FKBP12

BALTIMORE, Oct. 23, 2024 (GLOBE NEWSWIRE) -- Rapafusyn Pharmaceuticals is pleased to announce an upcoming oral presentation at the 7th Targeted Protein Degradation & Induced Proximity Summit taking place from October 28-31, 2024 in Boston, MA. Dr. Rick Ewing, VP and Head of Chemistry, will be giving an oral presentation entitled “Non-Degrading Molecular Glues: A Platform for Finding Novel Chemical Matter for Inhibiting Intracellular & Transmembrane Proteins” on Oct 31st. Application of RapaGlues™ (Rapafusyn’s novel proximity inducing non-degrading macrocyclic molecular glues) and RapaTags™ (designed molecular glues) to deliver high quality HIT molecules will be presented. SAR campaigns will be described that have produced cell permeable molecules with extended PK half-life. “Our innovative non-degrading molecular glue platform has enabled significant advances in tackling difficult-to-drug targets. Rapafusyn’s platform is leveraging a modality validated by nature and extending it to broad types of disease targets. We are excited to share our progress at the 7th Targeted Protein Degradation & Induced Proximity Summit”, said Dr. Sean Hu, CEO of Rapafusyn. About Rapafusyn Pharmaceuticals At Rapafusyn, we’re creating non-degrading molecular glues to address hard-to-drug targets. Using our FKBP12-binding macrocyclic peptide platform, we've built large DNA encoded libraries (DELs) and arrayed libraries, yielding novel starting points. Our approach targets intracellular proteins and domains of transmembrane proteins like SLCs, ion channels, and GPCRs. With a modular design, we rapidly optimize key drug properties to accelerate drug-discovery. For more information, please visit https://www.rapafusyn.com/ or contact Heather Lavin at hlavin@rapafusyn.com

学以致用 侃侃而言 Drug Discovery Today, 2024, Oct. 10 DOI：10.1016/j.drudis.2024.104205 分子胶降解剂（MGDs）是靶向蛋白降解剂疗法的一种，同时又具有小分子疗法一致的物化特性，因此特别让人瞩目。 近日，Drug Discovery Today刊载了一篇重要评述，以细胞周期蛋白K和锌指蛋白IKZF2为例，深入探讨了MGDs的发现、发展。并重点介绍了MGDs的设计规则、生物学分析、和治疗应用。此外，文中还对分子胶的“化学空间”进行了探讨，并概述了推动该领域创新的合作努力。 主要内容 (1)分子胶发现：发现方法、案例探究 (2)分子胶格局：临床候选、靶点格局、疾病领域 (3)分子胶空间：物化特性空间、计算模型 (4)分子胶布局：制药合作伙伴 (5)相关分享回顾 01 分子胶发现 案例探究、发现方法 生物分子活性的调节是由它们彼此邻近达至某种平衡，进而相互作用所控制的。这种相互作用对于从细胞生成到有效细胞功能、维持和最终程序性细胞凋亡所必需的复杂过程的无缝进展至关重要。而协调的核心是生物分子邻近相互作用，其中蛋白质的多聚、蛋白质-底物复合物的形成等就是邻近性塑造生物功能中关键作用的重要实例证明。 分子胶是低分子量化合物，有助于增强两种蛋白质之间的相互作用，用于促进蛋白质-连接酶相互作用导致的泛素化和随后的靶蛋白降解，称之为“分子胶降解剂”（MGDs）。 如下图a是分子胶驱动的蛋白质降解示意图。图b中的沙利度胺类似物，主要用于与CRBN结合并招募新的底物进行泛素化和降解而作为分子胶发挥作用。 EARLY R&D 最初的最初分子胶之概念由来 最初，是围绕环孢菌素A（CsA）和FK506等免疫抑制剂分子机制的好奇心引发了分子胶的发现。CsA与亲环蛋白和钙调神经磷酸酶的结合，以及FK506与FKBP12和钙调神经元蛋白的结合，为小分子充当“分子胶”的概念奠定了基础。 “分子胶”一词，非常贴切的捕捉到了，用以增强邻近相互作用蛋白对之间的结合亲和力的化合物的本质。2007年，以生长素激素充当分子胶，增强植物连接酶转运抑制剂反应1（TIR1）与其底物的相互作用的发现，进一步阐明了分子胶降解剂的概念。 而早在1980年，Rose、Herschko、Ciechanover等人就提出了蛋白质泛素化的概念，并为他们赢得了2004年的诺贝奖。他们的工作改变了传统对细胞内蛋白质降解和调节过程的理解，为治疗癌症和神经退行性疾病铺平了道路。 在过去的几十年中，泛素化驱动的蛋白质降解在创新疗法中得到了应用，如蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）和分子胶，这得益于沙利度胺及其类似物作用机制的阐明。2010年，发现CRBN作为沙利度胺的分子靶标，引发了靶向蛋白降解（TPD）的革命；2013年，沙利度胺作为分子胶的能力也被揭示了出来。 沙利度胺及其类似物可以招募CBRN和其一系列底物邻近、增强结合、泛素化、及底物降解。这些化合物也被称为“免疫调节酰亚胺药物”（IMiDs），可以抑制炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNFα），并招募新底物蛋白质。而这些蛋白质并非CBRN的天然底物，不会与CRBN发生强烈的相互作用，这也凸显了MGDs在增强结合亲和力和随后泛素化中的关键作用。 目前蛋白质组质谱分析表明，CRBN有40多种新底物，而一种G-loop的特定环，对CRBN识别新底物至关重要。而除了CRBN，其它连接酶也被用于发现靶向各种蛋白质的MGDs。关键的突破是鉴定了一种含羟脯氨酸的缺氧诱导因子-α（HIFα）肽作为von Hippel-Lindau连接酶（VHL）的底物，这导致了一种在基于VHL的PROTACs中广泛使用的小分子的开发。此后更是有更多的E3连接酶被发现、应用。 分子胶的发现多是基于偶然，合理性的设计面临着诸多挑战。首先就是靶标本身的确定，它是某种连接酶的新底物。其次，确定了新底物靶标后，在探索Hit和Lead的过程中，还需要一整套独特的结构研究、建模、生物测定、和数据分析等。 EARLY R&D 案例一细胞周期蛋白K降解剂 细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）参与多种细胞过程的调节，与细胞周期蛋白亚基形成复合物。CDK12-cyclin K就是这样一个参与基因表达调控的复合体。CR8是一种CDK12抑制剂，也诱导周期蛋白K降解，因此具有双重活性。 也有报道研究了DNA损伤结合蛋白1（DDB1)与CDK12结合的结构和生物物理特性，评估了90多种细胞周期蛋白K降解剂。发现强效、选择性CDK12抑制剂，可以将DDB1招募到CDK12！ 针对DDB1-CDK12界面对ZINC数据库进行虚拟筛选，鉴定出了一种CRK抑制剂（RGB-286147），该抑制能够有效地与两种蛋白结合。此外，还发现了两种蛋白间的最小粘合剂，化合物919278，如下图a，是三元复合物晶体结构。 EARLY R&D 案例二Helios降解剂 肿瘤细胞部署多种机制来抑制免疫系统的抗肿瘤反应，一种这样的机制是招募免疫抑制FOXP3+调节性T细胞。研究表明，主要在Treg细胞中表达的helios蛋白（IKZF2）的降解可以增强抗肿瘤免疫反应。 泊马度胺是IKZF1的选择性降解剂，虽然它在50 μM之前不会引起IKZF2水平的变化，但它确实会引起CRBN-IKZF2的参与。此外，泊马度胺结合的IKZF1的锌指-2结构域（ZNF2）与IKZF2的不同之处仅在于一个氨基酸：Q146→H141。 在泊马度胺存在下，全长IKZF2H141Q显示出与全长IKZF1相似的降解曲线。这确立了Q146在IKZF1中在使泊马度胺具有选择性方面发挥的关键作用，研究发现，选择IKZF1降解剂作为起始分子，可发现IKZF2降解的选择性分子胶。 以上两个案例表明MGDs的发现可以以结构为导向，并以典型的基于结构的药物发现方式进行。新底物（靶点）的发现，和Hit的鉴定也可以通过其它筛选来实现，但基于结构的方法可以帮助优化化合物的选择性。 EARLY R&D 分子胶筛选鉴定方法 如下图，分子胶的发现涉及生化、生物物理、和计算技术的结合。 先进的生物物理分析、计算策略、基于细胞的筛选在识别和表征潜在分子胶、加速新治疗剂发现和加深对蛋白质-蛋白质相互作用驱动的复杂细胞过程至关重要。随着研究和分析技术的发展，整合多学科方法将成为分子胶研究和药物开发的突破关键。 02 分子胶格局 临床候选、靶点格局、疾病领域 EARLY R&D 临床中的分子胶候选药物 目前有17种分子胶正在进行临床试验，如下表。 EARLY R&D 临床适应症分布和特定药物靶点 分子胶化合物在各种临床适应症中的靶点分布提供了对该领域当前研究和开发格局的洞察。在已确定的适应症中，分子胶化合物的靶点数量最多的是肿瘤学领域，主要集中在液体肿瘤，包括AML、白血病、骨髓增生性肿瘤（MPNs）和MM，以及实体肿瘤。 其它相关临床适应症及特定靶点分布见下图。 03 分子胶空间 物化特性、计算模型 EARLY R&D 分子胶物化特性空间 如下图，是分子胶存在于与口服药物相邻或略微重叠的物理化学空间中的描述。鉴于其低分子量和低数量的氢键供体（HBDs），MGDs可能是穿越血脑屏障的有前景的候选者，它们可能在未来解决中枢神经系统疾病。 EARLY R&D 计算模型 尽管没有具体的既定程序来设计和模拟分子胶，但涉及分子胶与POI结合的实验可以通过各种分子描述水平的计算机工具进行合理化或预测。基于结构的计算方法特别有吸引力，适合提供有价值的蛋白质-配体相互作用信息反过来，这些信息可以用来合理化和理解分子胶如何与不同的蛋白质结合，从而指导新分子胶的设计，如下图。 从药物设计的角度来看，计算模型可以解决分子胶设计的两个问题： (1) 蛋白质-蛋白质复合物或蛋白质-配体复合物或两者的计算机预测。这可以细分为两个步骤：（i）姿势预测和（ii）姿势排名 (2) 超大虚拟筛选，用于从大型化合物库中鉴定配体 04 分子胶布局 制药合作伙伴 近年来，生物制药领域的几家初创公司与大型制药公司达成了重大合作协议，反映了协同创新和战略投资的趋势。上表中列出了与初创公司合作开发分子胶的大型制药公司。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

引言 蛋白质的亚细胞定位对蛋白质的功能至关重要，因为它们在不同的细胞区域执行特定的生物学功能。例如，某些蛋白质在细胞核内调控基因表达，而另一些则在细胞质中参与信号传导或物质代谢。这种精确的亚细胞定位是通过复杂的蛋白质转运机制实现的，包括核输入和输出、以及细胞器间的蛋白质运输。蛋白质的异常运输和定位往往与多种疾病的发生发展有关，包括癌症、神经退行性疾病和遗传性疾病等【1,2】。尽管针对性地调控蛋白质的亚细胞定位为治疗这些疾病提供了新的思路，但如何在不干扰细胞其他正常活动的前提下，高效、特异性地控制蛋白质的精确位置，以及如何将这种调控转化为疾病治疗的有效手段，都是该领域所面临的重大科学问题。 通过将目标蛋白与细胞内的穿梭蛋白或锚蛋白耦合来调节其位置，为可编程分子控制提供了另一种途径。为了推进定位控制的理念，以解决导致疾病的蛋白质问题，需要了解使定位被劫持的细胞特征，以及扩展可行的目标蛋白、分子和调控机制的原理。而对定位重编程能力的定量分析也将极大地促进小分子介导的蛋白质重新定位向治疗疾病的应用的扩展。 近日，来自美国斯坦福大学的Steven M. Banik团队在Nature上发表题为Targeted protein relocalization via protein transport coupling的文章，利用一种创新的化学生物学工具——靶向重定位激活分子（TRAM），通过结合穿梭蛋白的转运来控制目标蛋白的亚细胞定位。筛选了一系列具有强效配体的穿梭蛋白，并将其成功用于多种内源蛋白的重新定位。开发了一个定制的成像分析流程，展示了通过分子偶联到含有足够强定位序列的穿梭蛋白，可以调节蛋白质的稳态定位。由此提出了一种通过蛋白质转运重构细胞互作网络的靶向治疗方法，为治疗疾病提供了新的思路。 核定位序列（NLS）和核输出序列（NES）可被karyopherin蛋白家族识别，以调节货物在细胞核和细胞质之间的双向运输。要通过蛋白质运输耦合的方式来克服蛋白质的固有定位，将需要满足2点：（1）在穿梭蛋白上有一个足够强的相反定位序列；（2）穿梭蛋白的必要化学计量比。为此，本文研究人员首先选择了烟酰胺核苷酸腺苷基转移酶1（NMNAT1）作为模型蛋白进行重新定位研究，因为NMNAT1只有一个预测的NLS且没有已知的直接DNA结合域，所以可能容易受到小分子介导的重新定位的影响。为了研究缺乏已知小分子结合位点的蛋白质，研究人员合成了双功能分子TRAM 1，其能够与大肠杆菌二氢叶酸还原酶结构域（EcDHFR）和FKBP12F36V结构域结合，这些结构域因其与大多数哺乳动物蛋白的紧密的结合亲和力和正交性而被广泛使用。然后生成了mCherry融合EcDHFR和来自HIV-1 REV蛋白的NES作为穿梭蛋白，并在HeLa细胞中稳定地整合了mCherry-EcDHFR-NES和FKBP12F36V-GFP-NMNAT1。实验证实在TRAM 1的介导下形成了复合物，而且NMNAT1表现出剂量依赖性地向细胞质的转移，且这种效应在更高浓度下被废除（图1）。 图1:a.通过TRAM的蛋白质转运偶联实现亚细胞核质靶向定位控制示意图。b. TRAM 1的结构。c.用于产生稳定细胞系以研究NMNAT1定位控制的病毒构建体。d. TRAM 1介导形成复合物。e.由TRAM 1驱动的NMNAT1重定位（Credit: Nature） 当同时研究两种蛋白质时，核质转运的量化传统上通过一组代表性图像的共定位度量来完成。而一个开源的计算成像分析流程，能够独立地在细胞核和细胞质中对两种不同蛋白质进行单细胞级别的分析，将是衡量蛋白质运输和比较不同目标蛋白与穿梭蛋白的最准确方法。为此，研究人员建立了这样一个定制的计算成像分析流程，展示了蛋白质稳态定位可以通过分子偶联到含有足够强定位序列并在必要丰度中表达的穿梭蛋白来调节。这种方法适用于不同的细胞类型和密度，将定量分析用于检测剂量、穿梭蛋白和化学计量依赖的再定位，实验结果再次证实NES可以通过小分子介导的偶联主动驱动的NMNAT1再分布。与此同时，研究人员发现，必须存在足够水平的锚或穿梭蛋白才能加强TRAM诱导的靶蛋白的再定位。原则上，只要提供合适的定位强度、表达水平和有效的分子偶联，任何蛋白质的运输都可以重新定位另一个蛋白质。核激素受体如雌激素受体 (ERα) 和糖皮质激素受体 (GR) 表现出从细胞质到细胞核的配体依赖性易位，从而发挥下游转录激活作用。研究人员合成了TRAM 4-7，通过实验证实了这些受体作为核穿梭蛋白的潜力。 为了有效地重新定位靶蛋白，TRAM必须与能够克服靶蛋白内在定位的穿梭蛋白充分结合，蛋白质相对再定位能力的量化将有助于合理选择穿梭-靶组合。为了开发一个定量方法来评估通过TRAM介导的蛋白质重新定位的潜力，研究人员建立了含有一系列遗传构建的多克隆细胞系，这些构建将核激素受体（GR和ERα）与已知的NES序列配对，以及将HIV-1 REV NES与不同的NLS序列配对。随后，研究人员使用不同浓度的相关TRAM处理这些细胞系，然后评估NES标记的蛋白以及核激素受体的重新定位情况。研究结果表明，目标蛋白的重新定位程度依赖于穿梭蛋白（ERα或GR）的特性和目标蛋白的NES序列。此外，研究人员还观察到，不同的NLS构建对HIV-1 REV NES的重新定位能力呈现出梯度变化。通过这些数据，研究人员能够区分不同穿梭蛋白和目标蛋白之间的相对可重新定位性，并为蛋白质对的选择提供了一个定量的评估标准，这对于实现程序化的蛋白质重新定位至关重要。 错位的转录调控蛋白和RNA结合蛋白是多种癌症和神经退行性疾病的特征，将这些蛋白质返回细胞核的靶向方法可能有助于改善疾病驱动表型。本文研究人员利用上述方法，使用核激素受体作为穿梭蛋白，检测了三种已知在疾病中表现出异常定位的突变蛋白——SMARCB1Q318X（一种SMARCB1蛋白的突变型C末端截短，存在于非典型畸胎样和横纹肌样肿瘤，定位与细胞质）、TDP43ΔNLS（缺失了核定位信号的TDP43突变形式，导致它不能正确地定位到细胞核，而是异常地积累在细胞质中，形成病理性的聚集体）和FUSR495X（与ALS相关的FUS蛋白的一种突变形式，通常在细胞质中形成应激颗粒，与疾病的发生发展密切相关）——的重新定位能力。研究结果显示，不同的突变蛋白根据其固有特性，对ERα介导的重新定位的敏感性不同。TDP43ΔNLS和FUSR495X比SMARCB1Q318X更容易被ERα重新定位。此外，研究还发现，FUSR495X在应激颗粒中的定位可以通过TRAM的处理而转移到细胞核，并且这种重新定位与应激颗粒数量的减少相关。这些发现表明，通过靶向蛋白质重新定位的方法，有可能改善疾病相关的蛋白错位现象。 与此同时，研究人员探索了利用TRAM实现内源性蛋白质重新定位的能力。他们采用了CRISPR-Cas9基因编辑技术，将结合域和荧光蛋白标签插入到内源性蛋白PRMT9、SOS1和FKBP12上，使用METAP2和PARP1作为内源性细胞质和核的穿梭蛋白，并合成了能够与它们结合的TRAM 11-13。实验结果证明即使在内源性蛋白表达水平下，通过TRAM介导的内源性蛋白重新定位也是可行的，并且整个细胞群体均显示出均匀的重定位效果，这与外源性表达模型通常只在细胞群体的子集中观察到重定位的现象不同。这表明在内源系统中，可以在整个群体中达到穿梭蛋白与靶蛋白的最低相对比例要求。 最后，研究人员使用TRAM 1处理转导了携带mNMNAT1和EcDHFR标签的腺相关病毒（AAV）的大鼠胚胎的背根神经节（DRG）神经元，发现TRAM 1可以促进NMNAT1从细胞核向轴突的重新定位，NMNAT1在轴突中的表达得到了维持，即使在轴突损伤后也能观察到轴突的健康状况和轴突末端的保护，这表明通过TRAM介导的NMNAT1重新定位确实能够在体外模型中减缓轴突退化的过程。 综上所述，本研究开发了一种定量的单细胞分析方法来检查通过TRAM介导的目标蛋白与穿梭蛋白的耦合潜力，展示了两种蛋白质伙伴的相对表达水平是推动目标蛋白重新定位能力的主要参数，证明通过与内源性穿梭蛋白的耦合可以改变内源性目标蛋白的定位。由此提供了一种新的策略来调控蛋白质的亚细胞定位，为治疗蛋白质定位异常相关疾病提供了新的可能性。通过精确控制蛋白质的定位，不仅可以纠正因蛋白质错位导致的疾病表型，还可以通过蛋白质重新定位赋予有益的功能，更细致地调节细胞功能，从而扩大治疗选择的范围，为开发新的治疗方法提供了理论基础和实验策略。 参考文献 1. Kau, T. R., Way, J. C. & Silver, P. A. Nuclear transport and cancer: from mechanism to intervention. Nat. Rev. Cancer 4, 106–117 (2004). 2. Hung, M.-C. & Link, W. Protein localization in disease and therapy. J. Cell Sci. 124, 3381–3392 (2011). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07950-8 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述