Rimiducid

摘要细胞疗法作为一种新兴治疗方式，有望通过独特且强大的作用模式治疗许多当前难以治愈的疾病。尽管近年来在临床和商业领域取得了显著成功，但细胞疗法仍面临诸多挑战，限制了其广泛转化和商业化，包括合适细胞来源的识别、生成满足患者和疾病特定需求的足够存活、有效且安全的产品，以及开发可规模化的制造工艺。这些障碍正通过下一代工程化方法驱动的前沿基础研究来解决，包括基因组和表观基因组编辑、合成生物学以及生物材料的应用。细胞疗法通过将细胞作为活的药剂施用以对抗疾病，近年来在临床应用和制药市场扩展中经历了爆发式增长。特别是，部分疗法已克服监管障碍并进入商业应用，引发了公众日益增长的认可和关注。其中包括通过基因重编程T细胞的过继细胞转移成功治疗淋巴癌，2017年美国食品药品监督管理局（FDA）分别批准了tisagenlecleucel和axicabtagene ciloleucel用于治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）和大B细胞淋巴瘤（LBCL）。其他近期的成功案例还包括批准使用患者来源的角膜缘干细胞修复受损角膜上皮，以及使用成体干细胞治疗克罗恩病相关瘘管。这些突破建立在数十年基础研究的基础上，它们以及其他前沿疗法的成功，激发了许多此前相互独立的基础生物医学研究和工程领域的巨大跨学科兴趣。伴随这一增长，临床试验数量不断增加，商业批准的疗法也日益增多（表1）。人们对细胞疗法的持续热情，很大程度上源于重新定向细胞固有功能的前景，以实现超越其他更成熟治疗方式的安全性和有效性。尽管生物制剂（包括重组蛋白和其他细胞衍生生物分子）能够利用大分子的识别能力实现高度的靶点特异性，但它们往往具有不利的药代动力学（PK）和药效学（PD）特性，可能限制其安全性和有效性。基因疗法有望通过治疗性转基因递送（通常通过病毒载体）纠正细胞基因型。然而，基因疗法面临多项转化挑战，包括对转基因表达的定位、分布和强度缺乏控制，许多载体的转基因负载大小受限，以及由于适应性免疫反应而无法支持重复给药周期，这一点已有充分记载。此外，最近的基因治疗临床试验中还出现了重大安全问题。尽管细胞疗法与基因疗法面临许多相同的转化障碍（包括潜在致瘤性相关的安全担忧以及产品报销面临的高制造成本），但它们具有独特的内在特征，有望提高疾病治疗效果。例如，细胞能够自然迁移、定位，甚至在特定组织或腔室中增殖。因此，利用这些特性的细胞疗法不仅相对于受PK/PD特性限制的生物制剂，而且相对于靶向特异性仍难以工程化改造的基因疗法，都具有生物分布和靶向递送优势。此外，细胞能够主动感知多种外部输入，包括小分子、细胞表面标志物蛋白甚至物理力。因此，细胞疗法具有高度复杂的“感知-响应”功能，能够通过检测相关分子信号动态追踪疾病状态，并提供包括激活内在反应或表达治疗性转基因在内的多因素输出响应。最后，由于细胞能够在体内存活、消耗营养并通过产生分泌因子影响外部环境，细胞疗法可用于维持长期内源性药物递送。尽管人体中几乎每种细胞类型（总计约200种）都具有潜在的治疗应用特性，但当代一些最受关注的临床成功案例，是通过细胞功能的工程化改变实现的。例如，上述血液系统恶性肿瘤的临床治疗成果，是利用嵌合抗原受体（CARs）实现的——将工程化DNA构建体导入患者T细胞，使其细胞毒性重新定向至表达B淋巴细胞相关抗原CD19的肿瘤细胞。尽管针对多种适应症的细胞疗法正在取得进展，但开发新产品仍然是一项艰巨的任务，因为针对特定疾病的治疗策略必须克服一系列重大挑战，才能成功生成具有临床和商业可行性的产品（图1）。图1 细胞疗法工艺流程。开发新型细胞疗法每个步骤的选择和考量。细胞来源是起点，无论是异基因还是自体来源，但这些细胞通常会被修饰为定制化细胞疗法。然后必须进行规模化制造，这目前是行业的巨大瓶颈。最后，临床应用的检测、分销和递送相对早期的生产流程挑战较小。aAPC=人工抗原呈递细胞；GMP=良好生产规范；IP=知识产权。- 需识别能够产生具有稳健和稳定特性产品的细胞来源，且为便于工程化改造，该细胞来源需易于进行基因操作。- 细胞产品需具备足够的存活率，以确保足够的治疗作用持续时间。- 必须通过重新定向现有细胞特性或工程化新特性，实现可预测且明确的治疗效价水平。- 细胞的药代动力学/药效学特性必须与疾病的特定生理需求相匹配。- 必须确保细胞疗法产品的安全性和致瘤性特征，以限制与宿主免疫系统的不良反应并防止肿瘤形成。- 必须开发可规模化的制造工艺，能够高效且经济地生成足够数量的细胞用于患者给药。在本综述中，我们将探讨如何通过一系列新兴生物工程化方法（包括基因组和表观基因组编辑、合成生物学以及生物材料的应用）来补充、增强甚至重编程细胞固有功能，从而推动开发能够克服这些挑战的新型、更有效的细胞疗法。目前，这些策略不仅被用于增强现有疗法的作用模式，还通过为上述重大挑战寻找解决方案，创造全新的治疗方式。我们首先简要概述当前细胞疗法的现状，重点介绍该领域近期临床和商业成功的代表性案例，包括使用CAR T细胞（CAR-T）疗法治疗癌症，以及使用干细胞疗法治疗心肌梗死和糖尿病等其他适应症，描述相关突破以及当前的局限性。然后，我们简要介绍目前正在开发用于细胞疗法应用的各种细胞来源，强调其优势和局限性。文章的核心部分聚焦于上述生物工程化方法的一些最具创新性和令人兴奋的临床前应用，评估这些有前景的概念验证研究如何为解决重大挑战指明方向。最后，我们将强调未来的机遇，并讨论它们如何进一步扩大细胞疗法的临床和商业应用范围。细胞疗法的进展与挑战人类细胞疗法最早于20世纪50年代以骨髓移植的形式出现，用于治疗血源性癌症。这些治疗作为安全有效的标准护理方法的成功，长期以来证明了细胞治疗疾病的潜力，并为近几十年来使用脐带血来源的造血干细胞（HSCs）和造血祖细胞（HPCs）作为来源的治疗获得监管批准铺平了道路。这些产品已广泛应用于临床，构成了FDA迄今为止批准的大部分细胞疗法（表1）。尽管源自其他细胞来源的治疗其他适应症的疗法同时也在取得进展，但这些疗法的转化面临着商业化的巨大障碍，包括难以获取和制造的细胞来源识别。尽管大多数批准的疗法使用自体细胞（直接源自患者），但临床和临床前研究中探索的许多候选疗法是异基因的，即源自其他个体。尽管来自不同来源的细胞各有优缺点（专栏1；表2），但开发解决它们与宿主免疫系统相互作用的策略，仍然是新产品开发的主要障碍。这些以及其他挑战对安全性和有效性构成了持续障碍，导致在过去十年之前，仅有少数新型细胞疗法获得监管批准并进入市场。专栏1 细胞来源与免疫反应目前正在开发用于治疗的各种细胞来源，根据其起源可大致分为三类（表2）：自体细胞（构成产品的细胞源自患者）、异基因细胞（源自人类但来自与患者不同的个体）和异种细胞（源自非人类）。细胞来源是一个基本因素，不仅影响治疗产品的获取、制造和疗效，还影响安全性，因为它是患者对移植细胞免疫反应的关键决定因素。强烈的免疫反应可能导致毒性和细胞无法存活，无法为患者提供治疗益处。尽管异种来源细胞的潜力很大，但由于难以克服宿主免疫排斥，这些来源的使用仍然很少。因此，我们下面的讨论仅限于自体和异基因细胞的优缺点。自体细胞自体细胞疗法的目标是通过重新定向患者自身细胞的固有功能来治疗疾病。如上所述，目前已批准或正在积极进行临床开发的自体疗法主要有三种细胞类型：骨髓来源的造血干细胞（HSCs）、从外周血中分离的免疫效应细胞和诱导多能干细胞（iPSCs）。这些疗法的一个普遍限制是产品质量依赖于患者的健康状况。例如，许多过继性疗法研发管线使用的免疫细胞在患有慢性疾病的供体中可能会耗尽。当细胞来源的这种变异性与复杂的扩增方案和较长的交付周期相结合时，通常会导致高制造成本和报销挑战。然而，尽管存在这些挑战，自体疗法仍具有显著优势，包括避免免疫反应、由于长期植入时间而增强疗效以及具有再次给药的潜力。应当指出，自体疗法仍可能通过编码异种或先天性缺失抗原的转基因引发免疫反应的风险。非耐受转基因的免疫原性已在临床前得到证实，涉及适应性免疫反应的细胞（CD8⁺和CD4⁺T细胞）和体液部分。然而，在临床中尚未观察到此类有害的免疫反应。例如，在最近的一项研究中，通过转移表达突变β-珠蛋白基因的慢病毒修饰造血干细胞，实现了β-地中海贫血临床症状的完全逆转，且未出现明显的免疫反应。异体细胞与自体来源不同，异基因产品有望从丰富的细胞来源进行规模化生产，这可以显著提高成本效益并简化制造，尽管通常会以治疗效价为代价。尽管存在一些异基因细胞疗法来源的显著例子，这些来源引发的免疫原性反应最小——自然杀伤（NK）细胞不会诱导移植物抗宿主病（GvHD），并且间充质干细胞（MSCs）在大多数情况下具有免疫逃避状态——但大多数异基因细胞疗法由于免疫不匹配而容易与宿主发生负面相互作用。这对反应持续性构成了关键挑战，需要免疫抑制方案或新的工程化方法。例如，目前正在开发多种异基因疗法，其中细胞经工程化改造后可持续递送由于先天性突变而在患者中缺失或减少的治疗性蛋白。对于大多数这些应用，细胞被封装在生物聚合物基质中，以防止免疫识别并减少免疫抑制的使用。然而，对封装材料的异物反应仍然是一个持续的挑战（详见下文生物材料部分的讨论）。这种方法的优势包括能够再次给药，以及由于消除了与周期性输注相关的峰谷效应而具有稳定的药代动力学。目前正在开发多种封装异基因细胞疗法，包括用于1型糖尿病（NCT04678557）、血友病（NCT04541628）和青光眼（NCT04577300）。首批突破性非造血祖细胞产品之一是一种前列腺癌疗法：从患者体内分离树突状细胞，在体外暴露于重组肿瘤抗原，然后重新引入体内以促进T细胞介导的抗肿瘤反应。这种名为sipuleucel-T（由丹德里昂制药公司销售）的疗法在2010年获得FDA批准时，被吹捧为世界上第一种“个性化”癌症疗法，但由于疗效不一致和报销不确定性，其应用受到限制，这两者都是制造过程高成本和技术复杂性的后果。其他早期进入市场的产品包括使用患者和捐赠者来源的成纤维细胞局部治疗组织损伤，以及使用患者来源的软骨细胞修复关节软骨。其中最早的疗法是一种双层组织，由牛Ⅰ型胶原蛋白基质（种植有人包皮来源的新生儿成纤维细胞）和人包皮来源的新生儿表皮角质形成细胞衍生的表皮片组成，于20世纪90年代末由美国Organogenesis公司推向市场，在过去十年中还有更多产品进入市场（表1）。随着FDA在过去十年批准CAR-T疗法，细胞疗法的商业化进展显著加速。此后，用于难治性多发性骨髓瘤的CAR-T产品以及用于急性淋巴细胞白血病和大B细胞淋巴瘤的其他产品已进入市场，并且基于有前景的临床结果，使用捐赠者来源的自然杀伤（NK）细胞的疗法有望获得批准。目前，针对实体瘤和液体肿瘤适应症的大量临床试验已经完成，使用了各种效应细胞类型（表3列出了部分代表性案例，其他详细综述见相关文献），其中一些报告了突破性成功。然而，尽管这种多样化仍在继续，大多数过继性癌症细胞疗法试验仍使用患者来源的T细胞，尽管其在血液系统恶性肿瘤中取得了成功，但在治疗其他癌症方面仍面临一系列持续挑战。这些挑战包括细胞因子释放综合征（CRS）带来的安全问题，CRS由施用细胞的过度激活或不受控制的增殖导致。此外，需要改进肿瘤抗原靶向，以防止抗原逃逸或脱靶细胞毒性，这两者都是CAR-T疗法应用于实体瘤的关键障碍。最后，实体瘤微环境（TME）不仅构成限制T细胞迁移和浸润的物理屏障，而且与实体瘤微环境相关的免疫抑制信号还会降低效应功能以及细胞增殖和存活能力。正如我们在本综述后面所讨论的，克服这些挑战可能需要结合不同的工程化方法，包括遗传和/或表观遗传修饰以增强T细胞固有特性，以及开发允许T细胞与其细胞外环境相互作用的合成调控回路，从而实现效应功能的条件性调控或实体瘤微环境重塑。近年来围绕CAR-T产品的热情推动了针对多种适应症的细胞疗法开发投资，尽管癌症疗法仍然受到最多关注，但已有多个新兴领域的临床成功引发了关注（表4）。这些领域包括自身免疫性疾病、中枢神经系统（CNS）和神经退行性疾病、心血管疾病以及各种罕见疾病的治疗。其中一些疗法是利用间充质干细胞（MSCs，也称为基质细胞）开发的，由于其免疫调节和抗炎特性、分化为多种成熟细胞类型的潜力、易于从多种捐赠者组织来源分离以及良好的安全性，间充质干细胞长期以来一直被视为潜在的治疗产品来源。尽管间充质干细胞在临床前研究中显示出前景，但由于细胞分离程序、培养条件和最终扩增过程的变异性，大多数早期转化间充质干细胞疗法的努力缺乏适当的产品质量控制，导致产品不一致，进而导致多项临床失败。前面提到的用于治疗克罗恩病相关瘘管的darvadstrocel（目前在欧盟和日本提供）是少数商业化的间充质干细胞产品之一。另一种知名产品是remestemcel-L，其使用捐赠者来源的、培养扩增的间充质干细胞治疗移植物抗宿主病（GvHD）。该疗法最初由Osiris制药公司销售，后来被Mesoblast公司收购，已在加拿大获得监管批准，随后在新西兰和日本获得批准。尽管其用于治疗移植物抗宿主病的FDA批准仍在等待中，但该疗法最近已进行了治疗新冠病毒相关细胞因子释放综合征的临床试验（NCT04371393）。心血管疾病是过去20年中完成了多项间充质干细胞相关临床研究的另一个领域。一些最初被认为通过植入和分化替换受损宿主心脏组织来治疗心肌梗死的全身注射细胞疗法，后来的研究表明，这些细胞实际上并未植入，而是被宿主免疫系统迅速清除，而组织再生是通过间充质干细胞分泌的免疫原性和组织生成因子实现的。不幸的是，后续临床试验中的不一致结果导致这些疗法未能商业化，突显了作用模式未表征、效价不一致和体内存活能力差等挑战如何阻碍间充质干细胞的转化。目前有越来越多的疗法正在通过临床试验取得进展，这些疗法使用多能干细胞衍生的细胞产品。一个显著的例子是，源自诱导多能干细胞（iPSCs）的视网膜色素上皮细胞用于治疗急性黄斑变性和Stargardt病。中枢神经系统疾病是此类疗法的另一个活跃研究领域，多个研究小组正在研究使用诱导多能干细胞生成多巴胺能神经元用于帕金森病治疗，并且针对中风、癫痫、脊髓损伤、阿尔茨海默病、多发性硬化症和疼痛的多种基于干细胞的方法正在进行临床前开发。基于诱导多能干细胞的疗法的一个长期研究重点是工程化胰腺β细胞替代物，用于治疗1型糖尿病。早期使用尸体来源或非人胰岛的许多努力受到供应限制，并且在没有免疫抑制的情况下在宿主中表现出较差的长期存活能力，这限制了其广泛应用。最近，新一代公司已开始使用胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞衍生的胰岛细胞。近年来，在分化方案优化方面取得了重大进展，能够严格控制通过阶段特异性发育中间体的进程，产生具有更高成熟度、纯度和效价的细胞。然后，成熟胰岛可被置于某种封装技术或装置中，并植入人体，为患者提供功能性治愈。尽管围绕这些疗法存在巨大热情，但仍存在多项技术障碍，包括开发能够以足够临床使用数量实现成熟细胞表型的分化方案。细胞工程化创新工程学科的创新——基因组和表观基因组编辑、合成生物学和生物材料——目前正在被探索用于解决细胞疗法中的重大挑战。尽管其中一些方法已成功用于生成商业化产品，但许多仍处于临床前阶段。尽管如此，在使用这些方法改进现有细胞疗法并创建新的细胞疗法研发管线方面，已经取得了巨大进展。基因组和表观基因组编辑近年来细胞疗法的进展，得益于CRISPR和CRISPR相关（Cas）蛋白作为可编程工具在活细胞中工程化人类基因组和表观基因组的开发。CRISPR-Cas系统只需改变相关向导RNA（gRNA）的间隔序列，即可靶向特定基因组位点，这相对于其他基因组编辑工具（如锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应子核酸酶（TALEN）蛋白）具有优势，后者需要蛋白质工程化才能靶向新序列。这种改进的易用性可直接转化为优化的设计、构建和测试周期，从而缩短细胞疗法的上市时间并降低制造成本。尽管如此，ZFN和TALEN蛋白的使用已取得了多项重要的临床进展，为CRISPR-Cas技术的快速部署和临床应用铺平了道路。在本节中，我们将重点讨论基于CRISPR-Cas的工具在上述重大挑战背景下在细胞疗法中的应用。最具特征的CRISPR-Cas系统利用源自化脓性链球菌的Cas9蛋白在人类基因组中产生双链断裂（DSBs）。然而，其他几种CRISPR-Cas平台在未来也将具有重要的临床意义，包括源自多种原核生物的新型Cas蛋白以及在实验室中工程化改造的Cas蛋白（专栏2）。人类细胞中的CRISPR-Cas介导的双链断裂通过非同源末端连接（NHEJ）、同源定向修复（HDR）（图2a）或其他相关途径进行修复。Cas9介导的非同源末端连接已被用于沉默致病位点、去除有害插入以及赋予病毒抗性。在治疗性基因组编辑和细胞疗法中，早期的里程碑研究表明，Cas9介导的BCL11A红细胞增强子的非同源末端连接可潜在地治疗镰状细胞病或β-地中海贫血。此外，使用Cas9靶向人类免疫缺陷病毒（HIV）或人乳头瘤病毒（HPV）基因组特定区域的非同源末端连接策略，在限制这些病毒传播方面具有一定作用。图2 利用CRISPR-Cas介导的基因组和表观基因组编辑改进细胞疗法。a | 基因组编辑可应用于纠正单基因疾病。程序化基因组编辑产生的双链断裂（DSBs）通常通过人类细胞中的非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）修复机制进行修复。非同源末端连接通常导致靶向基因组位点附近的插入或缺失（indels），可用于可编程的内源性遗传破坏。相比之下，在存在供体DNA模板的情况下，同源定向修复可允许基因组DNA的精确替换，包括用于纠正与病理相关的DNA或整合具有临床重要性的转基因负载的供体模板。b | 基于CRISPR-Cas的基因组编辑技术非常适合多重编辑，可用于改进细胞疗法，包括嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法。多重基于CRISPR-Cas9的基因组编辑（此处同时靶向编码人类β₂-微球蛋白（β₂m）、PD1和内源性T细胞受体（TCR）的基因）与慢病毒递送的CAR结合，可用于生成具有改进功能和安全性特征的CAR-T细胞。c | 核酸酶失活的CRISPR-Cas系统不会产生双链断裂，但仍能精确靶向基因组DNA。这些基于CRISPR-Cas的“表观基因组编辑”平台能够在人类细胞中稳健激活或抑制转录（分别为CRISPR激活（CRISPRa）或CRISPR干扰（CRISPRi））或定制控制表观遗传修饰，可用于塑造基因调控和细胞功能。d | 这些变革性技术的融合可用于在细胞疗法中工程化有利特性，例如，通过在治疗级诱导多能干细胞（iPSCs）中破坏引发免疫识别的位点，通过使整合负载与自然遗传调控程序协调（即从自然驱动TCR表达的位点（TRAC）表达CAR-T受体）或过表达有益的内源性分子来克服治疗效价和自然效价的限制，以及通过重塑染色质特征更有效地重编程细胞谱系定向，例如，改进从成纤维细胞衍生诱导多能干细胞。gRNA=向导RNA；PAM=原间隔序列邻近基序；Transcript.=转录的。专栏2 CRISPR-Cas基因组编辑工具箱天然存在的基于CRISPR-Cas的基因组编辑工具典型的Cas9变体源自化脓性链球菌（SpCas9；此处称为Cas9）。Cas9识别并结合NGG原间隔序列邻近基序（PAM），结合后在PAM上游约3nt处切割，产生平末端双链断裂（DSB）。其他天然存在的Cas蛋白（例如SaCas9、NmCas9、CjCas9、AsCas12a和LbCas12a）具有更小的尺寸和改变的PAM特异性，分别有助于病毒包装和扩大靶向范围。此外，一些Cas蛋白可以位点特异性靶向RNA，特别是Cas13变体，最近的研究也集中在利用I型CRISPR系统，例如Cascade复合物，其包含多种不同的蛋白亚基。尽管这些平台中的每一个都具有巨大的临床潜力，但正在进行的表征效率、预先存在的免疫力以及核酸酶活性和修复机制的工作将提高其疗效和实用性。这些努力将受益于FDA最近发布的关于将基因组编辑纳入人类基因治疗产品的指南。工程化的基于CRISPR-Cas的基因组编辑工具除了重新利用天然存在的CRISPR-Cas平台外，还对Cas9蛋白进行了工程化改造，以提高特异性、扩大靶向范围并允许在不产生双链断裂的情况下进行序列修饰。Cas9蛋白中的关键突变产生了工程化变体，例如SpCas9-HF1、eSpCas9和HypaCas9，这些变体显示出改进的全基因组靶向特异性，同时保持高靶向活性。其他工程化努力产生了具有改变的PAM特异性的Cas9蛋白变体，最近还产生了近乎“无PAM”的版本，几乎可靶向任何内源性位点。此外，最近的进展包括无需诱导双链断裂即可改变DNA的Cas9蛋白，例如碱基编辑技术、基于CRISPR的转座酶和引导编辑平台。用于控制基因表达和表观基因组的核酸酶失活型基于CRISPR-Cas的工具已创建核酸酶失活、失活的CRISPR-Cas系统（dCas），其靶向人类基因组的方式与传统Cas蛋白类似，但在位点特异性识别后不进行切割。这些基于dCas的平台已被重新用作支架，将转录调节结构域和表观遗传效应递送至特定位点以获得治疗益处。使用dCas募集的广泛使用的转录激活因子包括VP64、VPR、p300和协同激活介质（SAM）效应子。SunTag平台还能够将多种效应子稳健募集到目标位点，可用于强效诱导基因表达。最近，已描述了源自人类蛋白的紧凑且稳健的转录激活因子。已开发了类似的技术来抑制人类基因表达，通过募集抑制因子（如KRAB结构域或其双组分融合体（即KRAB-MeCP2））。还使用dCas蛋白将DNA甲基化修饰结构域（包括DNMT3a-3l或去甲基化酶TET1的催化结构域）募集到人类位点，分别导致位点特异性DNA甲基化或去甲基化。对这些技术的全面评估超出了本综述的范围；然而，越来越清楚的是，这些工具与传统基因组编辑和最先进的细胞疗法的协同作用将是工程化细胞未来的重要组成部分。尽管目前利用Cas9介导的非同源末端连接靶向单个位点和/或单基因疾病的临床进展最为显著，但近年来旨在同时靶向多个位点的多重编辑方法也取得了实质性进展（图2b）。例如，使用同时靶向T细胞受体（TCR）、β₂-微球蛋白（β₂m）和PD1基因的Cas9 mRNA和gRNAs进行基于CRISPR-Cas9的多重基因组编辑，结合慢病毒递送的CAR，已用于生成TCR、I类HLA分子和PD1缺陷的异基因CAR-T细胞，并为通用CAR-T细胞的开发开辟了道路。重要的是，此类组合策略可能对于解决细胞疗法面临的一些重大挑战至关重要——特别是通过降低自体细胞来源的免疫原性特征并增强工程化细胞的存活能力，进而提高患者安全性和治疗效价。展望未来，多重基因组编辑技术还可能在建模和治疗更复杂的疾病（其中病理由多个位点协同作用引起）方面发挥关键作用。多重基因组编辑技术还可能为克服细胞疗法面临的许多障碍提供新方法，例如通过同时敲除多个否则会成为治疗性蛋白生产瓶颈或使细胞在不利条件下更容易发生凋亡的位点。使用非同源末端连接进行基因组编辑以构建细胞疗法的一个复杂因素是，非同源末端连接后双链断裂的修复可能具有不可预测性。相比之下，同源定向修复可导致基因组序列中精确且可预测的变化。例如，基于CRISPR-Cas的同源定向修复已被用于提高CAR-T细胞疗法的稳健性，通过将CD19特异性CAR定向到T细胞受体α链（TRAC）位点，实现更均匀的CAR表达和增强的效价。最近，通过同源定向修复，使用核糖核蛋白（RNP）介导的CRISPR-Cas组件和设计的供体模板递送，将外源负载插入原代人类T细胞。这种方法允许进行稳健的单独或多重修饰，并被用于纠正致病突变和工程化内源性TCR位点以识别NY-ESO-1癌症抗原。将这种方法扩展到在T细胞的特定位点敲入不同变体库，也被证明是筛选针对实体瘤的改进效价的有效方法。CRISPR-Cas系统产生的双链断裂可能导致有害的基因组重排和细胞毒性，对工程化细胞的安全性和存活能力构成担忧。例如，据报道，小鼠胚胎干细胞和造血祖细胞以及人类细胞系中的CRISPR-Cas9介导的双链断裂，会导致大量非预期缺失，如果不进行适当评估和控制，可能会驱动危险的病理过程。此外，观察到在永生化人类视网膜色素上皮细胞中基于CRISPR-Cas9的基因组编辑会诱导p53介导的DNA损伤反应。因此，人们也相当关注工程化无需产生双链断裂即可进行基因组编辑的基于CRISPR-Cas的工具。例如，已设计基于CRISPR-Cas的碱基编辑器，能够在不产生双链断裂的情况下靶向并编辑特定位点的基因组序列。尽管与传统基于核酸酶的基因组编辑相比，碱基编辑器相对较新，但它们无疑将在细胞疗法中显示出重要用途。例如，最近在原代人类T细胞中使用多重碱基编辑的研究，开发了一种生产异基因CAR-T细胞的新平台。其他技术，如基于CRISPR-Cas的引导编辑和基于CRISPR-Cas的转座酶，也允许无需双链断裂的位点特异性基因组编辑，并且可能成为未来细胞疗法基因组编辑工具库中的有用工具（专栏2）。由于CRISPR-Cas蛋白源自细菌或古菌，另一个重要考虑因素是用于细胞工程化和治疗性蛋白生产的基因组和表观基因组编辑工具的潜在免疫原性或毒性。例如，CRISPR-Cas组件在哺乳动物中可能具有免疫原性，某些患者可能通过先前接触Cas蛋白获得免疫力。此外，已有研究表明，在多种人类癌症细胞系中，仅Cas9的表达就与p53通路的激活以及使p53失活的突变富集相关。尽管体外编辑方法结合细胞筛选和选择可以规避许多这些问题，但它们可能成本高昂且不适合规模化。尽管这些免疫原性和毒性问题是明确的担忧，但靶向体内编辑的研究正在迅速成熟，并将在未来发挥关键作用。更全面地描述和解决这些担忧的进一步框架，将有助于未来在动物和患者中进行药物发现、疾病建模和细胞工程化的成功。除了正在进行的临床试验和创建新的CAR平台方面的进展外，基因组编辑在开发“现成”工程化细胞作为疗法方面也发挥了重要作用。例如，经过编辑去除CD7和TRAC的人类T细胞，在治疗T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）方面显示出效价，且无异种移植物抗宿主病（GvHD）的证据。如上所述，CRISPR-Cas9的多重应用也已被用于同时破坏内源性TCR、HLA和PD1，以生产免疫原性降低的异基因CAR-T细胞。在细胞分化前进行基因组编辑是另一种选择，可产生均质细胞群体，可能使制造更具规模化和成本效益。例如，在诱导多能干细胞中破坏HLA基因已被证明是提高免疫相容性的有效方法，最近通过对HLA进行等位基因特异性编辑以产生假纯合性，生成了能够逃避T细胞和NK细胞识别的诱导多能干细胞。敲除B2M并同时过表达CD47的类似策略，也产生了免疫原性显著降低的诱导多能干细胞。基于人类诱导多能干细胞的现成疗法正在迅速取得进展，针对实体瘤和晚期血液系统恶性肿瘤的临床试验正在进行中（分别为NCT03841110和NCT04023071）。这些在临床环境中使用基因组编辑的令人兴奋的进展已扩展到多种严重适应症，包括细菌感染（例如NCT04191148）、β-地中海贫血和镰状细胞病（例如NCT03655678；EDIT-301）、血友病B（NCT02695160）以及粘多糖贮积症I/II型（例如NCT03041324）等。尽管传统基于CRISPR-Cas的基因组编辑会导致基因组序列的改变，但人类细胞中使用的大多数CRISPR-Cas平台可以通过简单的氨基酸替换来灭活并使其成为核酸酶失活型。这些所谓的失活或dCas系统能够创建易于编程的合成转录因子和染色质修饰剂，进而建立了新兴的表观基因组编辑领域（图2c）。表观基因组编辑策略已被用于重编程和指导细胞谱系特异性，并用于建模人类疾病。例如，CRISPR激活（CRISPRa）技术在合成诱导控制细胞命运特异性的主转录因子表达方面显示出前景。例如，dCas9-VPR已被用于强效驱动内源性人类神经基因2的表达，从而迫使诱导多能干细胞进入神经元谱系定向。有趣的是，与传统的cDNA过表达相比，基于CRISPRa的谱系转换策略还会对内源性染色质产生改变，据观察可提高细胞重编程效率。类似的方法已被用于工程化肌细胞、重编程胰腺细胞命运、在体内同时靶向多个位点以及工程化多能性。此外，基于CRISPR-Cas的表观基因组编辑工具已被用于建模多种人类疾病和疾病治疗方法，其中基因表达和/或表观基因组存在失调。关于用于疾病模型的表观基因组编辑的全面讨论超出了本综述的范围；然而，最近值得注意的例子包括神经肌肉疾病和酶促疾病，以及肾脏疾病和糖尿病。随着这些精确编程人类基因表达和人类表观基因组的新技术不断涌现和成熟，当与当前最先进的细胞疗法和传统基因组编辑相结合时，它们无疑将成为下一代细胞药物的重要组成部分。这些技术可能特别适用于定制基因产物的精确水平，并防止工程化细胞中治疗性转基因或细胞因子随时间发生表观遗传沉默。与Cas蛋白一样，许多用于基于CRISPR-Cas的表观基因组编辑应用的最有效且广泛采用的转录效应子，是使用非人类（通常是病毒）天然甚至合成的转录和/或染色质修饰剂开发的。因此，这些效应子结构域在体内可能具有内在的免疫原性，特别是如果长期表达的话，这存在风险且可能性很高。未来旨在识别或工程化源自人类细胞的转录和/或表观遗传效应子蛋白的努力，将是克服患者中这些免疫障碍的关键。此外，尽管靶向基于CRISPR-Cas的表观基因组编辑工具的特异性可能远高于全局破坏人类表观基因组的小分子，但仔细分析表观基因组编辑的稳定性和特异性，对于在未来几年内定制细胞疗法的治疗效价、持续性和药代动力学/药效学特性至关重要。总之，基因组和表观基因组编辑的结合，为在人类细胞中工程化有利特性和行为带来了令人兴奋且意义深远的新机会（图2）。如上所述，这些新兴技术进步已经带来了利用人类细胞作为治疗方式的改进方法。鉴于这一进展，在基因组和表观基因组编辑工具的帮助下，细胞疗法几乎肯定将继续取得进展。针对细胞疗法面临的重大挑战，基因组和表观基因组编辑技术可能会加速大量低免疫原性细胞的生产，这些细胞还具有稳健和稳定的临床特性以及严格可控的存活能力。此外，通过利用人类细胞的天然表观遗传程序，基于CRISPR-Cas的表观基因组编辑可能有助于对治疗性转基因或内源性生物分子进行可调控制和可预测输出。尽管取得了这种变革性进展，但仍存在许多挑战。例如，通常难以在工程化细胞中稳定维持大型遗传负载的存在和高均匀表达。复杂的遗传回路（见下文）和表观基因组编辑技术的结合，可用于解决表达水平的不一致性，这对于平衡CAR-T活性特别重要，并可用于防止工程化细胞中的表观遗传耗竭。此外，由于转基因负载随时间可能发生表观遗传沉默，利用表观基因组编辑工具潜在地逆转和/或防止治疗性转基因负载的任何表观遗传沉默，是一个独特的机会。最后，尽管在过去十年中，从分化细胞产生诱导多能干细胞以及指导其随后的再分化取得了显著进展，但所使用的过程和方案通常效率低下和/或费力，因此不适合规模化制造。对人类基因组进行遗传工程化、对人类转录组进行表观遗传工程化以及定制培养条件和小分子组合的联合方法，可能会解决这些低效问题，并有助于引领下一代细胞疗法的浪潮。合成生物学数十年来，人们一直致力于利用基因工程将转基因或人工基因引入治疗性细胞，以创建更安全、更有效的细胞产品。许多这些方法（包括将CARs引入T细胞）都被冠以“工程化”的标签；大多数使用数十年前的遗传学工具将转基因引入细胞，对其表达的强度或时间缺乏控制。合成生物学领域在过去二十年中逐渐兴起，其目标是通过应用定量设计规则，使基因工程结果更加精确、可预测和可重复。尽管该领域最早在微生物系统中取得了突破，但近年来在人类细胞工程化方面也取得了进展。这一进展在很大程度上受到以下可能性的推动：通过精确控制治疗性转基因表达或分泌治疗性因子，或通过编程细胞感知与特定组织腔室或疾病状态相关的生物分子种类并通过改变细胞行为做出响应，来增强细胞疗法（图3a）。尽管目前大多数努力旨在提高治疗效价、药代动力学/药效学特性和安全性，但合成生物学有潜力提供解决本综述引言中讨论的所有重大挑战的工程化解决方案，包括扩大可用于治疗的细胞类型范围，以及使细胞制造过程更高效、更稳健（图3b）。图3 利用合成生物学方法赋予治疗性细胞增强的功能特性。a | 建立新的合成调控连接。可将工程化调控回路引入治疗性细胞，以创建人工输入-输出关系。这可将外部用户控制或与疾病相关的分子信号与多种治疗性输出连接起来。b | 合成生物学在工程化新型细胞疗法应用中的未解决挑战。未来的发展应包括开发人源化成分、开发更大容量的载体以容纳更大、更复杂的回路，以及使用合成回路指导细胞分化（例如从诱导多能干细胞到免疫效应细胞）。近年来报道的合成生物学在细胞疗法中的应用，其复杂性各不相同，从由工程化蛋白构建的简单开关模块，到多组件“回路”——人工基因和蛋白调控网络，被编程为将特定分子输入转换为治疗性输出。回路设计大致分为两类功能（图4）。第一类能够通过小分子药物等输入对外源控制基因表达或蛋白活性的剂量或时间响应曲线。这些“用户操作”回路可用于激活或灭活转基因表达，使治疗方案能够优化治疗作用的时间。第二类将生物分子输入的自主识别与下游活性联系起来，从而建立对与特定组织腔室或疾病状态相关的外源信号的闭环感知和响应。第二类中的回路通常与工程化细胞表面受体偶联，这些受体检测细胞外蛋白或小分子种类。两类回路都具有中间信号处理“基序”，能够根据定量定义的操作将输入转换为输出。例如，反馈控制可用于调节回路输出的时间，而布尔逻辑操作可用于仅在存在特定输入集时激活回路。这两种基序在增强治疗效果方面都具有明确的应用：前一种情况可用于调节治疗作用的动力学，而后一种情况可利用组合分子识别更精确地将治疗性输出导向特定目标细胞或组织（图3a）。这一方法范围的一个例证是最近使用合成生物学解决过继性T细胞疗法中特异性和活性相关挑战的研究。该领域最成功的应用之一是一种工程化蛋白安全自杀开关，旨在导致植入细胞的凋亡。该开关的嵌合设计包含与人FK结合结构域融合的人半胱天冬酶9，能够在小分子药物AP1903施用后二聚化并激活凋亡信号传导。尽管该开关最初开发用于在干细胞移植过程中消除同种反应性T细胞，但随后在CAR-T疗法的临床试验中被用于在细胞因子释放综合征发生时限制效应细胞增殖（NCT03696784）。在另一项应用中，化学二聚化通过细胞内激活结构域的膜募集来诱导CAR活性（图4a）。这种所谓的“开关”CAR提供了一种工具，可通过施用二聚化剂AP21967微调CAR-T产品的体内效价，或通过去除药物在细胞因子释放综合征发作期间中止激活。图4 | 利用合成回路增强治疗功能。a | 已开发出合成调控回路，通过小分子远程控制CAR活性和提高靶细胞特异性（synNotch）来改进嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法。远程控制回路包含拆分型CAR，可通过施用小分子二聚化剂重建CAR活性，实现对T细胞抗肿瘤功能的外源控制。SynNotch是一种可编程受体，能够感知细胞表面配体，并通过激活基因表达做出响应。这种响应可与CAR的产生相结合，进而使CAR能够识别第二种配体，从而实现布尔“与”门功能。b | 已设计出能够自主治疗病变组织的合成“感知-响应”程序。在一组示例应用中，已开发出将炎症细胞因子感知与抗炎细胞因子分泌相结合的系统。TA=转录激活因子。CAR-T合成生物学最近的一个重要研究重点是开发增强肿瘤靶向特异性的策略，以期实现实体瘤治疗。一个著名的例子（最初由Lim及其同事开发）是一种受体介导的基因调控回路设计，其中附加了单链抗体的工程化嵌合Notch受体在与相邻细胞表面的配体结合后被触发，导致转录激活因子的蛋白水解释放和转基因表达（图4a）。这种名为synNotch的系统最初被工程化为在存在第二种配体时表达CAR，从而能够对抗原组合进行双输入“与”门识别。synNotch的进一步开发产生了利用反馈实现开关样激活、在目标细胞抗原密度阈值下完全激活或完全不激活的回路，以及能够区分特定肿瘤与旁观者组织的复杂多输入布尔门回路。其他改进CAR-T特异性的解决方案侧重于工程化细胞外识别能力，包括拆分、通用和可编程（SUPRA）CARs，其使用多价细胞外蛋白支架介导对抗原组合的识别。另一种已描述的系统中，工程化蛋白在存在抗原集时发生构象变化，暴露出能够募集CAR-T细胞的肽。使CAR-T疗法更安全的解决方案包括重新工程化为可诱导或通过小分子施用激活的拆分受体，这两种策略都能够在细胞因子释放综合征发生时快速灭活CAR功能。已有研究描述了一种创新策略，即使用腺相关病毒（AAV）将“分类器回路”引入细胞，该回路被编程为感知肿瘤特异性转录因子和微小RNA特征。然后，表达回路输出（一种独特的细胞表面配体）的细胞可被携带同源CAR的T细胞靶向。最后，最近使用受体结构域交换开发了一种合成受体，能够选择性识别活化淋巴细胞的标志物。这种名为同种异体防御受体的蛋白，允许过继性T细胞通过靶向同种反应性淋巴细胞来抵抗宿主免疫排斥，从而在动物模型中产生更长期的治疗益处。合成生物学的另一个主要研究重点是开发通用化的闭环调控回路，这些回路经工程化改造可监测生理或疾病状态特征，并以治疗性输出做出响应。已利用一种策略，即使用转基因报告盒重新路由内源性信号传导通路。一个此类例子是两阶段细胞因子转换回路，在其第一阶段将TNFα依赖性NF-κB信号传导转换为IL-22产生，然后激活细胞因子受体并通过STAT3发出信号，驱动抗炎细胞因子IL-10和IL-4的转录产生和分泌（图4b）。在封装并植入小鼠后，含有该回路的细胞能够减轻小鼠银屑病模型中的炎症。类似地，已构建了β细胞模拟设计细胞，其引入了一个回路，通过将糖酵解介导的Ca²⁺进入与驱动胰岛素表达和分泌的转录回路诱导相结合来感知葡萄糖。当植入糖尿病小鼠模型时，工程化细胞以葡萄糖响应方式分泌胰岛素，从而纠正胰岛素缺乏并基本消除高血糖。尽管这些设计主要侧重于改进疾病特异性作用模式，但合成生物学的发展为临床和商业可行性开辟道路，可能来自解决制造和细胞来源挑战——尽管这些挑战代表了限制产品商业化的主要瓶颈，但该领域对其关注有限。一种潜在方法可能涉及控制促进有利细胞固有表型的转录调控因子过表达的回路，甚至作为分化“引导”程序。此类回路可用于指导免疫效应细胞分化为治疗性强效亚群，或促进细胞分化和扩增为更具存活能力或效价的细胞产品。在安全性方面，可构建使用细胞状态响应回路感知异常或致瘤性调控状态并激活细胞死亡的调控方案，这种策略已成功用于在微生物中创建条件性安全开关。这种方法的一个显著早期例子是，使用关键转录因子的定时表达，通过基因回路引导诱导多能干细胞分化为胰腺β样细胞。这种方法已被用于通过诱导性转录激活回路引导诱导多能干细胞分化为肝脏类器官。随着该领域继续将上述策略整合到临床相关治疗管线中，它面临两组总体工程化挑战：首先，需要开发和完善新的合成元件和回路设计，以识别与疾病相关的物理和生物分子特征，创建稳健且可调的回路连接，并将其与治疗性输出偶联；其次，需要开发细胞工程化策略，以精确、可重复地将回路递送到构成治疗产品的细胞群体中，确保稳定、定量定义、可重复的行为。对于第一个挑战，尽管取得了上述进展，但哺乳动物细胞中的工程化调控方案通常缺乏微生物系统中发现的控制程度和可扩展性。可用于哺乳动物基因回路工程化的基因表达控制系统数量有限，且可扩展性相对较差。此外，它们主要源自微生物（例如TetR、Gal4），这引发了对其免疫原性的担忧。未来，在细胞疗法应用中，将越来越优先使用由人源化蛋白和基因构建的模块化系统。最近解决这一缺陷的一个例子是创建了一组基于锌指（ZF）的转录调控因子，已证明其在人类细胞中具有功能。虽然基于锌指的回路可扩展以支持复杂的多基因调控行为，但这些系统也可用于精确的开关样表达控制。该领域的另一个持续研究重点是工程化表面蛋白，以扩展细胞与环境相互作用的能力。这包括开发能够将疾病特异性输入与内源性信号传导或转录回路偶联的定制化可配置受体。除上述例子外，工程化细胞外配体响应受体的最新进展包括创建用于工程化外源因子结合与细胞内信号传导通路激活之间连接的模块化框架，以及工程化对可溶性细胞因子配体敏感的CARs。通过工程化表面蛋白表达实现组织和疾病特异性靶向的方法也已显示出早期前景。经工程化改造以瞬时表达编码PSGL1/SLeXX（一种在炎症反应中起关键栓系作用的表面蛋白）的单一转基因的间充质干细胞，在皮肤炎症小鼠模型中显示出增强的向炎症部位的定位。在另一项小鼠研究中，趋化因子受体CXCR4的过表达增加了间充质干细胞向缺血心肌组织的归巢。这些临床前结果表明，通过微调多基因表达重塑细胞的表面蛋白表达谱（其“表面组”），是一种有望提高治疗效价和药代动力学/药效学特性的策略。将来自表面表达蛋白的输入与下游信号传导回路偶联，将是表面蛋白工程化的重要延伸。该领域最近对基于蛋白的回路工程化的重视，提供了用于工程化依赖磷酸化和蛋白水解的合成信号传导网络的元件和设计框架。这些设计已被用于创建能够感知细胞外环境并以比基因回路快得多的速度传递信息的翻译后信号传导通路。这些回路获得的响应速度可通过整合基于磷酸化的信号传导网络或离子通道调控等快速时间尺度事件来增强药代动力学特性。如前一节所讨论的，释放合成生物学的全部潜力，需要克服目前在将复杂合成回路有效引入治疗性细胞方面的大小和相应复杂性限制。许多原代细胞类型的转染效率低且扩增潜力有限，再加上修复模板大小的限制，将基于CRISPR的整合限制在少数几个基因，使得编码复杂功能面临挑战。同样，通过逆转录病毒和转座子载体引入细胞的回路也具有特征性的大小限制，并且还存在拷贝数控制问题，限制了精确性和可重复性。重组酶介导的着陆垫整合技术有望通过允许在特定基因组位点单拷贝整合大型转基因盒，提高回路工程化的精确性和可重复性。然而，这种方法受到整合效率低的阻碍，并且需要从小型亚群扩增细胞，这可能降低产品效价。目前正在探索的另外两种克服这些障碍的方法是引入人类人工染色体或利用大基因组病毒递送多基因系统，而前面提到的基于转座子的CRISPR工具未来可能为复杂回路的稳定整合提供更通用的解决方案。此外，在表观遗传沉默的情况下维持转基因稳定性，是合成回路工程化面临的一项重大挑战，但可能通过部署序列优化和回路设计的组合，以及表观基因组效应子来动态维持“开放”染色质调控状态来解决。解决向治疗性细胞工程化和精确递送复杂回路的相互关联挑战的解决方案，将使合成生物学能够专注于开发具有多方面功能的程序，这些程序可同时编码疾病特异性作用模式、安全机制和回路稳定性，同时建立和维持相关的细胞固有特性。此外，重要的是，这些能力将使合成生物学家有机会采用设计、构建和测试周期，迭代收敛于定量精确且能够更有效地满足疾病和患者特定需求的合成回路。生物材料半透性生物材料和水凝胶已被用于改善治疗性细胞的递送、存活能力、保留和安全性。人们探索了多种生物材料制剂，从可降解水凝胶到不可降解塑料和金属，作为支架来改善递送和存活能力、促进细胞在特定体腔内的保留（即腹腔内、心外膜或眼内）、促进控释并实现可回收性以提高安全性。这些方法已被证明在许多临床前研究和早期临床试验中改善细胞疗法的治疗效果方面具有重要作用。然而，该领域的一个主要目标仍然是开发长期功能性免疫隔离解决方案，以实现异基因细胞的使用。多种类型的免疫细胞在异基因细胞排斥中发挥作用，限制了真正现成细胞疗法产品的开发（图5）。CD4⁺和CD8⁺T细胞通过识别高度变异的主要组织相容性复合体（MHC）I类和MHC II类基因产物，在介导异基因细胞排斥中起核心作用。此外，自然杀伤细胞和巨噬细胞等先天免疫细胞也可介导异基因细胞排斥。已通过CRISPR介导的敲除表达HLA I类和HLA II类基因所需的B2M和CIITA基因，创建了通用诱导多能干细胞。此外，工程化诱导多能干细胞进一步定制化，以高水平表达负调控因子：PDL1、HLA-G和CD47，分别阻断T细胞、自然杀伤细胞的功能并向巨噬细胞提供“不要吃我”信号。通过利用这些策略，多个研究小组已报道生成了低免疫原性或“通用”诱导多能干细胞，这些细胞保留了其多能性潜力，并可分化为多种谱系，如内皮细胞、心肌细胞甚至更复杂的类器官，如胰岛。已发现低免疫原性细胞在临床前人源化小鼠的体外和体内均不会诱导免疫反应。尽管这些临床前数据令人感兴趣，但这些细胞在人类受试者中逃避免疫排斥的潜力仍有待确定。然而，在胰岛移植领域，目前已计划或正在进行多项临床试验，以确定低免疫原性细胞在细胞疗法中的效用。图 5 | 克服异基因细胞疗法免疫排斥的策略。该示意图展示了目前正在研究的、用于克服移植异基因细胞排斥潜在免疫机制的方法。（1）全身性免疫抑制是唯一经临床批准的方法，但会导致免疫力受损和恶性肿瘤风险增加。目前有多种药物方案及联合治疗方法可用于细胞和器官移植，包括使用雷帕霉素和 / 或糖皮质激素、环孢素 A 和 / 或环磷酰胺的治疗，细胞因子阻断和 / 或 JAK-STAT 抑制剂治疗，以及使用抗体耗竭 B 细胞的治疗。（2）利用生物相容性聚合物进行细胞封装，可形成物理屏障，限制 T 细胞和自然杀伤（NK）细胞激活及功能性裂解所需的细胞间接触。（3）通过在移植细胞中直接过表达抑制性通路配体来诱导耐受，从而产生免疫耐受。（4）通过 CRISPR 介导敲除主要组织相容性复合体（MHC）分子并过表达 CD47，生成低免疫原性细胞（即 “通用” 干细胞），可限制 T 细胞和 NK 细胞介导的细胞杀伤，以及巨噬细胞介导的吞噬作用。ADCC = 抗体依赖的细胞介导的细胞毒性；FC = 可结晶片段区；IFN = 干扰素；MAC = 膜攻击复合物；MHC = 主要组织相容性复合体；TCR=T 细胞受体。介导异基因细胞排斥的免疫机制（图5）需要细胞间接触。一种在临床前研究和临床试验中均得到积极探索的策略是将供体异基因细胞封装在半多孔膜内，以实现免疫隔离。这些努力的目标是将移植细胞与患者自身的免疫系统隔离，同时允许可溶性因子的双向运输；例如，葡萄糖和氧气等营养物质的流入以支持移植细胞的长期存活，以及它们产生的治疗性蛋白的输出。最初通过使用海藻酸盐水凝胶促进大鼠胰腺胰岛的免疫隔离，在动物中证明了可行性。这项研究表明，在免疫活性动物中，移植的异基因细胞可在短期内（数周）发挥功能。多年来，许多先进的封装细胞产品原型已在临床中针对多种基于细胞的治疗应用进行了评估，包括眼科、内分泌学、肿瘤学和神经病学。然而，由于宿主对植入生物材料的免疫反应导致装置内纤维化和缺氧，封装细胞产品的长期功能一直难以实现。尽管封装已被证明在防止受体适应性免疫系统对异基因细胞的MHC介导识别以及延长移植细胞存活数周方面非常有效，但移植细胞的长期存活受到对封装生物材料的特征性异物反应（FBR）的限制。异物反应包括一系列过程，始于宿主来源的循环蛋白（如补体和凝血因子、细胞外基质（ECM）蛋白和白蛋白）的沉积。这些蛋白质沉积物促进粒细胞和巨噬细胞的募集和附着。然后，附着的巨噬细胞可融合形成异物巨细胞，并产生导致肌成纤维细胞募集的因子，肌成纤维细胞最终产生过量的促纤维化和细胞外基质蛋白（如胶原蛋白），形成肉芽肿。在广泛纤维化后，可溶性因子的扩散受到极大限制，导致移植细胞死亡和治疗失败。使用供体细胞的移植技术需要长期保护免受异物反应和宿主识别。需要一种半透性水凝胶网络，允许小分子（如一氧化氮、活性氧（ROS）、氧气和细胞因子）自由循环，同时避免封装细胞与这些植入物周围浸润的免疫细胞密切接触。已采用多种策略来调节生物材料的物理化学性质，以减少纤维化并促进移植物的长期存活。已表明，用于调节表面性质的表面化学会影响免疫相关因子的生物反应。已采取多种化学方法来减轻异物反应并防止纤维化；其他文献对此进行了综述。然而，下面重点介绍了一些更接近临床转化的最先进技术。已通过免疫调节小分子修饰水凝胶表面，以防止任何异物反应。已证明一种独特的化学修饰策略，在基于海藻酸盐的水凝胶中使用小分子来调节宿主免疫识别。在小鼠中使用主要材料的腹腔内植入物，确定了三种含有三唑骨架的主要类似物具有最低的异物反应、细胞、巨噬细胞和胶原蛋白沉积，这可能在减轻纤维化方面发挥关键作用。在小鼠中观察到的积极结果已转化为非人灵长类动物。值得注意的是，从该筛选中获得的主要制剂促成了SIG-001的开发，这是一种双室球体，含有表达人凝血因子VIII的工程化人类细胞，最近进入了血友病A的首次人体临床试验。这是一个基于体内发现驱动的表型筛选方法，用于识别具有改进免疫反应的生物材料的例子。预计未来使用类似策略的筛选可能会为其他所需的免疫反应特征产生额外的主要制剂或材料。减轻生物材料异物反应的另一种有前景的方法是使用超低污染两性离子生物材料。蛋白质吸附被认为是宿主免疫激活和纤维化的关键协调因子。两性离子水凝胶创建了超亲水生物界面，用于限制蛋白质吸附。例如，超低蛋白质污染的聚（羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯）（PCBMA）水凝胶已被皮下植入小鼠，随后观察异物反应和炎症反应。研究表明，PCBMA植入物周围生长着血管生成血管，同时存在大量巨噬细胞，与pHEMA相比显示出抗炎表达。这些聚合物也可作为涂层应用，以减少对引发免疫反应的医疗装置植入物（如连续血糖监测仪）的免疫反应。最近，已证明海藻酸盐的两性离子磺基甜菜碱修饰可减轻啮齿动物、狗和猪中的异物反应，以实现胰腺胰岛的长期免疫隔离。生物材料的物理性质，包括大小、形状、表面形态、粗糙度、拓扑结构和几何形状，在协调蛋白质吸附、巨噬细胞附着和宿主对异物的免疫反应方面起着至关重要的作用。众所周知，材料拓扑结构可操纵巨噬细胞附着，并且材料表面的表型也在通过构象变化修饰吸附蛋白方面发挥作用。生物医学植入物的表面拓扑结构在巨噬细胞和其他免疫细胞的行为和调节中起着至关重要的作用，以影响异物反应。纳米尺度表面粗糙度的改变可影响更高的蛋白质吸附，影响与免疫细胞的相互作用，并且不同的纳米结构拓扑结构可影响细胞相互作用。研究表明，在聚合物表面压印光栅会导致巨噬细胞的行为变化，与光栅大小或表面化学无关。在聚合物表面压印的更大尺寸光栅影响免疫细胞与平面聚合物对照表面的粘附。对啮齿动物和灵长类动物中不同尺寸的球形植入物的评估表明，直径为1.5mm及以上的更大植入物在体内可引发极低的长期异物反应。其他报道表明，可调节钛纳米管的大小以减少巨噬细胞附着和异物反应。半透性膜化学和孔径的设计可能在增强免疫保护和移植物细胞存活方面具有额外作用。RGD功能化聚乙二醇（PEG）水凝胶，进一步用与促炎细胞因子（包括TNFα和MCP1）具有强结合亲和力的肽修饰，与未修饰的PEG水凝胶相比，提高了细胞存活。其他人已探索基于孔径调节的限制运输，以排除细胞因子等效应免疫分子。最近的研究表明，1μm或更小的孔径限制足以阻止T免疫细胞进入，同时允许巨噬细胞渗透，以提高存活能力和移植物免受免疫系统的长期保护。巨噬细胞的渗透性也有助于去除细胞碎片并促进血管生成，以提高存活能力。这些多因素设计考虑应在未来的装置设计中进一步探索，以开发改进的细胞封装解决方案。更大尺寸的细胞封装系统（即宏装置）提供了潜在的安全优势，因为它们可被设计为在植入后可回收。这一优势已被用于将具有更高安全风险评估的细胞来源（即干细胞衍生或转化细胞）推进到人类临床试验中（NCT02239354）。宏装置在设计特征（如聚合物化学、膜孔径和孔隙率以及整体装置尺寸）方面提供了更好的控制。然而，随着装置尺寸的增加，营养物质和氧气向封装细胞的扩散减少，导致细胞坏死。此外，更大的细胞储存库可能阻碍治疗剂从装置中扩散。对于胰岛细胞移植等应用（其中葡萄糖传感和胰岛素释放动力学必须严格调控以满足生理需求），宏尺寸装置构成了限制。为了提高宏装置封装系统的细胞存活能力和功能，必须纳入促进血管生成的设计特征。解决这一问题的最初方法涉及将血管生成因子加载到植入结构中，但很明显，仅这些分子不足以刺激有意义的血管生成。事实证明，植入含有内皮细胞接种通道的结构是一种更有效的诱导血管生成的策略。这些通道的目标通常是与宿主脉管系统融合。一旦实现，结构内的细胞将能更好地从血液中获取营养。这些人工通道通常接种内皮细胞以加速血管植入。3D打印提供了一种在大型生物相容性材料中创建血管通道的相对快速的方法。最近使用新的生物相容性化学反应进行水凝胶光聚合的进展，使得3D生物打印方法的扩展成为可能。值得注意的是，这些报道强调了打印有组织的组织构建体以创建血管和有组织的类器官，用于肺、心脏和肝脏修复的能力。为3D打印设计的血管结构既可以定制化以实现可调性，也可以源自计算模型以提高存活能力和自主性。这种精细的结构控制是必要的，因为组织和器官通常含有不同直径的脉管系统。从生理学角度来看，血管通道的大小至关重要——内皮细胞表型在很大程度上受剪切应力影响，对于恒定的体积流量和流体粘度，剪切应力由通道直径决定。最后，生物材料可作为支架，帮助促进施用后宿主组织的整合。源自动物来源的天然生物材料或合成聚合物（包括胶原蛋白、PLGA、PCL和柠檬酸盐）已用于当今市场上的多种批准的细胞产品。例如，取自尸体人类皮肤的脱细胞真皮基质与脂肪移植物结合用于乳房重建手术，以改善移植脂肪细胞的定位和存活。胶原蛋白已被用于促进组织移植物（如商业化产品Epigraft中的皮肤移植物）内复合细胞类型的组织。最近，负载干细胞衍生的心外膜细胞的胶原蛋白片与干细胞衍生的心肌细胞结合，用于心肌梗死后的心肌组织修复。未来，我们预计生物材料可进一步用于更先进的功能，例如作为激活细胞功能的信号转换器。动物早期可行性试验表明，产生可穿透身体的力的外部致动器（包括超声波、磁场和电子输入）可用于远程调控细胞活性。这些技术仍处于起步阶段，需要改进外部信号生成和捕获，以推动其未来发展。展望鉴于细胞疗法研究的最新进展，显然本综述中概述的工程学科——基因组和表观基因组编辑、合成生物学和生物材料介导的免疫调节——将在创建具有改进安全性、有效性和患者可及性的新治疗管线中发挥越来越重要的作用。最近的科学进展不仅证明了这些领域开发的技术的潜在影响，还确定了克服目前限制细胞疗法更广泛商业化的重大挑战的潜在途径。我们预计这些技术将继续完善自体细胞疗法管线（例如CAR-T疗法），在作用模式和制造方面提供改进。然而，产品最具影响力的进展可能来自能够提高更易于获取和制造的异基因产品的效价和存活能力的创新。除了本综述中概述的工程化方法做出的独立贡献外，我们还预见这些学科之间的协同作用将在推进细胞疗法转化方面发挥重要作用。基因组和表观基因组编辑策略将继续用于改善细胞固有特性，并且新发现和工程化的Cas蛋白变体将创造机会，产生越来越大且更复杂的遗传扰动。这些能力将使内源性细胞通路的全面、系统级重塑和细胞表型的改变成为可能，潜在地产生对凋亡信号具有抗性、在整个制造步骤中显示出增强的存活能力和扩增潜力，或能够分泌更高治疗性蛋白滴度的产品。推进这些能力将释放合成生物学的能力，通过复杂的调控回路工程化能够动态控制这些特征的功能。尽管这些能力有望增强自体细胞疗法，但鉴于可用于在易于获取但否则效价较低的产品中工程化增强疗效的复杂、多模块合成程序的潜力，它们对依赖异基因细胞来源的疗法的影响可能更大。生物材料的进展已经促进了多种异基因封装细胞产品的开发，目前有多家临床阶段公司正在推进用于1型糖尿病、内分泌适应症和罕见疾病的封装细胞产品。我们预计未来通过利用基因组和/或表观基因组编辑和合成生物学的创新，将封装细胞疗法扩展到新的适应症，开发具有更长寿命和增强的“感知-响应”能力的产品，以疾病阶段和患者特异性方式提供更精确的时空调控治疗活性。此类定制编程的细胞装置可作为哨兵部署，监测、调节和报告患者生理的波动，增强对内分泌或自身免疫性疾病等慢性适应症的管理。协同工程化方法解决细胞疗法重大挑战的最令人兴奋的长期机会之一，在于开发以干细胞衍生的现成产品为特征的治疗管线，这些产品可被定制工程化以治疗多种适应症。这些“通用”细胞疗法产品的剂量可通过从储存中检索、扩增和分化为成熟效应细胞类型按需生成，从而提供可不断补充的疾病特异性细胞来源。尽管在实现这一愿景之前必须克服巨大的基础研究障碍，但这种方法的潜在益处众多。由于多能干细胞通常易于进行重复和大规模的遗传操作，基因组和/或表观基因组编辑以及合成生物学方法可被充分利用来工程化复杂和专门的功能。除了可配置为免疫逃避或精确的HLA亚型匹配外，此类细胞还可携带精确描述分化为疾病特异性效应细胞或能够驻留在生物材料底盘内的合成调控程序。此外，这些细胞可通过定制的“感知-响应”模块进行编程，以增强效价和安全性，同时实现现场可编程的调谐能力，以灵活应对多种疾病和患者情况。

想象一下，晚期癌症患者，尤其是那些被称为“癌症之王”的胰腺癌患者，终于迎来了生命转机！一种名为“诱导邻近”的革命性疗法正在改写药物研发的历史。它不再依赖传统药物那种“硬塞”进蛋白质口袋的老方法，而是巧妙地“撮合”生物大分子在细胞内相遇，激活天然通路来调控靶点功能。这突破了80%蛋白质因缺乏可成药位点而被视为“难以成药”的困境，为无数绝症患者点燃了希望之光。科学家们兴奋地称，这不仅是医学的飞跃，更是人类对抗疾病的全新武器。 什么是诱导邻近疗法？简单说，就是“分子红娘” 传统药物就像个固执的守门员，必须直接占据蛋白质的活性位点才能起效。但问题来了：约80%的蛋白质根本没有这样的“门锁”，导致它们长期被贴上“难以成药”的标签。诱导邻近疗法却另辟蹊径——它用多特异性小分子当“红娘”，把两类原本不搭边的生物大分子拉到一起，让它们自然互动。比如，在细胞里“牵线搭桥”，激活信号通路来改变蛋白功能或水平。这听起来像科幻？不，它已经真实发生！从20世纪90年代的概念萌芽，到如今遍地开花的临床试验，这种模式让过去无法触及的靶点变得可操控。想想看，这不仅仅是治疗，而是重塑生命的网络，为癌症、免疫疾病等“不治之症”打开了大门。 分子胶：从意外发现到精准设计，小分子的大智慧 分子胶是诱导邻近疗法的先锋，分天然和合成两大类。天然产物型早在1980年代就崭露头角：环孢素A和他克莫司通过结合免疫蛋白，抑制磷酸酶来调控免疫；雷帕霉素则连接FKBP12和mTOR，影响细胞衰老。这些老药至今还在临床发光发热，比如雷帕霉素类似物依维莫司，全球每年惠及数百万患者。但真正引爆热潮的是合成降解型分子胶——沙利度胺的“再发现”。科学家们揭秘了它的机制：通过与E3连接酶CRBN结合，降解Ikaros转录因子来抗癌。更惊人的是，这解释了它曾导致胎儿发育异常的原因（SALL4蛋白被误降解），警示我们精准设计的重要性。如今，新一代分子胶如来那度胺和泊马度胺已上市，抗肿瘤活性提升超50%；而伊贝度胺等优化版，在临床试验中展示出更优的药效和安全性。数据说话：芳基磺酰胺类分子E7820，正在急性髓系白血病的2期试验中，抗癌潜力爆棚！非降解型也不甘示弱，比如1997年获批的阿那格雷，通过抑制PDE3A治疗血小板疾病。这证明，分子胶从偶然走向理性，让“不可成药”靶点乖乖听话。 双功能分子：PROTAC领衔，降解靶点的“超级武器” 如果分子胶是“单兵作战”，双功能分子就是“团队协作”的典范。它们由两个配体组成，强制拉近分子距离。小分子策略包括： 化学诱导二聚体（CIDs）：1993年，FK1012首次证明可诱导FKBP12二聚来抑制功能。如今，rimiducid作为CAR-T疗法的“安全开关”，获孤儿药资格——它能触发细胞凋亡，防止治疗失控。 PROTAC：2001年问世，已成主流。它连接靶蛋白和E3连接酶（如CRBN或VHL），形成三元复合体来降解蛋白。优势？催化性强，低剂量就起效，还能克服耐药突变！目前，超过30款PROTAC分子进入临床试验，覆盖肿瘤、自身免疫病等。代表药物vepdegestrant（ARV-471）针对乳腺癌，今年8月获FDA受理新药申请；luxdegalutamide（ARV-766）在前列腺癌2期试验中。但挑战也存在：分子量大、通透性差，科学家正用氢键设计等方法优化。 RNA靶向分子：如RIBOTAC平台，虽处概念阶段，但已靶向miRNA-21等肿瘤RNA，未来潜力无限。 这些双功能策略，让药物从“抑制剂”升级为“智能调控器”，彻底改变治疗逻辑。 真实突破：晚期癌症患者的新生故事 数据是最有力的证明！看看RAS抑制剂daraxonrasib（RMC-6236）的奇迹：它通过招募RAS蛋白到环孢菌素A上间接抑制，在二线及以上转移性胰腺导管腺癌（PDAC）试验中，携带RAS G12X突变的患者疾病控制率（DCR）达92%，任何RAS突变者更高达95%。胰腺癌素有“癌症之王”之称，5年生存率不足10%，这数据简直是救命稻草！目前，它的3期试验RASolute 302全球入组中，2026年将公布结果。同样，PROTAC药物在乳腺癌等领域进展迅猛。想想那些曾被宣判“无药可治”的患者，现在有了新选择——这不是实验室幻想，而是临床现实，情感上，谁能不为之振奋？ 未来展望：从细胞到生命，无限可能 诱导邻近疗法正加速扩张！已知E3连接酶超600种，但PROTAC只用少数，科学家正探索HSP90、IAPs等新系统来扩大靶点范围，缓解耐药问题。更酷的是，疗法从细胞内走向细胞外：双特异性抗体已获批十余款，桥接受体和免疫细胞，实现精准降解或免疫调控，比如在T细胞重定向中疗效显著。未来，它还将调控蛋白修饰（如磷酸化、乙酰化），甚至改变亚细胞定位或激活转录，这意味着药物不再简单“开关”靶点，而是可编程地重塑细胞功能。随着结构生物学和化学生物学的融合，这一领域从偶然走向理性设计——精准医疗的新时代，正加速到来。对患者来说，这不仅是治疗突破，更是生命的重生希望！