Somatropin(Genentech, Inc.)

在药物研发的浩瀚宇宙中，存在着两大 “阵营”：一方是我们熟悉的小分子药物，如阿司匹林、布洛芬等，凭借小巧的分子结构在体内快速发挥作用；另一方则是近年来备受瞩目的大分子药物，它们以复杂的蛋白质结构为核心，如同精准部署的 “生物军团”，在治疗疑难病症上展现出独特优势。今天，我们就来深入探索大分子药物的世界，看看这些 “大家伙” 是如何从实验室走向临床，为人类健康保驾护航的。一、大分子药物：不一样的 “治病能手” 提起药物，很多人首先想到的是药片、胶囊等常见形态，这些大多是小分子药物。而大分子药物则截然不同，它们主要以蛋白质为基础，分子重量通常在数千道尔顿以上，结构也更为复杂。与小分子药物通过化学合成生产不同，大分子药物的 “制造工厂” 是活的生物系统，比如细菌、酵母、哺乳动物细胞等，依靠重组 DNA 技术来生产出与人体自身蛋白质相似或能模拟其活性的药物分子。 大分子药物之所以越来越受重视，关键在于其独特的优势。它们更贴近人体自身的生物分子，能精准作用于疾病靶点，减少对正常细胞的影响，因此在治疗癌症、自身免疫性疾病、遗传性疾病等方面效果显著。而且，很多大分子药物是针对体内缺失或功能异常的蛋白质进行 “补充” 或 “修复”，从疾病根源入手，治疗更具根本性。 目前，大分子药物主要涵盖疫苗、抗体、细胞因子、激素、基因治疗和干细胞治疗等领域，每一类都在守护健康的战场上扮演着重要角色。二、疫苗：人体的 “防御训练营” 疫苗绝对是大分子药物家族中 “知名度” 最高的成员之一。从出生后接种的卡介苗、乙肝疫苗，到预防流感、新冠的疫苗，它们如同为人体免疫系统打造的 “防御训练营”，提前让免疫系统认识病原体，以便在真正遭遇病原体入侵时能迅速发起反击。（一）传统疫苗：经典的 “防御教程” 传统疫苗主要有减毒活疫苗、灭活疫苗和类毒素疫苗三种。减毒活疫苗是通过化学处理、温度适应等方式降低病原体的毒性，使其失去致病性但仍保留免疫原性。比如预防脊髓灰质炎的萨宾疫苗、预防麻疹的麻疹疫苗等，只需接种一次就能激发持久的免疫保护，但存在一定的回复突变风险，且保质期较短。 灭活疫苗则是用甲醛、苯酚等化学物质或辐射将病原体杀死，使其无法复制和致病，但仍能刺激免疫系统产生抗体。像流感疫苗、甲肝疫苗等都属于这类疫苗，安全性较高，保质期相对较长，但通常需要多次接种才能达到理想的免疫效果。 类毒素疫苗是将细菌分泌的毒素经过处理，使其失去毒性但保留免疫原性，比如预防白喉、破伤风的疫苗。这类疫苗能有效预防由细菌毒素引起的疾病，为人体筑起一道抵御毒素侵害的 “屏障”。（二）新型疫苗：精准的 “防御升级” 随着生物技术的发展，疫苗研发也迎来了 “升级换代”， subunit 疫苗、载体疫苗、DNA 疫苗和肽疫苗等新型疫苗不断涌现。 subunit 疫苗不再使用完整的病原体，而是提取病原体表面能激发免疫反应的关键蛋白片段（抗原表位）来制作疫苗。科学家通过基因测序找到病原体的抗原基因，利用基因工程技术在体外表达出这些抗原蛋白，再经过纯化制成疫苗。这种疫苗安全性高，能精准激发针对特定病原体的免疫反应，比如预防宫颈癌的 HPV 疫苗就是典型的 subunit 疫苗。 载体疫苗则是将抗原基因插入到无害的病毒或细菌载体中，通过载体进入人体细胞后表达出抗原蛋白，从而激发免疫反应。常用的载体有腺病毒、痘病毒等，这种疫苗能模拟病原体自然感染的过程，激发强烈且持久的免疫应答，在新冠疫苗研发中就有广泛应用。 DNA 疫苗是将编码抗原蛋白的 DNA 直接注入人体，让人体自身细胞表达出抗原蛋白，进而激发免疫反应。它制作简便、稳定性好，且能同时激发体液免疫和细胞免疫，不过目前仍处于研究阶段，部分疫苗已进入临床试验。 肽疫苗是通过化学合成模拟病原体抗原表位的短肽链来制作疫苗，结构简单、纯度高，可根据需要设计出针对多种病原体的多表位疫苗，在肿瘤疫苗等领域具有广阔前景。（三）疫苗的 “得力助手”：佐剂 为了增强疫苗的免疫效果，科学家还会在疫苗中加入佐剂。佐剂就像疫苗的 “得力助手”，能通过多种机制增强免疫反应，比如形成抗原储存库缓慢释放抗原、激活免疫细胞等。目前常用的佐剂有铝盐佐剂（如氢氧化铝、磷酸铝），在多种疫苗中都有应用。此外，还有一些新型佐剂如 CpG 寡核苷酸佐剂、脂质体佐剂等，能更精准地调节免疫反应，进一步提升疫苗的效果。三、抗体：人体的 “精准导弹” 抗体是人体免疫系统产生的一种蛋白质，能特异性识别并结合病原体或异常细胞，就像 “精准导弹” 一样精准打击 “敌人”。在大分子药物领域，抗体药物凭借其高度的特异性和有效性，成为治疗癌症、自身免疫性疾病等的 “主力军”。（一）抗体的 “结构密码” 抗体的结构就像一个 “Y” 字形，由两条重链和两条轻链组成，通过二硫键连接在一起。重链和轻链上都有可变区和恒定区，可变区是识别和结合抗原的关键部位，不同抗体的可变区结构不同，决定了其识别抗原的特异性；恒定区则决定了抗体的类型和功能，比如激活补体系统、介导细胞毒性等。 当抗体与抗原结合后，会通过多种方式发挥作用，比如标记病原体或异常细胞，让免疫细胞（如巨噬细胞、自然杀伤细胞）识别并清除它们；或者直接中和病原体的毒性，阻止其感染正常细胞。（二）抗体药物的 “进化之路” 早期的抗体药物主要是从免疫动物的血清中提取的多克隆抗体，这种抗体是多种抗体的混合物，特异性较低，且可能引起人体的免疫反应。后来，单克隆抗体技术的出现改变了这一局面。科学家将能产生特定抗体的 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，这种细胞既能无限增殖，又能分泌特异性的单克隆抗体。单克隆抗体特异性高、纯度高，在疾病诊断和治疗中发挥了重要作用，比如治疗乳腺癌的曲妥珠单抗（赫赛汀）就是一种单克隆抗体。 不过，早期的单克隆抗体大多是鼠源抗体，进入人体后容易被人体免疫系统识别为 “外来物质”，引发免疫反应（如产生人抗鼠抗体），影响治疗效果且可能带来副作用。为了解决这一问题，科学家对抗体进行了 “人源化改造”，先后开发出嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。 嵌合抗体是将鼠源抗体的可变区与人源抗体的恒定区拼接而成，降低了鼠源成分的比例，减少了免疫反应的发生。人源化抗体则进一步减少了鼠源成分，只保留鼠源抗体可变区中识别抗原的关键片段，其余部分均为人源序列，大大提高了安全性和耐受性。全人源抗体则是通过基因工程技术，让人体细胞或转基因动物产生完全由人源基因编码的抗体，几乎不会引起人体的免疫反应，是目前抗体药物研发的主流方向，如治疗类风湿关节炎的阿达木单抗（修美乐）就是全人源抗体。（三）抗体药物的 “升级形态”：抗体偶联药物 为了进一步提升抗体药物的治疗效果，尤其是在肿瘤治疗领域，科学家开发出了抗体偶联药物（ADC）。ADC 由抗体、连接子和细胞毒性药物三部分组成，抗体负责将细胞毒性药物精准递送到肿瘤细胞，连接子确保药物在到达肿瘤细胞前不被释放，细胞毒性药物则发挥杀伤肿瘤细胞的作用。这种 “精准投递 + 强效杀伤” 的模式，大大提高了肿瘤治疗的有效性，同时减少了对正常细胞的损伤，目前已有多种 ADC 药物获批用于治疗乳腺癌、淋巴瘤等恶性肿瘤。四、细胞因子：免疫调节的 “信号兵” 细胞因子是由免疫细胞和其他细胞分泌的一类小分子蛋白质，它们在免疫系统中扮演着 “信号兵” 的角色，通过传递信号调节免疫细胞的增殖、分化和功能，参与免疫应答和炎症反应等过程。在大分子药物中，细胞因子药物主要用于调节免疫系统功能，治疗免疫缺陷、癌症等疾病。 细胞因子主要分为淋巴因子和单核因子两大类。淋巴因子由淋巴细胞分泌，如白细胞介素（IL）、干扰素（IFN）等；单核因子由单核细胞分泌，如肿瘤坏死因子（TNF）等。 干扰素（IFN）是一类重要的细胞因子，根据其来源和结构可分为 I 型干扰素（如 IFN-α、IFN-β）和 II 型干扰素（如 IFN-γ）。I 型干扰素具有广谱抗病毒作用，能诱导细胞产生抗病毒蛋白，抑制病毒复制，同时还能调节免疫细胞功能，增强免疫应答，在治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎、某些血液系统疾病等方面有广泛应用。II 型干扰素主要由 T 细胞和自然杀伤细胞分泌，具有更强的免疫调节作用，能激活巨噬细胞、增强 T 细胞的杀伤活性，在治疗肿瘤、自身免疫性疾病等方面有一定的应用前景。 白细胞介素（IL）家族成员众多，不同的白细胞介素具有不同的功能。比如 IL-2 能促进 T 细胞、B 细胞的增殖和分化，增强免疫细胞的杀伤活性，在治疗黑色素瘤、肾癌等肿瘤方面有应用；IL-10 具有免疫抑制作用，能抑制炎症反应，在治疗自身免疫性疾病如类风湿关节炎等方面处于研究阶段。 肿瘤坏死因子（TNF）主要包括 TNF-α 和 TNF-β，其中 TNF-α 具有多种生物学功能，既能参与炎症反应、杀伤肿瘤细胞，也能在某些情况下促进肿瘤生长和转移。在药物研发中，科学家开发出了抗 TNF-α 抗体（如英夫利昔单抗、阿达木单抗），通过特异性结合 TNF-α，抑制其活性，用于治疗类风湿关节炎、强直性脊柱炎等自身免疫性疾病，取得了良好的治疗效果。五、激素：人体的 “内分泌调节器” 激素是由内分泌腺分泌的一类化学物质，通过血液循环到达全身各个组织器官，调节人体的生长、发育、代谢等多种生理过程，就像人体的 “内分泌调节器”。当人体自身激素分泌异常时，就需要通过激素药物进行补充或调节。 在大分子药物中，常见的激素药物有胰岛素、生长激素等。 胰岛素是由胰腺 β 细胞分泌的一种多肽激素，主要功能是调节血糖水平。当人体胰岛素分泌不足或胰岛素作用缺陷时，就会导致糖尿病。1921 年，科学家首次从动物胰腺中提取出胰岛素，用于治疗糖尿病。随着基因工程技术的发展，科学家通过重组 DNA 技术在大肠杆菌、酵母等微生物中表达出人类胰岛素，解决了动物胰岛素来源有限、可能引起免疫反应等问题。目前，重组人胰岛素已广泛应用于糖尿病治疗，根据作用时间的不同，可分为短效胰岛素、中效胰岛素、长效胰岛素等，能满足不同患者的治疗需求。 生长激素是由垂体前叶分泌的一种蛋白质激素，主要作用是促进人体生长发育，调节蛋白质、脂肪、糖的代谢。当儿童时期生长激素分泌不足时，会导致生长迟缓（侏儒症）；而分泌过多则会导致巨人症。通过基因工程技术生产的重组人生长激素，可用于治疗生长激素缺乏症，帮助患者恢复正常的生长发育。此外，生长激素在抗衰老、改善身体成分等方面也有一定的研究和应用，但需在医生指导下合理使用。六、基因治疗：修复基因的 “生命工程” 基因治疗是一项具有革命性意义的医疗技术，它通过将正常基因导入患者体内，替换或修复有缺陷的基因，从而治疗由基因缺陷引起的疾病。这就像对人体的 “基因密码” 进行修复和优化，从根本上解决疾病问题。 基因治疗的核心在于如何将正常基因安全、有效地递送到目标细胞中，这就需要借助载体。常用的载体主要有病毒载体和非病毒载体。病毒载体是将病毒的致病基因去除，然后将治疗基因插入到病毒基因组中，利用病毒的感染能力将治疗基因导入细胞。常用的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等，其中腺相关病毒载体因其安全性高、能长期稳定表达治疗基因等优点，在基因治疗中应用广泛，如治疗脊髓性肌萎缩症的 Zolgensma 就是采用腺相关病毒载体。 非病毒载体则是通过物理、化学方法将治疗基因导入细胞，如脂质体、纳米颗粒、电穿孔等。非病毒载体具有安全性高、可大规模生产等优点，但转染效率相对较低，目前仍在不断改进和优化中。 基因治疗在遗传性疾病、癌症、传染病等领域都有广阔的应用前景。比如在遗传性疾病治疗方面，通过修复患者体内缺陷的基因，可治疗镰状细胞贫血、囊性纤维化等疾病；在癌症治疗方面，可通过导入抗癌基因、免疫调节基因等，增强人体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤能力，或抑制肿瘤细胞的生长和扩散。不过，基因治疗目前仍处于发展阶段，还面临着技术、伦理、安全等诸多挑战，需要科学家不断探索和突破。七、干细胞治疗：修复组织的 “种子细胞” 干细胞是一类具有自我更新和分化能力的细胞，就像 “种子细胞” 一样，能分化成多种不同类型的细胞，修复受损的组织和器官。在大分子药物治疗领域，干细胞治疗为多种疑难疾病的治疗带来了新的希望。 根据干细胞的分化潜能，可分为全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。全能干细胞具有分化成人体所有细胞类型的能力，如受精卵；多能干细胞能分化成多种细胞类型，但不能分化成完整的个体，如胚胎干细胞、诱导多能干细胞（iPS 细胞）；专能干细胞只能分化成某一特定类型的细胞，如神经干细胞、造血干细胞等。 胚胎干细胞来源于早期胚胎，具有强大的分化能力，能分化成各种组织细胞，在组织修复、疾病模型构建等方面具有重要意义。不过，胚胎干细胞的获取涉及伦理问题，目前其研究和应用受到一定限制。 诱导多能干细胞（iPS 细胞）是通过将特定的转录因子导入体细胞（如皮肤成纤维细胞），使其重编程为具有多向分化潜能的干细胞。iPS 细胞的出现解决了胚胎干细胞的伦理问题，且具有来源广泛、可个性化治疗等优点，在疾病治疗、药物筛选等领域展现出巨大潜力。 造血干细胞是一种专能干细胞，主要存在于骨髓、外周血和脐带血中，能分化成红细胞、白细胞、血小板等各种血细胞。造血干细胞移植已广泛应用于治疗白血病、淋巴瘤、再生障碍性贫血等血液系统疾病，通过将健康的造血干细胞移植到患者体内，重建患者的造血功能和免疫功能。 干细胞治疗虽然前景广阔，但目前仍面临着诸多挑战，如干细胞的定向分化、移植后的免疫排斥、长期安全性等问题。不过，随着技术的不断进步，相信在不久的将来，干细胞治疗将为更多患者带来福音。 从疫苗到干细胞治疗，大分子药物家族不断发展壮大，为人类健康提供了更多强有力的 “武器”。虽然目前部分大分子药物仍处于研究阶段，面临着技术、成本、伦理等方面的挑战，但随着生物技术的持续突破，相信这些 “生物军团” 将在守护人类健康的道路上发挥越来越重要的作用，为更多疑难疾病患者带来希望。 参考书籍：《DRUGS  FROM DISCOVERY TO APPROVAL：CHAPTER 4 DRUG DISCOVERY:  LARGE MOLECULE DRUGS  》 附：Cell Culture书籍知识汇总 细胞培养基础知识手册 药品制剂生产工艺技术转移 生物制品的质量控制与监管要求 制药与生物技术行业的 GMP 审计 生物制药生产的进展、趋势与挑战 细胞培养生物工艺工程 蛋白质层析：方法与实验方案 生物制药研发中蛋白质的生物物理表征 药物研发与上市全流程 大家好，本公众号设有专门的CMC学习交流群，不定期在群里进行CMC知识直播分享，欢迎感兴趣的朋友扫码入群学习。

重组DNA (rDNA) 技术通过实现安全、清洁、有效的rDNA表达产品的大规模生产，彻底改变了人类医疗保健。目前，各种rDNA产品正在被开发用于人类，包括治疗性激素、治疗性酶、溶栓剂、凝血产品、白介素、抗凝剂、干扰素和造血生长因子。本文将讨论rDNA产品的几个方面，例如表达系统、生产、纯化、分析和药物应用，以及各种产品的监管方面和市场潜力。 简介 1971年至1973年间，一项新技术应运而生，并引领了后来的重大科学转折点。这项技术就是基因工程，也称为重组DNA（rDNA）技术，至今仍是许多生物技术程序的基础。斯坦福大学的保罗·伯格（Paul Berg）于1972年首次合成了rDNA，他获得了1980年诺贝尔化学奖。1973年，由加州大学旧金山分校的赫伯特·博耶（Herbert Boyer）指导的团队将重组质粒引入大肠杆菌细胞，并随后建立了基因工程技术。 有三件事对人类生活有重大影响：食物匮乏、健康挑战和环境问题。除了清洁安全的环境外，人类的基本需求还包括食物和健康。对其中一个或多个因素的管理不当每年导致全球大量人员死亡。根据网站http://GlobalIssues.org/ 的数据，癌症、糖尿病、艾滋病毒、结核病、疟疾等非传染性疾病和传染性疾病每年导致全球近 3600 万人死亡。在过去的几十年里，基因治疗策略已经成为治疗和控制人类疾病的重要工具。根据目前的估计，一个基因突变就可能导致 10,000 多种人类疾病。 rDNA 技术的较新进展，即成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)，在治疗多种健康疾病方面发挥了关键作用。尽管 CRISPR 技术有望成为一种安全有效的治疗策略，但其作为治疗方法的实施仍处于早期阶段，仍存在许多障碍和未解决的问题。在用于治疗遗传疾病之前，应该对这项技术进行更彻底的研究和测试；否则，不受限制地使用这种方法可能会对子孙后代产生有害影响。这些健康问题通过开发新型药物和疫苗来克服，治疗策略（诊断试剂盒、监测设备和新的治疗方法）也通过使用现代基因工程方法和 rDNA 技术得到改进。 rDNA技术是一种人工DNA开发方法，该方法涉及将来自两个不同来源的DNA分子组合，并将其引入宿主生物体，以生成供人类使用的产品。多种微生物，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、汉逊酵母和黑曲霉，已被用作宿主并用于生产治疗性rDNA蛋白。 图6.1. 重组DNA技术的步骤 由于冠状病毒疾病（COVID 19）的突然出现，世界对此措手不及，生物技术迎来了开发药物和疫苗以拯救人类生命的重大机遇。例如，出现了基于蛋白质、DNA 和 mRNA 的疫苗（辉瑞-BioNTech、牛津-阿斯利康、国药集团 BIBP、Moderna、CoronaVac、Covaxin、Novavax、Convidecia 和赛诺菲-葛兰素史克）。rDNA 技术助力了COVID 疫苗的研发，Katalin Karikó 和 Drew Weissman 也因同样的方法获得了 2023 年诺贝尔奖，他们发现了核苷碱基修饰，从而开发出了有效的 COVID-19 mRNA 疫苗。随着rDNA技术的不断发展及其在医疗保健行业的应用，如今已有多种治疗性rDNA产品可供人类使用。本文概述了特定rDNA产品的医疗保健用途，这些产品（例如治疗性激素、治疗性酶、溶栓剂、凝血产品、白细胞介素、抗凝剂、干扰素和造血生长因子）对人类医疗保健的重要性日益增强。 治疗性r-DNA产品 具有治疗意义的激素 生长激素或人类生长激素 (hGh) 是一种非糖基化的 22 kDa 蛋白质，含有191 个氨基酸残基和 2 个二硫键。主腺体（也称为脑垂体）产生生长激素。这种生长激素具有多种功能，包括维持正常的身体组成和转化。以前，从尸体脑垂体中提取的 hGh 曾用于治疗目的，但由于克雅氏病等安全问题而停止使用。基因泰克团队于1981 年发现的重组 hGh 解决了这个问题，并于 1985 年获得批准。该策略现已用于各种医疗应用。哺乳动物、酵母和细菌细胞均已被用作表达宿主来生产重组 hGh。因为非糖基化 hGh 被证明是一种生物效应物，大肠杆菌因其诸多优势而被广泛用于生产 hGh，包括易于细菌改造、生产成本低、细胞生长快以及能够培养高密度细胞。所有这些因素使其成为一个有价值的系统，尤其是从经济角度来看。hGh 基因已被克隆并主要在大肠杆菌的细胞质中以包涵体的形式表达。一般来说，在克隆过程中，由垂体mRNA 产生的互补 DNA (cDNA) 与化学合成的 DNA 一起克隆，以产生细菌形式的hGh。正在设计一种化学合成的 DNA 片段，该片段编码 hGh 的前24 个氨基酸，保留了第 23 和 24 个氨基酸残基的HaeIII 限制位点，与 hGh cDNA 中的天然序列相似。这种设计有利于将来与完整的 hGh cDNA 进行组装。由 HaeIII 产生的 551 个碱基对(bp) 长的 hGh 特异性 cDNA 包含hGh 的第 24 至 191 个氨基酸的编码序列。ATG起始密码子和 hGh 的第 1 至23 个残基的编码序列包含在化学合成的 DNA“接头”片段中，该片段可独立于该 cDNA 片段克隆。这些DNA 片段的组合将创建一个合成的天然杂交基因。当该基因被引入质粒中适当的细菌启动子和核糖体结合位点的下游时，它可以调节 fMet-hGh 的合成。由于大多数细菌蛋白缺乏 N 端蛋氨酸残基，因此fMet 应该被有效消除，从而直接产生 hGh。这一工艺为rhGh的工业化生产奠定了基础。本质上，原始rhGh的作用机制与脑垂体产生的生长激素（主要形式，22 kDa）相同。 必须记住的是，大规模 rhGh 生产不仅需要合成细胞的培养（发酵），还需要后续的下游工艺步骤，旨在消除所有非激素成分。rhGh产品有两种纯化方法，包括通过 SDS-PAGE 进行结构分析、色谱法（例如 HI-HPLC）、激光密度测定法和蛋白质测序。此外，免疫学测定、放射受体测定和生物测定可作为验证产品与垂体衍生的 22 kD hGh 的化学和生物等效性的工具。制药行业对 rhGh 药物的生产和审批有严格的规定，例如有效性和安全性证明。药物审批分为两个步骤：临床前测试（在实验室和动物中）和临床试验（在人体中）。 1985 年，美国食品药品监督管理局 (FDA) 批准使用rhGh 治疗生长激素缺乏症 (GHD)（例如，肌肉力量下降、身体成分改变、能量消耗低和生长减慢，甚至肥胖）、特发性矮小症、特纳综合征、普拉德-威利综合征、慢性肾功能不全和人类免疫缺陷病毒 (HIV)、侏儒症、骨折、皮肤烧伤、出血性溃疡和艾滋病。 糖尿病已成为当今社会最常见的代谢紊乱之一，且发病率持续大幅上升。世界卫生组织 (WHO) 估计，全球糖尿病患者人数达 1.71 亿，预计到2030 年将翻一番。解决糖尿病治疗中尚未解决的问题对于维护人类健康至关重要。自 20 世纪 20 年代Banting 和 Best 首次发现胰岛素以来，其在糖尿病治疗中的应用一直是药物科学最伟大的成就之一。 胰岛素是由 51 个氨基酸组成的胰腺激素的一种，它可以控制体内的葡萄糖水平，因为糖尿病可能由低胰岛素水平引发。1978年，大肠杆菌被用作生产重组人胰岛素的宿主，首次成功生产重组胰岛素。在细菌系统中，胰岛素以前体形式产生并储存在包涵体中，然后溶解并重新折叠为活性胰岛素。前体胰岛素也称为胰岛素原，由三条多肽链组成：A、B 和C。链 A 和 B 通过C 链连接在一起。胰岛素原分解成其活性形式胰岛素。这是通过分离两条链（A 有 21 个氨基酸，B有 30 个氨基酸）并用二硫键连接它们来实现的。在此过程中，在成熟的胰岛素释放之前，一条额外的链（C链）被去除。大肠杆菌或酿酒酵母通常在重组人胰岛素的商业化生产中起着至关重要的作用。A 链和 B 链的DNA 序列是化学生成的，并分别放入两个 pBR322 质粒中，与 β-半乳糖苷酶基因放在一起。将这些质粒分别插入两个宿主系统，例如大肠杆菌，在那里它们以 β-半乳糖苷酶-A 和β-半乳糖苷酶-B 的融合链形式表达和分泌。然后，A 和B 胰岛素多肽链通过化学方法从 β-半乳糖苷酶多肽中分离出来，并与通过连二亚硫酸钠和亚硫酸钠通过二硫键连接的纯多肽链结合，从而产生功能性重组胰岛素，如图6.2所示。使用 RP-HPLC 去除剩余的杂质或试剂。Zielinski等人报告称，他们开发了 20 种独特的大肠杆菌菌株，并创建了创新的 pIBAINS 表达载体，从而提高了每升培养基中重组胰岛素的产量。然后，制药行业可以包装和商业化纯化的活性人重组胰岛素。重组胰岛素具有多种药用应用，并获得了 FDA 的批准。重组胰岛素产品已被发现可有效治疗糖尿病，其中，门冬胰岛素比常规人胰岛素、甘精胰岛素、长效重组胰岛素和赖脯胰岛素吸收更快，其主要实际优势是起效迅速。 图6.2. 链式法微生物表达重组人胰岛素 治疗酶 酶对于人体内进行的多种细胞呼吸作用都至关重要，许多疾病都是由于酶缺乏或酶活性不足引起的。这些类型的疾病和紊乱可用治疗性酶（生物催化剂）来治疗。图6.3显示了治疗性酶在疾病治疗中的各种应用。治疗性酶通过两种方法获取：第一，从天然来源获取；第二，使用 rDNA 技术。在过去的一个世纪中，几种治疗性酶已在制药行业中得到重要用途，包括L-天冬酰胺酶、链激酶、胶原酶、核糖核酸酶、尿酸酶、葡萄糖苷酶等。在这里，我们将讨论这四种主要酶中的 L-天冬酰胺酶。 图6.3. 治疗性酶及其在治疗各种疾病中的健康应用 L-天冬酰胺酶，又称 L-天冬酰胺酶酰胺水解酶，用于化疗（治疗癌症）已得到广泛认可。这种酶具有天冬酰胺酶和谷氨酰胺酶的功能，可催化 L-天冬酰胺和 L-谷氨酰胺的水解。它专门从L-天冬酰胺侧链中去除氨基，将其转化为 L-天冬氨酸并释放氨。氨基酸和天冬酰胺的损失会导致肿瘤细胞营养降低，最终导致死亡。大多数L-天冬酰胺酶来自天然存在的微生物，但有些也是在细胞内设计和产生的，除了少数分泌到细胞外。这种酶由多种细菌产生，包括大肠杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌和普通假单胞菌。基于 Tandon 等人的早期研究结果，研究已经鉴定出几种可大规模生产的细菌 L-天冬酰胺酶，它们已获得 FDA 批准用于治疗肿瘤相关疾病。此外，来自酿酒酵母的 L-天冬酰胺酶也已被证实可有效治疗急性淋巴细胞白血病。科学家利用酿酒酵母分离出编码天冬酰胺酶 II 的 ASP3 基因。然后，将该基因整合到表达载体pET28a 中，并与 6x 组氨酸标签融合以便于纯化。最后，将该构建体引入大肠杆菌BL21 (DE3) 细胞以表达重组天冬酰胺酶 II 蛋白。从微生物菌株中产生的酶的纯化程序涉及层析技术，例如离子交换和尺寸排阻以及使用硫酸铵的沉淀法。L-天冬酰胺酶以胞内可溶性分子形式高水平表达（225.6 IU/g），然后用镍亲和层析技术从上清液中分离出来。重组天冬酰胺酶用于治疗多种疾病，包括慢性淋巴细胞白血病、霍奇金病、急性髓性白血病、危重淋巴细胞白血病和髓性白血病。此外，它还被证实可以治疗由肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌和化脓性链球菌等有害微生物引起的感染性疾病。在治疗自身免疫性疾病和炎症等疾病时，L-天冬酰胺酶因其免疫抑制和抗炎作用而成为一种常见选择。 血栓溶解剂 血栓溶解疗法在治疗各种循环系统疾病（例如心血管疾病、肺栓塞、深静脉疾病、血栓形成和心肌梗死）中至关重要。在全球范围内，循环系统疾病正逐渐成为现代人死亡的主要原因。血栓是由血液成分凝结而成，在血管内形成。这些阻塞物会阻碍氧气输送到周围组织，导致组织降解和坏死。为了最大限度地减少组织损伤并提高存活率，成功的血栓治疗优先考虑快速分解血栓。根据 Adivitiya 和 Khasa 的研究，血栓溶解疗法主要有四种治疗方法：第一代纤溶酶原激活剂、第二代血栓溶解剂、第三代纤溶酶原激活剂和其他纤溶酶原激活剂。第一代纤溶酶原激活剂包括链激酶和尿激酶型纤溶酶原激活剂（简称尿激酶）。它们不仅可以激活血液中的纤溶酶原，还可以分解纤维蛋白原和其他凝血因子（除了纤维蛋白本身）。选择溶栓治疗方案需要考虑多种因素，包括药物成本、不良反应、稳定性、半衰期、纤维蛋白特异性和免疫原性。 链激酶 (SK) 是由某些细菌菌株产生的蛋白质。这种蛋白质可以激活纤溶酶原，而纤溶酶原是血液中的一种物质，可以溶解血栓。SK（47 kDa，单链，414个氨基酸）通过激活血液循环中的纤溶酶原间接发挥纤溶酶的作用。SK 是第一种用于治疗急性心肌梗死的药物，大约在 40 年前问世。此外，它还可以溶解肾脏透析过程中分流形成的血栓纤维蛋白。这种药物在新形成的血栓中溶解效果最显著，它通过插入动脉的导管释放到血栓部位。通过在大肠杆菌表达系统中生产重组链激酶 (rSK) 可以避免链球菌中产生的固有 SK 的一些缺点，特别是产量有限、成本效益和存在额外的免疫原性分子。研究人员一直致力于优化 rSK，使其在体内持续更长时间、减少副作用并提高其有效性。rSK 蛋白的生产利用大肠杆菌BL21 (DE3) 作为宿主生物。为了实现高效表达，将针对不常见密码子和 mRNA 二级结构进行优化的成熟 SK 蛋白编码基因克隆到 pET-3a 表达载体中，然后插入大肠杆菌BL21 (DE3) 中。使用快速稀释法在 6 M 氯化胍中纯化、变性和重新折叠不溶性 rSK 包涵体抗体。采用阴离子交换层析分离折叠后的 rSK 蛋白，并用 ELISA 进行评估。为了延长溶栓治疗的半衰期，Wu 等人通过突变易受纤溶酶水解的 Lys 59和 Lys 386残基，制备了抗纤溶酶突变蛋白，使该突变蛋白在缺乏蛋白酶的枯草芽孢杆菌WB600中的半衰期延长了 21 倍。同时，他们利用毕赤酵母通过糖基化生产 rSK，形成了耐蛋白水解的分子。从β-溶血性链球菌中提取的药物 rSK 现在以商品名 Kabikinase ®和 Streptase ®上市。 尿激酶（UK）是一种参与多种生理过程的强效纤溶酶原激活剂 (PA)。UK裂解精氨酸-缬氨酸键，激活纤溶酶中的纤溶酶原。现在，血凝块中的纤维蛋白聚合物被先前形成的活性纤溶酶分解。这种活性纤溶酶在细胞迁移、组织重塑、补体激活、激素原转化和伤口愈合中发挥作用。它还在致癌作用和转移中发挥重要作用，并且是一种非常常见的心血管药物。UK 最初是从人类尿液中发现和分离的。从尿液中分离 UK 的过程耗时、昂贵且费力。自从rDNA 技术发展以来，人们已经探索了包括细菌（大肠杆菌、假单胞菌、枯草芽孢杆菌、嗜盐杆菌和肠球菌）、真菌（曲霉菌、青霉菌、单端孢菌和酿酒酵母）、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物在内的宿主来生产 rSK。虽然大规模培养细菌或真菌非常简单，但采用原核系统制造 UK 的最大缺点是这些生物缺乏翻译后修饰所需的机制。因此，产生的非糖基化 UK 缺乏天然 UK 的药效学特性和有效性。因此，建议使用哺乳动物细胞系来生产 UK。 近 20 年来，从人尿液或肾细胞培养物中提取的双链 uPA (tc-uPA) 一直被用作溶栓药物。由于它对纤维蛋白有特异性并且在血浆中呈惰性，因此最近已构建出单链 uPA 用于溶栓。Sc-uPA 已通过重组技术从几个来源生成，包括大肠杆菌、哺乳动物细胞和酵母。Tang 等人开发了一种从大肠杆菌生产单链尿激酶纤溶酶原激活剂 (sc-uPA) 的方法。他们的方法利用 pET 表达系统，该系统将组氨酸标签连接到 sc-uPA 蛋白的C 端。该策略可高表达组氨酸标记的 sc-uPA (ch-sc-uPA) 并促进其纯化和重新折叠。目前，人类新生儿肾细胞被用于尿激酶（ Abbokinase® 、Kinlytic™）的商业化生产，该药物于1978年首次获得FDA批准。这些药物的活性成分是低分子量的u-PA。然而，在一项调查揭露病毒污染问题后，FDA于1998年12月停止销售该药物，原因是该药物不符合现行良好生产规范。自2002年起，尿激酶再次成为治疗肺栓塞患者的可行选择。 血液和凝血制品 当纤维蛋白和活化的血小板聚合在一起时，哺乳动物就会发生血液凝固。在这个过程中，会发生许多酶活化事件，其中酶原和辅因子由丝氨酸蛋白酶激活。这个过程有助于防止受伤时失血过多。如果这种血凝块在血管内形成，则称为病理性血栓形成，这会导致人类各种残疾，甚至导致死亡。为了触发血液凝固，组织因子途径（外在）和接触途径（内在）起着主要作用。这些途径与血友病 A 型和 B 型有关，因为如果凝血因子或蛋白质无法凝结血管中的出血，就会发生血友病。血友病 A 与因子 VIII（F8）缺乏有关。 Bashar 和 Jeong 研究了凝血因子VIII (F8) 重组 A2 和A3 结构域的生成。F8 缺乏会导致一种称为血友病 A 的先天性出血性疾病。A2和 A3 编码基因的合成基于人类 F8 基因序列。使用大肠杆菌表达载体pGEX-4T1保存 rF8-A2 和 rF8-A3 的表达。使用Ni-NTA 填料从上清液中纯化蛋白质，并使用 SDS-PAGE 测量浓度。进行间接 ELISA 以检查A2 和 A3 抗原的抗原-抗体结合能力。GST 标记的rF8-A2 和 rF8-A3 蛋白（大小分别为 50.5 kDa 和 51.6 kDa）以可溶形式纯化。通过在F8的5′端引入GST，将pET28a (+)转换为pGETX-4T1载体，提高了重组蛋白的产量。使用抗F8多克隆抗体时观察到较高的结合效率，表明rF8-A3上存在与抗F8抗体结合的表位。因此，rF8-A2和rF8-A3可用于生成针对A2和A3的重组抗体，这有助于识别血友病A患者的A2/A3结构域。 白细胞介素 白介素 (IL) 是一类重要的天然免疫调节蛋白，能够调节细胞间通讯。虽然此前人们认为只有白细胞才能产生这些蛋白质，但现在人们发现许多其他类型的体细胞也能产生它们。它们有助于促进免疫细胞的活化和分化，以及增殖、成熟、迁移和粘附。此外，它们还具有促炎和抗炎特性。IL 通过自分泌和旁分泌两种功能，粘附于细胞表面的高亲和力受体，从而诱导细胞和组织中的多种反应。目前，人类 IL 基因家族中已鉴定出 55 个IL 和 IL 相关基因。根据其独特的结构特征，大多数 IL 可分为七个不同的类别和亚组。重组细胞因子是彻底改变多种重大疾病治疗方法的技术之一。目前市场上有多种细胞因子免疫疗法可供选择。许多人类重组白介素具有造血活性，例如rIL-2、rIL-3、rIL-4、rIL-5、rIL-7和rIL-11。其中，由于rIL-2在免疫系统中发挥着核心作用，值得深入研究。 Devos 等人于 1983 年首次描述了人类IL-2 在大肠杆菌中的表达。天然人类 IL-2（nIL-2）和重组人类IL-2（rIL-2）之间存在细微差别。糖基化的 nIL-2 由133 个氨基酸的多肽链组成，这些氨基酸排列成四个反向平行的两亲性 α 螺旋。相反，由大肠杆菌产生的 rIL-2是非糖基化的，第一个氨基酸丙氨酸不存在，并且位置 125 的半胱氨酸残基已被丝氨酸残基取代。Halfmann 及其同事在大肠杆菌中表达了编码 nIL-2 的基因，以产生大量 rIL-2（Met-IL-2）。当他们在 pGF25 中高水平表达成熟的 IL-2 基因时，产生的rIL-2 会积累在包涵体中。Devos 等人也面临过这个问题，他们发现了第一个 rIL-2，但它积累在大肠杆菌的细胞质中。为了解决这个难题，Halfman 等人开发了一种策略，将 IL-2 靶向至大肠杆菌的周质，将IL-2 与细菌信号肽或位于周质的麦芽糖结合蛋白融合。为此，他们将 IL-2 与前体麦芽糖结合蛋白（preMBP）融合，这导致大量preMBP-IL-2 蛋白被适当消化并递送至周质区域。现在我们可以轻松纯化合成的 rIL-2。rIL-2的一种特定变体可用作治疗贫血、癌症和多发性硬化症等疾病的药物。转移性肾细胞癌和黑色素瘤均已成功利用rIL-2作为促进T细胞增殖的治疗药物进行治疗。 抗凝剂 抗凝疗法在过去 70 年里被广泛应用于治疗急性血栓栓塞，最近也被接受用于治疗慢性血栓栓塞性疾病。血栓栓塞会导致多种类型的心血管疾病（CVD），因为心脏和血管问题是 CVD 的根本原因。根据世界卫生组织的数据，到 2030 年，CVD 预计将继续成为死亡的主要原因，造成2330 万人死亡。对这一问题的最佳治疗方法可能是溶栓疗法，以及抗凝疗法，它有助于重新打开阻塞的血管。这些抗凝药物对凝血过程有不同的作用。维生素K拮抗剂、直接口服抗凝药 (DOAC) 和低分子量肝素(LMWH) 是三大类抗凝药物。抗凝药物的例子包括阿哌沙班、达比加群、依度沙班、利伐沙班、华法林和水蛭素。其中，水蛭素是最初的直接凝血酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，是一种由65个氨基酸组成的蛋白质，由吸血水蛭（Hirudo medicinalis ）的唾液腺自然分泌。 酿酒酵母和大肠杆菌等细菌菌株可用于生产重组抗凝剂。与大肠杆菌相比，酿酒酵母具有多种优势，包括更高的细胞外表达效率和更类似于人类和其他真核生物的糖基化系统。酿酒酵母因其一般公认安全 (GRAS) 状态而成为治疗性蛋白质生产的热门选择。美国食品药品监督管理局(FDA) 批准酿酒酵母用于生产重组蛋白。一些研究集中在酵母酿酒酵母中水蛭素基因的表达和分泌。水蛭素基因已使用氨基酸序列合成。现在，该合成基因被克隆到酵母的 YEGα-1 表达载体中。这个载体还含有半乳糖诱导启动子 GAL10 和α-交配因子前原前导序列。已发现重组酿酒酵母将具有生物活性的水蛭素分泌到细胞外培养基中。从培养基中提取后，分泌的重组水蛭素 (rH) 用反相高效液相色谱和超滤法进行精纯。在不太理想的培养环境下，每升可形成1 毫克水蛭素，经过两阶段纯化后，纯度可提高到几乎 90%。Lipurin 是水蛭素的重组衍生物，与天然水蛭素相同，来源于酵母。该分子与水蛭素非常相似，但有两个主要区别：链开头（N 端）的异亮氨酸被亮氨酸取代，并且 69 位的酪氨酸缺少硫酸酯基。这种名为利匹卢定（lepirudin，rH）的药物用于治疗肝素诱导的血小板减少症。德西卢定（Desirudin）也是一种rH，它是一种凝血酶抑制剂，可以预防患者的深静脉血栓形成和血栓栓塞性疾病。 干扰素 干扰素 (IFN) 是人类的天然防御系统，由 Isaacs 等人发现。最初，人们认为干扰素在抗癌治疗和作为一种广谱抗病毒药物方面具有潜在应用。它是一组参与许多过程的蛋白质，包括调节免疫系统和细胞生长。干扰素目前分为三大类：I 型、II 型和III 型。I 型干扰素包括 IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-τ 和IFN-κ。这些干扰素在阻止病毒复制和细胞增殖方面发挥关键作用。II 型干扰素仅由 IFN-γ 组成，它对于刺激巨噬细胞和自然杀伤(NK) 细胞至关重要。 III 型干扰素由 IFN-λ 和白细胞介素(IL)-28/29 组成，它们也表现出与 I 型干扰素类似的抗病毒作用。尽管多种干扰素具有一些共同特性，但三种干扰素中 I 型干扰素的抗病毒作用最强。1980 年在大肠杆菌中成功克隆IFN-α 基因，使其成为哺乳动物基因克隆的模型系统。苏黎世大学 Charles Weissmann 实验室使用大肠杆菌质粒 pBR 322 作为表达系统，生物技术公司 Biogen 为该大学提供了这项研究的支持。该表达系统的建立首先是从仙台病毒刺激的产生干扰素的白细胞中分离mRNA。然后将该 mRNA 逆转录为双链互补 DNA (cDNA)。最后，将cDNA克隆到pBR322质粒载体中，大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞均能产生干扰素。 Rajabi Memari 等人使用带有 T7 lac 启动子和peIB 信号序列的 apET 26b (+) 载体在大肠杆菌系统中表达 IFN-α2b。为了分析表达情况，使用蛋白质印迹法确定蛋白质在大肠杆菌系统中表达，并使用免疫测定法测量蛋白质浓度。IFN-α2b 对多种细胞类型有免疫调节和抗增殖特性。重组 IFN-α2b 在全球范围内获批用于治疗超过 14 种疾病，例如毛细胞白血病、尖锐湿疣、卡波西肉瘤和肝炎，这表明这些多重益处具有实际意义。利用大肠杆菌BL21 (DE3) 质粒建立了重组人干扰素-γ (rhIFN-γ)。采用一种结合阴离子和阳离子交换层析的新型层析纯化技术，从包涵体中纯化重组人干扰素-γ (rhIFN-γ)。采用高效液相色谱 (HPLC) 评估重组人干扰素-γ (rhIFN-γ) 的纯度。重组人干扰素-γ (rhIFN-γ) 能够降低与慢性肉芽肿性疾病相关的严重感染的发生频率和严重程度。 造血生长因子 目前，市场上有三种合成的造血生长因子可供医疗使用：G-CSF（非格司亭）、GM-CSF（沙格司亭）和促红细胞生成素（epoetin；EPO）。促红细胞生成素 (EPO) 在所有造血生长因子中确实是独一无二的，因为它具有激素的功能。重组人促红细胞生成素 (rhuEPO) 被广泛用于治疗与肾衰竭、HIV 感染、癌症和手术等疾病相关的贫血。rhuEPO主要有三种：epoetin alfa、epoetin beta 和epoetin omega。EPO 是一种造血生长因子，在调节红细胞成熟为功能性红细胞的最后阶段起着关键作用。 促红细胞生成素（EPO）是一种合成的促红细胞生成素，而促红细胞生成素是调节红细胞生成的主要激素。EPO最初用于治疗肾衰竭相关的贫血，现已成为一种成熟的疗法。它也用于治疗其他各种患者群体的贫血。20 世纪 70 年代末，内源性促红细胞生成素的分离和纯化，以及其产生基因的分离和克隆，为重组人促红细胞生成素（rhuEPO）的开发铺平了道路。这种合成激素通常是通过在中国仓鼠卵巢细胞中表达促红细胞生成素基因而产生的。EPO 是一种重组人促红细胞生成素，已被用于治疗肾衰竭以外的贫血。它还用于辅助手术前的自体献血。 基因工程的突破促成了促红细胞生成素β（epoetin beta）的诞生，这是一种合成的人类蛋白促红细胞生成素（r-HuEPO）。科学家首先分离了编码促红细胞生成素的基因，然后将该基因导入中国仓鼠卵巢细胞，使其能够产生促红细胞生成素β。这种糖蛋白激素在骨髓中红细胞前体的生长和成熟过程中起着至关重要的作用。使用促红细胞生成素β治疗贫血与多种心血管健康指标的改善相关，包括降低心输出量和静息心率。此外，接受血液透析治疗的慢性肾衰竭 (CRF) 患者在接受 12 个月的促红细胞生成素β治疗后，左心室肥大和运动诱发的心脏缺血有所减少，同时运动能力也有所提高。然而，值得注意的是，这种治疗可能会导致血细胞比容和外周血管阻力升高，从而导致血压升高。 继促红细胞生成素α和β问世后，科学家们开发了第三种重组人促红细胞生成素（rHuEPO），并将其命名为促红细胞生成素-ω。它由BHK细胞产生。它也用于治疗肾衰竭和心脏相关疾病引起的贫血。 单克隆抗体 抗体是我们免疫系统的一部分，可以消灭抗原（外来颗粒）。单克隆抗体，通常称为 mAb，是合成蛋白质，其功能类似于人体内的抗体。这些重组抗体 (mAb) 因其高特异性、敏感性和可重复性而成为诊断检测的金标准。20 世纪 80 年代初，治疗性单克隆抗体首次得到商业开发，1986 年，第一个治疗性单克隆抗体 Orthoclone OKT3 获批用于预防肾移植排斥反应。作为大量生产 mAb 的先驱，米尔斯坦和科勒获得了 1984 年诺贝尔生理学或医学奖。这得益于“杂交瘤”技术（骨髓瘤细胞系与血浆 B 细胞融合），该技术永久改变了mAb 的生产方式。早期的单克隆抗体（mAb）采用小鼠蛋白（鼠类）制备，但事实证明，其并不适合长期人体使用。这种不兼容性促使人们重新评估生产方法，最终促使人们通过技术进步开发出完全人源化抗体。抗排斥药物 Muromonab-CD3 是首个在美国获得 FDA 批准的人源化单克隆抗体。 细菌能够产生抗体，这使得研究人员可以更直接地根据抗体的功能成功程度来选择所需抗体，这为抗体开发带来了令人着迷的新机遇。微生物细胞，即酿酒酵母、毕赤酵母和大肠杆菌，被用作生产重组抗体的表达系统。重组抗体还有许多好处有待发现，它们比传统的单克隆抗体有更大的潜力。优势源于两个关键特点：首先，可以在大肠杆菌系统内测试免疫球蛋白基因，从而可以使用成熟的基因操作方法。其次，由于抗体的较短片段（而不是整个 IgG 分子）尺寸较小且没有 Fc 区，因此可以使用它们。由于二硫键对于抗体的完整构象和结合能力至关重要，因此分子需要在氧化条件下折叠。即使面临来自替代表达系统的竞争，第一个生产重组生物制药的革兰氏阴性细菌大肠杆菌仍然保持着该领域的领先地位，占目前市场上所有生物制药的 40% 左右。 重组蛋白在细菌宿主中的表达通常由携带强启动子的自我复制多拷贝质粒触发，例如噬菌体 T7 的启动子、大肠杆菌中的乳糖操纵子 (lac)或合成的色氨酸操纵子(trp)，以及允许高基因剂量的核糖体结合位点。虽然多拷贝质粒提高了体积生产力，但它们对大肠杆菌的代谢负担是一个主要问题，导致细胞生长抑制和死亡。这导致了无质粒表达系统的开发，该系统使用定点技术将所需的 DNA 直接整合到大肠杆菌染色体中。这些系统提供了一种更有利的替代方案，具有较低的代谢负担。一旦触发产生抗体，大肠杆菌细胞就会破裂（通过添加溶菌酶或使用温和的渗透休克技术提取周质内容物来实现）。经过筛选后，抗体可以单独生产并进行大批量精纯。分泌可溶性抗体片段的菌落通常采用单步亲和层析法纯化，该方法利用与抗体片段C端融合的肽标签。与传统单克隆抗体类似，纯化的物质大部分可以分成几部分并冷冻保存。单克隆抗体的开发和应用已经改变了感染、癌症、器官移植、自身免疫性疾病以及心血管、呼吸系统和其他神经系统疾病的治疗。 r-DNA产品的监管方面 通过既定的监管措施，实施全面的风险评估框架来保障发酵相关的完整性。在这方面，根据 (EC) 第 1831/2003 号法规，受管制的产品和/或生产生物只有在被认为对人类、动物和环境安全的情况下才允许使用。确保所选生物无致病性且无毒性是维护安全性的首要任务。大多数众所周知的发酵物种都符合上述标准。另一方面，基因组测序为发酵行业的新手提供了重要的见解。它允许对菌株进行准确的分类学鉴定，并表征可能引起关注的功能特征，例如已知毒素的产生、毒力因子和抗生素耐药性。 1989年，印度政府制定了处理危险微生物、转基因生物 (GMO) 和细胞的法规。这些法规由环境与森林部根据通知号 GSR 1037 (E) 发布，并属于1986年《环境保护法》的范畴。该法规构成了临床试验和1988年《药品和化妆品法规》（第八修正案）的基础。印度政府环境与森林部和科技部生物技术开发委员会(DBT) 负责实施这些法规，也称为“1989年法规”。1999年，印度生物技术部为审批采用重组DNA (rDNA) 技术生产的生物制药制定了更清晰的路径。他们的指导方针“生成基于 r-DNA 的疫苗、诊断产品和其他生物制品的临床前和临床数据”要求公司首先获得基因操作审查委员会 (RCGM) 对与现有药物类似的药物（类似生物制品或 SBP）的批准。为确保按照 DBT 发布的指南和标准操作程序采取适当的安全预防措施和控制条件，RCGM 密切关注正在进行的重组 DNA 项目和涉及转基因生物/危险微生物活动的安全相关方面。之后，数据被发送给印度药品管理总局 [DCG(I)]，以获得最终的商业许可和临床试验批准。在 DCG(I) 批准产品后，中央和州药品管理局联合检查设施，然后由中央许可审批机构颁发生产许可证。 rDNA产品市场规模 重组DNA (rDNA) 蛋白质生产是生物技术的支柱，而生物技术目前是且很可能将继续是一个研发密集型领域。自20世纪70年代初以来，由于分子生物学和基因工程的发展，人们对人类疾病生物分子根源的认识取得了巨大进步。rDNA治疗领域蓬勃发展，强生、安进、诺和诺德和百健（Biogen IDEC）等110多家公司积极致力于创新rDNA产品的商业化。这些公司拥有强大的开发路径，目前有80多种潜在治疗药物处于临床试验阶段。他们的目标是扩大其现有的73种上市产品库。 印度政府制药部于2010年为生物制药行业设定了一个雄心勃勃的目标：到2020年，该行业应发展成为全球主要的高性价比生物治疗药物生产商。印度制药业在2023年迎来辉煌，产量位居全球第三。此外，印度在提供价格实惠的仿制药和疫苗方面也处于领先地位。目前，印度有20多家公司生产生物治疗药物，其中领先的公司包括雷迪博士实验室 (Dr. Reddy's Laboratories)、Ranbaxy、Biocon、Shanta Biotech、Reliance Life Sciences、Panacea Biotech、Bharat Biotech 和 Intas Biopharmaceuticals。目前，约有50种生物治疗药物已进入印度市场，价格比竞争对手低85%，使大多数印度人都能负担得起。在 2009-2010 财年，印度的促红细胞生成素销售额增加了 2200 万美元，粒细胞集落刺激因子（G-CSF 或GCSF）销售额增加了 1100 万美元，干扰素销售额增加了 2200 万美元，链激酶销售额增加了1500 万美元。尽管 2009 年全球经济衰退，2010 年逐渐复苏，但印度生物技术产业的收入仍保持在 1500 亿美元以上。在过去 10 年里，该行业持续扩张，年增长率超过10%，平均收入增长率超过 20%。到 2020 年，其营业额预计到4500 亿美元，这意味着它必须以每年近 30% 的速度扩张。 r-DNA产品的下游工艺挑战 发酵在受控条件下在密闭系统中进行，其中培养设计用于发酵的微生物或生产微生物。“下游”工艺 (DSP) 用于在此“上游”工艺程序之后回收产品。所需的产品纯度因应用和授权而异，这决定了DSP 的复杂性。DSP 通常包含以下工艺：生物质分离、产品回收/纯化和制剂配制。然而，DSP 存在许多问题，这些问题会严重影响rDNA 生产的成本和生产效率。 在消费者需求激增的推动下，各公司正在加大rDNA产品的产量。然而，高效地实现大规模rDNA生产并非易事。以下是他们面临的一些关键挑战： 1.表达缺失：靶基因必须产生足够的蛋白质才能获得高产量。多种因素可能导致重组基因沉默，包括基因本身的突变或基因从靶细胞中消失。维持理想温度、增加插入片段的拷贝数以及表达蛋白对宿主的毒性也可能影响克隆产量。表达稳定性问题可以通过外源基因的染色体整合来解决；然而，在染色体外元件系统中，过量的重组基因可以提高产量。翻译后加工：糖基化——复杂的翻译后修饰 (PTM)，一个多步骤的酶促过程；它如何保持形状、与水相互作用、与免疫系统相互作用、正确折叠、到达细胞内的正确位置、正常运作并保持活性。为了生产重组蛋白，科学家经常对各种生物体进行基因工程改造，例如大肠杆菌、酵母或昆虫细胞 (SF9)、小鼠细胞 (SP2/0) 和仓鼠细胞；然而，生产完全人源化的 PTM 却十分困难。常用的啮齿类动物衍生的哺乳动物细胞系可以进行与人类类似的糖基化。尽管重组蛋白与其天然对应物非常相似，但它们可能缺乏人类体内存在的某些糖分子（例如 2,6-链唾液酸）。相反，它们可能含有人类体内不存在的其他糖（例如末端半乳糖-半乳糖或末端唾液酸）。这些结构差异可能会触发免疫系统，从而可能导致不必要的免疫反应。由于治疗性蛋白质通常缺乏人类所发现的正确糖结构，研究人员越来越多地使用人类细胞系，甚至构建新的细胞系。这使我们能够生产完全糖基化的蛋白质，从而有可能带来更有效的治疗方法。在原核系统中，治疗性蛋白质的过表达可能导致包涵体形成。当大分子蛋白质表达且细胞内蛋白质快速聚集时，更容易发生聚集。积累的蛋白质受到保护，不会发生蛋白水解，因此更容易回收。当产生的蛋白质对宿主具有毒性时，细胞内聚集的蛋白质往往可以保护宿主。 与rDNA产品微生物生产相关的专利和临床试验 将重组蛋白 (rDNA) 等新疗法推向市场需要经过严格的三期临床开发流程。每一步都比上一步更艰难、耗时更长且成本更高。I期涉及对新疗法进行人体初步测试。I期试验优先考虑安全性，评估产品的初始耐受性以及不同剂量下的基本药代动力学/药效动力学。这些数据将指导第二阶段的进展，II期侧重于疗效以及在患者身上的进一步安全性评估。至关重要的III期试验将利用这些先导研究的数据进行设计，该阶段将对产品的安全性及其在特定患者群体中的疗效进行精确评估。III期试验数据表明了 FDA 或其他监管机构将在审批过程中考虑的确切指征。 塔夫茨药物开发研究中心通过公司调查和公开记录收集了 1980 年至 2002 年间进入临床研究的271 种 rDNA 药物的临床开发和监管审查数据。作为“治疗性疫苗”、治疗性单克隆抗体和现有产品的改良版（如新剂量或重新配方）的rDNA 产品并未包括在内。59 家美国公司资助了其中 271 种产品，其中222 种在美国研发或进入临床试验。10 家跨国公司获得了 FDA 一种或多种治疗性rDNA 产品的上市批准；其余 49 种产品来自这些公司。 1980年12月2日，美国专利局公布了新兴生物技术领域的首项重要专利。这项创新是后来被称为科恩-博耶重组DNA克隆专利的三项专利之一。它源于斯坦福大学的斯坦利·N和科恩大学及加州大学旧金山分校（UCSF）的赫伯特·W·博耶于1973年至1974年间开创的一项关键分子生物学程序。这项程序后来被称为重组DNA技术，彻底改变了该领域。 rDNA技术的未来发展 在操纵目标基因表达方面，rDNA 技术目前可以引入可用于改进现有技术的理想性状。使用 rDNA 技术可以大量生产治疗性蛋白质，这些蛋白质具有高度的稳定性和一致性。该技术的多学科应用可以解决生活中的重大问题，例如增进健康和改善食物资源。全球 rDNA 技术市场有望呈现爆炸式增长，分析师估计到 2022 年达到1455 亿美元。这一势头将持续下去，市场在 2022 年至 2023 年间以每年7.9% 的强劲速度增长。重大成功以及 rDNA 技术在治疗癌症、糖尿病和传染病等严重人类疾病方面的广泛用途预计将成为市场发展的主要驱动力。重组技术的进步使得用于药物研发和基因治疗的长效治疗蛋白（即新型分子药物）的开发成为可能。这对遗传疾病的治疗产生了积极影响，并促进了rDNA技术市场的增长。此外，科学家现在拥有了一种强大的工具，可以精确改变微生物、植物、小鼠、狗和人类细胞的DNA，这可以通过一种称为成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的新型基因编辑技术实现。该工具可用于靶向清除人类细胞中的异常基因。世界卫生组织（WHO）于2020年1月30日发布了公共卫生紧急状态，以应对始于2019年12月并已蔓延至全球100多个国家的COVID-19疫情。另一方面，由于COVID-19 疫苗研发中采用了创新的重组技术，COVID-19 大流行最终对国际 rDNA 技术领域产生了有利影响。 微生物生物技术取得了长足的进步，在rDNA技术发现后的四年内，人类胰岛素和人类生长激素就已通过细菌基因工程生产出来并上市销售。疫苗的生产过程也令人着迷，例如乙肝疫苗就是利用病毒表面抗原在酵母中生产的。 结论 重组DNA技术是一项历史性的科学创新，极大地改善了人类福祉。如今，利用rDNA技术生产的微生物药物已成为国际公认的医学领域，可用于治疗多种慢性疾病。本文讨论了rDNA技术转化的治疗性激素、治疗性酶、溶栓剂、凝血产品、白介素、抗凝剂、干扰素和造血生长因子的表达系统、生产、纯化、分析和药物应用。与传统方法相比，微生物rDNA产品具有诸多优势，包括适应性强、可重复性、纯度高、安全性高、成本效益高以及产品产量高。许多此类微生物产品专注于对多种疾病产生积极作用的治疗，并且它们在未来很可能将继续保持这一优势。 原文：I.Modasiya, P.Mori, S.Goswami, Microbial Production of r-DNA Products. Microbial Products for Health and Nutrition, 2024.