Patisiran sodium

-01- 引言 提高药物特异性、安全性和效力，同时最小化毒性，是开发新型治疗药物的核心目标。寡核苷酸是一类能够调节多种生物功能的新型治疗药物，正迅速发展。寡核苷酸通过沉默、激活、调节、编辑和替换来调节基因表达，特别是基于mRNA的基因表达调控。寡核苷酸易于合成、特异性强、靶点范围广且毒性低，因此在治疗遗传性疾病和神经退行性疾病方面前景广阔。尽管在提高寡核苷酸安全性和有效性方面取得了重大进展，但将寡核苷酸递送至肝脏以外的部位仍具挑战性。此外，提高寡核苷酸通过细胞内化的摄取效率是当前研究的主要焦点。 抗体-寡核苷酸偶联药物（AOC）是一类由抗体、连接子和寡核苷酸组成的新型治疗药物。AOCs结合了抗体的抗原特异性结合能力和寡核苷酸的基因调控功能，旨在实现对多种疾病的靶向高效治疗干预。尽管AOCs尚处于发展早期，但在过去几十年中进展稳步。本文旨在全面概述AOC治疗药物，包括作用机制、结构组件和制造工艺。此外，本文还将讨论当前的质量控制策略、现有局限性以及潜在的未来研究方向，以支持AOC治疗药物的进步。 -02- 一、AOC的发展历程 1913年，诺贝尔奖得主、德国科学家Paul Ehrlich首次提出了“魔术子弹”的概念，即有毒物质（“弹头”）可以被装载到能够精确靶向癌细胞的载体上，以选择性杀死恶性细胞而不伤害健康细胞。2000年首个抗体-药物偶联物（ADC）Mylotarg的获批，极大地推动了药物开发行业。ADC等抗体修饰药物的出现，拓展了新药开发的范式。AOCs目前已成为前景广阔的靶向治疗药物。 AOCs的发展与RNA干扰（RNAi）疗法的发展紧密交织；过去三十年中，这两个领域都取得了显著进展。我们将AOC的发展进程分为五个不同的阶段。早期探索阶段从1995年持续到2005年。关于AOCs的第一项研究发表于1995年。1998年，Fire和Mello阐明了RNAi的机制，为基于siRNA的治疗药物奠定了基础，并于2006年获得诺贝尔生理学或医学奖。1998年，首个ASO药物福米韦生获批上市。尽管福米韦生已从美国和欧洲市场撤出，但其获批是核酸类治疗药物开发的开创性里程碑。 第二阶段是AOC技术发展阶段，从2006年到2014年。2010年，首次在人体中证明了siRNA对蛋白质表达的抑制，为基于siRNA的治疗药物开发提供了理论基础。2014年，基因泰克利用THIOMAB™技术将siRNA定点缀合到抗体上，为AOCs的开发奠定了基础。从2015年到2021年，AOCs进入临床突破阶段。2016年，首个磷酰二胺吗啉代寡聚物（PMO）药物依特立生获得监管批准，扩大了RNAi治疗领域，并为AOC开发提供了重要的寡核苷酸形式。2018年，首个siRNA治疗药物帕替司兰获批临床使用。2021年，首个AOC治疗药物AOC 1001进入临床试验。 从2022年开始，AOCs进入临床进展加速阶段。截至2024年，已有11种ASO药物、6种siRNA药物和2种适配体药物获批临床使用。2022年，多个AOC候选药物进入临床试验，包括DYNE-101、DYNE-251和TAC-001。2024年，AOC 1001被美国食品药品监督管理局（FDA）指定为突破性疗法。2025年，DYNE-101获得FDA快速通道认定。首个AOC治疗药物AOC 1001（或AOC 1044）预计将于2026年上市。 作为一种新兴的治疗技术，AOCs在全球范围内拥有显著的研究和开发势头。截至2025年3月，全球有31个AOC项目处于从临床前研究到III期临床试验的不同开发阶段。这些项目主要针对罕见病、癌症和神经退行性疾病。例如，由Avidity Biosciences开发的Delpacibart Etedesiran（AOC 1001）已进入III期临床试验，用于治疗强直性肌营养不良1型。这种基于RNAi的治疗药物包含一种抗转铁蛋白受体1（TfR1）抗体，能够实现寡核苷酸的靶向递送。Avidity Biosciences的其他AOCs，包括用于面肩肱型肌营养不良症的Delpacibart Braxlosiran（AOC 1020）和用于杜氏肌营养不良症的Delpacibart Zotadirsen（AOC 1044），目前正处于II期临床试验。这些疗法的开发突显了AOCs在治疗肌肉退行性疾病方面的技术优势。 由Tallac Therapeutics开发的用于治疗实体瘤的TAC-001目前处于I/II期临床试验。TAC-001靶向CD22抗原并结合TLR9激动剂以增强免疫反应。DYNE-101由Dyne Therapeutics设计，用于治疗强直性肌营养不良1型。DYNE-101由抗TfR1抗体的Fab片段缀合ASO组成，用于肌肉特异性递送。DYNE-251也由Dyne Therapeutics开发，由靶向TfR1的Fab片段缀合PMO组成。DYNE-251旨在促进向肌肉组织的靶向递送，并促进细胞核中的外显子跳跃，从而在肌肉细胞中产生截短但功能正常的抗肌萎缩蛋白。该疗法适用于适合外显子51跳跃的杜氏肌营养不良症患者。DYNE-101和DYNE-251目前均处于I/II期临床试验。由Aro Biotherapeutics开发的ABX1100是一种新型Centyrin-siRNA缀合物，它采用源自人腱蛋白C的小型稳定蛋白支架，靶向TfR1，将糖原合成酶1（GYS1）特异性siRNA有效载荷直接递送至肌肉组织，用于治疗晚发型庞贝病。ABX1100目前处于I期临床试验。 -03- 二、AOC的作用机制 1. 通过抗体实现靶向递送 已识别出多种抗原靶点，包括转铁蛋白受体、凝集素、受体酪氨酸激酶、整合素和HER2/EGFR。这些靶点使得能够递送至肌肉、中枢神经系统、肝脏和肿瘤细胞。TfR1是研究性AOCs中最常靶向的抗原。TfR1在大多数正常细胞中低水平表达，在具有高增殖率（如基底细胞）和高铁需求（如红系祖细胞）的细胞中显著上调。许多与癌症发病机制相关的基因会调节TfR1的表达。TfR1已在骨骼肌和罕见病、肿瘤学和帕金森病治疗的背景下进行了研究。在TfR1抗体识别靶点后，寡核苷酸的跨膜递送主要通过受体介导的内吞作用进行。 AOCs发挥细胞内作用的机制始于抗体部分与细胞表面其同源抗原的精确相互作用。这种高亲和力结合事件是细胞内在化的启动信号，主要通过受体依赖性内吞作用介导。抗原识别后，AOC-抗原复合物诱导质膜局部内陷，导致缀合物被包裹在称为内体的囊泡结构中。随着新生内体通过内吞途径进展，其经历成熟过程，其特征是管腔环境逐渐酸化——从早期内体的近中性pH到晚期内体和溶酶体中酸性环境的增加。这一成熟过程伴随着各种内体分选复合物和水解酶的募集，它们共同调节囊泡内条件。至关重要的是，这些内在的物理化学特性（如pH梯度和酶活性）会触发连接寡核苷酸和抗体的连接子的裂解。AOCs中的连接子通常被设计为对这些信号作出反应，包含酸不稳定键或蛋白酶敏感肽等元件。连接子解离后，释放的寡核苷酸必须穿过内体膜进入细胞质区室，这一步骤通常称为内体逃逸。这种逃逸机制对治疗成功至关重要，因为被困在内体中可能导致溶酶体降解和活性丧失。各种策略促进了这一过程，包括掺入融合肽或质子海绵聚合物，通过渗透膨胀或膜扰动破坏内体完整性。一旦释放到细胞质中，寡核苷酸就与其分子靶点结合以调节基因表达。根据寡核苷酸类型（如反义寡核苷酸（ASOs）、小干扰RNA（siRNAs）或剪接调节剂），它可能与互补的mRNA序列杂交，从而募集内源性机制，如用于转录物切割的RNase H、用于转录后沉默的RNA诱导沉默复合物（RISC），或改变剪接模式以产生功能性蛋白质亚型。这种基因调控作用最终转化为表型变化，例如遗传性疾病中致病蛋白表达的减少或肿瘤学应用中免疫反应的增强。 尽管大多数靶向不同抗原的AOCs共享涉及网格蛋白介导的内吞作用的内在化共同机制，但内在化速率和内吞后运输各不相同。靶向TfR1的AOCs在小鼠骨骼肌中快速内在化。单次10 mg/kg注射后，24小时内超过80%的靶基因表达被敲低。相比之下，靶向TENB2的AOCs仅在肿瘤血管附近内在化，导致三天内仅33%的基因抑制。TfR1是一种循环抗原，内在化后将AOCs返回细胞表面，而HER2是一种降解抗原，将AOCs导向溶酶体进行降解。 寡核苷酸从内体逃逸的效率低下是一个重大的技术瓶颈。内体具有能够隔离和保留约99% RNA治疗药物的脂质双层。香港大学的研究人员使用定量NanoSIMS显微镜证实，体内只有1%到2%的GalNAc-ASO缀合物从肝细胞内体中逃逸。此外，RNA分子固有的亲水性和负电荷阻碍了它们穿过类似带电的细胞膜的易位。 2. 寡核苷酸的类药特性 传统的ADCs递送作用于特定细胞内分子靶点的细胞毒性有效载荷，以破坏关键的细胞机制。相比之下，AOCs中的寡核苷酸有效载荷作用于上游信号分子，例如内源性mRNAs，通过碱基配对互补特异性沉默靶mRNA，从而减少致病蛋白的产生。几种不同的机制已在临床上得到验证，包括内含子剪接调节（例如，用于治疗脊髓性肌萎缩症的ASO药物诺西那生钠）和RNA诱导沉默复合物的形成（例如，用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性的脂质纳米颗粒包裹的siRNA帕替司兰）。 与ADC制备相关的挑战包括异质性、连接子疏水性、聚集和连接子稳定性。药物的大小以及药物对最终缀合物整体电荷的贡献也显著影响ADC制备。AOCs在结构相似性和设计原理方面与ADCs共享。然而，寡核苷酸的偶联可能带来更大的挑战。例如，ADCs中药物-连接子部分的分子量通常小于2 kDa，而寡核苷酸通常超过10 kDa。因此，寡核苷酸对抗体的物理化学性质的影响比小分子药物更大。此外，寡核苷酸带负电荷的磷酸主链赋予其水溶性，并在偶联时改变抗体的整体电荷。带负电荷的寡核苷酸赋予AOCs与ADCs不同的电荷分布，因此需要专门定制的分析和表征方法，而不是直接用于ADCs的技术。 -04- 三、AOC治疗药物的结构组件 AOCs由抗体或抗体片段、连接子和寡核苷酸组成。抗体应被靶细胞内化。连接子在体循环中保持稳定性，以防止或最小化到达靶组织前的有效载荷降解。连接子还有助于细胞摄取后寡核苷酸的快速释放。寡核苷酸通过调节细胞内的靶mRNA发挥治疗作用。因此，AOCs代表了生物大分子（抗体）和化学大分子（寡核苷酸）的缀合物，具有独特的作用机制和药代动力学特性。 1. 抗体 抗体组件引导AOCs。将抗体的靶向能力与寡核苷酸的基因调控功能相结合，扩展了寡核苷酸的治疗潜力，实现了对致病蛋白的精确调节。用于AOCs的抗体应具备以下特征：对抗原具有高特异性和亲和力、高效快速的内在化以及良好的药代动力学特性。低免疫原性的单克隆抗体（mAbs）是携带寡核苷酸至肝外靶点并参与各种药理作用（如抗体依赖性细胞吞噬作用，从而实现寡核苷酸的肝外递送）的理想递送载体。 抗体类型：全长mAbs，尤其是免疫球蛋白G（IgG），是AOCs最常用的抗体。IgG分子分子量约为150 kDa，由两条重链和两条轻链组成，形成不同的Fab和Fc区。IgGs表现出高特异性、强亲和力和延长的半衰期。然而，IgGs相对较大的尺寸限制了渗透性，降低了IgG缀合的AOC向深层组织区域的浸润。全长抗体，包括IgGs，主要积聚在肿瘤血管附近的少数细胞层内，而不是深层组织区域。尽管存在这些挑战，AOC设计的进步正在利用全长mAbs的优势来克服此类限制并实现靶向递送。Avidity Biosciences正在推进Delpacibart Etedesiran的临床开发，该药物采用靶向TfR1的全长mAb实现肌肉特异性递送。 抗体片段，如Fab或scFv，越来越多地用于解决全长抗体组织渗透有限的问题。抗体片段通过完整抗体的酶消化或基因工程产生截短抗体而产生。抗体片段的分子量范围为25 kDa至50 kDa。抗体片段保留了高特异性和亲和力，并表现出增强的组织渗透性，但抗体片段的半衰期比全长抗体短。Sutherland等人证明，靶向癌胚抗原的抗体片段在体外肿瘤球体模型中显示出相对于完整IgG显著改善的渗透性。Dyne Therapeutics正在推进DYNE-101的临床开发，该药物采用结合TFR1的Fab实现肌肉特异性递送。 源自骆驼科物种的VHH抗体（纳米抗体）由单个可变域组成，分子量在12 kDa至15 kDa之间。与全长mAbs和片段化抗体相比，VHH抗体表现出更高的特异性和亲和力以及更优的组织渗透性，但半衰期更短。纳米抗体在注射后3至5小时内达到高肿瘤背景对比度，表明其能够快速渗透深层组织区域。使用VHH的AOC正成为一个热门研究领域。迄今为止，尚无相关药物进入临床试验。 抗体特异性和亲和力：理想抗体的独特分子结构是其对抗原靶点具有高特异性和适当亲和力的基础。Y形抗体包含两个可变区，由通过V(D)J重组产生多样性的互补决定区组成。互补决定区的独特构象确保了与靶抗原的精确匹配，这是高特异性和亲和力的基础。精确靶向可最大限度地减少脱靶细胞的非特异性摄取，从而降低AOCs的毒性并增强其治疗效力。适当的亲和力也增加了靶细胞摄取AOC的可能性，从而提高了整体效率。 药代动力学特性：将抗体与寡核苷酸偶联会导致相对于裸抗体的物理化学变化。这些改变可能影响药代动力学，应在AOC开发过程中仔细考虑。人源化抗体具有与未偶联抗体相似的药代动力学特性，越来越多地用于下一代ADC构建。人源化抗体为AOC设计提供了宝贵的指导；低免疫原性和最佳的药代动力学特性对抗体选择至关重要。 2. 寡核苷酸 寡核苷酸包括短的低分子量RNA或DNA分子及其合成类似物（异源核酸）。寡核苷酸在治疗、诊断和免疫调节方面具有多种应用，包括病原体检测、基因沉默和基因表达调节。寡核苷酸是AOCs的关键组成部分，体现了其药理作用。该组包括ASOs、小干扰RNA（siRNAs）、PMOs、微小RNA（miRNAs）和核酸适配体。其中，ASOs、siRNAs和PMOs得到了最广泛的研究。与作用于分子靶点以实现所需表型的传统ADC小分子有效载荷不同，当前的合成寡核苷酸治疗药物靶向上游信号分子，例如内源性mRNAs。寡核苷酸通过碱基配对互补特异性沉默靶mRNAs，以减少致病蛋白的产生。 ASOs：ASOs是通过碱基互补靶向mRNA或pre-mRNA以调节基因表达用于治疗目的的单链核酸分子。AOCs中的抗体靶向递送可显著增强传统ASO疗法的效力和安全性。AOC作用的主要机制包括与靶RNA特异性结合，诱导RNase H介导的RNA降解，或通过空间位阻抑制RNA剪接和翻译，从而调节特定基因的表达。例如，用于治疗脊髓性肌萎缩症的ASO药物Spinraza（诺西那生钠）通过调节SMN2基因的表达来增加SMN蛋白的产生。Spinraza在脊髓性肌萎缩症患者的临床试验中实现了持续的治疗获益。对于AOCs，1995年首次报道的AOC使用ASO作为核酸分子。近年来，几种AOCs已进入临床试验，并使用ASOs，一个显著的例子是DYNE-101。 小干扰RNA（siRNAs）：研究最广泛且临床应用最广泛的寡核苷酸是siRNAs。双链siRNAs通常为21至23个碱基对。反义链与靶mRNA完全互补，并通过RNA诱导沉默复合物介导靶mRNA的降解以沉默基因。Inclisiran是一种已批准的siRNA分子，具有已证实的效力和安全性，可干扰前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）的mRNA，导致该蛋白和低密度脂蛋白胆固醇的持续降低。与传统小分子药物相比，siRNAs表现出更高的特异性和更广的靶点谱，能够精确干预小分子难以靶向的蛋白质或基因。然而，与ASOs相比，siRNAs通常表现出较低的组织渗透性。许多临床试验中的AOCs使用siRNA作为有效载荷，例如Avidity开发的Delpacibart Etedesiran和Delpacibart Braxlosiran。 PMOs：PMOs是合成的单链DNA类似物，其中天然的磷酸二酯键被磷酰二胺键取代。每个PMO亚基中的吗啉环赋予其增强的稳定性和对酶降解的抵抗力。PMOs主要通过互补结合pre-mRNAs以阻断剪接体对靶功能蛋白特定外显子的识别来调节基因表达。PMO结合诱导外显子跳跃并恢复功能蛋白的翻译。2016年批准的Eteplirsen（EXONDYS 51®）是一种基于PMO的反义寡核苷酸，用于治疗确诊DMD基因突变且适合外显子51跳跃的杜氏肌营养不良症患者。尽管PMOs是AOCs中最新使用的寡核苷酸类型，但它在该领域发挥着重要作用。Avidity开发的Delpacibart Zotadirsen使用PMO作为AOC的寡核苷酸部分。 寡核苷酸的修饰：作为生物大分子，寡核苷酸在进入生理环境时会面临一些挑战，这些挑战限制了它们的治疗效力，包括稳定性差和易受血清核酸酶降解。AOCs通常携带寡核苷酸有效载荷。对寡核苷酸骨架、糖部分和核碱基的修饰包括骨架重组、糖环改变、末端加帽和5'磷酸化。这些修饰提高了寡核苷酸的稳定性和治疗效力。寡核苷酸化学和偶联技术的重大进步促进了多种寡核苷酸缀合物的开发，用于临床候选药物。 3. 连接子 连接子在AOC的靶向抗体和治疗性寡核苷酸之间建立高效且可控的化学桥梁。连接子显著影响AOCs的关键参数，包括寡核苷酸-抗体比率（OAR）、治疗指数、药代动力学/药效学以及整体稳定性。因此，连接子的设计和选择需要综合考虑稳定性、可控释放和生物相容性等多种因素。 连接子大致可分为可裂解和不可裂解两种类型。可裂解连接子在特定生理条件下释放药物，可进一步分为酶敏感型、酸敏感型和还原敏感型亚型。酶敏感型连接子可以基于溶酶体的独特微环境进行设计。例如，水解酶如组织蛋白酶特异性裂解基于肽键的连接子（如Val-Cit），磷酸酶降解磷酸酯基连接子。连接子的肽序列或化学结构必须在血浆中的稳定性与细胞内高效裂解之间取得平衡。寡核苷酸的释放也可由酸性条件（内体中pH 5.5，溶酶体中pH 4.5）或还原环境触发。常见的酸敏感型连接子包含肼、缩醛和碳酸酯键。细胞内谷胱甘肽浓度升高诱导二硫键的选择性裂解；因此，连接子的稳定性可以根据缀合位点和空间位阻程度进行微调。 不可裂解连接子提高了偶联稳定性，适用于需要长时间循环和持续活性的疗法。常见的偶联策略包括与天然氨基酸（如半胱氨酸或赖氨酸）共价连接、形成马来酰亚胺-硫醇连接（例如通过SMCC）以及使用点击化学方法（例如铜催化的叠氮-炔环加成或应变促进的叠氮-炔环加成）进行定点偶联。 直接偶联：直接缀合是AOC设计中最常用的缀合方法。在寡核苷酸上引入官能团允许其直接连接到抗体上。化学修饰的多样性支持使用多种连接子，包括可裂解和不可裂解连接子以及先前经过验证的ADC连接子。针对抗体上特定结合位点设计的连接子可以有效调节OAR，并且可以更小，与较大的连接子相比，对AOCs整体物理化学性质的影响更小。然而，这种方法需要在寡核苷酸上构建连接子附着位点，然后通过化学缀合将连接子连接到该位点。因此，直接缀合的通用性依赖于连接子的高稳定性，该连接子必须与DNA或RNA分子及其双链退火过程兼容且稳定。 在当前ADCs中，主要的偶联基团包括赖氨酸和半胱氨酸残基，近年来半胱氨酸基偶联的使用显著增加。类似地，AOCs目前主要利用半胱氨酸残基作为关键偶联基团，利用其反应性硫醇部分高效附着寡核苷酸有效载荷，特别是通过工程化半胱氨酸实现定点偶联，从而精确控制OAR值、偶联位置，并促进靶向递送应用以增强治疗效力。Cochran等人比较了AOCs的不同连接子方法。为此，他们采用了三种不同的抗体与寡核苷酸偶联方法：1）半胱氨酸偶联，2）赖氨酸偶联，3）Asn297糖基化偶联。为了实施基于半胱氨酸的方法，他们用TCEP处理抗体以切割链间二硫键，暴露半胱氨酸残基上的硫醇基团，然后使siRNA与含马来酰亚胺的连接子MCC反应，形成siRNA-连接子-马来酰亚胺中间体，随后通过硫醇-马来酰亚胺反应偶联到抗体上。结果表明，通过半胱氨酸偶联构建的AOCs在药代动力学和siRNA递送效率方面优于其他方法，因为赖氨酸偶联导致血浆清除更快，而Asn297糖基化缀合虽然稳定，但血浆暴露较低。 点击化学是美国化学家Barry Sharpless于2001年引入的现代有机合成策略，并于2022年获得诺贝尔化学奖。点击化学因其高效、优异的选择性、模块化和温和的反应条件而被用于构建AOCs。点击化学的一个显著例子是使用应变促进的叠氮-炔环加成。在这种方法中，抗体用DBCO-PEG5-NHS修饰，寡核苷酸的5'端通过标准固相合成功能化叠氮基团（-N₃）。抗体和寡核苷酸通过DBCO和叠氮的应变促进叠氮-炔环加成快速偶联。这种由点击化学实现的模块化设计，便于在实验过程中灵活交换不同的抗体和寡核苷酸，并支持抗体与各种寡核苷酸的正交偶联，为经济高效且可扩展的AOC生产提供了支持。 亲和力偶联：亲和力偶联的一个典型例子是利用亲和素和生物素之间的高亲和力，将siRNA稳定偶联到靶向抗体上。在这项研究中，正义siRNA链在3'端单生物素化，并与靶向人胰岛素受体的重组链霉亲和素和mAb的缀合物组装。使用转染了荧光素酶报告基因的人293上皮细胞来监测基因表达并表征该构建体。AOC构建成功，AOC处理在48小时内使荧光素酶表达显著降低超过90%。RNA干扰作用持续长达5天，但在7天后消失。在siRNA浓度低至3 nM时可检测到抑制作用，并且抑制效果随siRNA浓度增加而增加（半数抑制常数约为30.5 ± 11.7 nM）。这些发现表明，亲和素-生物素系统是构建AOC的高效且稳定的连接子。 通过离子相互作用偶联：离子相互作用偶联利用寡核苷酸骨架的负电荷，通过离子相互作用与修饰有多聚阳离子结构的抗体偶联。最常用的多聚阳离子部分是内源性蛋白鱼精蛋白。Liberman等人首次报道了通过离子相互作用缀合构建AOCs的方法。来自靶向HIV-1包膜蛋白的mAb F105的重链Fab片段与鱼精蛋白基因融合，生成融合蛋白F105-P。将F105-P与siRNA孵育得到AOC。siRNA的荧光标记显示，每个鱼精蛋白分子稳定结合大约六个siRNAs。构建的AOCs证明了有效的靶向和基因沉默，而不会触发干扰素反应。这项研究证实了离子相互作用缀合用于AOC构建的潜力，并突出了这种方法的简单性。多聚阳离子部分也充当溶酶体逃逸剂，并通过“质子海绵”效应诱导溶酶体渗透膨胀，增加膜通透性并促进寡核苷酸释放到细胞质中。 尽管简单，离子相互作用偶联存在固有的不稳定性。离子键的可逆性使得缀合物在生理pH或盐度变化下容易解离，可能导致寡核苷酸过早释放。此外，由于依赖于间接表征方法，如荧光标记或PCR，质量控制尤其具有挑战性，这通常导致批次间差异大，并难以确保产品一致性。最后，缺乏全面的体内稳定性数据，包括ADME谱，引入了释放动力学的不确定性，增加了脱靶效应和降低治疗效力的风险。因此，上述挑战导致离子相互作用偶联在当代AOC研究中很少使用。 -05- 四、AOC的制造工艺 AOC制造通常涉及裸抗体、连接子、寡核苷酸、AOC散装溶液和AOCs的生产。基于质量源于设计和风险评估等原则的工艺设计和开发，指导生产过程中宿主细胞、培养基和试剂的控制。应全面管理与AOC组件制造过程相关的潜在杂质和病毒污染风险。应在工艺开发层面进行优化，以主动实现质量控制。 AOC生产材料包括制造材料、细胞基质、耗材和容器。制造材料涵盖起始物料、生产过程中使用或添加的材料、辅料和生产耗材。制造材料的质量与最终产品的质量、安全性和有效性密切相关，应在稳健和标准化的质量管理体系内使用风险评估原则进行控制。例如，当生产具有高疏水性的AOCs时，应特别注意AOC分子与灭菌滤膜之间潜在的非特异性结合，因此需要仔细选择合适的膜。 1. 单克隆抗体 单克隆抗体通常用于AOCs，mAbs的制造工艺与传统抗体治疗药物的制造非常相似。然而，由于为定点偶联设计的基因工程mAbs的修饰基团，生产工艺可能有所不同。因此，除了常规抗体生产的风险因素外，还必须解决AOC制造特有的风险因素。例如，在采用赖氨酸介导缀合的AOCs中，应注意裸抗体上N末端赖氨酸残基的水平以及裸抗体溶液中的氨基酸组成。在采用半胱氨酸介导偶联的AOCs中，必须监测裸抗体中的半胱氨酸变体，如具有二硫键和游离硫醇基团的半胱氨酸。在裸抗体溶液的开发过程中，应防止抗体降解和聚集。此外，与后续偶联工艺的兼容性将防止在AOC生产的后期阶段（包括缀合和制剂）产生不利影响。 典型的抗体生产过程包括细胞增殖、mAb表达、mAb纯化以及mAb修饰和功能化。在细胞增殖和蛋白质表达过程中，应控制关键的细胞培养参数。亲和层析通常用于mAbs的初步纯化。低pH处理通常用于病毒灭活；但是，如果产品在低pH条件下不稳定，则可以使用替代的病毒灭活策略。中间和精制纯化通常采用离子交换层析和疏水相互作用层析。使用层析方法（包括混合填充材料的层析）从蛋白质中去除工艺相关和产品相关杂质。大多数纯化工艺还结合了纳滤以去除对化学灭活具有抵抗力的小病毒。最后，通过超滤浓缩mAbs并交换缓冲液。细胞培养和纯化后，对抗体进行修饰以引入偶联所需的官能团。修饰过程根据偶联技术而异；主要目标是在抗体上引入反应性化学基团。例如，可以使用还原剂切割二硫键并生成反应性游离硫醇基团。可以通过糖基的酶修饰引入反应性官能团。抗体修饰是决定AOCs中寡核苷酸负载能力和分布的关键步骤。因此，必须基于特定的偶联技术和修饰开发合适的制造工艺，并建立合理的中间过程控制策略。如果需要纯化修饰后的裸抗体，则应实施适当的纯化工艺。如果修饰过程中使用的试剂引入了外源性病毒污染物，则必须在纯化过程中去除这些污染物。应根据国际人用药品注册技术协调会（ICH）Q5A指南进行病毒清除研究。如果将修饰后的裸抗体作为中间体管理，则必须建立质量标准，并且必须进行稳定性研究以确定保质期。对于需要定点缀合的AOCs，mAb修饰过程中的还原和再氧化条件尤为关键。抗体修饰中的关键工艺参数包括试剂类型、接触时间、试剂浓度和温度。 2. 连接子 AOCs合成中采用两种类型的连接子。含连接子的亚磷酰胺单体和含有两个偶联基团的连接子。含连接子的亚磷酰胺单体应根据适用于治疗性寡核苷酸合成中用作起始物料的单体的控制标准进行开发和制造。含有两个偶联基团的连接子可以根据适用于常规小分子活性药物成分的标准进行开发。应为连接子制造过程中使用的中间体、关键起始物料和试剂建立质量控制标准。当原材料或中间体中的杂质与最终产品的关键质量属性相关时，必须验证在制造过程中去除此类杂质或其衍生物。如果工艺涉及过滤器的重复使用，应注意过滤器的使用寿命和清洁方法，并进行相关研究。对于含有手性中心的连接子，应评估手性对AOC产品生物活性的影响，并适当控制手性杂质。连接子的关键质量属性应通过基于其对AOC缀合工艺以及最终产品安全性和有效性的潜在影响的风险评估来确认。 3. 寡核苷酸 目前寡核苷酸活性药物成分的工业生产采用以单体为原料的固相合成。合成过程在固相支持物上启动，该支持物可能预装载有递送配体。使用固相合成设备，通过去保护、偶联、氧化/硫代和加帽，将核苷单体依次连接到寡核苷酸链的3'至5'方向。通过氨解将寡核苷酸链从固相支持物上切割下来，并去除保护基团。随后的纯化、超滤和冻干（如适用）产生单链寡核苷酸中间体。然后将所得的正义链和反义链以适当的比例退火（如适用）形成双链寡核苷酸（如适用），随后进行冻干（如适用）和包装以获得活性寡核苷酸药物成分。 寡核苷酸的生产应根据ICH Q9-Q11中概述的原则进行评估，特别关注固相合成过程中每个步骤的关键性。基于寡核苷酸制造和质量控制的平台赋能模块的可用性，应根据先前项目的经验和历史批次数据进行系统的风险评估。应基于寡核苷酸活性药物成分的质量目标产品概况，建立将关键质量属性与关键工艺参数相关联的风险管理策略，以制定适当的制造工艺质量控制策略。高级控制策略可能包括过程分析技术（离线、在线、在线）、由设备内传感器监测的工艺参数直接通知的直接控制、生产线和设施中设备操作的实时控制以及数据管理和风险预测。 4. 含连接子的寡核苷酸 AOCs的有效载荷是低细胞毒性的寡核苷酸。因此，寡核苷酸的合成和制造可以在具有标准防护设备的常规生产设施中进行。通常不需要使用通风柜动力空气净化呼吸器、高活性材料隔离策略和环境卫生监测程序。连接子通常通过使用相容的连接子和亚磷酰胺单体进行一步固相合成掺入寡核苷酸中。如果所需连接子的化学性质与固相合成条件不兼容，则使用固相和液相合成以两步法制备具有特定连接子的寡核苷酸。 5. AOC散装溶液制备 使用各种技术平台进行偶联反应，通过快速化学或酶促反应将寡核苷酸精确附着到修饰裸抗体上的反应位点。在此过程中，必须考虑裸抗体、连接子和有效载荷物理化学性质的差异，并严格优化关键工艺参数。有机溶剂的类型、小分子进料比例、pH、温度和裸抗体浓度直接影响反应效率，必须精细控制以最小化聚集和非特异性结合的形成。 鉴于AOCs的高度异质性，工艺开发应关注以下方面：（1）如果涉及还原，则选择抗体二硫键还原位点并控制还原程度；（2）偶联位点的特异性以及对缀合寡核苷酸的精确控制；（3）有效载荷分布的均匀性；（4）监测偶联过程中的杂质。对于定点缀合，必须基于潜在机制评估脱靶缀合的风险和副反应的发生率。对于酶促偶联，应验证与酶相关的安全风险，特别是散装溶液中的残留水平。 扩大生产时需要特别注意两个风险类别。首先，原材料投入过多可能导致副产物积累，需要进行风险评估，并结合下游纯化能力进行工艺优化。其次，必须通过逐步参数优化和过程监控来防止多步缀合反应中原材料比例不平衡或反应效率不足，例如偶联未负载连接子的抗体比例增加、次优OAR或残留有效载荷过多。 偶联后，应从AOC反应混合物中去除工艺相关和产品相关的杂质。工艺相关杂质包括残留的修饰试剂（如还原剂）、催化剂、酶、有机溶剂和其他外源性物质。产品相关杂质包括聚集体、抗体片段、游离小分子及其衍生物、副产物和其他内源性污染物。值得注意的是，在AOC生产过程中，可以通过纯化选择性去除特定组分，以精细控制OAR和有效载荷分布。因此，纯化技术的选择应以特定的纯化目标（例如杂质清除或产品属性优化）以及对生产过程中可能出现的杂质类型和水平的全面评估为指导。应建立有针对性的纯化策略并验证去除效率，以确保最终产品符合质量标准。 6. AOC制剂 AOC剂型和配方必须根据每个AOC的复杂性和独特特性量身定制。应进行全面研究，以确定适当的剂型，防止AOCs在储存期间在溶液中降解和聚集。 -06- 五、AOC的质量控制 AOCs具有抗体药物和寡核苷酸治疗药物的属性。鉴于AOC治疗药物独特的分子结构和作用机制，在建立质量标准时应考虑整体AOC分子（散装溶液和制剂）及其关键成分（裸抗体和寡核苷酸）。此外，质量控制策略应针对具体产品，并考虑设计原理和制造工艺。与ADCs类似，AOCs表现出复杂的结构、高异质性和多种多样的产品相关和工艺相关杂质。应根据抗体和寡核苷酸的质量属性以及与缀合工艺相关的因素来确定关键质量属性。应开发适当的技术和分析方法，以全面表征结构、物理化学性质、生物活性和杂质。对AOC中间体、散装溶液和制剂的关键质量属性的研究应基于以下章节提供的先前经验。 1. 中间体 AOCs中的寡核苷酸有效载荷大于ADCs中的小分子有效载荷，导致分子大小和电荷发生显著变化。ADCs中偶联分子的特性更像抗体而非小分子。然而，AOCs中的偶联物表现出双重特性，既像带正电荷的抗体，又像带负电荷的寡核苷酸。例如，ADC散装溶液放行阶段的质量控制属性，如大小变异杂质、电荷变异杂质和糖基化变异杂质，在AOC散装溶液放行阶段控制起来要困难得多。这种复杂性也适用于寡核苷酸中的核酸杂质。寡核苷酸的产品相关杂质通常包括N-1和N+1序列变异；裸抗体的引入显著复杂化了将这些杂质与AOCs分离的过程。因此，应在中间体放行阶段单独控制偶联工艺之前产生的杂质。 裸抗体：评估用于AOCs的裸抗体中间体的质量类似于评估抗体药物；但是，应考虑与偶联工艺相关的质量属性。例如，在采用半胱氨酸介导缀合的AOCs生产中，必须仔细监测裸抗体中半胱氨酸变体（例如具有二硫键和游离硫醇基团的半胱氨酸）的水平。用于AOCs的裸抗体可能是新分子或生物类似药，应具有明确的基因来源和背景信息。裸抗体生产细胞库的表征和稳定性评估必须符合《中华人民共和国药典》和ICH Q5A。此外，培养基和添加剂不应存在传染性海绵状脑病或牛海绵状脑病的风险。总体而言，可能影响最终产品安全性和有效性的质量属性应根据产品特有的特性进行适当控制。工艺相关杂质，包括宿主细胞DNA和蛋白质，应在中间体放行阶段控制，而不是在AOC散装溶液放行阶段。 寡核苷酸和含连接子的寡核苷酸：寡核苷酸生产通常采用固相合成。ICH Q6A明确指出，其范围不包括放射性药物、发酵产品、寡核苷酸、草药或源自动物和植物的粗制品，或寡核苷酸治疗药物。但是，一些测试项目和限度仍可使用本指南作为补充参考进行开发，包括外观、鉴别、含量测定和杂质。此外，美国食品药品监督管理局和欧洲药品管理局最近发布的寡核苷酸药物草案指南也可作为参考。 除了小分子化学药物或合成肽活性药物成分的标准质量评估外，固相合成寡核苷酸药物的质量评估应纳入针对其独特制造工艺、结构特征和物理化学性质的具体测试，包括序列验证和反离子含量分析。寡核苷酸中的产品相关杂质多样且结构复杂（例如N-1、N+1、不完全去保护和P=O），需要多种正交分析方法来控制。工艺相关杂质，包括残留试剂和小分子污染物，通常在寡核苷酸制造过程中完全去除。此外，遗传毒性杂质、残留溶剂和无机杂质的控制策略应与相关ICH指南保持一致。 含连接子的寡核苷酸的质量控制取决于合成路线，可分为两种情况。如果连接子是通过固相合成过程中使用专门的亚磷酰胺单体引入的，则可以使用标准寡核苷酸质量控制策略评估含连接子的中间体寡核苷酸。但是，如果连接子是通过与寡核苷酸中间体反应引入的，则应评估寡核苷酸和连接子偶联的寡核苷酸中间体。应评估含连接子的寡核苷酸在偶联过程中引入的杂质或反应副产物。例如，用马来酰亚胺基团修饰的寡核苷酸通常会发生缓慢水解，导致产生非反应性寡核苷酸-连接子副产物。此外，应控制在寡核苷酸-连接子偶联反应中使用的溶剂等工艺相关杂质。 与ASOs和PMOs不同，siRNA作为双链寡核苷酸，需要确保siRNA在寡核苷酸连接子偶联步骤和抗体缀合物制备步骤中的稳定性。通常，siRNA连接子的制备在抗体偶联物制备之前完成。策略1涉及首先制备寡核苷酸连接子偶联物，然后与互补链杂交。策略2涉及首先制备连接子siRNA的杂交，然后将连接子与带有连接子的siRNA偶联。无论采用何种策略，都需要确保siRNA在工艺步骤中的稳定性，并避免在高温和高pH下变性。对于siRNA纯度的检测，可以使用尺寸排阻色谱法和非变性离子对反相色谱法来控制双链和残留单链的纯度。应过量使用不含连接子的互补链，因为它不会在抗体缀合物制备步骤中引入AOC储备溶液，并且在工艺步骤中更容易去除。此外，对于偶联过程中产生的寡核苷酸或寡核苷酸-连接子降解产物，例如由马来酰亚胺水解形成的非反应性连接子-寡核苷酸杂质和反应性寡核苷酸脱硫杂质，一个可用的选择是使用反相色谱法，它提供增强的分辨率、变性离子对或变性离子交换色谱法。 2. AOC散装溶液 寡核苷酸-抗体比率（OAR）：OAR定义为每个抗体分子缀合的寡核苷酸分子数。OAR决定了AOC的分子量和大小，并与AOC的物理化学性质密切相关，包括溶解度、亲和力和聚集。OAR直接影响产品的效力、安全性和药代动力学。因此，优化OAR可显著提高成本效益和制造效率。OAR必须在散装溶液制造过程中进行控制和监测，尤其是在偶联过程中。用于OAR的常见分析方法包括紫外-可见光谱法、强阴离子交换色谱法、毛细管区带电泳-质谱法、还原毛细管凝胶电泳法和尺寸排阻色谱-质谱法。ADCs的药物-抗体比率分析通常利用不同数量小分子有效载荷的疏水性差异。然而，对于AOCs，寡核苷酸的变化导致疏水性和与色谱固定相的二次相互作用差异最小。因此，使用疏水相互作用色谱法或反相液相色谱法分析AOCs的OAR具有挑战性。带负电荷的寡核苷酸通常会改变AOC分子的整体电荷。因此，可以采用能够区分电荷差异的分析方法来分析具有不同OAR的AOCs。Tian等人首次使用毛细管区带电泳-质谱法来表征和量化具有不同OAR值的AOCs。优化鞘流缓冲液和干燥气体条件显著提高了AOCs的电离和解吸效率，并通过调节背景电解质的pH实现了具有不同OAR的AOCs的分离。Cochran等人使用还原毛细管凝胶电泳分析了抗体缀合PMOs的OAR。使用还原毛细管凝胶电泳可以分离还原的轻链、缀合一个PMO的轻链、重链和缀合一个至五个PMO的重链，显著提高了OAR测定的准确性。此外，通过尺寸排阻色谱结合质谱分析AOCs中的OAR值与ADCs相比具有明显优势。ADCs中的药物分子通常分子量低于2 kDa。然而，寡核苷酸要大得多，通常超过10 kDa。因此，具有不同OAR值的AOCs之间的分子量差异非常明显。利用这一优势，Nagornov等人采用天然尺寸排阻色谱结合Orbitrap傅里叶变换质谱法分析了曲妥珠单抗-寡核苷酸偶联物的完整分子和亚基的OAR分布，并计算了平均OAR。将FTMS Booster X2数据采集系统与Q Exactive HF Orbitrap仪器用于傅里叶变换质谱，实现了简化的数据采集和处理。因此，在OAR分析之前不再需要纯化和去糖基化步骤，简化了药物开发流程。值得注意的是，基于质谱的方法往往会低估OAR，因为寡核苷酸的负电荷会显著降低正离子模式下高OAR分子的信号。因此，应使用正交技术（如强阴离子交换高效液相色谱法）补充基于质谱的OAR测定。 偶联位点分布和未偶联mAbs：AOCs的异质性反映在偶联寡核苷酸数量的变化和偶联的特定位点上，这会影响其效力和安全性。当前的AOC偶联策略，不包括离子相互作用和竞争性亲和力（例如生物素标记的寡核苷酸与抗体上亲和素之间的强相互作用），通常涉及通过赖氨酸或半胱氨酸残基进行化学偶联，从而导致产品异质性。应采用适当的分析方法，包括离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、毛细管电泳法和质谱法，来表征具有不同OAR的AOCs上的寡核苷酸分布。蛋白质工程和酶方法已成功应用于生产具有改善均一性和定点AOCs，这可能会减少缀合位点异质性带来的挑战。 以ADCs为例，液相色谱-质谱法是分析缀合位点的行业标准，因其高灵敏度、高分辨率和位点特异性分析。然而，使用这种方法分析AOCs中的偶联位点具有挑战性。寡核苷酸相对较大的分子量和负电荷会显著改变抗体的电荷，并可能主导AOC的净电荷。这些差异影响了检测模式（正离子或负离子模式）的选择，并增加了串联质谱中离子碎裂的难度，阻碍了偶联位点的准确识别。为了应对这些挑战，应引入样品制备步骤，去除寡核苷酸部分，以提高偶联水平的定量准确性和离子碎裂质量。去除寡核苷酸部分的常用方法包括酶消化（例如使用核酸酶P1或磷酸二酯酶I）将寡核苷酸消化成短核苷酸序列甚至单个核苷酸。酶消化对天然寡核苷酸和化学修饰的寡核苷酸都有效。该策略已成功应用于ADCs中偶联位点的识别和定量，显著提高了缀合位点的识别率和缀合水平的定量准确性。 对于非偶联抗体，使用强阴离子交换色谱法或尺寸排阻色谱法进行质量控制。在强阴离子交换中，通过带负电荷的分析物与固定相中带正电荷的季铵基团之间的静电相互作用实现保留。保留强度由目标分子上的负电荷决定。典型的洗脱顺序如下：非偶联抗体、具有不同OAR的AOCs（较高OAR洗脱较晚）和游离寡核苷酸。大多数非偶联抗体不携带负电荷。因此，它们倾向于不保留地流过，与其他组分（如AOCs）分离。然而，确保反应溶液和储存缓冲液在检测波长处没有特征吸收至关重要，因为这可能导致高估。值得注意的是，强阴离子交换色谱法不适用于中性电荷的寡核苷酸有效载荷（如PMOs）；因此，应采用替代分析方法来分析这些有效载荷。基于尺寸排阻色谱的分离机制，洗脱顺序通常如下：具有不同OAR的AOCs（较高OAR洗脱较早）、非偶联抗体和游离寡核苷酸。尺寸排阻色谱法也可用于检测分子量与其他组分显著不同的非偶联抗体。偶联位点分布和非偶联mAbs的分析可以与OAR相关联，以提高产品质量控制的全面性。 生物活性：生物活性是产品质量和效力的关键指标。对于AOCs，应建立生物活性测定以反映体内药效学机制。这些测定是评估产品功能活性的基础。AOCs中的抗体与靶抗原结合，随后AOC-受体复合物内在化形成内体。连接子的裂解促进寡核苷酸从内体释放到细胞质中，在那里发挥其生物效应。应采用适当的分析方法，包括表面等离子体共振和酶联免疫吸附测定，来评估AOC与靶抗原的结合。应开发使用表达靶抗原的细胞系的基于细胞的测定来分析生物活性。可以根据评估靶细胞中小核酸药物效力的方法来评估AOC治疗药物的体外效力。应评估靶mRNAs、蛋白质、细胞表型和功能干扰。在选择生物活性测定时，应优先考虑变异性低、操作简单、可有效评估和质量控制的测定。 游离寡核苷酸：未与抗体偶联的寡核苷酸以多种形式存在，包括游离寡核苷酸和寡核苷酸-连接子复合物。游离寡核苷酸的毒性源于由于碱基互补配对而产生的杂交依赖性毒性；与杂交无关的毒性与其化学修饰、物理化学性质和递送载体有关。这些毒性可能导致血小板减少症、凝血抑制以及高暴露水平器官的毒性作用。可以通过基于其毒性和清除率建立适当的限度来控制游离寡核苷酸。此外，在稳定性研究期间，应注意有效载荷脱落的风险，这可以通过使用强阴离子交换色谱法和尺寸排阻色谱法监测AOC产品中游离寡核苷酸的水平来评估。 其他关键质量属性： AOC和蛋白质浓度：应采用适当的物理、化学或免疫学方法来量化AOC产品。当使用分光光度法进行浓度测量时，必须考虑寡核苷酸在测量波长处对吸光度的潜在贡献。寡核苷酸在260 nm处表现出最大吸收，在计算AOC散装溶液或制剂的浓度时通常需要适当的校正因子。Cochran等人使用280 nm处的吸光度和药物-抗体比率1和2的消光系数确定了AOC浓度。蛋白质浓度也可以使用BCA测定等方法测量。评估裸抗体中间体、散装溶液和制剂的蛋白质含量，以确保产品稳定性和效率。 产品相关杂质：AOC散装溶液中的产品相关杂质包括由物理化学异质性产生的分子变异。应分离、识别和分析目标产物的分子变异。常见的产品相关杂质包括电荷变异、分子大小变异和降解产物。例如，在使用马来酰亚胺试剂修饰抗体期间，可能通过与邻近赖氨酸残基的反应形成非特异性分子内交联副产物。表现出与目标产品等效活性的变异包括产品相关物质。 对于在散装溶液生产或储存过程中由AOC降解产生的裸抗体或寡核苷酸杂质，应利用适当的预处理策略来最小化或消除分析此类杂质相关的挑战。例如，可以对AOC进行蛋白水解消化以分析siRNA或ASO，并应用寡核苷酸的磷酸二酯酶消化来分析抗体。这些策略涉及可能对产品质量分析构成风险的样品预处理步骤。因此，必须系统评估预处理对产品的影响，以避免将预处理引入的杂质误判为产品相关杂质或高估其水平。 工艺相关杂质：工艺相关杂质是在制造过程中引入的，包括由抗体和连接子缀合的寡核苷酸之间反应产生的杂质。这些杂质包括酶、有机试剂和元素杂质。应对这些杂质的残留水平进行彻底的安全风险评估，并应将具有潜在安全风险的残留杂质纳入质量控制标准。 3. 成品AOC产品 对于成品AOC产品的质量控制，应遵循药典标准，同时考虑具体产品类型和剂型。控制参数通常包括外观、pH、渗透压、可见异物、不溶性微粒、灌装体积和辅料含量。对于冻干形式，应控制复溶时间和水分含量。值得注意的是，化学修饰的寡核苷酸在储存过程中可能产生内源性可见颗粒。此外，抗体和寡核苷酸可以形成非共价复合物作为副产物，可能会沉淀。这些风险应在AOC制剂开发过程中仔细考虑，并实施主动监测策略。此外，应评估源自起始物料、散装溶液、中间体以及与产品接触的材料或设备的可提取物的风险。检测到的可提取物应根据ICH Q3E进行安全评估，以防止对产品安全产生任何不利影响。 -07- 六、AOC面临的当前挑战 AOCs结合了抗体的靶向能力和siRNAs和ASOs等寡核苷酸的治疗功能。抗体识别特定的细胞表面抗原，并将寡核苷酸有效载荷精确递送至靶细胞，例如肿瘤细胞或病变组织中的细胞。理论上，这种设计可以增强治疗效力，同时降低全身毒性；然而，在实际应用中仍然存在许多挑战。 1. 免疫原性 免疫原性是指药物引发免疫反应的潜力。AOCs中的抗体和寡核苷酸都可能被免疫系统识别为外来物质。对于非人源化或不完全人源化的抗体，这种风险尤其明显；这些抗体的效力可能会被中和或清除治疗药物的抗药物抗体降低。由此产生的免疫复合物可能被免疫细胞摄取并沉积在特定器官中，存在脱靶毒性的风险。免疫原性的评估高度依赖于分析方法的灵敏度和特异性，并可能受到测量方法学、样品处理、样品收集时间、伴随用药和基础疾病的影响。AOCs的免疫原性通过评估总抗药物抗体和中和抗体来评估。 抗体对于精确靶向至关重要。与mAbs类似，AOCs中使用的抗体存在免疫原性风险。抗体的异质性，例如鼠源或嵌合抗体的异质性，可能诱导加速药物清除或中和治疗作用的抗药物抗体的形成。全长抗体的Fc区可以通过与Fcγ受体相互作用激活免疫系统。因此，用Fab或scFv片段替代全长抗体可以防止Fc介导的免疫反应。例如，DYNE-101采用靶向TfR1的Fab片段，显著降低了免疫原性风险。尽管人源化或完全人源化抗体降低了免疫原性风险，但一些患者仍可能产生抗药物抗体。免疫原性的风险还受到患者特定因素、药物结构和给药方案的影响。此外，增加给药频率和剂量水平可能会增加免疫原性风险。 寡核苷酸可能通过模式识别受体（如Toll样受体（TLRs））激活先天免疫系统，从而诱导炎症反应。未修饰的siRNAs或ASOs可以通过激活TLR3/7/8/9或RIG-I样受体触发先天免疫反应（例如细胞因子释放综合征），导致高免疫原性和与TLR激活相关的风险升高。随着生物技术的快速进步，寡核苷酸修饰变得越来越多样化，可能降低免疫原性风险。硫代磷酸酯修饰减少了TLR9激活，但可能通过NLRP3途径诱导炎症。此外，2'-O-甲基和2'-氟修饰抑制TLR7/8识别并降低IFN-α水平。CpG寡核苷酸激活TLR9并引发全身炎症。TAC-001通过CpG寡核苷酸激活TLR9用于肿瘤免疫治疗；然而，必须仔细平衡免疫激活和过度炎症反应的风险以用于临床应用。 连接子的选择在调节免疫原性方面也起着至关重要的作用。可裂解连接子（如二硫键）在体循环中过早裂解可能导致寡核苷酸的非靶向释放，从而增强免疫原性。不可裂解连接子（如MCC和Bis-Mal）可以减少循环中寡核苷酸的非靶向释放。例如，Avidity证明，在TfR1过表达模型中，不可裂解连接子不会损害效力，并且可能降低免疫原性。 没有标准化的策略来减轻免疫原性。因此，降低每个组分的免疫原性潜力至关重要。潜在的方法包括使用完全人源化抗体、改进临床给药方案、优化寡核苷酸修饰以及掺入免疫抑制元件。所有这些方法都需要在效力和安全性之间取得平衡。 2. 治疗窗口 治疗窗口定义为最小有效浓度和最小毒性浓度之间的剂量范围。AOCs通过抗体靶向将寡核苷酸特异性递送至靶细胞，释放的寡核苷酸通过RNAi或反义沉默调节基因表达。AOCs显著增强了寡核苷酸在靶组织中的积累，以选择性地干预疾病相关通路。AOCs的目标是通过提高效力同时最小化不良影响来改善治疗指数。然而，许多AOCs由于临床耐受性差而失败，因此需要全面评估和增强效力和耐受性以扩大治疗窗口。 AOC开发面临多方面的挑战，包括（1）由抗体与健康组织的交叉反应性或寡核苷酸介导的非特异性基因沉默引起的脱靶效应，以及（2）靶细胞中有效载荷释放效率低下，需要增加剂量，从而增加毒性。AOCs的治疗窗口受到脱靶效应和有效载荷释放效率的限制。因此，扩大这一窗口需要仔细考虑多种因素，包括脱靶效应对整体毒性的潜在贡献。例如，对靶细胞缺乏完全特异性的抗体可能将寡核苷酸递送至非靶组织，导致脱靶基因沉默或其他不良影响。可以通过抗体优化来解决这个问题。 具体而言，应提高抗体的特异性，并优化其对靶抗原的亲和力，以避免非特异性结合。此外，在抗体设计时应考虑表位分化。应优化抗体亲和力，因为过强的抗体-抗原结合会通过减少游离抗体的可用性来阻碍抗体渗透。除了抗体优化之外，还可以使用生物信息学工具设计高度特异性的寡核苷酸序列，并且化学修饰可以调节寡核苷酸结合亲和力，以减少与非靶RNA的相互作用，平衡亲和力与特异性。例如，应设计寡核苷酸序列以防止种子区与人类转录组中其他mRNA的完全互补。siRNAs的脱靶效应也可以通过2'-O-甲基和2'-氟修饰来减少，这些修饰可以防止RNA诱导沉默复合物与非特异性RNA结合；siRNA种子区（从5'端开始的核苷酸2至8）中的2'-O-甲基修饰可以将脱靶基因沉默减少高达80%，而锁核酸修饰增强了靶标结合特异性并降低了错配耐受性。 有效载荷（寡核苷酸）释放的效率和稳定性也至关重要。如果寡核苷酸在到达靶细胞之前释放或在细胞内释放不足，则可能需要增加剂量以达到治疗效力，从而增加毒性风险。减少不适当有效载荷释放的策略包括优化抗体特异性、开发具有改善稳定性的寡核苷酸（例如掺入锁核酸和肽核酸）以及改善细胞内释放机制（例如通过pH敏感连接子或内体溶解剂增强溶酶体逃逸，以促进有效载荷从溶酶体到细胞质的转移）。还可以通过优化连接子稳定性、缀合特异性、释放可控性和溶酶体逃逸效率来增强寡核苷酸的释放。目标是确保连接子在循环中稳定，以防止在到达靶细胞之前释放，同时在特定的细胞内环境中实现可控裂解，以确保高效的寡核苷酸释放和最佳的治疗活性。 其他考虑因素包括增强的内在化能力、良好的药代动力学/药效学以及降低的免疫原性。总的来说，这些策略旨在实现以下目标：（1）选择最佳靶点和AOC组件，以提高体循环中的稳定性，增强靶组织摄取，并最小化非特异性全身毒性；（2）平衡均匀的组织分布和高效的细胞内化；（3）增强AOC活性以确保卓越的临床效力。 3. 复杂的药代动力学 AOCs由大分子抗体和小分子寡核苷酸组成；因此，它们的药代动力学特性受到两种组分的影响。应考虑以下关键方面：（1）抗体和寡核苷酸之间药代动力学的差异影响AOCs的体内分布、代谢和清除（抗体通常具有约21天的长半衰期，而寡核苷酸在大约2小时内被快速代谢）；（2）组织分布的差异（抗体主要分布在血浆和肿瘤组织中，而寡核苷酸必须穿透细胞膜才能到达细胞质）；（3）连接子稳定性的双重要求（早期裂解可能导致全身暴露和毒性增加，例如肝毒性，但过于稳定的连接子可能会降低治疗效力）。 与具有小分子有效载荷的ADCs相比，AOCs在寡核苷酸和抗体之间表现出更多种类的偶联策略。抗体上的偶联位点（半胱氨酸、赖氨酸或糖基）显著影响AOCs在血浆中的药代动力学。例如，Avidity的研究人员证明，通过赖氨酸和糖基偶联的siRNAs与半胱氨酸偶联物相比，血浆清除率增加。赖氨酸偶联siRNA的血浆暴露减少可能归因于更大的异质性和较低的体内稳定性。考虑到药代动力学数据和半胱氨酸偶联的便利性，研究人员最终选择了半胱氨酸连接的AOCs进行进一步开发。值得注意的是，尽管许多糖基偶联的ADCs高度稳定，但糖基偶联AOCs血浆暴露略有减少的原因尚不清楚；血浆暴露减少可能是由于连接子稳定性或抗体上siRNA的位置。偶联方法也会影响细胞内的溶酶体释放，这对AOCs的药理活性至关重要。具有不同缀合策略的AOCs的药代动力学研究需要开发相应的生物分析方法。选择适当的生物测定对于AOC研究至关重要。 4. 耐药性 对AOCs的耐药性可能来自多种机制，包括抗原逃逸、溶酶体降解增强、寡核苷酸稳定性不足和适应性免疫逃逸。抗原逃逸类似于ADCs中观察到的耐药机制。肿瘤细胞可能下调靶抗原的表达或改变表位构象，从而降低AOCs的结合效率。或者，肿瘤细胞可以通过表观遗传沉默或抗原内在化（例如CD19丢失）来逃避抗体识别。溶酶体降解增强或寡核苷酸稳定性不足也会导致耐药，因为寡核苷酸必须从内体/溶酶体逃逸到细胞质中才能发挥作用。然而，溶酶体活性增加可能导致早期寡核苷酸降解和有效载荷浓度降低。重复给药可能由于免疫原性诱导抗药物抗体，加速AOC清除并降低治疗效力。 已经提出了几种策略来解决这些耐药机制。第一种策略涉及抗体工程和多靶点方法，以克服抗原逃逸和靶点下调。例如，可以开发靶向多个抗原表位的双特异性或双表位抗体，以减少由单靶点下调引起的耐药性。或者，可以优化抗体特异性（例如使用Dyne Therapeutics开发的FORCE™平台），通过特异性受体介导的内吞作用增强组织选择性。第二种策略包括改进的连接子和寡核苷酸修饰。具有改善稳定性和裂解效率的连接子确保AOCs在循环中稳定，但在靶细胞内释放寡核苷酸。寡核苷酸的化学修饰可以增强其稳定性、亲和力和细胞渗透性，同时减轻脱靶效应并减少耐药性的发展。例如，寡核苷酸骨架中的硫代磷酸酯修饰增加了对核酸酶降解的抵抗力。 克服AOC治疗药物耐药性的策略包括开发多特异性抗体以靶向多种抗原，将具有不同作用机制的寡核苷酸组合，以及采用间歇给药方案以最小化免疫原性并延迟耐药性的发展。 -08- 七、AOC的未来展望 基于ADCs在推进靶向治疗方面的成功，AOCs已迅速成为下一代生物治疗平台，以其调节基因表达的独特能力而著称。全球范围内，六种AOC候选药物已进入关键的临床阶段，包括Avidity Biosciences用于强直性肌营养不良的AOC 1001。临床试验中的AOCs主要针对遗传性疾病，特别是肌肉相关疾病。 未来，预计将在多个维度进行优化和创新，包括： （1）增强的靶向策略，例如双特异性抗体和多表位设计，以显著提高组织特异性； （2）智能递送系统，例如血脑屏障穿透性AOCs（例如Denali Therapeutics开发的抗TfR抗体-siRNA）用于治疗中枢神经系统疾病，或靶向心脏组织（例如Avidity的新AOC管线）用于治疗心脏病； （3）标准化生产方法，结合人工智能驱动的连续流制造和模块化缀合平台（例如Dyne Therapeutics的FORCE™），以加速开发时间表并降低成本； （4）技术优化（连接子稳定性和免疫原性控制的改进）和临床验证。 AOCs在精准医学中的独特优势为下一代治疗药物铺平了道路。随着临床数据的积累和监管框架的成熟，AOCs有望成为继ADCs之后的核心技术平台，并有可能从根本上重塑肿瘤学和慢性病的治疗格局。 参考文献： Advances in the pharmaceutical development of antibody-oligonucleotide conjugates.  Eur J Pharm Sci. 2025 Dec 1:215:107292.