Micvotabart pelidotin

今天除夕，祝大家新春快乐 今天聊一款非内化ADC，即通过靶向肿瘤微环境靶点并在胞外释放的新型ADC PYX-201（Micvotabart pelidotin，简写MICVO）。 MICVO由Pyxis Oncology 开发，目前正在开展HNSCC的单用及K药联用临床I期研究。 MICVO的分子设计： 🎯EDB+FN靶点：纤连蛋白的外域-B 剪接变体（EDB⁺FN） 是纤连蛋白的一种剪接异构体。纤连蛋白是一种仅在多种实体瘤基质中表达上调的基质蛋白，与肿瘤生长、血管生成及转移密切相关，在正常组织低表达。 在肿瘤细胞内和细胞膜上不表达，在肿瘤基质中特异性表达，因此属于肿瘤微环境的靶点 💊载荷：微管抑制剂Auristatin-0101，DAR4设计 丫抗体：anti-EDB+FN-K(94)R-huIgG1-K290C-κK183C，工程化的半胱氨酸实现定点偶联 🔗连接子：传统连接子mc-vc-pab，作为一款first-in-concept 的ADC，并没有针对肿瘤微环境对连接子进行优化，不过体外研究证实多种组织蛋白酶可以有效释放载荷，且肿瘤微环境的低pH更容易释放载荷。 🐓proposed MOA：1)载荷释放后直接杀伤肿瘤；2)旁观者效应杀伤；3) ICD效应杀伤。 💯潜在优势：靶点特异性强，安全性更好；可以穿过肿瘤的纤维化屏障，药效更优（At ESMO, Tolcher emphasized that Micvo’s extracellular-targeting approach could bypass the fibrotic barriers of tumors like pancreatic cancer and enable a potent bystander effect，未看到相关证据） 🐭药效学研究中，多种PDX模型观察到显著药效，和PD-1具有协同优势 👤临床研究： I期剂量爬坡研究中，有效剂量为3.6-5.4mpk，在此剂量范围内ORR=26%，HNSCC的ORR为50%（2PR，1CR），DCR 100%，2例更高剂量6.6mpk 均为SD。 安全性方面，在3.6-5.4mpk剂量范围内，无治疗相关性死亡，但是5.4mpk出现多例给药终止，剂量减少和延迟给药。3-4级AE主要为皮肤、中性粒细胞减少，贫血，还有1例肺炎。 MICVO显著增加了淋巴细胞的浸润 靶点表达和药效并没有显著的相关性 HNSCC的结构特征可能和药效有一定相关性 总结：靶向肿瘤微环境ADC是一种比较好的差异化思路，有些靶点如LRRC15在肿瘤细胞和肿瘤微环境同时表达，靶向肿瘤微环境Treg的CCR8 ADC，靶向肿瘤相关成纤维细胞的FAP ADC等也在POC阶段。MICVO目前的数据还比较有限，安全性和有效性的平衡点，肿瘤标志物和药效的相关性等都需要深入研究，期待更多研究结果。 关注小编不迷路 参考文献 1MICVO AACR_2024_Poster_PYX-201_a_stroma-targeting_ADC.pdf 2 MICVO AACR_2024-Poster_Sara_Final_2.pdf 3 MICVO AACR_NCI_EORTC_immune_intfilt_2025_EL_Final.pdf 4 MICVO AACR-NCI-EORTC-2025_CS_Final.pdf 5 MICVO ESMO-2025-Poster_Final__07Oct2025_print_Sized.pdf 6 MICVO ESMO-2025-Poster-1014e-IHC_FINAL-1.pdf

注：文章内容源自书籍Antibody-Drug Conjugates--The 21st Century Magic Bullets for Cancer (Second Edition)第6章内容的翻译。 摘要 ADCs兼具大分子生物药和小分子药物的特性。目前已有多种用于表征ADCs的分析方法被报道，但为了更好地表征临床用ADCs，仍需一套全新且全面的生物分析策略，以克服现有方法的局限性。由于ADCs的结构复杂且具有异质性，合适的生物分析方法对其理化性质和药代动力学性质的表征至关重要。本文总结了用于表征各类ADCs的常用生物分析方法，重点关注药代动力学研究和药物抗体比的测定，同时探讨了这些分析方法面临的挑战与发展前景。 关键词 抗体药物偶联物；生物分析 6.1 引言 ADCs是一类异质性分子，由细胞毒性药物（有效载荷）通过稳定的化学连接子与抗体（完整单克隆抗体或其片段）偶联而成。ADCs在癌症治疗中的重要性日益凸显。在全身循环中，药物分子通常与抗体稳定结合。当抗体与表达抗原的肿瘤细胞结合后，ADC会被内吞并转运至溶酶体，溶酶体内的低pH环境（pH 4.5~5.0）可水解连接子，或蛋白酶可降解连接子，从而释放游离的有效载荷。ADCs的分子结构复杂，兼具大分子和小分子的特性。小分子药物可通过抗体上不同的氨基酸残基偶联位点与抗体结合，这会导致ADCs的异质性。例如，可通过还原链间二硫键，将连接子-药物偶联在赖氨酸残基和半胱氨酸残基上，或偶联在工程化半胱氨酸残基上（图6.1）。该偶联反应会生成具有不同药物抗体比（DARs）的ADC异质混合物。若在赖氨酸残基处进行偶联，DAR的分布范围可为0~9；在半胱氨酸残基所在的不同二硫键位点，可偶联0、2、4、6、8个药物分子；而在工程化半胱氨酸位点进行偶联时，所得ADC的药物抗体比主要为2。 图6.1 ADC的偶联位点及载药特征 （a）赖氨酸残基偶联；（b）还原链间二硫键后的半胱氨酸残基偶联；（c）工程化半胱氨酸残基偶联。Ab：抗体；ADC：抗体药物偶联物；DAR：药物抗体比；TDC：硫代单克隆抗体-药物偶联物。 ADCs也可用于其他疾病的治疗研究。DSTA4637S是一种新型硫代单克隆抗体抗体-抗生素偶联物，目前正作为治疗复杂金黄色葡萄球菌血流感染的新疗法接受研究。该偶联物由靶向金黄色葡萄球菌的硫代单克隆抗体IgG1，通过蛋白酶可裂解的连接子与利福霉素类抗生素（dmDNA31）偶联而成。在大鼠和猴体内开展的临床前研究揭示了DSTA4637S复杂的PK特征，为了解其全身药物浓度提供了有价值的信息，也为其后续的临床开发提供了依据。 ADCs在体内会因分解代谢和生物转化进一步增加其结构复杂性。除了连接子经化学或酶解作用发生药物解偶联外，加合物形成、肽片段生成或连接子-药物片段产生等其他生物转化过程，也会让其结构更加复杂。ADCs经给药进入体内后，除了原本的完整或总ADC外，还会产生多种不同的组分，具体包括： 总ADC：完整的ADC（药物有效载荷通过化学连接子与抗体结合），其结合的有效载荷数量可能不同； 总抗体：所有形式的抗体，包括未偶联药物和已偶联药物的抗体； 完整抗体：完全组装的抗体（重链和轻链相互连接）； 活性ADC：保留治疗功能的ADC（结构完整、具备靶向结合能力和细胞毒性作用）； 偶联型有效载荷：与抗体结合的药物有效载荷； 未偶联型有效载荷：未与抗体结合的药物有效载荷（部分文献称其为游离有效载荷，游离有效载荷既包括从偶联物中释放的部分，也包括单独存在的药物）； 偶联型有效载荷代谢物：仍与抗体结合的有效载荷代谢产物； 有效载荷分解产物：与连接子或部分连接子一起从抗体上释放的药物有效载荷。 活性ADC可能会因有效载荷解偶联与代谢、可溶性靶点结合，或中和性抗体与活性结构域结合而失活。 总抗体可用于评估ADC的蛋白组分，偶联型抗体和ADC的含量可用于评估偶联效率，游离有效载荷则可用于安全性评价。 理论上，ADC和总抗体的谱图差异可反映药物的解偶联程度，公式如下： 总抗体=活性ADC+无活性ADC+未偶联药物抗体 DAR是评估ADC效价和毒性的关键质量指标，因此亟需可靠的体内外方法来测定DAR的分布特征。目前已有多种方法用于分析药物偶联形式的分布（如结合不同数量药物的抗体比例），这是ADC的重要特征，因为不同的药物偶联形式可能会导致其PK和毒理学性质存在差异。用于ADC定量和定性分析的相关信息及典型生物分析方法见表6.1。单一分析方法可实现多种检测目的并提供不同信息，但要全面描述异质性ADC的浓度和组成，仍需一套组合分析方法。本章将对ADC生物分析表征的常用方法进行总结。 表6.1 ADC生物分析中常用的分析物及相关参数 注：LBA为配体结合分析法；DAR为药物抗体比；MS为质谱法；HIC为疏水作用色谱法；HPLC为高效液相色谱法 6.2 ADCs的典型生物分析方法 生物分析方法在小分子化学药和复杂生物药的研发中均发挥着关键作用。化学药通常为结构明确的小分子，因此其分析方法主要聚焦于母体药物和/或其代谢产物的定量；而ADCs的复杂性则要求分析方法能够对抗体、药物有效载荷、连接子等各组分进行表征，并提供其分子结构、偶联效率、稳定性和活性的详细信息。准确、可靠的生物分析方法对ADCs的研发、监管审批和临床应用至关重要。 6.2.1 PK研究用分析方法 在ADCs的典型PK研究中，需建立三种分析方法分别对总抗体、总ADC和未偶联型有效载荷进行定量。但若药物有效载荷/连接子的修饰程度较大，则需建立更多分析方法，对活性ADC、偶联型有效载荷、偶联型有效载荷代谢物、有效载荷分解产物等更多形式的ADCs进行检测（表6.2）。 表6.2 配体结合分析法LBA和质谱法用于ADC组分定量的实例 目前用于ADCs分析的方法多种多样，包括配体结合分析法（LBA）、紫外-可见分光光度法（UV/Vis）、质谱法（MS）以及色谱法。ADC药代动力学研究常用的生物分析方法主要为大分子LBA和MS。 6.2.1.1 配体结合分析法LBAs LBA是基于配体与其特异性受体结合的一种分析方法。大分子具有结构明确的三级结构，适用于LBAs。该方法已被广泛用于总抗体浓度（游离抗体和偶联药物抗体/ADC）和偶联型抗体（ADCs）的定量，常用的LBAs包括酶联免疫吸附测定法（ELISAs）、基于细胞的结合试验及其他结合试验。 酶联免疫吸附测定法 ELISA ELISA基于抗原与特异性抗体结合的免疫学基本原理，可实现对多种物质的检测，包括小分子（如化学药）和大分子（如多肽、蛋白质或抗体）。该方法通常利用可捕获抗体的特异性抗原对ADC浓度进行测定，通过可与抗体或有效载荷结合的特异性试剂，ELISA可对总抗体进行定量，包括完全偶联药物、部分解偶联和完全解偶联的抗体。此外，该方法也可对从ADC中释放的游离有效载荷浓度进行测定，只是这种应用并不常见。 ELISA是检测总抗体的常用方法。图6.2a展示了一种用于大分子分析的典型ELISA结合试验。捕获试剂（抗原、抗互补决定区单克隆抗体或抗药物单克隆抗体）被固定在固相基质上，目标分析物可被捕获试剂识别并结合，其他分子则被洗脱。分析物的含量可通过检测试剂进行定量。图6.2b为利用抗体结合试剂检测总抗体的实例。该方法通过特异性抗原捕获单克隆抗体或人源化抗体，再利用酶标记的抗鼠源或抗人IgG检测被捕获的抗体。此方法已应用于多种ADC的定量检测，包括huC242单抗-DM1、Trastruzumab-DM1、Anti-CD33-刺孢霉素偶联物（Gemtuzumab Ozogamicin）、anti-MUC16-vc-MMAE以及CR011-vc-MMAE。采用抗原直接包被法时，需具备纯化蛋白作为捕获试剂。抗药物抗体既可作为捕获试剂（图6.2c），也可作为检测试剂，二者的主要区别在于检测方法对药物载量的灵敏度不同。抗药物抗体理论上可捕获所有药物载荷，因此该检测方法对药物载量不敏感；但如果将抗药物抗体作为检测试剂，信号强度则与抗体偶联的药物量成正比。Kovtun等人的研究便是典型案例，该研究以鼠源抗美登素单克隆抗体为捕获试剂，检测huC242-DM1的浓度，采用辣根过氧化物酶标记的驴抗人IgG检测标准品或待测样品中的偶联物。以抗药物抗体为捕获抗体的检测方法存在一个难点，即无法对不同药物载量的所有抗体药物偶联物进行定量检测。Xie等人的研究指出，在PK研究中测定huC242-DM1的清除率时，此类检测方法可能会低估偶联物中药物分子的流失量。抗药物抗体也被用作ADC定量检测的检测试剂，例如Stephan等人分别采用生物素化抗DM1抗体和生物素化抗MMAF抗体，检测anti-CD22-MCC-DM1和MC-MMAF ADC。上述偶联物检测方法产生的信号与药物载量相关，且信号强度与美登素DM1或MMAF的分子数量成正比。Sanderson等人以抗独特型cAC10单克隆抗体为捕获试剂，以生物素化抗MMAE抗体为检测试剂，检测每个抗体偶联2、4、8个VC-MMAE药物连接子的anti-CD30 ADC（cAC10-Val-Cit-MMAE，DAR为2、4、8）。研究发现，DAR为2的cAC10-Val-Cit-MMAE产生的偶联抗体检测信号强度低于DAR为4的该偶联物。这表明，考虑到血液循环中药物可能发生流失，与作为标准品的原始ADC相比，血液循环中ADC的实际浓度可能高于检测值。值得注意的是，ELISA无法检测DAR及整体药物载量。 图6.2 基于ELISA的结合试验 （a）典型的ELISA，（b）用于ADC总抗体测量的ELISA，（c）用于ADC偶联抗体测量的ELISA。 检测总抗体时，将特异性抗体包被在酶标板上，无论药物是否偶联，均可捕获目标抗体；随后加入酶标记的检测抗体，与目标抗体的另一结合位点结合；再加入酶的底物，通过底物与酶的反应产生信号并进行定量。ADC的检测方法与之类似，不同之处在于需使用针对药物载荷或ADC其他结构的特异性检测抗体，信号强度与样品中ADC的浓度相关。 ELISA也可检测ADC释放的游离药物浓度，不过质谱法仍是该检测的常用方法。Sanderson等人先通过cAC10单克隆抗体ELISA测定血浆中的总单克隆抗体含量，再利用MMAE竞争ELISA，检测该ADC（cAC10-Val-Cit-MMAE）经组织蛋白酶体外孵育后释放的MMAE含量。在游离单MMAE竞争ELISA中，抗MMAE单克隆抗体（SG3.218克隆株）是检测游离MMAE最灵敏的试剂。为验证SG3.218单克隆抗体捕获游离及辣根过氧化物酶标记MMAE的检测灵敏度，将一系列梯度稀释的游离MMAE标准品与已知浓度的辣根过氧化物酶-MMAE偶联物混合，共同竞争结合包被有抗MMAE单克隆抗体SG3.218的酶标板。结果显示，游离药物可通过剂量依赖性方式有效竞争抑制辣根过氧化物酶-MMAE报告分子的结合。 ELISA具有高通量、成本相对较低的优势，但该检测方法也存在一定局限性：检测试剂易受多种因素干扰，无法区分不同DAR的ADCs。而DAR相关信息至关重要，因为ADC在体循环中可能发生偶联药物的流失，导致DAR改变，进而可能影响其疗效和安全性。若能获得可特异性结合目标ADCs的经充分表征的抗体，ELISA可具备高特异性；但在药物研发早期，这类特异性试剂（如高选择性、经充分表征的抗体）往往难以获取。随着ADCs研发的推进，LC-MS/MS等基于质谱的检测方法的重要性日益凸显，这类方法具有更强的分析能力和灵活性。 基于细胞的结合检测试验 尽管ELISA应用广泛，但在缺乏抗原的情况下则无法使用。此时，表征ADC结合活性的另一常用方法，是利用表达内源性或转染抗原的细胞进行检测，这类细胞可被ADCs识别。体外细胞结合试验可用于测定ADC与抗原阳性细胞的靶向结合效果，试验所用细胞需表达足量的靶蛋白，同时与细胞的非特异性结合需尽可能低，以保证检测方法的灵敏度。通常将细胞接种于96孔板，随后与梯度稀释的ADC共同孵育30分钟至数小时；孵育完成后清洗酶标板，采用放射性标记或荧光染料标记的特异性二抗进行检测。为减少ADC结合后可能发生的抗原内吞，基于细胞的结合检测试验需在0~4℃的条件下进行。在缺乏纯化抗原的情况下，基于细胞的结合检测试验具有独特优势，只是操作过程相对繁琐。目前已有多种可用于ADC评价的细胞结合检测方法，如直接细胞结合试验和竞争性细胞结合试验，流式细胞术也可应用于细胞结合检测试验。细胞表面结合检测的常规操作是，将完整细胞与放射性标记或荧光标记的配体共同孵育，随后检测细胞上的结合标记物；为降低与细胞的非特异性结合，该方法需进行充分的洗涤步骤。由于多次洗涤过程中酶标板中的细胞易发生流失，导致细胞表面结合检测试验的重复性较差，因此研究人员开发了一种替代方法，即利用固定的质膜组分测定抗体与细胞表面抗原的结合能力。该方法将表达细胞表面抗原的分离质膜组分固定在96孔板上，再与可识别特定细胞表面蛋白的抗体共同孵育，为克服传统基于细胞的检测方法的局限性提供了新的解决方案。 其他类型的结合检测试验 表面等离子体共振（SPR）结合分析是检测两种不同分子间相互作用的另一类结合检测试验，该方法将抗原固定在芯片上，已应用于Inotuzumab Ozogamon（CMC-544）、Gemtuzumab Ozogamicin（CMA-676）等多种ADCs的检测。其检测原理是，通过测定生物传感器芯片上大分子相互作用引起的折射率变化实现检测。由于SPR可直接检测分子质量（浓度），无需在检测前对相互作用的组分进行放射性或荧光标记，因此能有效避免标记可能导致的分子性质改变，这是该技术的一大优势。但该方法使用的仪器需专门用于处理有毒物质，这在一定程度上限制了其在ADCs分析中的应用。为避免仪器污染，一种便捷的替代方案是采用基于生物层干涉技术的检测平台。该光学检测技术通过分析两束反射光的干涉图谱实现检测：一束光来自生物传感器探头上的固定蛋白层，另一束光来自内部参考层。固定在生物传感器探头表面的抗原可特异性捕获溶液中的ADC，这种结合作用会导致波长偏移。无论采用何种检测形式，进行ADC结合检测时，均需以未修饰抗体作为对照。 6.2.1.2 基于质谱的检测方法 质谱（MS）是一种通过测定分子的质荷比（m/z）来确定肽段、其他化合物等分子质量的分析技术。基于质谱的检测方法已被用于表征DAR组分、测定不同DAR值ADC的相对比例、分析游离药物及代谢物，以及监测ADC的各类分子实体。该技术的核心过程是将分子电离为带电离子或分子碎片，再通过质量分析器对其进行检测。 常用的电离方法包括电喷雾电离（ESI）、大气压化学电离（APCI）、大气压光电离（APPI）、基质辅助激光解吸电离（MALDI）、激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）、解吸电喷雾电离（DESI）和二次离子质谱（SIMS）。在ADC的定量检测中，ESI和MALDI是最常用的两种方法。ESI是在高压条件下，将溶液中的分子电喷雾电离为气相离子；MALDI是一种软电离技术，利用能吸收激光能量的基质使大分子电离为离子碎片。 ADC检测中常用的质谱质量分析器包括四极杆质谱、飞行时间质谱（TOF）和轨道阱质谱。四极杆质谱通过由四根平行金属杆组成的四极杆质量过滤器，根据质荷比分离离子；飞行时间质谱通过测定离子飞行固定距离的时间实现检测，离子的飞行时间与质荷比成反比；轨道阱质谱则将离子捕获在静电场中，通过测定与质荷比成正比的频率信号实现检测。这些分析器也可组合为杂化模式，如四极杆-轨道阱质谱、四极杆-飞行时间质谱。 游离药物载荷或解偶联的药物载荷通常采用常规的LC-MS/MS进行定量检测，检测前需通过蛋白沉淀、液液萃取或固相萃取等方法，将其作为小分子化学药物从样品中提取。但药物载荷可能以多种形式存在：不可裂解连接子的ADC解偶联后，产生的未偶联药物形式与可裂解连接子的ADC不同。 对于含可裂解连接子的ADC，可通过蛋白酶（肽类连接子采用组织蛋白酶B、木瓜蛋白酶）或还原剂（二硫键连接子采用二硫苏糖醇）切割连接子，分离出药物载荷；对于含不可裂解连接子的ADC，通常需通过化学水解、酶解等更复杂的方法分离药物载荷。ADC定量检测前，通常需先对其各组分进行分离，其中配体结合法是分离和富集目标ADC的常用方法。将捕获的ADC组分酶解，产生小分子肽段并释放偶联的药物载荷，随后通常采用LC-MS/MS的方法对产物进行检测和定量。免疫捕获-LC-MS/MS技术是一种杂化检测技术，可从复杂的生物样品中选择性分离、鉴定和定量特定生物分子，该技术的检测过程主要分为三步： 步骤1：从生物基质中免疫捕获目标ADC 该步骤的目的是从生物基质中捕获目标ADC。在药物发现或早期非临床研究中，可采用蛋白A/G或抗人免疫球蛋白G作为免疫捕获试剂（蛋白A是一种相对分子质量为42000的表面蛋白，可与免疫球蛋白的Fc段结合）；在临床研究中，可通过链霉亲和素包被的磁珠固定生物素化抗独特型抗体或靶抗原，实现对目标ADC的捕获。捕获并洗脱的总抗体包括ADC和游离抗体，可进行后续处理；若用于ADC的定量检测，可采用抗药物载荷抗体作为捕获试剂，仅捕获ADC，不捕获游离抗体。 步骤2：采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等蛋白酶进行酶解 经免疫富集的ADC和/或游离抗体可直接采用高分辨精准质量质谱（HRAMS）检测完整的生物分子，因此若使用该质谱技术，本步骤可省略。 若未使用HRAMS，常规质谱方法也可有效测定ADC的浓度，只是其质量准确度和分辨率不如高分辨精准质量质谱。可将捕获的ADC（包括游离抗体）变性/还原、烷基化后，用胰蛋白酶或木瓜蛋白酶酶解，随后测定抗体的特征肽段和药物载荷的质荷比跃迁信号。 步骤3：检测与定量 HRAMS是一种可高精度测定离子质荷比的先进分析技术，能对质量差异极小的复杂化合物进行定性和定量检测，因此在蛋白质组学、代谢组学、药物研发等领域不可或缺。通常药物载荷为相对分子质量300~1000的小分子，而单克隆抗体的相对分子质量约为130000，因此未偶联单克隆抗体与ADC之间，因偶联连接子-药物载荷产生的质量差异通常仅为0.1%~1%。HRAMS可直接检测到ADC与未偶联单克隆抗体之间小于1%的质荷比差异，可采用提取离子流色谱法（XIC）或去卷积质量分析法进行定量：提取离子流色谱法是将色谱图中特定离子（或窄范围离子）的强度随保留时间的变化作图，而去卷积质量分析法则可将复杂质谱图中的重叠峰分离为单个肽段的质谱图。 目前，常规质谱法更常用于检测和定量肽段碎片与释放的药物载荷，通过测定特征肽段和药物载荷的检测信号强度，与已知标准品或校准曲线对比，确定各组分的相对浓度。HRAMS可识别常规串联质谱法无法检测到的新分子种类（ADC的新生物转化产物），但该技术的数据分析过程更为复杂，需要专用的软件和专业的技术人员；相比之下，常规质谱仪器的成本更低，应用也更广泛。 目前，大多数PK研究均包含总抗体、总ADC和偶联药物载荷三类物质的检测。ELISA曾是总抗体定量检测的最常用方法，但近年来，质谱法的应用越来越广泛。 在非临床研究中，可采用蛋白A磁珠、生物素化靶抗原或生物素标记的抗独特型单克隆抗体捕获目标抗体；将富集的ADC用木瓜蛋白酶或胰蛋白酶酶解，释放小分子肽段和带可裂解连接子的药物载荷分子。重链和轻链的特征肽段具有不同的检测用途：重链特征肽段用作总抗体的检测标志物，轻链特征肽段则用作完整抗体的检测标志物（表6.2）。 目前仅有少数研究对完整抗体和总抗体进行了区分，大部分研究仍以总抗体水平为主要检测指标。研究人员开发了一种杂化免疫亲和捕获微流LC-MS/MS方法（μLC-MS/MS），采用可与人免疫球蛋白G-Fc段结合的生物素偶联配体作为捕获试剂；将捕获的抗体和ADC用木瓜蛋白酶酶解后，经固相萃取纯化，分别以重链和轻链的特征肽段为标志物，定量检测总抗体和完整抗体。研究发现，μLC-MS/MS与ELISA测定的总抗体水平具有高度相关性，二者差异小于20%。 对于总ADC的检测，通常以偶联药物载荷为替代标志物，其前提是假设DAR稳定，体内偶联药物载荷的量与总ADC的量直接相关。PYX-201是一种全人源IgG1抗体药物偶联物，由可裂解的马来酰亚胺基己酰-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄醇连接子和4个澳瑞他汀0101（Aur0101，PF-06380101）药物载荷组成，研究人员采用蛋白A磁珠富集该偶联物后，用木瓜蛋白酶酶解释放澳瑞他汀0101并进行检测。另一项关于LCB14-0110的研究中，该偶联物是一种新型的异戊二烯基转移酶介导的定点ADC，由自主研发的β-葡萄糖醛酸连接子、微管蛋白聚合抑制剂MMAF药物载荷和靶向HER2的曲妥珠单抗偶联而成；其检测方法包括亲和捕获和酶解步骤，随后采用正离子模式的LC-MS/MS对释放的偶联药物载荷进行定量检测。 在抗金黄色葡萄球菌的硫代单抗抗体-抗生素偶联物DSTA4637S的非临床研究中，研究人员测定了总抗体、抗体偶联dmDNA31和未偶联dmDNA31三种物质的体内浓度：采用蛋白A包被的磁珠从血清中捕获目标抗体，随后进行酶解；选取人抗体特有的特征肽段作为总抗体浓度检测的替代标志物，通过多反应监测模式的LC-MS/MS进行检测；通过测定释放的药物载荷dmDNA31，确定抗体偶联dmDNA31的含量；此外，采用蛋白沉淀法提取未偶联的dmDNA31，并用LC-MS/MS进行定量检测。 ADC在体内可能发生修饰并失去活性，因此区分活性与非活性ADCs具有重要意义。一项关于含微管聚合抑制剂药物载荷和组织蛋白酶B可裂解连接子的ADC研究中，研究人员同时检测了总抗体、活性ADC、总ADC、抗体偶联药物载荷和未偶联药物载荷的水平。活性ADC是与药理作用最相关的组分，因此研发能够对各组分进行定性和定量检测的生物分析方法至关重要，这有助于深入理解暴露-效应关系，从而优化给药方案，提升治疗效果。 部分研究仅对游离药物载荷进行了检测，这类研究无需捕获ADC，而是采用与小分子化学药物相同的方法处理生物样品。例如，有研究开发了LC–TOF-MS/MS方法，用于评价大鼠体内MMAF ADC的代谢和PK特征，并对其代谢产物进行了鉴定；该研究结果加深了对MMAF药代动力学、分解代谢和代谢过程的理解，为后续ADC的研发提供了参考。 HRAMS可作为常规质谱法的补充，为复杂生物分子的分析提供更高的精度和更丰富的细节。在一项研究中，研究人员采用该技术对Trastuzumab Emtansine和Trastuzumab-SG3584两种ADC进行了检测和定量（表6.2）：首先通过免疫捕获步骤从复杂的生物混合物中选择性捕获并纯化抗体，随后采用HRAMS直接分析总抗体含量和完整的ADC；数据采集完成后，对质谱图进行去卷积处理，将复杂的原始数据转化为可解释的质量图谱，从而准确测定完整蛋白的分子质量，实现对ADC的表征，包括检测抗体上的各类修饰或偶联结构。研究结果显示，该技术与常规质谱法的检测结果具有一致性。 6.2.2 药物抗体比DAR 药物抗体比DAR指单个单克隆抗体偶联的平均药物分子数，是ADC最重要的特性之一。根据药物的性质及与蛋白的偶联方式，可采用多种方法测定药物抗体比。 6.2.2.1 紫外-可见分光光度法 紫外-可见分光光度法（UV/Vis）是利用抗体、药物和ADC的消光系数ε测定DAR和ADC浓度的最简单分析方法。消光系数可通过朗伯-比尔定律（A=ε⋅c⋅l，其中A为特定波长下的吸光度，c为摩尔浓度，l为光程长度）轻松测定。测定ADC在药物特征波长和280 nm处的吸光度，得到两个波长下的吸光度比值（R），随后通过以下公式计算DAR： 其中，εAb,D和εAb,280分别为ADC在药物特征波长和280 nm处的消光系数，R为药物特征波长与280 nm处的吸光度比值，εD,280和εD,D分别为药物在280 nm和其特征波长处的消光系数。 该方法已应用于刺孢霉素类似物、cA10-Val-Cit-MMAE和美登素DM1的DAR表征。通过ADC的吸光度和抗体的消光系数可测定平均DAR，但由于抗体和药物的吸光特性可能存在相似性，基于紫外吸收的计算过程可能较为复杂。 6.2.2.2 基于质谱的检测方法 基于质谱的检测方法已被用于表征DAR组分，以及测定不同DAR值ADC的相对比例，DAR的测定通常采用电喷雾电离质谱法ESI-MS。基质辅助激光解吸电离MALDI是一种用于生物分子图谱分析和监测的软电离技术，MALDI飞行时间质谱TOF-MS也是一种已报道的药物载量测定新方法。 近期一项研究采用该技术测定了曲妥珠单抗及其偶联物的完整分子质量：将样品脱盐后与芥子酸基质溶液混合，在高线性正离子模式下进行分析，测定各偶联物和美坦辛的分子质量并计算摩尔比。 通过测定质谱峰质心的质量偏移，可计算平均药物载量；同时利用峰形图谱，通过数学方法模拟药物的分布特征。红外基质辅助激光解吸电离技术（IR MALDI）已被用于刺孢霉素偶联物的分析评价；紫外基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱与紫外分光光度法联用，已应用于紫杉醇活化酯制备的赖氨酸偶联物平均DAR的分析。 基于质谱的检测方法可单独用于ADC的表征，无需分离、纯化等额外步骤，但通常会与色谱技术联用，例如与RP-HPLC、LC-MS、LC-MS/MS测定DAR，该联用方法适用于赖氨酸偶联的ADC。检测时，首先采用反相液相色谱柱通过RP-HPLC对ADC样品进行脱盐处理，随后对质谱图进行处理和去卷积，转化为一系列零电荷态质量数据，对应ADC中药物分子数量递增的不同形式。游离药物或其代谢物等小分子的定量检测，通常需先从组织或血浆/血清中提取，再采用LC-MS或LC-MS/MS分析；而未偶联药物的检测则可采用配体结合分析和质谱两种分析平台。将cAC10-vc-MMAE在人、小鼠或犬的血浆中孵育后，可采用LC-MS/MS法检测游离MMAE的释放量。高分辨精准质量分析系统（如亲和捕获毛细管液相色谱-质谱）可通过半定量方式测定血浆/血清中ADC的DAR分布，实现药物释放的表征。 近年来，电喷雾电离结合飞行时间（TOF）或三重四极杆质量检测器的LC-MS已被用于分析huN901-DM1、Trastruzumab-MCC-DM1（T-DM1）和C242-DM4等ADC。王莉等人采用SEC结合ESI-TOF-MS，研究了huN901-DM1的药物分布特征。图6.3为采用该方法得到的去糖基化huN901-DM1的解卷积质谱图示例。七个主要峰可分别对应未偶联药物的去糖基化huN901（0D）以及共价偶联1至6个美登素DM1药物的去糖基化huN901（1D-6D），不同药物偶联形式之间的质量差与理论值一致（852 Da）。对于还原后的偶联物，其轻链和重链可通过RP-HPLC实现分离，轻链和重链上连接的连接子数量可直接从解卷积质谱图中获得。轻链质谱图中的三个主要峰对应连接0、1、2个连接子的产物，而重链质谱图中的四个主要峰则对应连接0、1、2、3个连接子的重链（图6.4）。由此可见，抗体的轻链和重链均会被连接子修饰，并与美登素DM1药物发生偶联。 图6.3 去糖基化huN901-DM1的电喷雾电离-飞行时间质谱分析。A：原始电喷雾质谱图，质荷比（m/z）范围为2000~4000；B：解卷积质谱图，七个主要峰分别对应未偶联药物的去糖基化huN901（0D）以及共价偶联1、2、3、4、5、6个美登素DM1药物的去糖基化huN901（1D~6D）。B中的 “D” 代表DM1。经John Wiley父子出版公司许可改编自王等人（2005）的研究 图6.4 去糖基化并还原后的huN901-DM1的反相高效液相色谱-电喷雾电离-飞行时间质谱分析。A：反相高效液相色谱对轻链（L）和重链（H）的分离结果；B：偶联轻链的解卷积质谱图，对应连接0、1、2个连接子的产物（0L~2L）；C：偶联重链的解卷积质谱图，对应连接0、1、2、3个连接子的产物（0L~3L）。经John Wiley父子出版公司许可改编自王等人（2005）的研究 LC-MS联用技术的一大挑战是，ADC样品前处理需要额外的考量。例如，在组织匀浆时，需向匀浆缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，防止抗体和连接子-药物发生降解。此外，用于蛋白沉淀的有机溶剂、固相萃取（SPE）以及液相色谱条件等引发的基质pH值变化，都可能导致DAR改变或药物脱落。另一问题在于，传统用于小分子药物检测的LC-MS联用技术，主要对ADC经分解代谢释放的、预先假定的药物形式进行定量分析。但从理论上讲，释放的药物可能与血浆肽/蛋白结合，或结合有ADC的部分连接子，因此预先假定的释放药物分析物未必是药物释放后的主要形式。ADC在电喷雾电离过程中的酸性条件，可能导致偶联药物的肽链发生解离，这也限制了该技术仅能应用于以半胱氨酸残基为偶联位点制备的ADCs。 配体结合分析-液相色谱-高分辨质谱联用技术（LBA-LC-HRMS）将亲和捕获与完整质量分析相结合，可在完整蛋白或亚基水平上精准表征DAR。该方法通过将质谱图解卷积为一系列“零电荷”质量数，再对质谱峰面积或峰强度进行积分和加权计算，得到平均DAR，同时也能测定不同时间点的DAR分布。例如，Kaur等人利用固定在链霉亲和素包被的顺磁微球上的生物素化HER2，实现了对所有不同DAR形式的ADC的捕获，将捕获的ADC进行去糖基化后，采用正离子飞行时间质谱模式的液相色谱-质谱联用技术进行分析，对原始数据解卷积后得到各药物抗体偶联比对应的峰面积，从而直接实现定量。 6.3 色谱法 色谱分离技术通常是实现精准分析的必要手段，可将复杂生物基质中的各组分分离。RP-HPLC、HIC、IEC和SEC等技术常与质谱联用（LC-MS联用或LC-MS/MS联用）。 6.3.1 RP-HPLC RP-HPLC可实现混合物中各组分的分离、鉴定、定量和纯化，是分离ADC中游离药物最常用的分析技术。分离后的组分通过UV/Vis检测器进行检测，检测波长设定为药物的最大吸收波长，以峰面积对相应的标称浓度作图绘制标准曲线，再根据HPLC峰面积计算游离药物的含量。有研究报道，RP-HPLC与MS联用也可用于检测游离药物形式。 此外，反相色谱还可用于分析以半胱氨酸为偶联位点的ADC中，药物-连接子在抗体重链和轻链上的分布情况，进而计算ADC的平均药物负载分布。该方法先通过还原反应使ADC的重链和轻链完全解离，再利用反相色谱柱分离轻链、重链及其相应的载药形式，结合轻链和重链峰的积分面积占比与偶联药物数量，计算加权平均DAR。例如，可通过RP-HPLC确定MMAE在抗CD30单克隆抗体重链和轻链上的偶联位点。需要重点说明的是，将含蛋白的ADC样品直接进样至反相高效液相色谱柱，可能因蛋白与固定相结合不可逆而造成色谱柱劣化。因此，在RP-HPLC分析前，需采用保护柱并通过多种样品前处理方法，将样品中的游离药物与蛋白-药物偶联物分离。 6.3.2 HIC HIC是另一项高效的分析技术，可分离不同药物负载量的ADC组分，测定以半胱氨酸为偶联位点的ADC的DAR及药物负载分布。该技术采用离子强度递减的梯度洗脱方式进行分离，通过监测洗脱组分的紫外吸光度实现检测。不同载药形式可根据其疏水性差异实现分离，且疏水性随偶联药物数量的增加而增强。例如，一种ADC最多可偶联8个药物分子，未偶联药物的形式疏水性最弱，偶联8个药物的形式疏水性最强，因此未偶联形式最先被洗脱，偶联8个药物的形式最后被洗脱。洗脱组分经紫外检测器检测后，其峰面积代表不同药物负载量ADC的相对占比，结合峰面积占比与偶联药物数量即可计算加权平均DAR。如图6.5所示，Hamblett等人采用HIC-HPLC将cAC10-val-cit-MMAE分离为每个抗体偶联2、4、8个药物的形式，并得到各单峰对应的紫外光谱。可识别出五个主要色谱峰，原因是MMAE的偶联会使样品在约248 nm处（MMAE的最大吸收波长）的吸光度相对280 nm处（cAC10的最大吸收波长）显著增强。HIC的分离效果可实现色谱纯组分的分离和纯化，便于后续通过ELISA和细胞水平实验进行分析。该技术除可分析药物负载分布外，还能根据峰面积的加权平均值确定ADC的平均药物负载量。HIC的一大优势是能保持ADC的结构完整性，但其初始流动相通常含有高浓度盐，而高浓度盐是实现蛋白结合的必要条件，后续需通过盐浓度递减的梯度洗脱实现目标物的洗脱，这也导致该技术无法直接与质谱联用。 图6.5 cAC10-vc-MMAE的HIC分析结果，共出现五个主要色谱峰，分别对应每个抗体偶联0、2、4、6、8个药物的cAC10单克隆抗体。插图：初始单克隆抗体与各疏水作用色谱峰的紫外光谱叠加图，可见随着每个单克隆抗体偶联的药物-连接子数量增加，样品在248 nm处的吸光度相对280 nm处逐渐增强。另见Hamblett等人（2004）、Sanderson等人（2005）的研究 6.3.3 其他类型色谱法 IEC等基于电荷差异的色谱法可用于分析ADC的分布，而SEC等基于分子尺寸的色谱法不仅可分析药物分布，还能对ADC进行表征，检测其在液体制剂储存过程中的蛋白分离、聚集和降解情况。 6.4 方法验证的一般考量 ADC是由大分子（抗体）和多个小分子药物偶联形成的复杂分子，因此需对适用的分析方法进行验证，确保其能对两种分子进行精准、准确的检测。大分子具有明确的三级结构，且通常亲水性更强；而小分子无三级结构，且通常疏水性更强。由于小分子和大分子的理化性质存在显著差异，实际检测中通常结合多种分析方法，如采用LBA检测大分子，采用LC-MS联用技术检测小分子，以实现对ADC的定量。目前，尚无针对ADC生物分析方法的官方监管指南和行业最佳标准，但现有广泛认可的大分子和小分子分析方法验证指南可作为重要参考。例如，美国FDA发布的生物分析方法验证指南（FDA，2018）阐述了方法验证的基本要素，其中关键验证项目见表6.3。可在该指南基础上，补充ADC分析特有的验证要求。 表6.3 配体结合分析和色谱分析的方法验证参数 采用LC-MS联用技术检测游离细胞毒性药物浓度时，可沿用现有色谱分析方法的验证指南。如前所述，ELISA主要用于检测总抗体分析物，包括偶联、部分解偶联和完全解偶联的抗体。因此，在方法验证过程中需开展额外实验，验证该方法能以可接受的准确度和精密度，对已偶联和完全解偶联的抗体进行定量。ADC分析的另一特有考量点为，需评估游离药物在ADC存在下的稳定性，因为在储存条件下，ADC可能进一步释放药物，导致游离药物浓度升高。小分子药物需进行化学稳定性评估，而大分子药物的稳定性评估更为复杂，需同时分析其理化性质和生物活性完整性。 将该方法应用于实际样品分析（如PK研究样品）时需注意，ELISA等配体结合分析的校准曲线通常采用具有固定DAR分布的产品参考标准品制备，此类标准品仅与PK研究初始时间点的样品性质相近。此外，多数配体结合分析的校准曲线在标称浓度范围内本身呈非线性，需采用非线性回归法实现良好拟合。因此，必须验证校准曲线适用于定量PK评价中动态变化的ADC混合物。 美国FDA现行的生物分析方法验证指南中，还增设了内源性化合物分析的相关章节。小分子药物分析通常在实验前进行提取处理，以降低不同个体基质差异带来的影响。与之相反，大分子药物分析方法通常无需前处理，可直接检测复杂基质中的分析物，但基质中可能存在内源性蛋白，因此需特别关注基质效应的影响。 6.5 挑战与未来展望 与传统的大分子或小分子生物分析相比，ADC的生物分析更为复杂。ADC的多组分特性--源于偶联过程的异质性和体内的生物转化，为开发可靠、准确的生物分析方法带来了巨大挑战。在体内循环过程中，由于药物解偶联和抗体降解，DAR的组成会持续变化，因此用于方法定量的ADC参考标准品，与体内样品中的ADC混合物可能存在差异。需格外关注分析试剂的选择，确保其能检测体内形成的所有DAR形式，同时不损失方法的选择性。鉴于现有ADC表征方法存在固有局限性，为ADC制定全面的生物分析策略具有重要意义。 分析用ADCs形式的选择应与各研究的目标相匹配，生物分析策略也需根据这些形式的特定分子性质进行调整。对于特定ADC的生物分析，可能需要基于现有分析平台制定专属的分析方法。随着双特异性抗体、双载药、免疫刺激性载药等技术的发展，亟需开发新的分析策略，以应对这些创新技术带来的挑战。 6.6 结论 本文总结了目前用于ADC药代动力学研究和DAR测定的常用分析方法。要全面表征ADC的理化性质和药代动力学特征，需结合多种分析方法。ADC的复杂性为生物分析方法的开发带来了诸多挑战，因此亟需开发新的生物分析技术，保障检测方法的准确性。