Zeleciment Basivarsen

-01- 引言 随着多款抗体-寡核苷酸缀合物（AOCs）进入临床试验阶段，这一新兴疗法的临床转化前景日益清晰，但同时也暴露出诸多亟待解决的挑战。AOCs的独特作用机制在带来高效靶向治疗希望的同时，也引入了免疫原性、治疗窗口、复杂药代动力学和潜在耐药性等临床开发中的关键问题。这些挑战直接影响着AOCs的安全性、有效性和最终的患者获益。 -02- 一、AOC面临的当前挑战 AOCs结合了抗体的靶向能力和siRNAs和ASOs等寡核苷酸的治疗功能。抗体识别特定的细胞表面抗原，并将寡核苷酸有效载荷精确递送至靶细胞，例如肿瘤细胞或病变组织中的细胞。理论上，这种设计可以增强治疗效力，同时降低全身毒性；然而，在实际应用中仍然存在许多挑战。 1. 免疫原性 免疫原性是指药物引发免疫反应的潜力。AOCs中的抗体和寡核苷酸都可能被免疫系统识别为外来物质。对于非人源化或不完全人源化的抗体，这种风险尤其明显；这些抗体的效力可能会被中和或清除治疗药物的抗药物抗体降低。由此产生的免疫复合物可能被免疫细胞摄取并沉积在特定器官中，存在脱靶毒性的风险。免疫原性的评估高度依赖于分析方法的灵敏度和特异性，并可能受到测量方法学、样品处理、样品收集时间、伴随用药和基础疾病的影响。AOCs的免疫原性通过评估总抗药物抗体和中和抗体来评估。 抗体对于精确靶向至关重要。与mAbs类似，AOCs中使用的抗体存在免疫原性风险。抗体的异质性，例如鼠源或嵌合抗体的异质性，可能诱导加速药物清除或中和治疗作用的抗药物抗体的形成。全长抗体的Fc区可以通过与Fcγ受体相互作用激活免疫系统。因此，用Fab或scFv片段替代全长抗体可以防止Fc介导的免疫反应。例如，DYNE-101采用靶向TfR1的Fab片段，显著降低了免疫原性风险。尽管人源化或完全人源化抗体降低了免疫原性风险，但一些患者仍可能产生抗药物抗体。免疫原性的风险还受到患者特定因素、药物结构和给药方案的影响。此外，增加给药频率和剂量水平可能会增加免疫原性风险。 寡核苷酸可能通过模式识别受体（如Toll样受体（TLRs））激活先天免疫系统，从而诱导炎症反应。未修饰的siRNAs或ASOs可以通过激活TLR3/7/8/9或RIG-I样受体触发先天免疫反应（例如细胞因子释放综合征），导致高免疫原性和与TLR激活相关的风险升高。随着生物技术的快速进步，寡核苷酸修饰变得越来越多样化，可能降低免疫原性风险。硫代磷酸酯修饰减少了TLR9激活，但可能通过NLRP3途径诱导炎症。此外，2'-O-甲基和2'-氟修饰抑制TLR7/8识别并降低IFN-α水平。CpG寡核苷酸激活TLR9并引发全身炎症。TAC-001通过CpG寡核苷酸激活TLR9用于肿瘤免疫治疗；然而，必须仔细平衡免疫激活和过度炎症反应的风险以用于临床应用。 连接子的选择在调节免疫原性方面也起着至关重要的作用。可裂解连接子（如二硫键）在体循环中过早裂解可能导致寡核苷酸的非靶向释放，从而增强免疫原性。不可裂解连接子（如MCC和Bis-Mal）可以减少循环中寡核苷酸的非靶向释放。例如，Avidity证明，在TfR1过表达模型中，不可裂解连接子不会损害效力，并且可能降低免疫原性。 没有标准化的策略来减轻免疫原性。因此，降低每个组分的免疫原性潜力至关重要。潜在的方法包括使用完全人源化抗体、改进临床给药方案、优化寡核苷酸修饰以及掺入免疫抑制元件。所有这些方法都需要在效力和安全性之间取得平衡。 2. 治疗窗口 治疗窗口定义为最小有效浓度和最小毒性浓度之间的剂量范围。AOCs通过抗体靶向将寡核苷酸特异性递送至靶细胞，释放的寡核苷酸通过RNAi或反义沉默调节基因表达。AOCs显著增强了寡核苷酸在靶组织中的积累，以选择性地干预疾病相关通路。AOCs的目标是通过提高效力同时最小化不良影响来改善治疗指数。然而，许多AOCs由于临床耐受性差而失败，因此需要全面评估和增强效力和耐受性以扩大治疗窗口。 AOC开发面临多方面的挑战，包括（1）由抗体与健康组织的交叉反应性或寡核苷酸介导的非特异性基因沉默引起的脱靶效应，以及（2）靶细胞中有效载荷释放效率低下，需要增加剂量，从而增加毒性。AOCs的治疗窗口受到脱靶效应和有效载荷释放效率的限制。因此，扩大这一窗口需要仔细考虑多种因素，包括脱靶效应对整体毒性的潜在贡献。例如，对靶细胞缺乏完全特异性的抗体可能将寡核苷酸递送至非靶组织，导致脱靶基因沉默或其他不良影响。可以通过抗体优化来解决这个问题。 具体而言，应提高抗体的特异性，并优化其对靶抗原的亲和力，以避免非特异性结合。此外，在抗体设计时应考虑表位分化。应优化抗体亲和力，因为过强的抗体-抗原结合会通过减少游离抗体的可用性来阻碍抗体渗透。除了抗体优化之外，还可以使用生物信息学工具设计高度特异性的寡核苷酸序列，并且化学修饰可以调节寡核苷酸结合亲和力，以减少与非靶RNA的相互作用，平衡亲和力与特异性。例如，应设计寡核苷酸序列以防止种子区与人类转录组中其他mRNA的完全互补。siRNAs的脱靶效应也可以通过2'-O-甲基和2'-氟修饰来减少，这些修饰可以防止RNA诱导沉默复合物与非特异性RNA结合；siRNA种子区（从5'端开始的核苷酸2至8）中的2'-O-甲基修饰可以将脱靶基因沉默减少高达80%，而锁核酸修饰增强了靶标结合特异性并降低了错配耐受性。 有效载荷（寡核苷酸）释放的效率和稳定性也至关重要。如果寡核苷酸在到达靶细胞之前释放或在细胞内释放不足，则可能需要增加剂量以达到治疗效力，从而增加毒性风险。减少不适当有效载荷释放的策略包括优化抗体特异性、开发具有改善稳定性的寡核苷酸（例如掺入锁核酸和肽核酸）以及改善细胞内释放机制（例如通过pH敏感连接子或内体溶解剂增强溶酶体逃逸，以促进有效载荷从溶酶体到细胞质的转移）。还可以通过优化连接子稳定性、缀合特异性、释放可控性和溶酶体逃逸效率来增强寡核苷酸的释放。目标是确保连接子在循环中稳定，以防止在到达靶细胞之前释放，同时在特定的细胞内环境中实现可控裂解，以确保高效的寡核苷酸释放和最佳的治疗活性。 其他考虑因素包括增强的内在化能力、良好的药代动力学/药效学以及降低的免疫原性。总的来说，这些策略旨在实现以下目标：（1）选择最佳靶点和AOC组件，以提高体循环中的稳定性，增强靶组织摄取，并最小化非特异性全身毒性；（2）平衡均匀的组织分布和高效的细胞内化；（3）增强AOC活性以确保卓越的临床效力。 3. 复杂的药代动力学 AOCs由大分子抗体和小分子寡核苷酸组成；因此，它们的药代动力学特性受到两种组分的影响。应考虑以下关键方面：（1）抗体和寡核苷酸之间药代动力学的差异影响AOCs的体内分布、代谢和清除（抗体通常具有约21天的长半衰期，而寡核苷酸在大约2小时内被快速代谢）；（2）组织分布的差异（抗体主要分布在血浆和肿瘤组织中，而寡核苷酸必须穿透细胞膜才能到达细胞质）；（3）连接子稳定性的双重要求（早期裂解可能导致全身暴露和毒性增加，例如肝毒性，但过于稳定的连接子可能会降低治疗效力）。 与具有小分子有效载荷的ADCs相比，AOCs在寡核苷酸和抗体之间表现出更多种类的偶联策略。抗体上的偶联位点（半胱氨酸、赖氨酸或糖基）显著影响AOCs在血浆中的药代动力学。例如，Avidity的研究人员证明，通过赖氨酸和糖基偶联的siRNAs与半胱氨酸偶联物相比，血浆清除率增加。赖氨酸偶联siRNA的血浆暴露减少可能归因于更大的异质性和较低的体内稳定性。考虑到药代动力学数据和半胱氨酸偶联的便利性，研究人员最终选择了半胱氨酸连接的AOCs进行进一步开发。值得注意的是，尽管许多糖基偶联的ADCs高度稳定，但糖基偶联AOCs血浆暴露略有减少的原因尚不清楚；血浆暴露减少可能是由于连接子稳定性或抗体上siRNA的位置。偶联方法也会影响细胞内的溶酶体释放，这对AOCs的药理活性至关重要。具有不同缀合策略的AOCs的药代动力学研究需要开发相应的生物分析方法。选择适当的生物测定对于AOC研究至关重要。 4. 耐药性 对AOCs的耐药性可能来自多种机制，包括抗原逃逸、溶酶体降解增强、寡核苷酸稳定性不足和适应性免疫逃逸。抗原逃逸类似于ADCs中观察到的耐药机制。肿瘤细胞可能下调靶抗原的表达或改变表位构象，从而降低AOCs的结合效率。或者，肿瘤细胞可以通过表观遗传沉默或抗原内在化（例如CD19丢失）来逃避抗体识别。溶酶体降解增强或寡核苷酸稳定性不足也会导致耐药，因为寡核苷酸必须从内体/溶酶体逃逸到细胞质中才能发挥作用。然而，溶酶体活性增加可能导致早期寡核苷酸降解和有效载荷浓度降低。重复给药可能由于免疫原性诱导抗药物抗体，加速AOC清除并降低治疗效力。 已经提出了几种策略来解决这些耐药机制。第一种策略涉及抗体工程和多靶点方法，以克服抗原逃逸和靶点下调。例如，可以开发靶向多个抗原表位的双特异性或双表位抗体，以减少由单靶点下调引起的耐药性。或者，可以优化抗体特异性（例如使用Dyne Therapeutics开发的FORCE™平台），通过特异性受体介导的内吞作用增强组织选择性。第二种策略包括改进的连接子和寡核苷酸修饰。具有改善稳定性和裂解效率的连接子确保AOCs在循环中稳定，但在靶细胞内释放寡核苷酸。寡核苷酸的化学修饰可以增强其稳定性、亲和力和细胞渗透性，同时减轻脱靶效应并减少耐药性的发展。例如，寡核苷酸骨架中的硫代磷酸酯修饰增加了对核酸酶降解的抵抗力。 克服AOC治疗药物耐药性的策略包括开发多特异性抗体以靶向多种抗原，将具有不同作用机制的寡核苷酸组合，以及采用间歇给药方案以最小化免疫原性并延迟耐药性的发展。 -03- 二、AOC的未来展望 基于ADCs在推进靶向治疗方面的成功，AOCs已迅速成为下一代生物治疗平台，以其调节基因表达的独特能力而著称。全球范围内，六种AOC候选药物已进入关键的临床阶段，包括Avidity Biosciences用于强直性肌营养不良的AOC 1001。临床试验中的AOCs主要针对遗传性疾病，特别是肌肉相关疾病。 未来，预计将在多个维度进行优化和创新，包括： （1）增强的靶向策略，例如双特异性抗体和多表位设计，以显著提高组织特异性； （2）智能递送系统，例如血脑屏障穿透性AOCs（例如Denali Therapeutics开发的抗TfR抗体-siRNA）用于治疗中枢神经系统疾病，或靶向心脏组织（例如Avidity的新AOC管线）用于治疗心脏病； （3）标准化生产方法，结合人工智能驱动的连续流制造和模块化缀合平台（例如Dyne Therapeutics的FORCE™），以加速开发时间表并降低成本； （4）技术优化（连接子稳定性和免疫原性控制的改进）和临床验证。 AOCs在精准医学中的独特优势为下一代治疗药物铺平了道路。随着临床数据的积累和监管框架的成熟，AOCs有望成为继ADCs之后的核心技术平台，并有可能从根本上重塑肿瘤学和慢性病的治疗格局。 -04- 结语 AOCs的发展已从概念验证发展到临床转化。AOCs将在癌症治疗、精准医学和神经退行性疾病治疗中发挥关键作用，为个性化和靶向医疗解决方案提供新途径。与基于mAbs或寡核苷酸的治疗药物相比，AOCs在分子设计和制造工艺方面面临独特的挑战。行业和监管机构之间的协调努力（例如制定标准化制造指南）将加速AOCs作为继ADCs之后下一代精准疗法的发展。然而，它们的成功取决于解决制造复杂性（例如OAR控制和有效载荷分布的均匀性）和长期安全性方面的挑战。 参考文献： Advances in the pharmaceutical development of antibody-oligonucleotide conjugates.  Eur J Pharm Sci. 2025 Dec 1:215:107292. 公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

-01- 引言 提高药物特异性、安全性和效力，同时最小化毒性，是开发新型治疗药物的核心目标。寡核苷酸是一类能够调节多种生物功能的新型治疗药物，正迅速发展。寡核苷酸通过沉默、激活、调节、编辑和替换来调节基因表达，特别是基于mRNA的基因表达调控。寡核苷酸易于合成、特异性强、靶点范围广且毒性低，因此在治疗遗传性疾病和神经退行性疾病方面前景广阔。尽管在提高寡核苷酸安全性和有效性方面取得了重大进展，但将寡核苷酸递送至肝脏以外的部位仍具挑战性。此外，提高寡核苷酸通过细胞内化的摄取效率是当前研究的主要焦点。 抗体-寡核苷酸偶联药物（AOC）是一类由抗体、连接子和寡核苷酸组成的新型治疗药物。AOCs结合了抗体的抗原特异性结合能力和寡核苷酸的基因调控功能，旨在实现对多种疾病的靶向高效治疗干预。尽管AOCs尚处于发展早期，但在过去几十年中进展稳步。本文旨在全面概述AOC治疗药物，包括作用机制、结构组件和制造工艺。此外，本文还将讨论当前的质量控制策略、现有局限性以及潜在的未来研究方向，以支持AOC治疗药物的进步。 -02- 一、AOC的发展历程 1913年，诺贝尔奖得主、德国科学家Paul Ehrlich首次提出了“魔术子弹”的概念，即有毒物质（“弹头”）可以被装载到能够精确靶向癌细胞的载体上，以选择性杀死恶性细胞而不伤害健康细胞。2000年首个抗体-药物偶联物（ADC）Mylotarg的获批，极大地推动了药物开发行业。ADC等抗体修饰药物的出现，拓展了新药开发的范式。AOCs目前已成为前景广阔的靶向治疗药物。 AOCs的发展与RNA干扰（RNAi）疗法的发展紧密交织；过去三十年中，这两个领域都取得了显著进展。我们将AOC的发展进程分为五个不同的阶段。早期探索阶段从1995年持续到2005年。关于AOCs的第一项研究发表于1995年。1998年，Fire和Mello阐明了RNAi的机制，为基于siRNA的治疗药物奠定了基础，并于2006年获得诺贝尔生理学或医学奖。1998年，首个ASO药物福米韦生获批上市。尽管福米韦生已从美国和欧洲市场撤出，但其获批是核酸类治疗药物开发的开创性里程碑。 第二阶段是AOC技术发展阶段，从2006年到2014年。2010年，首次在人体中证明了siRNA对蛋白质表达的抑制，为基于siRNA的治疗药物开发提供了理论基础。2014年，基因泰克利用THIOMAB™技术将siRNA定点缀合到抗体上，为AOCs的开发奠定了基础。从2015年到2021年，AOCs进入临床突破阶段。2016年，首个磷酰二胺吗啉代寡聚物（PMO）药物依特立生获得监管批准，扩大了RNAi治疗领域，并为AOC开发提供了重要的寡核苷酸形式。2018年，首个siRNA治疗药物帕替司兰获批临床使用。2021年，首个AOC治疗药物AOC 1001进入临床试验。 从2022年开始，AOCs进入临床进展加速阶段。截至2024年，已有11种ASO药物、6种siRNA药物和2种适配体药物获批临床使用。2022年，多个AOC候选药物进入临床试验，包括DYNE-101、DYNE-251和TAC-001。2024年，AOC 1001被美国食品药品监督管理局（FDA）指定为突破性疗法。2025年，DYNE-101获得FDA快速通道认定。首个AOC治疗药物AOC 1001（或AOC 1044）预计将于2026年上市。 作为一种新兴的治疗技术，AOCs在全球范围内拥有显著的研究和开发势头。截至2025年3月，全球有31个AOC项目处于从临床前研究到III期临床试验的不同开发阶段。这些项目主要针对罕见病、癌症和神经退行性疾病。例如，由Avidity Biosciences开发的Delpacibart Etedesiran（AOC 1001）已进入III期临床试验，用于治疗强直性肌营养不良1型。这种基于RNAi的治疗药物包含一种抗转铁蛋白受体1（TfR1）抗体，能够实现寡核苷酸的靶向递送。Avidity Biosciences的其他AOCs，包括用于面肩肱型肌营养不良症的Delpacibart Braxlosiran（AOC 1020）和用于杜氏肌营养不良症的Delpacibart Zotadirsen（AOC 1044），目前正处于II期临床试验。这些疗法的开发突显了AOCs在治疗肌肉退行性疾病方面的技术优势。 由Tallac Therapeutics开发的用于治疗实体瘤的TAC-001目前处于I/II期临床试验。TAC-001靶向CD22抗原并结合TLR9激动剂以增强免疫反应。DYNE-101由Dyne Therapeutics设计，用于治疗强直性肌营养不良1型。DYNE-101由抗TfR1抗体的Fab片段缀合ASO组成，用于肌肉特异性递送。DYNE-251也由Dyne Therapeutics开发，由靶向TfR1的Fab片段缀合PMO组成。DYNE-251旨在促进向肌肉组织的靶向递送，并促进细胞核中的外显子跳跃，从而在肌肉细胞中产生截短但功能正常的抗肌萎缩蛋白。该疗法适用于适合外显子51跳跃的杜氏肌营养不良症患者。DYNE-101和DYNE-251目前均处于I/II期临床试验。由Aro Biotherapeutics开发的ABX1100是一种新型Centyrin-siRNA缀合物，它采用源自人腱蛋白C的小型稳定蛋白支架，靶向TfR1，将糖原合成酶1（GYS1）特异性siRNA有效载荷直接递送至肌肉组织，用于治疗晚发型庞贝病。ABX1100目前处于I期临床试验。 -03- 二、AOC的作用机制 1. 通过抗体实现靶向递送 已识别出多种抗原靶点，包括转铁蛋白受体、凝集素、受体酪氨酸激酶、整合素和HER2/EGFR。这些靶点使得能够递送至肌肉、中枢神经系统、肝脏和肿瘤细胞。TfR1是研究性AOCs中最常靶向的抗原。TfR1在大多数正常细胞中低水平表达，在具有高增殖率（如基底细胞）和高铁需求（如红系祖细胞）的细胞中显著上调。许多与癌症发病机制相关的基因会调节TfR1的表达。TfR1已在骨骼肌和罕见病、肿瘤学和帕金森病治疗的背景下进行了研究。在TfR1抗体识别靶点后，寡核苷酸的跨膜递送主要通过受体介导的内吞作用进行。 AOCs发挥细胞内作用的机制始于抗体部分与细胞表面其同源抗原的精确相互作用。这种高亲和力结合事件是细胞内在化的启动信号，主要通过受体依赖性内吞作用介导。抗原识别后，AOC-抗原复合物诱导质膜局部内陷，导致缀合物被包裹在称为内体的囊泡结构中。随着新生内体通过内吞途径进展，其经历成熟过程，其特征是管腔环境逐渐酸化——从早期内体的近中性pH到晚期内体和溶酶体中酸性环境的增加。这一成熟过程伴随着各种内体分选复合物和水解酶的募集，它们共同调节囊泡内条件。至关重要的是，这些内在的物理化学特性（如pH梯度和酶活性）会触发连接寡核苷酸和抗体的连接子的裂解。AOCs中的连接子通常被设计为对这些信号作出反应，包含酸不稳定键或蛋白酶敏感肽等元件。连接子解离后，释放的寡核苷酸必须穿过内体膜进入细胞质区室，这一步骤通常称为内体逃逸。这种逃逸机制对治疗成功至关重要，因为被困在内体中可能导致溶酶体降解和活性丧失。各种策略促进了这一过程，包括掺入融合肽或质子海绵聚合物，通过渗透膨胀或膜扰动破坏内体完整性。一旦释放到细胞质中，寡核苷酸就与其分子靶点结合以调节基因表达。根据寡核苷酸类型（如反义寡核苷酸（ASOs）、小干扰RNA（siRNAs）或剪接调节剂），它可能与互补的mRNA序列杂交，从而募集内源性机制，如用于转录物切割的RNase H、用于转录后沉默的RNA诱导沉默复合物（RISC），或改变剪接模式以产生功能性蛋白质亚型。这种基因调控作用最终转化为表型变化，例如遗传性疾病中致病蛋白表达的减少或肿瘤学应用中免疫反应的增强。 尽管大多数靶向不同抗原的AOCs共享涉及网格蛋白介导的内吞作用的内在化共同机制，但内在化速率和内吞后运输各不相同。靶向TfR1的AOCs在小鼠骨骼肌中快速内在化。单次10 mg/kg注射后，24小时内超过80%的靶基因表达被敲低。相比之下，靶向TENB2的AOCs仅在肿瘤血管附近内在化，导致三天内仅33%的基因抑制。TfR1是一种循环抗原，内在化后将AOCs返回细胞表面，而HER2是一种降解抗原，将AOCs导向溶酶体进行降解。 寡核苷酸从内体逃逸的效率低下是一个重大的技术瓶颈。内体具有能够隔离和保留约99% RNA治疗药物的脂质双层。香港大学的研究人员使用定量NanoSIMS显微镜证实，体内只有1%到2%的GalNAc-ASO缀合物从肝细胞内体中逃逸。此外，RNA分子固有的亲水性和负电荷阻碍了它们穿过类似带电的细胞膜的易位。 2. 寡核苷酸的类药特性 传统的ADCs递送作用于特定细胞内分子靶点的细胞毒性有效载荷，以破坏关键的细胞机制。相比之下，AOCs中的寡核苷酸有效载荷作用于上游信号分子，例如内源性mRNAs，通过碱基配对互补特异性沉默靶mRNA，从而减少致病蛋白的产生。几种不同的机制已在临床上得到验证，包括内含子剪接调节（例如，用于治疗脊髓性肌萎缩症的ASO药物诺西那生钠）和RNA诱导沉默复合物的形成（例如，用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性的脂质纳米颗粒包裹的siRNA帕替司兰）。 与ADC制备相关的挑战包括异质性、连接子疏水性、聚集和连接子稳定性。药物的大小以及药物对最终缀合物整体电荷的贡献也显著影响ADC制备。AOCs在结构相似性和设计原理方面与ADCs共享。然而，寡核苷酸的偶联可能带来更大的挑战。例如，ADCs中药物-连接子部分的分子量通常小于2 kDa，而寡核苷酸通常超过10 kDa。因此，寡核苷酸对抗体的物理化学性质的影响比小分子药物更大。此外，寡核苷酸带负电荷的磷酸主链赋予其水溶性，并在偶联时改变抗体的整体电荷。带负电荷的寡核苷酸赋予AOCs与ADCs不同的电荷分布，因此需要专门定制的分析和表征方法，而不是直接用于ADCs的技术。 -04- 三、AOC治疗药物的结构组件 AOCs由抗体或抗体片段、连接子和寡核苷酸组成。抗体应被靶细胞内化。连接子在体循环中保持稳定性，以防止或最小化到达靶组织前的有效载荷降解。连接子还有助于细胞摄取后寡核苷酸的快速释放。寡核苷酸通过调节细胞内的靶mRNA发挥治疗作用。因此，AOCs代表了生物大分子（抗体）和化学大分子（寡核苷酸）的缀合物，具有独特的作用机制和药代动力学特性。 1. 抗体 抗体组件引导AOCs。将抗体的靶向能力与寡核苷酸的基因调控功能相结合，扩展了寡核苷酸的治疗潜力，实现了对致病蛋白的精确调节。用于AOCs的抗体应具备以下特征：对抗原具有高特异性和亲和力、高效快速的内在化以及良好的药代动力学特性。低免疫原性的单克隆抗体（mAbs）是携带寡核苷酸至肝外靶点并参与各种药理作用（如抗体依赖性细胞吞噬作用，从而实现寡核苷酸的肝外递送）的理想递送载体。 抗体类型：全长mAbs，尤其是免疫球蛋白G（IgG），是AOCs最常用的抗体。IgG分子分子量约为150 kDa，由两条重链和两条轻链组成，形成不同的Fab和Fc区。IgGs表现出高特异性、强亲和力和延长的半衰期。然而，IgGs相对较大的尺寸限制了渗透性，降低了IgG缀合的AOC向深层组织区域的浸润。全长抗体，包括IgGs，主要积聚在肿瘤血管附近的少数细胞层内，而不是深层组织区域。尽管存在这些挑战，AOC设计的进步正在利用全长mAbs的优势来克服此类限制并实现靶向递送。Avidity Biosciences正在推进Delpacibart Etedesiran的临床开发，该药物采用靶向TfR1的全长mAb实现肌肉特异性递送。 抗体片段，如Fab或scFv，越来越多地用于解决全长抗体组织渗透有限的问题。抗体片段通过完整抗体的酶消化或基因工程产生截短抗体而产生。抗体片段的分子量范围为25 kDa至50 kDa。抗体片段保留了高特异性和亲和力，并表现出增强的组织渗透性，但抗体片段的半衰期比全长抗体短。Sutherland等人证明，靶向癌胚抗原的抗体片段在体外肿瘤球体模型中显示出相对于完整IgG显著改善的渗透性。Dyne Therapeutics正在推进DYNE-101的临床开发，该药物采用结合TFR1的Fab实现肌肉特异性递送。 源自骆驼科物种的VHH抗体（纳米抗体）由单个可变域组成，分子量在12 kDa至15 kDa之间。与全长mAbs和片段化抗体相比，VHH抗体表现出更高的特异性和亲和力以及更优的组织渗透性，但半衰期更短。纳米抗体在注射后3至5小时内达到高肿瘤背景对比度，表明其能够快速渗透深层组织区域。使用VHH的AOC正成为一个热门研究领域。迄今为止，尚无相关药物进入临床试验。 抗体特异性和亲和力：理想抗体的独特分子结构是其对抗原靶点具有高特异性和适当亲和力的基础。Y形抗体包含两个可变区，由通过V(D)J重组产生多样性的互补决定区组成。互补决定区的独特构象确保了与靶抗原的精确匹配，这是高特异性和亲和力的基础。精确靶向可最大限度地减少脱靶细胞的非特异性摄取，从而降低AOCs的毒性并增强其治疗效力。适当的亲和力也增加了靶细胞摄取AOC的可能性，从而提高了整体效率。 药代动力学特性：将抗体与寡核苷酸偶联会导致相对于裸抗体的物理化学变化。这些改变可能影响药代动力学，应在AOC开发过程中仔细考虑。人源化抗体具有与未偶联抗体相似的药代动力学特性，越来越多地用于下一代ADC构建。人源化抗体为AOC设计提供了宝贵的指导；低免疫原性和最佳的药代动力学特性对抗体选择至关重要。 2. 寡核苷酸 寡核苷酸包括短的低分子量RNA或DNA分子及其合成类似物（异源核酸）。寡核苷酸在治疗、诊断和免疫调节方面具有多种应用，包括病原体检测、基因沉默和基因表达调节。寡核苷酸是AOCs的关键组成部分，体现了其药理作用。该组包括ASOs、小干扰RNA（siRNAs）、PMOs、微小RNA（miRNAs）和核酸适配体。其中，ASOs、siRNAs和PMOs得到了最广泛的研究。与作用于分子靶点以实现所需表型的传统ADC小分子有效载荷不同，当前的合成寡核苷酸治疗药物靶向上游信号分子，例如内源性mRNAs。寡核苷酸通过碱基配对互补特异性沉默靶mRNAs，以减少致病蛋白的产生。 ASOs：ASOs是通过碱基互补靶向mRNA或pre-mRNA以调节基因表达用于治疗目的的单链核酸分子。AOCs中的抗体靶向递送可显著增强传统ASO疗法的效力和安全性。AOC作用的主要机制包括与靶RNA特异性结合，诱导RNase H介导的RNA降解，或通过空间位阻抑制RNA剪接和翻译，从而调节特定基因的表达。例如，用于治疗脊髓性肌萎缩症的ASO药物Spinraza（诺西那生钠）通过调节SMN2基因的表达来增加SMN蛋白的产生。Spinraza在脊髓性肌萎缩症患者的临床试验中实现了持续的治疗获益。对于AOCs，1995年首次报道的AOC使用ASO作为核酸分子。近年来，几种AOCs已进入临床试验，并使用ASOs，一个显著的例子是DYNE-101。 小干扰RNA（siRNAs）：研究最广泛且临床应用最广泛的寡核苷酸是siRNAs。双链siRNAs通常为21至23个碱基对。反义链与靶mRNA完全互补，并通过RNA诱导沉默复合物介导靶mRNA的降解以沉默基因。Inclisiran是一种已批准的siRNA分子，具有已证实的效力和安全性，可干扰前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）的mRNA，导致该蛋白和低密度脂蛋白胆固醇的持续降低。与传统小分子药物相比，siRNAs表现出更高的特异性和更广的靶点谱，能够精确干预小分子难以靶向的蛋白质或基因。然而，与ASOs相比，siRNAs通常表现出较低的组织渗透性。许多临床试验中的AOCs使用siRNA作为有效载荷，例如Avidity开发的Delpacibart Etedesiran和Delpacibart Braxlosiran。 PMOs：PMOs是合成的单链DNA类似物，其中天然的磷酸二酯键被磷酰二胺键取代。每个PMO亚基中的吗啉环赋予其增强的稳定性和对酶降解的抵抗力。PMOs主要通过互补结合pre-mRNAs以阻断剪接体对靶功能蛋白特定外显子的识别来调节基因表达。PMO结合诱导外显子跳跃并恢复功能蛋白的翻译。2016年批准的Eteplirsen（EXONDYS 51®）是一种基于PMO的反义寡核苷酸，用于治疗确诊DMD基因突变且适合外显子51跳跃的杜氏肌营养不良症患者。尽管PMOs是AOCs中最新使用的寡核苷酸类型，但它在该领域发挥着重要作用。Avidity开发的Delpacibart Zotadirsen使用PMO作为AOC的寡核苷酸部分。 寡核苷酸的修饰：作为生物大分子，寡核苷酸在进入生理环境时会面临一些挑战，这些挑战限制了它们的治疗效力，包括稳定性差和易受血清核酸酶降解。AOCs通常携带寡核苷酸有效载荷。对寡核苷酸骨架、糖部分和核碱基的修饰包括骨架重组、糖环改变、末端加帽和5'磷酸化。这些修饰提高了寡核苷酸的稳定性和治疗效力。寡核苷酸化学和偶联技术的重大进步促进了多种寡核苷酸缀合物的开发，用于临床候选药物。 3. 连接子 连接子在AOC的靶向抗体和治疗性寡核苷酸之间建立高效且可控的化学桥梁。连接子显著影响AOCs的关键参数，包括寡核苷酸-抗体比率（OAR）、治疗指数、药代动力学/药效学以及整体稳定性。因此，连接子的设计和选择需要综合考虑稳定性、可控释放和生物相容性等多种因素。 连接子大致可分为可裂解和不可裂解两种类型。可裂解连接子在特定生理条件下释放药物，可进一步分为酶敏感型、酸敏感型和还原敏感型亚型。酶敏感型连接子可以基于溶酶体的独特微环境进行设计。例如，水解酶如组织蛋白酶特异性裂解基于肽键的连接子（如Val-Cit），磷酸酶降解磷酸酯基连接子。连接子的肽序列或化学结构必须在血浆中的稳定性与细胞内高效裂解之间取得平衡。寡核苷酸的释放也可由酸性条件（内体中pH 5.5，溶酶体中pH 4.5）或还原环境触发。常见的酸敏感型连接子包含肼、缩醛和碳酸酯键。细胞内谷胱甘肽浓度升高诱导二硫键的选择性裂解；因此，连接子的稳定性可以根据缀合位点和空间位阻程度进行微调。 不可裂解连接子提高了偶联稳定性，适用于需要长时间循环和持续活性的疗法。常见的偶联策略包括与天然氨基酸（如半胱氨酸或赖氨酸）共价连接、形成马来酰亚胺-硫醇连接（例如通过SMCC）以及使用点击化学方法（例如铜催化的叠氮-炔环加成或应变促进的叠氮-炔环加成）进行定点偶联。 直接偶联：直接缀合是AOC设计中最常用的缀合方法。在寡核苷酸上引入官能团允许其直接连接到抗体上。化学修饰的多样性支持使用多种连接子，包括可裂解和不可裂解连接子以及先前经过验证的ADC连接子。针对抗体上特定结合位点设计的连接子可以有效调节OAR，并且可以更小，与较大的连接子相比，对AOCs整体物理化学性质的影响更小。然而，这种方法需要在寡核苷酸上构建连接子附着位点，然后通过化学缀合将连接子连接到该位点。因此，直接缀合的通用性依赖于连接子的高稳定性，该连接子必须与DNA或RNA分子及其双链退火过程兼容且稳定。 在当前ADCs中，主要的偶联基团包括赖氨酸和半胱氨酸残基，近年来半胱氨酸基偶联的使用显著增加。类似地，AOCs目前主要利用半胱氨酸残基作为关键偶联基团，利用其反应性硫醇部分高效附着寡核苷酸有效载荷，特别是通过工程化半胱氨酸实现定点偶联，从而精确控制OAR值、偶联位置，并促进靶向递送应用以增强治疗效力。Cochran等人比较了AOCs的不同连接子方法。为此，他们采用了三种不同的抗体与寡核苷酸偶联方法：1）半胱氨酸偶联，2）赖氨酸偶联，3）Asn297糖基化偶联。为了实施基于半胱氨酸的方法，他们用TCEP处理抗体以切割链间二硫键，暴露半胱氨酸残基上的硫醇基团，然后使siRNA与含马来酰亚胺的连接子MCC反应，形成siRNA-连接子-马来酰亚胺中间体，随后通过硫醇-马来酰亚胺反应偶联到抗体上。结果表明，通过半胱氨酸偶联构建的AOCs在药代动力学和siRNA递送效率方面优于其他方法，因为赖氨酸偶联导致血浆清除更快，而Asn297糖基化缀合虽然稳定，但血浆暴露较低。 点击化学是美国化学家Barry Sharpless于2001年引入的现代有机合成策略，并于2022年获得诺贝尔化学奖。点击化学因其高效、优异的选择性、模块化和温和的反应条件而被用于构建AOCs。点击化学的一个显著例子是使用应变促进的叠氮-炔环加成。在这种方法中，抗体用DBCO-PEG5-NHS修饰，寡核苷酸的5'端通过标准固相合成功能化叠氮基团（-N₃）。抗体和寡核苷酸通过DBCO和叠氮的应变促进叠氮-炔环加成快速偶联。这种由点击化学实现的模块化设计，便于在实验过程中灵活交换不同的抗体和寡核苷酸，并支持抗体与各种寡核苷酸的正交偶联，为经济高效且可扩展的AOC生产提供了支持。 亲和力偶联：亲和力偶联的一个典型例子是利用亲和素和生物素之间的高亲和力，将siRNA稳定偶联到靶向抗体上。在这项研究中，正义siRNA链在3'端单生物素化，并与靶向人胰岛素受体的重组链霉亲和素和mAb的缀合物组装。使用转染了荧光素酶报告基因的人293上皮细胞来监测基因表达并表征该构建体。AOC构建成功，AOC处理在48小时内使荧光素酶表达显著降低超过90%。RNA干扰作用持续长达5天，但在7天后消失。在siRNA浓度低至3 nM时可检测到抑制作用，并且抑制效果随siRNA浓度增加而增加（半数抑制常数约为30.5 ± 11.7 nM）。这些发现表明，亲和素-生物素系统是构建AOC的高效且稳定的连接子。 通过离子相互作用偶联：离子相互作用偶联利用寡核苷酸骨架的负电荷，通过离子相互作用与修饰有多聚阳离子结构的抗体偶联。最常用的多聚阳离子部分是内源性蛋白鱼精蛋白。Liberman等人首次报道了通过离子相互作用缀合构建AOCs的方法。来自靶向HIV-1包膜蛋白的mAb F105的重链Fab片段与鱼精蛋白基因融合，生成融合蛋白F105-P。将F105-P与siRNA孵育得到AOC。siRNA的荧光标记显示，每个鱼精蛋白分子稳定结合大约六个siRNAs。构建的AOCs证明了有效的靶向和基因沉默，而不会触发干扰素反应。这项研究证实了离子相互作用缀合用于AOC构建的潜力，并突出了这种方法的简单性。多聚阳离子部分也充当溶酶体逃逸剂，并通过“质子海绵”效应诱导溶酶体渗透膨胀，增加膜通透性并促进寡核苷酸释放到细胞质中。 尽管简单，离子相互作用偶联存在固有的不稳定性。离子键的可逆性使得缀合物在生理pH或盐度变化下容易解离，可能导致寡核苷酸过早释放。此外，由于依赖于间接表征方法，如荧光标记或PCR，质量控制尤其具有挑战性，这通常导致批次间差异大，并难以确保产品一致性。最后，缺乏全面的体内稳定性数据，包括ADME谱，引入了释放动力学的不确定性，增加了脱靶效应和降低治疗效力的风险。因此，上述挑战导致离子相互作用偶联在当代AOC研究中很少使用。 -05- 结语 AOCs的分子设计是一个高度复杂且精密的系统工程，其核心在于通过优化的抗体、连接子与寡核苷酸三大组件的协同作用，实现从精准靶向到高效基因调控的完整生物学功能。从作用机制上看，AOCs成功地将抗体的细胞特异性递送与寡核苷酸的细胞内基因沉默能力相结合，但其效力最终受限于内体逃逸等关键细胞内步骤的效率。在制造工艺方面，从抗体的工程化生产、寡核苷酸的固相合成，到通过多种化学策略进行可控偶联，每一步都面临着确保产品均一性、稳定性和活性的严峻挑战。尽管存在这些复杂性，对AOCs结构组件和作用通路的深入理解，以及不断成熟的制造平台，正共同推动着这一新兴治疗模式从实验室走向临床。未来，进一步的创新将聚焦于开发更智能的连接子、穿透性更强的抗体形式以及更稳定的寡核苷酸化学，以最终释放AOCs在治疗遗传性疾病、癌症等领域的全部潜力。 参考文献： Advances in the pharmaceutical development of antibody-oligonucleotide conjugates.  Eur J Pharm Sci. 2025 Dec 1:215:107292. 公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。