FKBP12

靶向蛋白降解技术(TPD)是一种有广阔前景的治疗方法。与传统抑制剂相比，TPD在剂量、副作用和靶向“无成药性”蛋白质方面具有潜在的优势。除此之外，还可以克服现有小分子抑制剂（SMIs）的耐药性。TPD理论上可以结合目标蛋白的任何位点来引发降解，而传统小分子抑制剂必须在机制明确的结构域中起作用，这就为药物分子设计方面提供了便利。TPD降解过程主要依靠两种细胞自毁机制——即泛素-蛋白酶系统和溶酶体降解途径。各种TPD策略（如蛋白水解靶向嵌合体、分子胶、溶酶体靶向嵌合体和自噬靶向嵌合体）已经被开发出来，这些方法对靶向功能失调蛋白具有很大的潜力，在将来可能成为新的治疗方法。众所周知，功能失调蛋白的积累会导致各类疾病（如糖尿病、癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病和神经系统疾病）的发生。例如，tau蛋白积累是阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、皮克病和慢性创伤性脑病的病理标志，因此tau蛋白也被认为是治疗痴呆症的靶点。最近有报道称，一种名为C004019的蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）分子选择性地促进tau消除，这一发现提供了一种治疗阿尔茨海默病和相关tau病变的新方法。自本世纪初以来，许多TDP策略被相继开发，包括PROTACs、溶酶体靶向嵌合体（LYTACs）、自噬靶向嵌合体（AUTACs）、自噬系固化合物（ATTECs）、分子胶降解剂、Trim-Away、tag靶向蛋白降解剂（tTPD）系统等。目前大约有20种TPDs正在临床试验中。TPD策略为开发新疗法提供了全新的可能性，并为药物开发提供了新思路。本文回顾了TPD技术的最新进展，并介绍了其发展成为新疗法的潜力以及局限性。图1 基于UPS的TPD原理图1基于泛素-蛋白酶体系统（UPS）的TDP策略UPS是控制细胞中蛋白质含量的主要蛋白水解系统。它由泛素、三种关键酶、26S蛋白酶体和蛋白质底物组成。蛋白质先被泛素标记，然后被蛋白酶体识别和降解。例如，在三磷酸腺苷（ATP）水解反应中，泛素激活酶E1激活并将泛素传递给泛素结合酶E2。之后，E2酶在E3泛素连接酶的帮助下将泛素转移到底物，泛素连接酶E3识别并选择性地将泛素结合到特定位点上。随后，蛋白酶体以ATP依赖的方式催化泛素化底物的降解。图2 UPS作用原理E3连接酶是UPS级联反应中的关键酶，它识别底物并将底物泛素化标记。值得注意的是，在人类基因组中存在600多种E3连接酶，其中一些E3连接酶可用于TPD策略靶向并消除多种细胞内和跨膜蛋白底物。接下将对这些方法进行全面的概述，并总结目前的进展和挑战。01PROTACsPROTAC是一种双功能分子，它包含三部分:靶蛋白的配体、用于结合和募集E3泛素连接酶的另一配体以及连接两个配体的连接体（linker）。从机制上来说，PROTAC分子同时与E3连接酶和靶蛋白结合，形成三元复合物（E3连接酶-PROTAC-靶蛋白）。随后，靶蛋白被泛素标记，并通过蛋白酶体靶向降解。2001年，Sakamoto首先报道了第一代靶向蛋氨酸氨基肽酶-2的PROTACs。然而，这些多肽类药物膜通透性低，化学稳定性差，限制了其临床应用。2008年，小分子的第二代PROTAC被开发出来，由是引起了社会关注。从那时起，各药企研发部门对这项技术投入了相当多的资金和精力，直至目前已有超过10余种PROTAC进入临床试验。表1 部分在临床开发中的PROTACs与传统的SMIs相比，一种PROTAC分子可以降解多种等效的靶蛋白，从而增强药效学并降低毒性，这种药理机制使PROTACs具有先进的选择性和药效，并具有一定抗耐药性的能力。此外，PROTAC技术还消除了对结合受体或酶发挥作用的活性位点的需求，因而重新定义了不可成药的靶点。然而，PROTACs的双功能性也导致其具有复杂多变的理化性质。这种不确定性影响了其吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特征，从造成PROTACs的药代动力学研究困难。此外，尽管PROTACs可以有效地降解蛋白质，但当目标蛋白(POI)在正常组织中是必需成分时，研究人员应仔细考虑靶毒性的可能性。PROTACs的有效性也受到某些特性的限制，包括高分子量、高疏水性、E3依赖性和潜在的脱靶毒性。02分子胶分子胶是一种诱导生物分子发生相互作用的新型小分子降解剂。与PROTACs类似，它们通过诱导靶蛋白和E3连接酶的蛋白-蛋白相互作用来实现其功能。“分子胶”一词在20世纪90年代初首次被用于描述免疫抑制药物环孢素A和FK506（他克莫司）所使用的蛋白-蛋白结合机制。现已证明免疫调节亚胺药物沙利度胺及其衍生物可以作为分子胶。这些化合物通过招募E3泛素连接酶来降解疾病相关蛋白以发挥其治疗作用。Indisulam可以募集DDB1和CUL4相关因子15（DCAF15）E3连接酶并引发RNA结合基序蛋白39 (RBM39)的降解。此外，小分子BI-3802作为分子胶，可以通过募集SIAH E3泛素蛋白连接酶1（SIAH1）诱导致癌转录因子B细胞淋巴瘤6（BCL6）的降解。近年来，分子胶降解剂已成为研究的热门话题，目前已有一些分子胶降解剂正在临床试验中进行评估。这种类型的降解剂促进了新型疗法的发展，这些降解剂对各种严重疾病（如恶性肿瘤、感染、炎症和免疫疾病）的特征蛋白具有显著的降解活性，因此有潜力成为高效的治疗手段。尽管分子胶的作用方式与PROTACs类似，但它们仍具有明显的优势，即更低的分子量、更好的细胞渗透性和药物耐受性。回顾经典分子胶的发展进程，它的发现具有一定偶然因素，且由于对其调控因素的认知有限、缺乏系统的发现策略，分子胶的合理设计仍面临挑战。因此，成功开发的药物还很少。分子胶这一领域的研究目前尚不成熟，在其合理应用于临床之前，还需要进行更深入的研究。03Protabs近年来，研究人员报道了介导跨膜蛋白降解的PROTABs。将可识别糖蛋白D的N末端表位的抗体臂与已知的IGF1R的抗体进行组装而得，即PROTABs （Proteolysis-targeting antibodies）。研究人员将PROTABs加入到表达RNF43或ZNRF3融合的的细胞中，发现细胞表面的IGF1R蛋白被诱导降解，而不表达异位连接酶的细胞则不受影响。为了证明PROTABs的普适性，研究人员设计了靶向另一种膜相关蛋白，即人表皮生长因子受体2（HER2）的Protab。HER2-Protab在细胞和小鼠模型中诱导HER2降解效果显著，并且在来源于患者的结直肠癌类器官中也可诱导肿瘤特异性降解。此外，研究人员还设计了靶向程序性死亡配体1（PD-L1）的Protab，结果也证明Protab策略可以靶向几种相关的膜蛋白。尽管Protab的临床应用还有待进一步探索和改进，但这种方法提供了一种可以改善药物的细胞渗透性和生物利用度的新方法。此外，PROTABs表现出更好的组织选择性，具有良好的生物安全性。未来，PROTABs与抗体工程相结合发展，将成为药物开发的一个全新领域。2基于溶酶体降解途径的TPD策略溶酶体是细胞中的降解中心，通过内吞、吞噬和自噬途径介导细胞外和细胞内物质的降解。内吞是细胞从外部环境中吸收物质的过程。吞噬与内吞密切相关，该过程首先以受体依赖的方式摄入直径＞0.5μm的颗粒，然后将其消除。自噬是一个动态的自降解过程，它能将细胞质成分（如蛋白质、细胞器和病原体）在溶酶体内进行降解。现已有许多基于溶酶体途径降解失调蛋白的TPD策略被开发，如LYTACs、基于抗体的PROTACs（AbTACs）、ATTECs、AUTACs、靶向自噬的嵌合体（AUTOTACs）以及双特异性适配体嵌合体。图3 溶酶体降解的不同途径基于溶酶体的TPD策略可以克服基于蛋白酶体的TPD策略的缺点，并提供靶向细胞膜内外受损细胞器和致病蛋白的成药可能。01LYTACsLYTACs是一类双功能蛋白降解物，它主要通过将靶蛋白招募到细胞表面溶酶体穿梭受体来靶向细胞外蛋白和膜蛋白。这些降解物介导内体-溶酶体降解。Banik等人首次报道的第一个LYTAC由结合靶蛋白的单克隆抗体和用作阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体（CI-M6PR）配体的寡糖肽片段（polyM6Pn）组成。研究表明，基于抗体的LYTAC靶向多种膜结合蛋白和细胞外蛋白，如载脂蛋白E4、表皮生长因子受体（EGFR）、PD-L1和CD71，并诱导其溶酶体途径降解。作为主要靶向细胞内蛋白的PROTACs的补充，LYTAC扩展了TPD策略的范围。然而，在它们的利用方面存在着某些挑战。例如，CI-M6PR对于LYTAC介导的靶标内化和降解是必不可少的，然而它并非组织特异性的，即可能会引起某些脱靶毒副作用。针对这一点，Ahn等人报道了一种新型LYTAC，即N-乙酰半乳糖胺-LYTAC（Galac -LYTAC）。这种类型通过利用Asialal糖蛋白受体（ASGPR），即一种肝脏特异性溶酶体靶向受体来实现特异性降解。此外，LYTAC还面临着大分子生物特征优化的挑战。幸运的是，这个问题可以通过基于适配体的LYTAC（Apt-LYTAC）来解决。最近，Wu等人开发了首个Apt-LYTAC。它利用N-寡核苷酸适配子结合ASGPR的三链N -乙酰半乳糖胺配体，从而诱导靶蛋白的降解。Apt-LYTACs具有分子量低、化学稳定性高、合成简便高效等优点，可通过溶酶体降解途径有效介导膜蛋白酪氨酸激酶7（PTK7）和细胞外蛋白血小板衍生生长因子（PDGF）的降解。Miao等人报道了双特异性适配体嵌合体，它拥有与LYTAC类似的机制，通过内体-溶酶体途径介导蛋白质降解。虽然LYTAC已被纳入TPD治疗策略，但在被作为治疗药物之前，还需要进一步探明其在人体中的行为特征，如ADMET性质。尽管如此，LYTAC技术仍是选择性消除细胞外和膜相关蛋白的不二之选。02AbTACs2021年，Cotton等人首次报道了AbTAC，该AbTAC通过重组双特异性抗体将跨膜E3连接酶RNF43募集到细胞表面蛋白上，并诱导溶酶体降解。作为概念证明，研究人员选择PD-L1作为降解靶点，并使用与RNF43结合的Fab-噬菌体序列和作为PD-L1结合剂的Atezolizumab产生双特异性免疫球蛋白G，称为AC-1。结果表明，AC-1可诱导多种类型细胞的PD-L1溶酶体降解，包括MDA-MB-241、MDA-MB-231、T24和HCC827细胞。PROTAC只能介导细胞内蛋白的降解,而AbTAC则绕过这一限制，开创了一种降解蛋白的新思路。然而，虽然设计思路来源于PROTAC，但AbTAC确切的机制仍有待证明。特别是目前尚不清楚RNF43是否在内吞作用前泛素化靶蛋白的细胞内区域。此外，AbTAC于人体内形成，可以降低免疫反应的可能性。在筛选AbTACs的最佳降解效率时，细胞特异性、内吞动力学、RNF43的再循环都应被考虑，并应确定有无其他膜受体。03GlueTACs2021年，Zhang等人报道了GlueTAC的开发，这是一种基于共价纳米体的PROTAC策略。GlueTAC主要由三部分组成：共价纳米体（GlueBody）、穿膜肽和溶酶体分选序列（CPP-LSS）。GlueBody共价附着在细胞表面表达的表面抗原上，CPP-LSS诱导GlueTAC-POI复合物内化以及随后的POI溶酶体降解。为了验证这一概念，研究人员将他们的策略应用于抗PD-L1纳米体，该纳米体可以通过阻断PD-1/PD-L1相互作用来恢复T细胞的细胞毒性。结果表明，GlueTAC能有效诱导细胞内PD-L1的内化和溶酶体降解，抑制免疫缺陷小鼠的肿瘤生长。GlueTAC技术代表了一种降解膜蛋白的替代策略，具有高亲和力和无脱靶效应的优点。然而在实际应用中，仍有一些问题需要解决：GlueTAC利用纳米体中的非天然氨基酸增强与膜抗原的共价结合，由于共价结合通常与潜在的毒性有关，因此GlueTAC的安全性仍然存在风险。此外，GlueTAC的血清半衰期和肾脏清除率也需要进一步考察。3基于自噬-溶酶体途径的TPD策略除了广泛使用的内体-溶酶体途径外，利用自噬-溶酶体途径消除致病蛋白的新技术（例如AUTACs、ATTEC、AUTOTACs和基于CMA的降解物）也有报道。01AUTACsAUTAC分子由细胞内靶蛋白的特异性结合剂和一个标签组（对氟苯基鸟嘌呤[FBnG]-HaloTag配体）组成，该标签组模拟S-鸟嘌呤基化，诱导靶蛋白的k63-多泛素化。泛素化靶蛋白被自噬受体识别后即选择性自噬降解。Takahashi等人于2019年报道了首个AUTACs，他们最初使用烟曲霉素设计的AUTAC1靶向蛋氨酸氨基肽酶2（MetAP2）可以显著降低HeLa细胞中内源性MetAP2水平。接下来，他们进一步利用合成的FKBP配体(SLF)作为FKBP12的配体，制备AUTAC2降解fk506结合蛋白（FKBP12）。结果表明，AUTAC2处理可显著消除HeLa细胞中的FKBP12。此外还设计了AUTAC3，即使用JQ1作为配体靶向转录调节因子BRD4。然而，AUTAC3仅能使A549细胞中BRD4蛋白含量略微降低。最后，他们开发了一种名为AUTAC4的线粒体靶向降解物，该降解物利用2-苯基吲哚衍生物靶向线粒体，并使用FBnG单元作为降解标签。AUTAC4可减少小线粒体和受损线粒体的数量，减轻羰基氰化间氯苯腙诱导的线粒体凋亡和线粒体膜电位的丧失，并维持羰基氰化间氯苯腙处理后细胞内ATP水平。此外，AUTAC4还可以促进线粒体自噬，以挽救急性线粒体损伤细胞。考虑到线粒体功能障碍与许多与年龄相关的疾病有关，AUTAC4和其他未来基于自噬的线粒体降解物可能是治疗此类疾病(如糖尿病、癌症、神经退行性疾病和心血管疾病)的有希望的治疗选择。图4 通过自噬-溶酶体途径降解技术的示意图AUTAC是第一个使用自噬机制的TDP策略。AUTAC分子可以降解细胞质蛋白以及与疾病相关的线粒体碎片。这些发现可能为基于自噬的药物开发提供新的方向。AUTAC在其特定和更广泛的降解范围方面比基于UPS的降解系统具有独特的优势。然而，它通过复杂的多步骤机理起作用，其对全细胞蛋白质含量的安全性和有效性目前尚不清楚。因此，需要进一步的研究来确定AUTAC分子本身是否对选择性自噬过程产生影响，以及它们是否在体内起作用。02ATTECs与基于自噬-溶酶体系统的AUTAC类似，ATTEC直接结合自噬受体微管相关蛋白1A/1B轻链3（LC3），触发致病蛋白的自噬降解。据Li等人报道，ATTEC是一组连接LC3和突变型亨氏蛋白(mHTT)的连接化合物。mHTT在细胞质中的聚集导致亨廷顿氏病（HD），它是一种无法治愈的神经退行性疾病。因此，mHTT的降解代表了对抗HD进展甚至治疗这种神经退行性疾病的策略开发的希望。基于ATTEC平台，研究人员发现了四种化合物，它们成功地降低了细胞中的mHTT水平，并改善了HD小鼠模型中的疾病相关症状。该研究进一步表明，这些化合物还具有降解其他致病蛋白的能力，例如突变的Ataxin-3 （ATXN3）。通过直接结合自噬受体LC3并绕过泛素化过程，ATTEC可能具有通过直接机制降解不同类型底物（如胞质蛋白、受损细胞器、DNA/RNA分子）的潜力。为了最大激发ATTEC潜力，Fu等人开发了一种降解LDs的新策略，称为脂滴-ATTEC（LD-ATTEC）。自噬受体LC3和LDs可以通过LD-ATTEC连接，从而在细胞和小鼠模型中几乎完全清除LDs并减少LDs相关表型。LDs是细胞内细胞器，在能量储存和脂质释放中起关键作用。LDs的积累在多种疾病中都有表现，包括动脉粥样硬化、肥胖、炎症性疾病、Ⅱ型糖尿病、脂肪肝、心血管疾病和癌症。因此，LDs的特异性降解可能提供新的治疗策略。ATTEC为非蛋白细胞组分的降解提供了一种新的途径。由于其优点（即低分子量，直接靶向降解机制，广泛的目标谱，即使在较低浓度下也有效），预计ATTEC将在未来得到进一步利用。03AUTOTACs现有研究已经确定自噬受体p62在通过自噬清除错误折叠蛋白中起作用。p62同时具有泛素结合域和LC3相互作用区（LIR），这使其能够作为桥接分子同时识别蛋白载体上的泛素链和生长中的自噬体膜上的LC3，从而诱导自噬体的生物发生。Kwon等人通过p62依赖性自噬系统设计了AUTOTAC平台。AUTOTAC是一种双功能分子，由靶结合配体（TBLs）与自噬靶向配体（ATLs）使用重复聚乙二醇（PEG）片段结合并激活p62，使其成为自噬兼容的形式。AUTOTAC分子同时识别自噬受体p62和靶蛋白。ATL与p62的ZZ结构域结合，诱导p62自聚合，与自噬体蛋白LC3相互作用，以及自噬体的生物发生。基于这一概念，研究人员设计了多种激活p62的小分子化合物，并在体外和体内测试了它们对可溶性蛋白的降解效果。PHTPP（雌激素受体β的非甾体合成配体）为基础的AUTOTAC（PHTPP-1304）设计靶向Erβ,它成功地诱导了几种类型癌细胞的p62自寡聚和ERβ降解。正如预期的那样，靶向MetAP2和雄激素受体的AUTOTAC有效地促进了p62的自聚合和靶蛋白的降解。此外，AUTOTAC PBA-1105可以诱导P301L突变体tau自噬降解，形成神经原纤维缠结，从而导致突触功能障碍和神经元死亡。AUTOTAC平台使多种细胞内蛋白质的选择性和有效降解成为可能。其关键在于可通过p62和LC3之间的直接结合来诱导降解，AUTOTACs不依赖于特定的连接物长度和靶蛋白的泛素化来降解。然而，在AUTOTAC平台应用于临床实践之前，需要进一步研究其组织选择性和脱靶效应。04基于伴侣介导的自噬（CMA）降解物CMA是一种基于溶酶体降解途径的细胞内蛋白质选择性降解模式。机制上，分子伴侣Hsc70c识别底物蛋白中存在的KFERQ样基序，并将其引导到溶酶体相关膜蛋白2A（LAMP2A），这是一种受体，可将含有KFERQ基序五肽的胞质蛋白转运到溶酶体膜上。随后，底物蛋白通过多聚体LAMP2A复合物进入溶酶体进行降解。基于CMA的降解分子是由细胞膜肽、CMA靶向基序（CTM）和靶蛋白结合域（PBD）组成的双功能分子。Fan等人报道了一种由CTM-PBD穿透肽TAT47-57组成的嵌合多肽，以可逆和剂量依赖性的方式有效地降低了多种蛋白质的水平，包括PSD-95、死亡相关蛋白激酶（DAPK1）和α-突触核蛋白（SNCA）。Zhou等人设计了一种膜渗透肽 （DAT -CDK5- CTM），该肽阻断CDK5与N-甲基-D-天冬氨酸受体亚基2B(NR2B)的相互作用，导致小鼠缺血性卒中模型中CDK5降解。值得注意的是，CMA策略也能够靶向mHTT蛋白。基于CMA的降解是一种以内源性蛋白质为目标的基于肽的新型降解策略。它为目前的TPD提供了一种补充方法，并促进了疾病治疗有效疗法的发展。然而，调节CMA的机制仍然知之甚少。由于CMA降解剂是肽类依赖性化合物，其稳定性和递送效率有待提高。因此，这一领域还需要进一步的研究。表2 各种TPD策略的优点和局限性4tTPD 系统与在野生型基因组背景下工作的TPD降解剂（如PROTACs）不同，tTPD系统是一种新颖的创新技术，需要在POI上添加标记，例如氨基酸信号序列。这些化合物通过利用标记靶向降解剂促进标记POI的降解。tTPD系统通过劫持UPS诱导标记POI的快速、选择性和可逆降解。tTPD系统包括降解结构域（DD）、生长素诱导degron（AID）、HaloPROTACs、dTAG系统、IKAROS家族锌指3（IKZF3）肽degron、配体诱导亲和蛋白导弹（L-AdPROM）、BromoTag和靶向nanoluc的PROTACs（NanoTACs）。对于许多学术实验室来说，为潜在目标开发定制类型的TPD是昂贵且不确定的。尽管如此，通过TPD技术和基因改造的结合，消除对特定配体的需求仍充满了吸引力。图5 tTPD系统示意图随着tTPD技术的不断发展，其在药物开发领域具有很大潜力。它可能在确定前瞻性治疗靶点和靶点验证中发挥重要作用。— 小结 —  众所周知，TPD可以有效降解致病靶蛋白，显示出巨大临床应用前景。在各种治疗TPD的方法中，PROTACs因其与经典抑制剂相比具有优越的选择性而受到广泛关注。因此，多个PROTAC临床候选化合物已经从临床前开发推进到临床试验。然而，PROTACs仅通过UPS来消除细胞内蛋白，而溶酶体介导TPD策略（例如LYTACs和AbTACs）在降解细胞外和膜蛋白方面具有优势，因此这些溶酶体介导的TPD策略是TPD发展的一个重要里程碑。然而，它们的适用性受到其高分子量、linker长度研究有限和药代动力学的挑战。此外，现有技术的优化和基于TPD的新技术（如Apt-LYTAC、ATTEC、AUTOTAC、CMA降解剂、GlueTACs等）的开发为新的蛋白降解模式的发展指明了方向。每种TPD技术都是为消除细胞内或细胞外的蛋白质而准备的。总之，这些技术组成了一个百宝箱，研究人员可以自行选择最合适的方法来降解目标蛋白。目前，TPD以其优异的选择性和效率成为靶向降解的有力工具。TPD策略在癌症、慢性病、罕见病、病毒感染等疾病的治疗中显示出巨大的前景。此外，该技术还可以作为一种通用策略，用于确定TPD是否适合体外和体内给定目标蛋白的药物开发方法。尽管TPD技术具有诸多优势，我们仍需要开发新的蛋白质降解机制来克服现有TPD方法的局限性，如毒性、耐药性和有限的降解范围。总的来说，TPD未来将是一种重要的治疗方法，它显示出充分临床实践价值。因此，可以合理地得出结论：TPD技术在药物开发方面具有很大的前景。参考文献：1、Targeted protein degradation in drug development: Recent advances and future challenges .European Journal of Medicinal Chemistry 261 (2023) 115839.2、《靶向蛋白质降解：机制、策略和应用》.智慧牙新药科讯。3、M. Goedert, D.S. Eisenberg, R.A. Crowther, Propagation of tau aggregates and neurodegeneration, Annu. Rev. Neurosci. 40 (2017) 189–210.4、W. Wang, Q. Zhou, T. Jiang, S. Li, J. Ye, J. Zheng, X. Wang, Y. Liu, M. Deng, D. Ke, Q. Wang, Y. Wang, J.Z. Wang, A novel small-molecule PROTAC selectively promotes tau clearance to improve cognitive functions in Alzheimer-like models, Theranostics 11 (2021) 5279–5295.5、Y. Li, J. Song, P. Zhou, J. Zhou, S. Xie, Targeting undruggable transcription factors with PROTACs: advances and perspectives, J. Med. Chem. 65 (2022) 10183–10194.声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

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基于UPS的TPD原理图1基于泛素-蛋白酶体系统（UPS）的TDP策略UPS是控制细胞中蛋白质含量的主要蛋白水解系统。它由泛素、三种关键酶、26S蛋白酶体和蛋白质底物组成。蛋白质先被泛素标记，然后被蛋白酶体识别和降解。例如，在三磷酸腺苷（ATP）水解反应中，泛素激活酶E1激活并将泛素传递给泛素结合酶E2。之后，E2酶在E3泛素连接酶的帮助下将泛素转移到底物，泛素连接酶E3识别并选择性地将泛素结合到特定位点上。随后，蛋白酶体以ATP依赖的方式催化泛素化底物的降解。图2 UPS作用原理E3连接酶是UPS级联反应中的关键酶，它识别底物并将底物泛素化标记。值得注意的是，在人类基因组中存在600多种E3连接酶，其中一些E3连接酶可用于TPD策略靶向并消除多种细胞内和跨膜蛋白底物。接下将对这些方法进行全面的概述，并总结目前的进展和挑战。01PROTACsPROTAC是一种双功能分子，它包含三部分:靶蛋白的配体、用于结合和募集E3泛素连接酶的另一配体以及连接两个配体的连接体（linker）。从机制上来说，PROTAC分子同时与E3连接酶和靶蛋白结合，形成三元复合物（E3连接酶-PROTAC-靶蛋白）。随后，靶蛋白被泛素标记，并通过蛋白酶体靶向降解。2001年，Sakamoto首先报道了第一代靶向蛋氨酸氨基肽酶-2的PROTACs。然而，这些多肽类药物膜通透性低，化学稳定性差，限制了其临床应用。2008年，小分子的第二代PROTAC被开发出来，由是引起了社会关注。从那时起，各药企研发部门对这项技术投入了相当多的资金和精力，直至目前已有超过10余种PROTAC进入临床试验。表1 部分在临床开发中的PROTACs与传统的SMIs相比，一种PROTAC分子可以降解多种等效的靶蛋白，从而增强药效学并降低毒性，这种药理机制使PROTACs具有先进的选择性和药效，并具有一定抗耐药性的能力。此外，PROTAC技术还消除了对结合受体或酶发挥作用的活性位点的需求，因而重新定义了不可成药的靶点。然而，PROTACs的双功能性也导致其具有复杂多变的理化性质。这种不确定性影响了其吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特征，从造成PROTACs的药代动力学研究困难。此外，尽管PROTACs可以有效地降解蛋白质，但当目标蛋白(POI)在正常组织中是必需成分时，研究人员应仔细考虑靶毒性的可能性。PROTACs的有效性也受到某些特性的限制，包括高分子量、高疏水性、E3依赖性和潜在的脱靶毒性。02分子胶分子胶是一种诱导生物分子发生相互作用的新型小分子降解剂。与PROTACs类似，它们通过诱导靶蛋白和E3连接酶的蛋白-蛋白相互作用来实现其功能。“分子胶”一词在20世纪90年代初首次被用于描述免疫抑制药物环孢素A和FK506（他克莫司）所使用的蛋白-蛋白结合机制。现已证明免疫调节亚胺药物沙利度胺及其衍生物可以作为分子胶。这些化合物通过招募E3泛素连接酶来降解疾病相关蛋白以发挥其治疗作用。Indisulam可以募集DDB1和CUL4相关因子15（DCAF15）E3连接酶并引发RNA结合基序蛋白39 (RBM39)的降解。此外，小分子BI-3802作为分子胶，可以通过募集SIAH E3泛素蛋白连接酶1（SIAH1）诱导致癌转录因子B细胞淋巴瘤6（BCL6）的降解。近年来，分子胶降解剂已成为研究的热门话题，目前已有一些分子胶降解剂正在临床试验中进行评估。这种类型的降解剂促进了新型疗法的发展，这些降解剂对各种严重疾病（如恶性肿瘤、感染、炎症和免疫疾病）的特征蛋白具有显著的降解活性，因此有潜力成为高效的治疗手段。尽管分子胶的作用方式与PROTACs类似，但它们仍具有明显的优势，即更低的分子量、更好的细胞渗透性和药物耐受性。回顾经典分子胶的发展进程，它的发现具有一定偶然因素，且由于对其调控因素的认知有限、缺乏系统的发现策略，分子胶的合理设计仍面临挑战。因此，成功开发的药物还很少。分子胶这一领域的研究目前尚不成熟，在其合理应用于临床之前，还需要进行更深入的研究。03Protabs近年来，研究人员报道了介导跨膜蛋白降解的PROTABs。将可识别糖蛋白D的N末端表位的抗体臂与已知的IGF1R的抗体进行组装而得，即PROTABs （Proteolysis-targeting antibodies）。研究人员将PROTABs加入到表达RNF43或ZNRF3融合的的细胞中，发现细胞表面的IGF1R蛋白被诱导降解，而不表达异位连接酶的细胞则不受影响。为了证明PROTABs的普适性，研究人员设计了靶向另一种膜相关蛋白，即人表皮生长因子受体2（HER2）的Protab。HER2-Protab在细胞和小鼠模型中诱导HER2降解效果显著，并且在来源于患者的结直肠癌类器官中也可诱导肿瘤特异性降解。此外，研究人员还设计了靶向程序性死亡配体1（PD-L1）的Protab，结果也证明Protab策略可以靶向几种相关的膜蛋白。尽管Protab的临床应用还有待进一步探索和改进，但这种方法提供了一种可以改善药物的细胞渗透性和生物利用度的新方法。此外，PROTABs表现出更好的组织选择性，具有良好的生物安全性。未来，PROTABs与抗体工程相结合发展，将成为药物开发的一个全新领域。2基于溶酶体降解途径的TPD策略溶酶体是细胞中的降解中心，通过内吞、吞噬和自噬途径介导细胞外和细胞内物质的降解。内吞是细胞从外部环境中吸收物质的过程。吞噬与内吞密切相关，该过程首先以受体依赖的方式摄入直径＞0.5μm的颗粒，然后将其消除。自噬是一个动态的自降解过程，它能将细胞质成分（如蛋白质、细胞器和病原体）在溶酶体内进行降解。现已有许多基于溶酶体途径降解失调蛋白的TPD策略被开发，如LYTACs、基于抗体的PROTACs（AbTACs）、ATTECs、AUTACs、靶向自噬的嵌合体（AUTOTACs）以及双特异性适配体嵌合体。图3 溶酶体降解的不同途径基于溶酶体的TPD策略可以克服基于蛋白酶体的TPD策略的缺点，并提供靶向细胞膜内外受损细胞器和致病蛋白的成药可能。01LYTACsLYTACs是一类双功能蛋白降解物，它主要通过将靶蛋白招募到细胞表面溶酶体穿梭受体来靶向细胞外蛋白和膜蛋白。这些降解物介导内体-溶酶体降解。Banik等人首次报道的第一个LYTAC由结合靶蛋白的单克隆抗体和用作阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体（CI-M6PR）配体的寡糖肽片段（polyM6Pn）组成。研究表明，基于抗体的LYTAC靶向多种膜结合蛋白和细胞外蛋白，如载脂蛋白E4、表皮生长因子受体（EGFR）、PD-L1和CD71，并诱导其溶酶体途径降解。作为主要靶向细胞内蛋白的PROTACs的补充，LYTAC扩展了TPD策略的范围。然而，在它们的利用方面存在着某些挑战。例如，CI-M6PR对于LYTAC介导的靶标内化和降解是必不可少的，然而它并非组织特异性的，即可能会引起某些脱靶毒副作用。针对这一点，Ahn等人报道了一种新型LYTAC，即N-乙酰半乳糖胺-LYTAC（Galac -LYTAC）。这种类型通过利用Asialal糖蛋白受体（ASGPR），即一种肝脏特异性溶酶体靶向受体来实现特异性降解。此外，LYTAC还面临着大分子生物特征优化的挑战。幸运的是，这个问题可以通过基于适配体的LYTAC（Apt-LYTAC）来解决。最近，Wu等人开发了首个Apt-LYTAC。它利用N-寡核苷酸适配子结合ASGPR的三链N -乙酰半乳糖胺配体，从而诱导靶蛋白的降解。Apt-LYTACs具有分子量低、化学稳定性高、合成简便高效等优点，可通过溶酶体降解途径有效介导膜蛋白酪氨酸激酶7（PTK7）和细胞外蛋白血小板衍生生长因子（PDGF）的降解。Miao等人报道了双特异性适配体嵌合体，它拥有与LYTAC类似的机制，通过内体-溶酶体途径介导蛋白质降解。虽然LYTAC已被纳入TPD治疗策略，但在被作为治疗药物之前，还需要进一步探明其在人体中的行为特征，如ADMET性质。尽管如此，LYTAC技术仍是选择性消除细胞外和膜相关蛋白的不二之选。02AbTACs2021年，Cotton等人首次报道了AbTAC，该AbTAC通过重组双特异性抗体将跨膜E3连接酶RNF43募集到细胞表面蛋白上，并诱导溶酶体降解。作为概念证明，研究人员选择PD-L1作为降解靶点，并使用与RNF43结合的Fab-噬菌体序列和作为PD-L1结合剂的Atezolizumab产生双特异性免疫球蛋白G，称为AC-1。结果表明，AC-1可诱导多种类型细胞的PD-L1溶酶体降解，包括MDA-MB-241、MDA-MB-231、T24和HCC827细胞。PROTAC只能介导细胞内蛋白的降解,而AbTAC则绕过这一限制，开创了一种降解蛋白的新思路。然而，虽然设计思路来源于PROTAC，但AbTAC确切的机制仍有待证明。特别是目前尚不清楚RNF43是否在内吞作用前泛素化靶蛋白的细胞内区域。此外，AbTAC于人体内形成，可以降低免疫反应的可能性。在筛选AbTACs的最佳降解效率时，细胞特异性、内吞动力学、RNF43的再循环都应被考虑，并应确定有无其他膜受体。03GlueTACs2021年，Zhang等人报道了GlueTAC的开发，这是一种基于共价纳米体的PROTAC策略。GlueTAC主要由三部分组成：共价纳米体（GlueBody）、穿膜肽和溶酶体分选序列（CPP-LSS）。GlueBody共价附着在细胞表面表达的表面抗原上，CPP-LSS诱导GlueTAC-POI复合物内化以及随后的POI溶酶体降解。为了验证这一概念，研究人员将他们的策略应用于抗PD-L1纳米体，该纳米体可以通过阻断PD-1/PD-L1相互作用来恢复T细胞的细胞毒性。结果表明，GlueTAC能有效诱导细胞内PD-L1的内化和溶酶体降解，抑制免疫缺陷小鼠的肿瘤生长。GlueTAC技术代表了一种降解膜蛋白的替代策略，具有高亲和力和无脱靶效应的优点。然而在实际应用中，仍有一些问题需要解决：GlueTAC利用纳米体中的非天然氨基酸增强与膜抗原的共价结合，由于共价结合通常与潜在的毒性有关，因此GlueTAC的安全性仍然存在风险。此外，GlueTAC的血清半衰期和肾脏清除率也需要进一步考察。3基于自噬-溶酶体途径的TPD策略除了广泛使用的内体-溶酶体途径外，利用自噬-溶酶体途径消除致病蛋白的新技术（例如AUTACs、ATTEC、AUTOTACs和基于CMA的降解物）也有报道。01AUTACsAUTAC分子由细胞内靶蛋白的特异性结合剂和一个标签组（对氟苯基鸟嘌呤[FBnG]-HaloTag配体）组成，该标签组模拟S-鸟嘌呤基化，诱导靶蛋白的k63-多泛素化。泛素化靶蛋白被自噬受体识别后即选择性自噬降解。Takahashi等人于2019年报道了首个AUTACs，他们最初使用烟曲霉素设计的AUTAC1靶向蛋氨酸氨基肽酶2（MetAP2）可以显著降低HeLa细胞中内源性MetAP2水平。接下来，他们进一步利用合成的FKBP配体(SLF)作为FKBP12的配体，制备AUTAC2降解fk506结合蛋白（FKBP12）。结果表明，AUTAC2处理可显著消除HeLa细胞中的FKBP12。此外还设计了AUTAC3，即使用JQ1作为配体靶向转录调节因子BRD4。然而，AUTAC3仅能使A549细胞中BRD4蛋白含量略微降低。最后，他们开发了一种名为AUTAC4的线粒体靶向降解物，该降解物利用2-苯基吲哚衍生物靶向线粒体，并使用FBnG单元作为降解标签。AUTAC4可减少小线粒体和受损线粒体的数量，减轻羰基氰化间氯苯腙诱导的线粒体凋亡和线粒体膜电位的丧失，并维持羰基氰化间氯苯腙处理后细胞内ATP水平。此外，AUTAC4还可以促进线粒体自噬，以挽救急性线粒体损伤细胞。考虑到线粒体功能障碍与许多与年龄相关的疾病有关，AUTAC4和其他未来基于自噬的线粒体降解物可能是治疗此类疾病(如糖尿病、癌症、神经退行性疾病和心血管疾病)的有希望的治疗选择。图4 通过自噬-溶酶体途径降解技术的示意图AUTAC是第一个使用自噬机制的TDP策略。AUTAC分子可以降解细胞质蛋白以及与疾病相关的线粒体碎片。这些发现可能为基于自噬的药物开发提供新的方向。AUTAC在其特定和更广泛的降解范围方面比基于UPS的降解系统具有独特的优势。然而，它通过复杂的多步骤机理起作用，其对全细胞蛋白质含量的安全性和有效性目前尚不清楚。因此，需要进一步的研究来确定AUTAC分子本身是否对选择性自噬过程产生影响，以及它们是否在体内起作用。02ATTECs与基于自噬-溶酶体系统的AUTAC类似，ATTEC直接结合自噬受体微管相关蛋白1A/1B轻链3（LC3），触发致病蛋白的自噬降解。据Li等人报道，ATTEC是一组连接LC3和突变型亨氏蛋白(mHTT)的连接化合物。mHTT在细胞质中的聚集导致亨廷顿氏病（HD），它是一种无法治愈的神经退行性疾病。因此，mHTT的降解代表了对抗HD进展甚至治疗这种神经退行性疾病的策略开发的希望。基于ATTEC平台，研究人员发现了四种化合物，它们成功地降低了细胞中的mHTT水平，并改善了HD小鼠模型中的疾病相关症状。该研究进一步表明，这些化合物还具有降解其他致病蛋白的能力，例如突变的Ataxin-3 （ATXN3）。通过直接结合自噬受体LC3并绕过泛素化过程，ATTEC可能具有通过直接机制降解不同类型底物（如胞质蛋白、受损细胞器、DNA/RNA分子）的潜力。为了最大激发ATTEC潜力，Fu等人开发了一种降解LDs的新策略，称为脂滴-ATTEC（LD-ATTEC）。自噬受体LC3和LDs可以通过LD-ATTEC连接，从而在细胞和小鼠模型中几乎完全清除LDs并减少LDs相关表型。LDs是细胞内细胞器，在能量储存和脂质释放中起关键作用。LDs的积累在多种疾病中都有表现，包括动脉粥样硬化、肥胖、炎症性疾病、Ⅱ型糖尿病、脂肪肝、心血管疾病和癌症。因此，LDs的特异性降解可能提供新的治疗策略。ATTEC为非蛋白细胞组分的降解提供了一种新的途径。由于其优点（即低分子量，直接靶向降解机制，广泛的目标谱，即使在较低浓度下也有效），预计ATTEC将在未来得到进一步利用。03AUTOTACs现有研究已经确定自噬受体p62在通过自噬清除错误折叠蛋白中起作用。p62同时具有泛素结合域和LC3相互作用区（LIR），这使其能够作为桥接分子同时识别蛋白载体上的泛素链和生长中的自噬体膜上的LC3，从而诱导自噬体的生物发生。Kwon等人通过p62依赖性自噬系统设计了AUTOTAC平台。AUTOTAC是一种双功能分子，由靶结合配体（TBLs）与自噬靶向配体（ATLs）使用重复聚乙二醇（PEG）片段结合并激活p62，使其成为自噬兼容的形式。AUTOTAC分子同时识别自噬受体p62和靶蛋白。ATL与p62的ZZ结构域结合，诱导p62自聚合，与自噬体蛋白LC3相互作用，以及自噬体的生物发生。基于这一概念，研究人员设计了多种激活p62的小分子化合物，并在体外和体内测试了它们对可溶性蛋白的降解效果。PHTPP（雌激素受体β的非甾体合成配体）为基础的AUTOTAC（PHTPP-1304）设计靶向Erβ,它成功地诱导了几种类型癌细胞的p62自寡聚和ERβ降解。正如预期的那样，靶向MetAP2和雄激素受体的AUTOTAC有效地促进了p62的自聚合和靶蛋白的降解。此外，AUTOTAC PBA-1105可以诱导P301L突变体tau自噬降解，形成神经原纤维缠结，从而导致突触功能障碍和神经元死亡。AUTOTAC平台使多种细胞内蛋白质的选择性和有效降解成为可能。其关键在于可通过p62和LC3之间的直接结合来诱导降解，AUTOTACs不依赖于特定的连接物长度和靶蛋白的泛素化来降解。然而，在AUTOTAC平台应用于临床实践之前，需要进一步研究其组织选择性和脱靶效应。04基于伴侣介导的自噬（CMA）降解物CMA是一种基于溶酶体降解途径的细胞内蛋白质选择性降解模式。机制上，分子伴侣Hsc70c识别底物蛋白中存在的KFERQ样基序，并将其引导到溶酶体相关膜蛋白2A（LAMP2A），这是一种受体，可将含有KFERQ基序五肽的胞质蛋白转运到溶酶体膜上。随后，底物蛋白通过多聚体LAMP2A复合物进入溶酶体进行降解。基于CMA的降解分子是由细胞膜肽、CMA靶向基序（CTM）和靶蛋白结合域（PBD）组成的双功能分子。Fan等人报道了一种由CTM-PBD穿透肽TAT47-57组成的嵌合多肽，以可逆和剂量依赖性的方式有效地降低了多种蛋白质的水平，包括PSD-95、死亡相关蛋白激酶（DAPK1）和α-突触核蛋白（SNCA）。Zhou等人设计了一种膜渗透肽 （DAT -CDK5- CTM），该肽阻断CDK5与N-甲基-D-天冬氨酸受体亚基2B(NR2B)的相互作用，导致小鼠缺血性卒中模型中CDK5降解。值得注意的是，CMA策略也能够靶向mHTT蛋白。基于CMA的降解是一种以内源性蛋白质为目标的基于肽的新型降解策略。它为目前的TPD提供了一种补充方法，并促进了疾病治疗有效疗法的发展。然而，调节CMA的机制仍然知之甚少。由于CMA降解剂是肽类依赖性化合物，其稳定性和递送效率有待提高。因此，这一领域还需要进一步的研究。表2 各种TPD策略的优点和局限性4tTPD 系统与在野生型基因组背景下工作的TPD降解剂（如PROTACs）不同，tTPD系统是一种新颖的创新技术，需要在POI上添加标记，例如氨基酸信号序列。这些化合物通过利用标记靶向降解剂促进标记POI的降解。tTPD系统通过劫持UPS诱导标记POI的快速、选择性和可逆降解。tTPD系统包括降解结构域（DD）、生长素诱导degron（AID）、HaloPROTACs、dTAG系统、IKAROS家族锌指3（IKZF3）肽degron、配体诱导亲和蛋白导弹（L-AdPROM）、BromoTag和靶向nanoluc的PROTACs（NanoTACs）。对于许多学术实验室来说，为潜在目标开发定制类型的TPD是昂贵且不确定的。尽管如此，通过TPD技术和基因改造的结合，消除对特定配体的需求仍充满了吸引力。图5 tTPD系统示意图随着tTPD技术的不断发展，其在药物开发领域具有很大潜力。它可能在确定前瞻性治疗靶点和靶点验证中发挥重要作用。— 小结 —  众所周知，TPD可以有效降解致病靶蛋白，显示出巨大临床应用前景。在各种治疗TPD的方法中，PROTACs因其与经典抑制剂相比具有优越的选择性而受到广泛关注。因此，多个PROTAC临床候选化合物已经从临床前开发推进到临床试验。然而，PROTACs仅通过UPS来消除细胞内蛋白，而溶酶体介导TPD策略（例如LYTACs和AbTACs）在降解细胞外和膜蛋白方面具有优势，因此这些溶酶体介导的TPD策略是TPD发展的一个重要里程碑。然而，它们的适用性受到其高分子量、linker长度研究有限和药代动力学的挑战。此外，现有技术的优化和基于TPD的新技术（如Apt-LYTAC、ATTEC、AUTOTAC、CMA降解剂、GlueTACs等）的开发为新的蛋白降解模式的发展指明了方向。每种TPD技术都是为消除细胞内或细胞外的蛋白质而准备的。总之，这些技术组成了一个百宝箱，研究人员可以自行选择最合适的方法来降解目标蛋白。目前，TPD以其优异的选择性和效率成为靶向降解的有力工具。TPD策略在癌症、慢性病、罕见病、病毒感染等疾病的治疗中显示出巨大的前景。此外，该技术还可以作为一种通用策略，用于确定TPD是否适合体外和体内给定目标蛋白的药物开发方法。尽管TPD技术具有诸多优势，我们仍需要开发新的蛋白质降解机制来克服现有TPD方法的局限性，如毒性、耐药性和有限的降解范围。总的来说，TPD未来将是一种重要的治疗方法，它显示出充分临床实践价值。因此，可以合理地得出结论：TPD技术在药物开发方面具有很大的前景。参考文献：1、Targeted protein degradation in drug development: Recent advances and future challenges .European Journal of Medicinal Chemistry 261 (2023) 115839.2、《靶向蛋白质降解：机制、策略和应用》.智慧牙新药科讯。3、M. Goedert, D.S. Eisenberg, R.A. Crowther, Propagation of tau aggregates and neurodegeneration, Annu. Rev. Neurosci. 40 (2017) 189–210.4、W. Wang, Q. Zhou, T. Jiang, S. Li, J. Ye, J. Zheng, X. Wang, Y. Liu, M. Deng, D. Ke, Q. Wang, Y. Wang, J.Z. Wang, A novel small-molecule PROTAC selectively promotes tau clearance to improve cognitive functions in Alzheimer-like models, Theranostics 11 (2021) 5279–5295.5、Y. Li, J. Song, P. Zhou, J. Zhou, S. Xie, Targeting undruggable transcription factors with PROTACs: advances and perspectives, J. Med. Chem. 65 (2022) 10183–10194.近期直播推荐:

本文分析了 FDA 批准的大环药物、临床候选药物和最近的文献，以了解大环化合物如何用于药物发现。目前的药物主要用于感染性疾病和肿瘤学，而肿瘤学是临床候选药物的主要适应症，文献中大多数大环药物与难以结合位点的靶点结合。天然产物提供了 80-90% 的药物和临床候选药物，而 ChEMBL 中的大环化合物结构不太复杂。大环化合物通常存在于超出 5 规则的化学空间中，但 30-40% 的药物和临床候选药物具有口服生物利用度。简单的述符模型，即 HBD ≤ 7 ,联合 MW < 1000 Da 或 cLogP > 2.5，可以区分口服药物和注射药物。作者认为构象分析的最新突破和天然产物结构的启发将进一步改进大环化合物的从头设计。 1.大环化合物的背景介绍寻找新方法来调节新颖且具有挑战性的药物靶点，引起了药物发现的生物制药公司和学术界对新治疗方式的浓厚兴趣。大环化合物和环肽、蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 和寡核苷酸是新模式的突出例子，所有这些都存在于超出 5 规则 (bRo5) 的化学空间中。尽管所有类型的新治疗方式尚未进入市场，但自本世纪初以来，靶向新靶点的努力已经导致口服药物的尺寸和复杂性增加。大环化合物通常定义为含有至少12个重原子的环的有机分子。不同科学领域对大环化合物的普遍兴趣在 1980 年之前的几年开始增长，然后从 1990 年起急剧增加（图 1 A）。在药物发现领域，快速增长阶段始于世纪之交（图 1B）。事实上，从那时起，每年的出版物数量增加了 10 至 20 倍。大环化合物的优点源于它们的半刚性、预组织结构（preorganized）中提供功能多样性和立体化学复杂性。与开环类似物相比，这可以使大环化合物以更高的亲和力和选择性与传统的小分子药物难以药物作用的靶标结合。匹配的大环化合物对和线性对照表明可以获得高达 100 倍的效力增加，但应该指出的是，其他匹配对的效力差异可以忽略不计或很小。尽管其大小，大环化合物也可能具有足够的细胞渗透性和生物利用度，以在口服给药后到达细胞内靶标。从历史上看，大环药物是由天然的，但从头设计的大环化合物现已开始被批准为药物（图 1 B）。图1. 从PubMed检索到的文章数量每年使用 (A)“Macrocycle”作为关键字，(B)“Macrocycle 和药物发现”作为关键字（最后下载时间为 2022 年 5 月）。天然产物来源的大环药物的一些例子（杆菌肽、放线菌素、两性霉素 B 和环孢菌素）以及一些通过从头设计获得的药物（西美普韦和劳拉替尼）、它们的治疗适应症以及在文献中首次报告的年份。有效的、细胞渗透性的、口服的大环药物的合理设计还有许多未知因素需要解决，而且，它们的合成也绝非易事。大环化的构象限制可以为具有平坦或浅结合位点的难以药物靶标提供有效的配体。但会导致环应变、空间相互作用和非共价跨环相互作用，这使得构象的预测以及随后的分子特性变得极具挑战性。此外，一些大环化合物具有使其构象适应环境的能力，从而表现得像分子变色龙（molecular chameleons）。大环药物被认为是bRo5空间中化合物的一个特别有用的特征，这提高了它们平衡水溶性和被动细胞渗透性的可能性。然而，尽管最近在一般方法论方面取得了一些有希望的进展，并报道了具体的例子，大环分子变色龙的设计仍然知之甚少。在近十年前，大环药物的设计仍然受益于基于易于计算的描述符的简单指数，以提高成功设计其药代动力学特性。在本文中，首先概述 FDA 批准的大环药物，重点关注它们的治疗适应症和它们调节靶点的性质。计算一组二维分子描述符可以剖析口服和注射大环药物的化学空间，并制定双性质指数，以帮助药物化学家设计下一代口服大环化合物。此外，文献挖掘和临床研究中大环化合物的分析为大环药物发现的未来趋势提供了一些提示。最后但并非最不重要的一点是，讨论了最近的发展如何改进具有定制特性的大环化合物的设计，以及对天然产物的重新兴起可能会促进大环药物的发现。2.现有大环药物分析结果与讨论2.1 FDA 批准的大环药物2.1.1 概述总共有 67 种大环化合物已被美国食品和药物管理局批准为药物（图 2）。直到 1990 年，大环类药物的批准量随着时间的推移波动很大，但从那时起，每年至少有一种大环类药物获得批准，只有少数例外。26种大环药物(39%) 是口服给药，以全身分布到其作用部位，而41 种是注射给药。尽管口服给药是优选的给药途径，但口服给药和注射给药之间的比例随着时间的推移保持恒定。绝大多数大环药物是天然产物或其衍生物（n = 59, 88%）。事实上，第一个从头设计的大环药物 Plerixafor 早在 2008 年就在肿瘤学领域获得批准。将天然产物细分为原始天然产物(n= 25)和天然产物衍生物(n= 34)，从而可以进行分析通过生产衍生物所取得的改进。12种天然产物衍生物源于药代动力学的优化。因此，3种抗菌赤藓糖内酯和利福霉素衍生物以及用于肿瘤学和作为免疫抑制剂的依维莫司的口服生物利用度和/或半衰期得到了改善。其他3种衍生物的化学稳定性、蛋白酶耐受性和溶解度也得到了改善。药效学，即提高的效力、更广的活性谱和/或减少的副作用，构成了7种衍生物产生的主要原因。出于各种原因，5 种衍生物的药效学和药代动力学都得到了优化，而我们无法找到对其余 10 种衍生物所取得的成果的明确解释。正如下面将进一步讨论的，大环化合物提供了独特的机会来调节具有难于药物结合位点的靶标，但尽管如此，FDA批准的药物中只有4%（n = 1796，生物制剂和兽用药物已被排除）是大环化合物。总而言之，这表明需要改进设计策略，以能够递送更多数量的口服吸收的大环药物。图2. 按FDA批准年份绘制的大环药物数量（n= 67，数据检索于2022年9月1日）。(A) 口服吸收的药物以蓝色表示(n= 26; 39%)，而注射给药的药物以金色表示(n= 41; 61%)。(B)天然产物及其衍生物呈浅绿色(n= 59, 88%)；从头设计的大环药物呈 深灰色（n= 8,12%）。造影剂、大环化合物偶联抗体、PEG连接的大环化合物和环糊精已被排除在外。2.1.2 治疗适应症和靶标感染性疾病是大环类药物治疗的主要治疗适应症（占所有大环类药物的44.4%，图3）。在这一类药物中，大多数用作抗菌药物，但抗病毒药物（6.9%）和抗真菌药物（8.3%）也很重要。肿瘤学（20.8%）、自身免疫性疾病（5.6%）和免疫抑制剂（5.6%）是另外三个主要的治疗适应症。大环类药物还用于13种“其他”次要适应症，占药物的23.6%（图3）。这些适应症包括抗利尿药、慢性疼痛、遗传性肥胖、心力衰竭等。随着时间的推移，大环类药物的批准揭示了几个趋势。首先，自1948年以来，抗菌药物的批准频率相当有规律。其次，用于治疗丙型肝炎病毒感染的五种大环化合物均在2013年至2017年间获得批准。最后，近年来大环化合物在肿瘤学中的使用出现了激增。2007年之前仅批准了4个，而此后批准了11个。图 3. FDA 批准的大环药物的治疗适应症（内圈）和靶点（外圈）（n= 72）。五个大环化合物是重复的，因为每个大环化合物用于两种治疗适应症。占大环类药物总数<4%的治疗适应症已归入“其他”类别。由“and”分隔的目标表明相应的药物是分子胶，而由“逗号”分隔的目标表明相应的药物表现出多药理学。 NA：目标不可用。大环化合物药物靶标的数量在主要治疗适应症之间显示出异质模式。抗菌大环化合物主要针对一些“传统”靶标，例如核糖体和 RNA 聚合酶 (RNAP)（图 3）。相比之下，在肿瘤学中，大环化合物针对大量靶标，包括激酶、脱乙酰酶、激素受体和微管蛋白。 Pacritinib 于 2022 年被批准作为第一个JAK2 和 FLT3 的双重抑制剂，该典型例子说明了使用大环化合物适用于多靶标适应症。值得注意的是，丙型肝炎病毒的NS3/4A蛋白酶是大环类药物调节的唯一病毒靶点。作者还强调几种大环药物充当分子胶与成对的蛋白质靶标形成三元复合物（图 3）。环孢素和沃罗孢素与亲环素 A (CyPA) 和钙调神经磷酸酶 B (CNB) 形成复合物，用于治疗自身免疫性疾病和免疫抑制，以防止移植器官的排斥反应。FK506 结合蛋白 FKBP12 与 CNB 或mTOR形成三元复合物，由子囊霉素和雷帕霉素家族的大环化合物诱导，用于自身免疫性疾病、免疫抑制和肿瘤学。2.2 药物-靶标结构2.2.1 结合位点形状大环化限制了配体的灵活性，并且被强调作为一种发现“难以成药”靶标的配体的策略，特别是具有大的平坦、凹槽形或隧道形结合位点的靶标。为了研究数据集中的大环药物与有“难”结合位点的靶标结合的程度，作者搜索了 PDB对于每种药物的靶标结合复合蛋白结构。然后，如前所述，对每个目标的结合位点的形状进行手动分类。67 种大环药物中的 34 种可得到大环化合物-靶标复合物。有趣的是，这些复合物中的大多数（34 个中的 27 个）的大环化合物结合在属于难以药物类别的结合位点，即平坦、凹槽形或隧道形位点（flat, groove-shaped, or tunnel-shaped site）（图 4 A）。其中四个大环化合物也结合在口袋中，三个大环化合物以其他方式发挥其药效作用，而不是与明确的结合位点相互作用。图 4. (A) 大环药物与其靶点的结晶复合物中结合位点形状的分类 ( n = 34)。括号中给出了与每个结合位点类别结合的药物数量及其占总数的百分比。药物-靶标复合物的示例，其中大环化合物与口袋状 (B)、扁平状 (C)、隧道状 (D) 或凹槽状 (E) 结合位点结合。大环配体显示为绿色棒，氮原子为蓝色，氧原子为红色，硫原子为黄色。所选示例是与SSTR2结合的奥曲肽（PDB ID：7T11）、与 HCV NS3/4A 蛋白酶结合的西美瑞韦（PDB ID：3KEE）、与 RNAP 结合的rifapentin（PDB ID：2A69）和在 ALK 的凹槽中结合的lorlatini（PDB ID：4CLI）。大多数大环药物保留在 bRo5 规则中，它们的大小为为什么它们对具有“困难”结合位点的靶标具有足够的亲和力提供了一种解释。Ro5 顺应性化合物通常可以在口袋中以足够的亲和力结合以用作药物，但与SSTR2 结合的奥曲肽复合物说明了大环化合物如何填充大口袋（图4 B）。Simeprevir 和利福喷丁举例说明了 bRo5 空间中的大环化合物如何分别与具有平坦或隧道状结合位点的靶标结合（图 4 C 和4 D）。应该指出的是，在 FDA药物中，只有四种 HCV NS3/4A 蛋白酶抑制剂与平坦结合位点结合，并且大多数在隧道中结合的大环化合物都是抗菌药物。尽管大多数结合在凹槽中的大环化合物位于 bRo5 空间中，但 lorlatinib 和ixabepilone也结合在凹槽中。这两种大环化合物符合 Ro5 和 Veber 规则（lorlatinib的 MW = 406 Da，ixabepilone的 MW = 507 Da），但仍然提供足够的亲和力以发挥有效药物的作用（图 4 E）。3个凹槽形结合位点涉及三元配合物，即大环充当分子胶对于形成凹槽的两种蛋白质。具体来说，这三种分子胶是环孢菌素与亲环蛋白A（CyPA）和钙调磷酸酶B（CNB）的复合物，tacrolimus与FK506结合蛋白FKBP12和CNB的复合物，以及西罗莫司（sirolimus）与FKBP12和哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）的复合物。   2.2.2 配体形状作者使用归一化的主惯性矩 (PMI，principal moment of inertia) 图分析了大环配体在其靶标结合构象中的形状，该图根据配体与棒、盘或球体的相似性对配体进行分类（图 5 ）。与 Ro5 规则药物参考集的比较证实了早期的报告与 Ro5 兼容药物相比，大环化合物在更大程度上填充球形构象，而 Ro5 兼容药物主要为棒-盘形（图 5 A）。采用球形构象的大环主要束缚在凹槽和隧道中（图5B）。除 simeprevir 外，丙型肝炎病毒抑制剂均采用圆盘形状，与 NS3/4A 蛋白酶相当平坦的结合位点相匹配（图 5 B）。Simeprevir 与其他三种抑制剂不同，因为它具有垂直于大环核心平面的芳香侧链和酰基磺酰胺侧链。图 5. 归一化主惯性矩 (PMI) 图，说明 (A) 与具有平坦、凹槽、隧道或袋状结合位点 (n = 31) 的靶标结合的大环药物的靶标结合构象的形状进行比较完全符合 Ro5 标准的药物参考集的形状 ( n = 37) (B) 靶标结合大环药物的形状，根据其结合位点的形状着色。与平坦结合位点结合的所有四个大环化合物都是丙型肝炎病毒 NS3/4A 蛋白酶的抑制剂。2.3大环药物的化学空间2.3.1 通过2维符号描述尽管在 bRo5 化学空间中的药物表征方面，2D分子特性描述符的信息量不如 3D 描述符，但它们计算起来很简单，也可以提供有价值的信息，包括与 Ro5 合规药物的比较。因此，作者选择了一组 10 个描述特征，这些描述特征是为大环药物数据集计算的，然后在整个化学空间分析中使用，即分子量 (MW) 和碳原子数 (nC) 大小，计算辛醇之间的分配系数和水 (cLogP) 和芳香环数量 (NAR) 代表亲脂性、拓扑极性表面积 (TPSA)、氢键供体 (HBD) 和氢键受体 (HBA) 代表极性，可旋转键数量 (NRotB) ，Kier 的灵活性指数 (Φ)，以及计算的溶解度 (cLogS)。化学结构为 pH 7.0 时的主要电荷态，以提供对生理水环境中大环化合物的适当描述。正如预期的那样，口服和注射的大环化合物子集的性质空间之间存在明显的分离（图6）。口服药物明显更小（MW）、更具亲脂性（cLogP）、极性较小（TPSA、HBA、HBD）和灵活性较差（NRotB）。这些发现总体上符合口服药物通过平衡亲脂性和极性来显示令人满意的细胞渗透性和水溶性的需要。然而，对于MW、TPSA 和HBA，大多数口服大环化合物都位于bRo5 化学空间的深处。通常认为，bRo5 空间中的化合物可以通过像分子变色龙一样使其构象适应周围环境来实现令人满意的细胞渗透性和溶解度。图 6. 雷达(Radar)图比较了FDA 批准的大环药物的口服（蓝色，n = 24）和注射药（金色，n = 38）子集的 Lipinski Ro5 和 Veber 规则中使用的描述符的中值。2.3.2通过主成分分析作者使用主成分分析（PCA,一种用于降低数据维数的无监督机器学习方法）作为探测口服和注射给药大环化合物化学空间的替代方法，而不是通过检查 Lipinski 的 Ro5 和 Veber 规则的描述符（图 7 ）。由于没有发现 MW > 1500 Da 的口服吸收药物，排除了 9 种 MW 高于此截止值的注射药物，以便更好地剖析口服生物可利用的大环化合物的化学空间。此外，未使用提供冗余信息的三个描述符（nC、NAR 和 Φ）。PCA 的前两个组成部分解释了高达 91% 的变异性，并能够识别口服和注射子集的不同但可重叠的区域（图 7）。正如对不同描述符的分析所揭示的那样，注射大环化合物通常比口服大环化合物位于更极性的化学空间中。因此，发现亲脂性 (cLogP) 是对 PCA 贡献最大的描述符，而灵活性 (NRotB) 是最不重要的。图 7. 大环药物数据集化学空间的主成分分析（n = 53）。 PCA 基于 Lipinski 和Veber 的规则以及 cLogS，在 pH 7.0 下计算。蓝色和黄色阴影的椭圆分别显示口服和注射给药大环化合物的 95% 置信区间。每个类别的质心用相应类别颜色的大圆圈表示。各个描述符对 PCA 的贡献由箭头的长度表示。提供了三种 Ro5 顺应性大环化合物、两种环肽激素类似物、以及环孢菌素和沃罗孢菌素的结构。PCA 中排除了 9 种 MW > 1500 Da 的注射药物，以便更好地剖析口服生物可利用的大环化合物的化学空间( n = 62)。PCA 显示口服大环化合物位于化学空间的四个区域(n=26)（图 7）。首先，大多数口服药是在靠近椭球中心的区域发现的，描述了口服大环的化学空间。其次，lorlatinib, pacritinib, 和moxidectin的 MW、cLogP、HBA 和 NRotB 低于主要口服药物组。这三个大环化合物位于Ro5空间，lorlatinib甚至可以治疗脑中的癌症转移。Cyclosporin 和voclosporin是具有高 MW、TPSA、HBA 和 NRotB 的环肽，位于化学空间的第三个区域。Cyclosporin（环孢菌素）已被证明具有分子变色龙的作用，并且通常认为该特性对其高但可变的生物利用度（高达 60%）至关重要。Voclosporin 是环孢菌素的衍生物，在残基 1 上进行了单一修饰，推测它也会受益于分子变色龙的行为。最后，口服空间的第四个区域由desmopressin 和 octreotide组成，这两种环肽具有非常高的极性（TPSA 和 HBD）、高 MW 和 NRotB值。尽管desmopressin 的生物利用度较低（F < 0.16%），但其超高效力使其可以用作口服药物。同样，口服给药是octreotide（奥曲肽）皮下途径的替代方案，尽管其生物利用度较低（F = 4%）。由于天然产物在大环药物中占主导地位，作者还使用主成分分析来了解原始天然产物的优化是否导致天然产物衍生物占据不同的化学空间，以及该空间是否更接近从头设计的药物的化学空间。由于八种从头设计的大环化合物中除其中一种外，其余都是口服给药，因此它们占据更靠近 Ro5 空间的部分口服化学空间也就不足为奇了。原始天然产物的化学空间与衍生物的化学空间完全重叠，但由于一些异常值，原始天然产物的化学空间更大。与此一致，PCA 并不表明优化已将衍生物推向 Ro5 空间，该结论与是否同时考虑注射和口服大环化合物或仅考虑口服大环化合物无关。 2.3.3 口服大环化合物与注射用注射大环化合物的分类 在药物发现的早期阶段，拥有简单而有效的定量结构-性质关系（QSPR）模型作为化合物选择的过滤是非常有意义的。这对于 bRo5 空间中的大环化合物和其他类别的化合物尤其重要，它们通常需要漫长的合成路线且总产率较低。为了推导易于解释的模型，作者在密度图中为批准的大环化合物计算的 10 个描述符中的每一个定义了口服和注射药物之间的交点。对于连续描述符，交点用作口服和注射给药之间的分界点，而四舍五入值用于离散描述符（HBD、HBA、NRotB）。HBD 和 TPSA 的截止值在区分口服和注射大环化合物方面表现最佳，而其他描述符（例如 NRotB）则不太有用（图 8）。然而，尽管 HBD 和 TPSA 的临界值能够以高灵敏度定义 FDA 批准的大环化合物的口服化学空间（分别为 88% 和 92%），但它们在注射大环化合物分类中的特异性较低（分别为71% 和 66%）。当这两个描述符应用于 2014 年临床试验中的大环化合物外部测试集时（n = 60），这一结论也是有效的。因此，作者继续研究基于两个描述符的模型是否能够表现更好。图 8. 大环药物训练集的口服（蓝色）和注射（金色）子集的 HBD (A)、TPSA (B) 和 NRotB (C) 的单属性分布 ( n = 62)。黑色虚线 表示密度图的交点，导出的截止值在虚线附近给出。基于用于区分训练集中口服药物和注射药物的三个描述符中的每一个的单属性模型的可靠性由 Cohen 的 kappa (κ) 值给出。由于MW 和cLogP 的截止值几乎可以与 HBD 和 TPSA 一样区分口服和注射大环药物，因此研究了基于这四种描述符的所有组合的双描述符模型。发现基于 HBD 的模型与其他三个描述符（MW、cLogP、TPSA）中任何一个的截止值相结合，在 FDA 批准的药物组中提供了口服和注射大环化合物之间的最佳区分（图 9 A，表 1)。desmopressin 和 octreotide的口服生物利用度非常低，是唯一被所有三种模型错误分类的口服药物（图 9 A）。在外部测试集中使用三个双描述符模型来预测口服和注射大环化合物给出了令人满意的预测（图9B，表1）。在对一些截止值进行四舍五入后，该分析发现 HBD ≤ 7 与 MW < 1000 Da、cLogP > 2.5 或 TPSA < 300 Å 2组合是易于记忆的准则，可用于设计口服大环化合物。超出这些限制，发现口服大环药物的可能性非常低，但注射药物可以位于指南的口服空间内。图 9. 口服生物利用度和注射给药的区分 (A) 大环药物和 (B) 尚未批准作为双描述符化学空间中的药物的大环化合物外部测试集。口服药物用蓝色圆圈表示，注射药物用黄色圆圈表示。填充的圆圈已稍微抖动以避免重叠。蓝色阴影标记由 HBD ≤ 7 和 MW < 982 Da、cLogP > 2.22 或 TPSA < 292 Å 2之一定义的化学空间。一些注射大环化合物未包括在图中，这些大环化合物已被截值为HBD < 20、MW < 1500 Da、-5 < cLogP < 10 和TPSA < 600 Å 2。表1 预测大环口服生物利用度的最精确双描述模型根据为批准的大环化合物计算的每个描述符的密度图中口服和注射药物之间的主要交叉点来选择截止值（图8）。缩写：阳性 (TP)、阴性 (TN)、假阳性 (FP)、假阴性 (FN) 和 κ 系数。正值代表“口服”。2.3.4针对 AB-MPS 分数的模型基准测试AbbVie 的多参数评分函数 (AB-MPS) [AB MPS = Abs(cLogD-3) + NAR + NRotB] 对于预测 bRo5 空间中化合物的口服生物利用度非常有用(感兴趣可以阅读10.1021/acs.jmedchem.7b00717)。发现 AB-MPS 评分≤14 是 bRo5 空间中可接受的（ F > 27.3%）和中低口服生物利用度之间的分界线，而 AB-MPS 评分≤15 可用于区分口服生物利用度和注射给药的药物。作者发现 AB-MPS ≤ 15 的截止值将研究中训练和测试集中的大多数大环化合物正确分类为口服或注射药物。2.3.5 HBDs之间的差异由于发现将 HBD 数量限制为 ≤7 对于口服生物利用度至关重要，因此进一步研究了哪些类型的 HBD在口服大环化合物中发现，以支持未来大环药物的设计和优化。根据口服大环药物的来源（即它们是否是从头设计的或者是天然产物或其衍生物）对一组口服大环药物进行划分，也提供了有用的见解（图10）。基于天然产物的大环化合物含有的 HBD 数量明显高于从头设计的药物（图 10 A）。从头合成类每个大环只有一到两个 HBD，主要源自酰胺键（图 10 B）。相比之下，天然产物中的 HBD 绝大多数源自酚类和脂肪醇，正如早期生物活性天然产物研究中所强调的那样（图 10 C）。Cyclosporin 和 voclosporin(大环肽)是例外，因为它们各自都有四个源自酰胺键的 HBD。然而，通常认为变色性（即这些 HBD 参与分子内氢键）对其口服生物利用度至关重要。因此，为了获得令人满意的口服生物利用度，大环化合物的酰胺型HBD的数量优选应保持在≤2。因此，在大环化合物的从头设计中加入酰胺、磺酰胺和相关官能团时应谨慎。图 10. (A) 通过从头设计 ( n = 7) 或天然产物 ( n = 17) 发现的口服生物可利用大环药物中 HBD 数量的比较（在 pH 7.0 下计算的电荷态）。两类药物中源自 (B) 酰胺部分和 (C) 酚类和脂肪醇 (OH) 的 HBD 频率。天然产物类包括原始天然产物和半合成衍生物。箱线图将第 50 个百分位数显示为水平条，将第 25 个百分位数和第 75 个百分位数显示为方框，将第 25 个百分位数负 1.5 倍四分位数范围和第 75 个百分位数加 1.5 倍四分位数范围显示为须线。黑点 表示框两端高于四分位距 1.5 倍且小于四分位距 3 倍的值。2.4临床试验中的大环化合物仅选择自 2017 年以来已完成临床试验或目前正在进行临床试验的大环化合物，以减少数据集中包含失败化合物的可能性。尽管如此，临床研究中的化合物分析总是与一些不确定性相关，例如，在药物被批准之前，治疗适应症和给药途径可能会发生变化。在所得的 34 种大环临床候选药物中，11 种为口服给药以进行全身分布，而 23 种为注射给药。然而，口服的比例可能被低估，因为药物在 I 期研究中通常是注射给药，即使它们可能打算在 II 期和 III 期研究中口服给药。尽管口服临床候选药物的数量存在不确定性，但与 FDA 已批准的大环药物（39％口服）相比，药物化学家似乎无法增加其比例。 6 个大环化合物被归类为从头设计 (18%)，28 个大环化合物被归类为天然产物。有趣的是，也许令人惊讶的是，天然产物衍生的大环临床候选药物的比例 (82%) 与 FDA 批准的药物组 (88%) 几乎相同。因此，大环化合物从头设计的方法似乎尚未对临床管线产生重大影响。与大环类药物一样，对天然产物的细分表明，大多数是天然产物衍生物（n = 24），而只有四种是原始天然产物（n = 4）。对于七种天然产物衍生物，其原始天然产物或其他衍生物已被批准为药物。其中三种天然产物衍生物是通过环肽文库筛选或噬菌体展示获得的环肽或其模拟物。这三者均处于I期或II期临床研究中的注射给药，可能表明近期对环肽的高度关注，开始交付到临床试验。仅发现其中九种有关生产天然产物衍生物的基本原理的信息，包括药代动力学和药效学，其中药代动力学更为常见。2.4.1治疗适应症和靶标临床候选药物的治疗适应症与已批准药物相比存在一些差异（图11）。抗菌药物是药物中的次要适应症（30%），现在已经落后于肿瘤学，后者已成为临床候选药物的主要适应症（47%）。心脏病已成为一个重要的适应症，大环临床候选药物现在也在其他几种新适应症中进行研究，从抗血栓到感染性休克（图11中的“其他”）。抗真菌药和抗病毒药的适应症包括几种成功的大环药物，每种药物只有一种化合物处于临床试验中。对于抗病毒药物来说，这很可能源于用于治疗 HIV 和 HCV 感染的上市药物的成功，这减少了对其他药物的医疗需求。图 11. 临床试验中大环化合物的治疗适应症（内圈）和目标（外圈）（n = 34）。仅由一名临床候选者（各 2.9%）治疗的治疗适应症已归入“其他”类别。 FDA 批准的大环药物的靶点标有红星，而灰色星表示该靶点是由批准的非大环药物调节的。由“和”分隔的目标表明相应的药物是分子胶，而由逗号分隔的目标表明相应的药物表现出多药理学。 NA：靶标未知。34 个大环临床候选药物针对大致相同数量的靶点，其中肿瘤学是靶点最丰富的适应症（图 11）。为了深入了解大环临床候选药物在多大程度上可能成为各自靶点的“FIC”小分子药物，从 ChEMBL 数据库中检索了有关每个靶点已批准哪些大环和非大环药物的信息。发现肿瘤学临床候选药物通常针对已批准的大环药物靶点为:CXCR4、FKBP12、FLT3、HDAC、JAK2、mTOR、ROS、SSTR 和微管蛋白，并且非大环药物已被批准用于某些靶标。2.4.2结合位点和配体形状仅报道了 5 个临床候选药物的药物靶点晶体结构，这可能反映了其中许多候选药物的新颖性（34 个候选药物中的 15 个处于 I 期或 I/II 期临床研究）。5种中的3种与具有凹槽状结合位点的目标结合，一种在隧道中，一种在口袋中。对靶标结合大环化合物形状的分析表明，这五种药物采用比 Ro5 兼容药物更像盘状和球状的构象，就像已批准的大环药物一样。2.4.3 化学空间结构正如大环药物一样，口服和注射给药的大环临床候选药物在化学空间中表现出一定的分离，口服药物显示出预期的较高亲脂性分布以及较低的分子量、极性和灵活性（图 12 A）。与已批准的药物相比，在化学空间的四个不同区域中发现了口服药物，而临床候选药物则位于一个区域，奥达拉韦是异常值。此外，发现口服临床候选药物比口服生物可利用的大环药物更接近Ro5化学空间（图12B）。临床候选药物的分子量、极性（TPSA、HBA 和 HBD）以及柔韧性 (NRotB) 的中值均略低于已批准药物，而两组化合物的亲脂性几乎相同。如果一些注射给药的 I 期候选药物打算用于口服给药，则该观察结果不太可能受到影响，因为它们的分子量均等于或低于口服临床候选药物的中位分子量。图 12.(A) 临床试验数据集化学空间的主成分分析 ( n = 27)。 PCA 基于 Lipinski 的描述符和Veber规则以及在 pH 7.0 下计算的 cLogS。五种 MW > 1500 Da 的注射药物被排除在 PCA 之外，以便更好地剖析口服生物可利用的大环化合物的化学空间 ( n = 32)]。蓝色和黄色阴影的椭圆分别显示口服和注射给药大环化合物的 95% 置信区间。每个类别的质心用相应类别颜色的大圆圈表示。各个描述符对 PCA 的贡献由箭头的长度表示。提供了口服离群奥达拉韦 的结构。给出了接近口服类质心的 milvexian (的结构进行比较。 (B) 雷达图比较了 FDA 口服批准的 Lipinski Ro5 和 Veber 规则中使用的描述符的中值（浅蓝色，n = 24）和临床试验大循环子集（深蓝色，n = 11）。请注意，这里HBD、HBA 和 TPSA 的计算方式与原始规则不同。尽管临床试验数据集很小，只有 11 个口服给药，但将其用作第二个测试集来评估三种双描述符模型区分口服和注射给药的性能。对于这个测试集，基于HBD≤7和cLogP>2.22的模型比其他两个模型表现更好。口服大环化合物的预测灵敏度为 91%，而注射药物的特异性为 67%（75% 准确度），这与第一个测试集的预测基本相同。这一结果为简单的双描述符模型提供了额外的支持，该模型可用作口服吸收大环化合物设计中的第一个过滤设置。在临床试验中对从头设计和天然产物衍生的口服大环化合物的HBD类型进行的研究揭示了与已批准的大环化合物类似的趋势（图10）。尽管两类之间的 HBD 总数差异不具有统计显着性，但天然产品存在含有更多 HBD 的趋势。此外，临床试验中从头设计的大环化合物具有明显更高数量的酰胺型 HBD，但羟基型 HBD 数量较少。在 pH 7.0 下质子化的芳香胺和脂肪胺没有发现差异。正如大环药物一样，这凸显了从头设计的大环化合物的合成依赖于酰胺键的形成，而酰胺键在天然产物中很少出现。此外，值得注意的是，从头设计的临床候选药物缺乏羟基。2.5大环药物发现的未来趋势大环类药物和临床候选药物的治疗适应症和靶点提供了大环类药物发现的见解，从 1942 年首次批准氰钴胺治疗维生素 B12 缺乏症到正在进行的临床研究（图3和11）。为了获得包括未来化合物的概述，挖掘了药物化学领域的最新文献，即从 2005 年到 2022 年。20 种领先的药物化学期刊中以“大环”为关键词的所有文章均经过人工检查，最终收集了 509 篇报道大环用于治疗适应症和/或靶点的文章。2.5.1适应症将最近文献中报道的大环类药物的治疗适应症与已批准的大环类药物（图3）和临床候选药物（图11）进行比较，揭示了几个趋势（图13）。肿瘤学是最近文献中最丰富的适应症（39.5%），抗病毒药物（16%）和抗菌药物（12.6%）分别位居第二和第三。同样，肿瘤学（47.1%）是临床候选药物最常研究的适应症，但抗菌药物（12%）位居第二。相比之下，抗菌药物 (29.6%) 在已批准的大环药物中占主导地位，肿瘤药物 (21.1%) 为第二大适应症，抗真菌药物 (8.5%) 为第三最常见的适应症。这些变化很可能反映了近几十年来制药行业对开发新型抗生素和抗真菌药物的兴趣下降以及对肿瘤学的日益重视。自身免疫性疾病和免疫抑制剂虽然是已批准药物的次要但仍然重要的适应症，但近年来受到的关注也明显较少。抗菌药物、抗真菌药物、免疫抑制剂和自身免疫性疾病治疗药物的衰落也可能源于 20 世纪 90 年代末以来药物来源从天然产品 ，从HTS中发现苗头分子的转变。最近的文献表明，大环化合物现在也正在研究大环化合物以前未探索过的疾病。例如，大约 4% 的大环化合物文献关注神经生成疾病和血栓形成（图 13）。大环化合物的新适应症还包括镇痛、血管生成、心血管疾病和炎症。图 13. 2005 年至 2022 年 20 种主要药物化学期刊上发表的文章中报道的大环化合物的治疗适应症（内圈）和靶点（外圈）（n = 532）。占条目总数<2% 的治疗适应症已归入“其他”类别。每个适应症较少探索的目标已被归类为“其他”，括号中提供了独特目标的数量。 UNK 表示靶标未知或未报告。 FDA 批准的大环药物的靶点标有红星，而橙色星表示针对同一靶点的一个或多个临床候选药物。绿色星表示临床候选药物针对新靶点，即不受现有药物调节的靶点。与“其他”相邻的星号可能表示针对一个或多个目标的一种或多种药物或临床候选药物。2.5.2 靶标最近的文献很大一部分涉及丙型肝炎病毒的NS3/4A蛋白酶（图13）。如上所述，这反映了人们为寻找 HCV 治疗方法付出的巨大努力，自 2013 年以来五种大环药物获得批准。然而，还研究了其他 HCV 靶标，例如 NS2B-NS3 蛋白酶，同时研究了 3C 蛋白酶用于其他病毒感染的情况。在肿瘤学领域，作用于 DNA、HDAC、微管蛋白和其他几个靶点（ALK、CXCR4、mTOR、SSTR2、JAK2 和 FLT3）的药物已获得批准，而新型大环化合物目前正在临床中针对其中一些靶点进行评估（HDAC、微管蛋白、CXCR4、mTOR 和 SSTR2）。此外，在大量其他肿瘤学靶点的研究中也报道了大环化合物（图13）。其中一些已进入临床试验，例如靶向CDK9、MEK、Mcl-1、STING、TRK的大环化合物。在抗菌领域，细菌rRNA复合物和RNA聚合酶受到多种大环药物的抑制，同时也是临床上新型大环化合物的靶点。大环化合物也被探索作为凝血因子 FXIa 和 FVIIa 的抑制剂来治疗血栓形成，其中 FXIa 抑制剂 milvexian 已完成 II 期试验。对于神经退行性疾病，BACE-1 作为阿尔茨海默病的治疗方法已得到深入研究，但迄今为止尚未取得成功。2.5.3化学空间结构被批准作为药物或进入临床试验的大环化合物占据的化学空间区域代表了超过 90 种化合物，这些化合物构成了大环药物发现的成功“冰山一角”。为了更全面地了解研究大环化合物生物活性的化学空间，我们从 ChEMBL 数据库中提取了所有大环化合物 ( n = 28 052)。正如所预料的，主成分分析表明，研究生物活性的大环化合物占据的化学空间比药物和临床候选药物的化学空间大得多，而药物和临床候选药物占据的化学空间区域更有限（图14A）。如已经指出的，口服生物可利用的药物和临床候选药物比注射药物更小、更亲脂并且灵活性更差（图14B）。为了会得到超出已探索范围的分子特性区域中的大环化合物将能够在多大程度上进入临床和市场。图 14. 主成分分析比较从 ChEMBL 检索到的大环化合物（n = 28052，灰色）与 (A) FDA 批准的大环药物（n = 62，红色）和正在进行的大环化合物 (MC)临床试验 (CT)（n = 32，绿色）和 (B) 合并口服（n = 35，蓝色）和注射（n = 59，黄色）部分的药物和临床候选数据集。每个类别的质心用相应类别颜色的大圆圈表示。 PCA 基于 Lipinski 和Veber规则的描述、以及 cLogS，在 pH 7.0 下计算。各个描述符对 PCA 的贡献由箭头的长度表示。 (C 和 E) ChEMBL 中大环化合物的分子量 (MW) 分布和计算的亲脂性 (cLogP)（n = 28 052，灰色）、药物（n = 62，红色）和临床候选药物（n = 32，绿色）数据集。 (D 和 F) ChEMBL 数据集（ n = 28 052，灰色）以及组合口服（n = 35，蓝色）和注射大环化合物的分子量 (MW) 分布和计算的亲脂性 (cLogP) （n = 59，黄色）部分药物和临床候选数据集。PCA中使用的七个属性描述符的分布和化学复杂性的两个描述符（即大环环大小和立构中心数量）的分布的比较，提供了不同大环组的化学空间的替代视角（图14C- F）。尽管 ChEMBL 集合中的大环化合物比大环药物和临床候选数据集探索了更广泛的属性描述符范围，但中值并没有显示出三组之间的重大差异，如大小（MW，图14 C）和亲脂性（cLogP，图14E）。然而，ChEMBL 组中的大环化合物比药物和临床候选药物更小、更亲脂、极性较小（TPSA 和 HBA）且灵活性较差（NRotB）。三个大环组的环尺寸分布相似，但 ChEMBL 集合的立构中心数量偏向下端。事实上，已批准药物组中的大环化合物的立构中心数量是 ChEMBL 组中的两倍。立体中心的差异很可能源于大环药物数据集具有高比例的天然产物及其衍生物，而ChEMBL数据集主要由药物化学家从头设计的大环化合物组成。将 FDA 批准的药物和临床试验数据集结合起来，然后细分为口服和注射数据集，结果显示口服数据集和 ChEMBL 数据集在所有七个属性描述符上都具有惊人的相似性（图14 D 和14 F）。注射大环化合物更大、亲脂性更低、极性更强且更柔韧。ChEMBL 和口服组具有比注射大环稍小的大环，而 ChEMBL 组再次以其低数量的立构中心而脱颖而出。尽管存在这种差异，ChEMBL 集中的大多数大环化合物都位于化学空间中，这很可能在未来提供新型大环药物。3.总结、结论和展望3.1总结和结论作者创建了一个由 FDA 批准的 67 种大环药物组成的数据库，以获取有关大环药物的用途及其所在化学空间的最新信息。另外三个数据库，其中1个列出了美国临床研究中的 34 个大环化合物，另1个数据库包含自 2005 年以来发表的 509 篇关于药物发现中大环化合物研究的文章，第3个数据库包含 ChEMBL 中报道的大环化合物（n = 28 052），提供对于大环药物发现的未来可能会是什么样子有不同的看法。对四个数据库的分析最重要的发现如下。·       大环类药物主要用作抗菌药物，肿瘤学是第二重要的适应症，而对于临床候选药物来说，这两个适应症之间的顺序是相反的。文献调查表明，肿瘤学仍将是未来的主要适应症，但大环化合物也有望用于多种新适应症。此外，分析还强调，大环化合物正在针对大量不受当前大环或非大环药物调节的不同靶点进行临床试验或临床前研究。·       对大环药物靶标结合复合物结构的检查（n = 34）表明，其中 79% 调节具有平坦、隧道形或凹槽形结合位点的靶标。值得注意的是，三元复合物（其中大环充当分子胶）占据了三个凹槽形结合位点。与 Ro5 兼容药物参考集的比较得出结论，大环化合物可以调节这些难以药物靶点，因为大环化合物更有可能采用盘状和球状构象。仅报道了五种临床候选药物的靶结合晶体结构。其中三个大环化合物结合在凹槽形结合位点中，一个结合在隧道中。有趣的是，对临床候选靶点竞争格局的分析初步表明，这些靶点的大部分可能比非大环药物更适合大环药物的调节。·       在大环药物和临床候选药物中，天然产物及其衍生物均优于从头设计的化合物（比例> 4:1）。将药物细分为原始天然产物和天然产物衍生物发现，在少数情况下，衍生物是为了改善药代动力学、药效学或两者兼而有之。然而，这些改进并没有导致天然产物的两个亚类所占据的化学空间出现任何显着差异。在临床候选数据集的天然产物衍生物中发现了通过肽库筛选或噬菌体展示获得的三种环肽。这可能表明最近对环肽的兴趣开始进入临床管线。平均而言，ChEMBL 数据集中的大环化合物仅包含药物集中的二分之一的立构中心，因此看起来比药物更像从头合成。·       近 40% 的大环药物具有口服生物利用度，而超过 30% 的临床候选药物似乎具有口服生物利用度。口服和注射给药的大环药物和临床候选药物填充化学空间的部分重叠区域。有趣的是，简单的双描述符模型，即 HBD ≤ 7 与 MW < 1000 Da 或 cLogP > 2.5 相结合，可以以大约 90% 的敏感性和 70% 的特异性区分口服药物和注射药物。作者建议这些简单的指南可以用作评估大环铅是否可能具有口服生物利用度的第一个过滤设置，并再次强调 HBD 计数是基于 pH 7.0 时预测的主要电荷状态。如果要将接近上限 7 的 HBD 纳入口服生物可利用药物中，则大多数应该是脂肪醇或酚。或者，该化合物应设计为形成分子内氢键，从而通过表现得像分子变色龙来减少其有效 HBD 计数。仲酰胺键常用于药物化学，但在口服大环药物和临床候选药物中很少出现两个以上的此类酰胺键。3.2展望定义口服生物可利用大环化合物化学空间的指南可作为大环药物项目设计的起点。预测大环化合物的生物学相关构象的计算方法，例如在水溶液中、穿过细胞膜时以及与药物靶标结合时所采用的构象，对于指导更精确的设计工作将具有巨大的价值。然而，大环化合物的构象分析具有挑战性，因为大环化合物通常表现出显着的灵活性，而这种灵活性受到环应变、分子内氢键和其他跨环相互作用的影响。附加的侧链进一步增加了定义大环构象系综的复杂性。最后，动态分子内氢键、芳香族基团对极性基团的屏蔽（例如，NH-π相互作用）以及其他分子内相互作用可能使大环化合物表现得像分子变色龙，使其构象适应周围环境。人工智能在药物发现中的应用越来越广泛，并且在大数据集可用时提供了基于结构和构象的特性预测的替代方案。深度学习和神经网络需要非常大的数据集，而这在药物发现项目中通常是不可用的。然而，人们发现不同的机器学习方法对于构建 ADMET 模型来说足够稳健。例如，使用传统的 QSAR 方法构建了大环化合物的细胞渗透性模型，以及最近引入的机器学习算法。还研究了预测大环化合物溶解度的方法，尽管数据集较小。声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓