的不良反应，但92%的患者遭受了某种形式的细胞因子释放综合征，87%的患者出现了神经毒性。 许多公司正在进行CAR-T疗法的临床试验，包括英国的Autolus Therapeutics、TC Biopharm和Adaptimmune，法国的Cellectis，比利时的Celyad，以及美国的Bellicum Pharmaceuticals和Mustang Bio。 使CAR-T疗法更安全 尽管在临床试验中出现了严重的副作用和数起死亡事件，但有些人认为，对于对其他可用治疗方法均无反应的患者来说，CAR-T疗法值得一试。然而，CAR-T开发商已经在开发更安全的下一代CAR-T细胞。 其中之一是Cellectis。该公司开发了一种CAR-T技术，目前已授权给Servier和Allogene，该技术包含一个开关控制系统，只有在患者服用药物时才会激活经过改造的T细胞。该疗法正在进行第一阶段试验，此前在同情用药的情况下，挽救了两名患有侵袭性白血病的婴儿。 美国的Bellicum Pharmaceuticals正在开发一种类似的技术，名为GoCAR-T，需要药物rimiducid来激活CAR-T细胞。与其他CAR-T细胞疗法不同，Bellicum的方法靶向实体肿瘤。该公司的主要GoCAR-T候选药物目前正在针对特定类型的胰腺癌患者进行第一阶段/第二阶段试验。 靶向实体肿瘤是免疫肿瘤学领域的一大挑战。在这些癌症中，自然浸润的T细胞数量较少，而且肿瘤细胞会创造出一种免疫抑制环境，从而抑制免疫反应。这使得实体肿瘤比液体肿瘤更难治疗。 Celyad也在靶向实体肿瘤。该公司正在开发一种CAR-T版本，使T细胞携带另一种名为自然杀伤细胞的免疫细胞的受体。“这是一种颠覆性的技术，因为该受体能够结合八种不同的配体，这些配体在超过80%的实体和血液恶性肿瘤中表达。”Celyad的联合创始人克里斯蒂安·霍姆西解释道。“我们已经启动了该领域最大且最广泛的试验之一，针对七种适应症。” 另一种策略是将CAR-T细胞与其他类型的癌症免疫疗法相结合。例如，通过与阻断癌细胞对抗T细胞的防御机制的检查点抑制剂一同输注，可以提高CAR-T细胞的疗效并降低剂量。然而，这种方法的一个缺点可能是使CAR-T疗法本已令人望而却步的价格进一步提高。 事实上，上市的CAR-T疗法的定价已经引发了争议。在德国，诺华的Kymriah定价为32万欧元，吉利德的Yescarta定价为32.7万欧元。专家估计，在考虑进行该程序所需的住院和其他药物费用后，总费用可能超过每名患者100万欧元。 现货CAR-T细胞 CAR-T领域的一个主要目标是开发异体CAR-T疗法。也就是说，从健康供体中获取T细胞，以便在患者需要时随时可用，而不是分别改造每个患者的T细胞。 Cellectis是首个在临床试验中测试这两种现货CAR-T细胞疗法的公司，尽管有人怀疑该技术是否能达到使用患者细胞时相同的成功水平。一个关键挑战是降低移植物抗宿主病的风险，即供体的免疫细胞攻击患者的机体。 Celyad也在开发现货CAR-T疗法。其两种异体候选药物目前正在进行第一阶段试验，初步结果似乎很有希望，尚未报告严重的毒性。 现货技术将为患者节省宝贵的时间，目前患者需要等待大约两周时间，以便将其细胞运送到制造设施进行改造后再返回。但根据Celyad的联合创始人克里斯蒂安·霍姆西的说法，开发现货疗法是一条“科学上具有挑战性的途径”。 “我怀疑异体CAR-T能否成为真正的现货疗法。”他告诉我。“在免疫学方面，以及制造、运输、可追溯性和银行解决方案等必要条件方面，仍存在一些重大的科学挑战，以达到大规模患者治疗所需的规模。” 事实上，在2021年10月初，Allogene在一名淋巴瘤患者接受的基因编辑的现货CAR-T细胞中发现染色体异常后，整个异体CAR-T领域遭受了巨大打击。 在利益相关者试图确定这一发现的严重程度时，Allogene的整个临床管线被搁置。这导致Allogene和Cellectis的股价遭受重创，因为Allogene使用了Cellectis的基因编辑技术。 当科学家们试图了解如何克服这些技术挑战时，这些疗法在监管方面也面临着挑战。作为一种全新的疗法类型，CAR-T细胞介于几种监管框架之间，这些框架在不同国家之间可能差异很大。 挑战众多，该技术显然尚未完美，但CAR-T细胞为那些原本没有希望的患者带来了希望。随着首批疗法已经上市，未来几年将有更多更好的替代疗法问世。 参考资料：https://www.labiotech.eu/in-depth/car-t-therapy-cancer-review/ 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观，不代表本站立。