Patisiran sodium

随着寡核苷酸药物（ONTs）在心血管代谢疾病等慢性疾病治疗领域的研发逐步推进至关键性临床试验阶段，大量候选药物需要根据 ICH S1 评估致癌性试验的必要性。对于需要进行致癌性试验的 ONTs，其致癌性试验面临特有的科学与监管挑战：试验时机：应在临床开发的哪个阶段提前规划，以匹配 NDA 申报计划？沟通交流：如何准备一套有效的致癌性试验 SPA 沟通交流？替代分子：对于在啮齿类动物中没有药理学活性的，是否需要开展替代分子的致癌性试验？剂量设计：仅参考暴露量的“25 倍”确定高剂量足够吗？统计分析：基于 ONTs 的独特作用机制，统计分析方法是否需进行调整或补充？提交时限：致癌性试验报告是否必须在 NDA 申请前完成并提交？全文共：12466 字 17 图预计阅读时长：30 分钟近年来，ONTs 成为继小分子化学药和抗体等生物药之后现代制药的第三次浪潮。随着研发管线的快速推进及长期用药需求的增加，ONTs 的安全性，尤其是致癌性风险，已成为行业与监管机构共同关注的核心科学问题。相较于传统小分子药物，ONTs 的分子特性、作用机制及体内作用路径具有显著特殊性，使其致癌性风险评估面临独特挑战。当前，全球范围内尚无专门针对 ONTs 致癌性试验的指导原则，业界在试验策略、相关种属确定、免疫原性潜在干扰及非传统毒性机制（如免疫调节、脱靶效应、组织蓄积与慢性炎症）的致癌潜能评估等方面，尚缺乏统一共识与成熟经验，亟需通过更多案例积累与系统研究加以明确。围绕前文所述的困扰众多 ONTs 药物研发企业的核心问题与挑战，本文将结合国内外监管指南、已上市代表性产品的致癌性评价路径及审评考量、基于致癌性试验和 ONTs 药物的评价逻辑，系统梳理当前的科学认知与监管要求，旨在为 ONTs 非临床致癌性试验的设计，以及开展策略的制定提供务实参考。声明本文仅为行业科普及学术研究用途，不构成对任何药品、医疗器械或相关产品的推广、推荐或商业宣传。文中提及内容均基于公开资料，不涉及具体产品功效暗示或商业利益关联；若与特定品牌或产品名称有所提及，均为事实描述，不代表任何商业导向。请读者勿将相关信息作为医疗建议或购买依据，任何诊疗或用药请遵从专业医师意见。本文内所引用的第三方图表、数据及产品信息，其知识产权归属于相关权利人，本文引用仅为学术研究及说明之目的，特此说明并致谢。★ 文章导览 ★01致癌性试验的监管要求 —— 理解 ONTs 致癌性试验的必要性和一般要求1.致癌性试验概述及相关指导原则2.ONTs 开展致癌性试验的必要性和一般要求02已上市 ONTs 致癌性评价概况 —— 学习上市药物的致癌性试验实施经验1.致癌性试验开展情况2.致癌性试验的开展时机03从 Fitusiran 致癌性试验了解试验设计细节 —— 剂量选择逻辑和关键数据1.SD 大鼠 2 年致癌性试验2.CB6F1-TgN (RasH2) 转基因小鼠致癌试验3.Fitusiran 致癌性试验给予的启示04从 Avacincaptad pegol 经验看如何运用 WoE 证据进行致癌性评估 —— 基于 WoE 的豁免案例05未来方向 —— 从“常规范式”到“科学化、个体化的整合性评估”06结语01致癌性试验的监管要求理解 ONTs 致癌性试验的必要性和一般要求致癌性试验概述及相关指导原则致癌性试验的目的在于系统评估化学物质、生物制剂或物理因素长期或终生暴露下，诱发实验动物肿瘤发生的能力与潜在风险，进而评估其对人体的相关风险。主要检测指标包括实验动物在受试物长期作用下，良性和恶性肿瘤的发生率、类型、发生部位、发生时间（潜伏期）以及肿瘤的多发性；检测范围通常涵盖药物对整体生存率、体重变化、摄食饮水消耗、血液学与血清生化指标、器官重量以及各组织器官病理学改变（尤其是肿瘤性病变）的综合性影响。在开展致癌试验时，可参照下表中致癌性相关指导原则进行。表 1. 致癌性试验相关指导原则在遵循表 1 所列指导原则的基础上，还需同步参考 ICH M3（关于体内致癌性研究的提交时机）与 ICH S6 等指南中针对致癌性试验的相关建议。2. ONTs 开展致癌性试验的必要性和一般要求ONTs 兼具生物制品与化学药物的双重属性，其非临床研究内涵与传统化学药有所不同。这类药物常通过化学修饰提高稳定性与疗效，但同时也可能引发独特的脱靶毒性及潜在的致癌风险。鉴于多数 ONTs 需长期甚至终身给药（例如用于治疗遗传性疾病或慢性疾病），现有长期安全性数据尚不充分，因此除非用于晚期肿瘤等预期寿命较短的适应症，致癌性试验通常具有开展的必要性[1]-[3]。表 2. 监管机构对于 ONTs 开展致癌性试验的要求ONTs 具有高特异性和低系统暴露的特点[4]-[6]，虽然其直接的遗传毒性风险较低，但其独特的药代动力学特征（组织蓄积、长期滞留）和机制相关的间接风险（免疫刺激、脱靶效应），使得通过标准化致癌性研究评估其致癌风险成为必要，以保障长期用药安全并满足监管要求。评估 ONTs 致癌风险时，应考虑其药理学效应，如在 2 个种属中开展致癌试验，应在至少 1 个种属中考察药理学效应相关的致癌风险。当临床分子在啮齿类动物中无药理活性时，可以使用在某种属中具有药理活性的替代分子来评估致癌风险[7]。当存在以下的几种情况时，采用替代分子评估药理学相关致癌风险不是必须的：◆ 作用机理明确且有致癌风险；◆ 替代分子在野生型大鼠中的作用不能反映人体中预期的药理学作用；◆ 啮齿类动物中不存在对应的靶点。此时，在啮齿类中需要开展 1 项两年致癌试验评估临床分子非杂交依赖的脱靶效应[7]。基于以下考虑，选择替代分子时仍需慎重：1）寡核苷酸微小的序列和模式差异可能导致毒性的巨大改变；2）啮齿类动物具有种属特异性毒性，与人体相关性有限；3）可能需要额外的 CMC 研究[2]。总体而言，当前行业内逐渐形成共识，通常应结合 ONTs 独特的分子特征，评估其开展致癌性试验的必要性，如需开展，相应的致癌性试验策略需建立在科学性原则基础上。02已上市 ONTs 致癌性评价概况学习上市药物的致癌性试验实施经验1.  致癌性试验开展情况截至 2025 年 12 月底，已有 21 种 ONTs（不含撤市药物）在全球范围内上市[4][8][9]。表 3 对已上市 ONTs 致癌性试验的开展情况，包括动物种属、是否使用替代分子、是否在 NDA 之前完成等进行了汇总。表 3. 已上市 ONTs 致癌性试验完成情况汇总（不包括撤市药物）注：未单独标注供试品的，均采用临床分子。从表 3 可以看出，已上市 ONTs 致癌性试验一般选择大鼠开展为期 2 年的致癌性试验，另外开展 1 项转基因小鼠 26 周致癌性试验或小鼠 2 年致癌性试验。对于属于已充分表征致癌性风险类别的 ONTs 类，进行单一种属的两年致癌性研究也是可行的[7]。图 1. 全球已上市 ONTs 致癌性试验开展比例致癌性试验的开展时机从图 1 可以看出，已上市的 ONTs 中，8 款（占比 38%）在上市前完成了致癌性试验；12 款（占比 57%）则是在 NDA 后按要求开展致癌性试验，1 款获得豁免。为何有的可在上市后开展？有的在上市前完成？有的可豁免开展？这一差异主要是由于近年来，致癌性试验的策略发生了从“固定范式”向“个性化策略+WoE 分析”的转变。ICH S1A 建议，对于“临床连续用药 6 个月以上”的药物，原则上需提交致癌性试验。然而，对于治疗慢性病的 ONTs（需长期给药），在实操过程中对于致癌性的开展时机，申请人采取了灵活策略：如果药物的目标适应症是严重或危及生命的疾病，且现有治疗手段有限，即使需要长期用药，也可在上市后完成该项试验。在上述上市后开展致癌试验的药物中，部分产品获得了孤儿药、突破性疗法或快速通道资格。这些资格可能在一定程度上支持了申请人加速审批途径，将确证性长期安全性数据（包括致癌性）作为上市后要求（Postmarketing Requirement, PMR）。这种做法确保了患者能尽快用上“救命药”，同时还能通过法规手段补全长期安全性数据。为何部分药物在上市前完成了完整的致癌性研究？就这一类药物的适应症来看，针对的是非致命性或已有成熟疗法的慢性病。在这种情况下，不开展完整的致癌性试验或许是“风险大于获益”的，因此，这部分产品往往在上市前即完成致癌性的完整评估。同时，如果在早期发现了一些特定风险信号，同样也会在上市前完成致癌性评价。例如，Inotersen 在肝脏和肾脏组织中暴露较高，在 NDA 阶段即完成了转基因小鼠致癌性试验。对于 Patisiran 来讲，由于在雄性动物中可见细支气管肺泡腺瘤，在 NDA 阶段开展了转基因小鼠致癌性试验，原则上大鼠 2 年致癌性试验也应在 NDA 申请前完成，但是由于抗药抗体（针对 LNP）的形成导致药物暴露减少，故豁免了 2 年大鼠致癌性试验。除此之外，2022 年 ICH S1B(R1) 指导原则的增补修订，标志着致癌性试验监管思维的革新。它不再要求所有药物都“一刀切”地进行 2 年的大鼠致癌试验，而是鼓励通过 WoE 进行综合评估。如果从药物靶点、信号通路、毒理学研究等综合分析，认为药物致癌风险很低，或者明确有致癌风险，则 2 年大鼠致癌性试验开展的意义并不大。WoE 分析维度如下图所示，包括靶点生物学作用、次要药效学、重复给药毒性研究结果、对激素的影响、遗传毒性和免疫调节作用等。图 2. 致癌性评估策略的关键步骤和选择（图片来源：S1B(R1) TESTING FOR CARCINOGENICITY OF PHARMACEUTICALS）总体而言，ONTs 致癌性试验的开展时机并非统一标准，而是基于现有数据是否提示风险信号、以及临床获益-风险评估的结果进行差异化决策。基于上述考量，接下来我们首先来详细解读最新上市的Fitusiran的致癌性试验设计、剂量选择逻辑与关键数据；随后，再以此为契机，探讨另一款上市 ONTs Avacincaptad Pegol 的致癌性试验豁免策略，以呈现不同科学背景下的监管考量。03从 Fitusiran 致癌性试验了解试验设计细节剂量选择逻辑和关键数据Fitusiran 是 FDA 于 2025 年批准的第 7 款 siRNA 药物，用于 12 岁及以上成人和青少年 A 型或 B 型血友病患者的常规预防，以减少或预防出血事件的发生，无论患者是否伴有凝血因子 VIII 或 IX 抑制物。临床使用剂量及给药频率：由于抗凝血酶（AT）活性过高可能增加出血风险，过低则可能导致血栓，启动 Fitusiran 治疗前，须检测患者基础 AT 活性，仅当活性大于 60% 时，才能进行给药 —— 起始剂量为 50 mg，每 2 个月皮下注射一次。治疗期间需根据 AT 活性进行剂量和/或给药间隔调整；对应的暴露量：MRHD 50 mg 下对应的 AUC 为 1290 ng·h/mL。关于该产品上市历程的详细复盘请见往期文章他山之石-7丨siRNA 药物 Fitusiran 上市历程及临床开发路径总结。Fitusiran 在小鼠、大鼠、恒河猴和犬中均具有药理活性，因为抗凝血酶 mRNA（来源于 SERPINC1 基因）的序列在各物种中高度保守。因此一般毒理和特殊毒理试验中动物种属的选择自由度较大，也无需为考察在靶毒性而制备替代分子。Fitusiran 啮齿类动物一般毒理以及遗传毒理试验结果汇总见表 4[10]，该结果为致癌性试验的剂量设计提供参考。Fitusiran 的啮齿类重复给药毒性试验中未见增生性或前肿瘤性病变，遗传毒理试验为阴性结果。但考虑到 Fitusiran 终生给药，故于 IND 获批后开展了 SD 大鼠和 CB6F1-TgN (RasH2)转基因小鼠致癌性试验。表 4. Fitusiran 啮齿类动物一般毒和遗传毒试验结果汇总SD 大鼠 2 年致癌性试验1.1 方案设计☆ 种属和周龄SD 大鼠，给药开始时 8 周龄。☆ 剂量设计依据大鼠致癌性试验的给药剂量为：雄性：0（0.9%氯化钠注射液），0.03、0.1 和 0.3 mg/kg；雌性：0（0.9% 氯化钠注射液），0.1、0.3 和 1 mg/kg。剂量选择依据：本试验的高剂量选择遵循了 ICH S1C(R2)指导原则的核心要求，综合考量了最大耐受剂量（MTD） 与药效学效应两大原则。1）高剂量的确定（基于毒性终点与药理学放大效应）：雄性大鼠高剂量设为 0.3 mg/kg，雌性大鼠设为 1 mg/kg。该设定依据来自前期开展的慢性毒性试验：当雄性大鼠给药剂量升至 1 mg/kg、雌性大鼠升至 3 mg/kg时，观察到了因药理学作用过度放大而引发的严重不良反应，具体表现为出血性血栓相关事件，并直接导致了受试动物死亡。因此，本研究选择上述未见因药效过强直接致死的剂量作为高剂量。2）中、低剂量的确定（基于暴露量）：中、低剂量组的设置主要依据药物在大鼠体内的系统暴露量（AUC）。通过选取覆盖不同倍数暴露水平的剂量，旨在探索剂量-暴露-效应关系，确保能够充分评估 Fitusiran 在从低到高暴露范围内的潜在的致癌性。☆ 给药周期溶媒对照组和供试品组皮下注射连续给药 104 周，每周给药 1 次（共计 104 次）。具体剂量和动物数见表 5。☆ 观察指标死亡/濒死、临床观察、体重、摄食量、大体观察、组织病理学检查☆ 分析参数生存率、肿瘤发生率。表 5. SD 大鼠致癌性试验剂量与组别设计注：供试品配制采用的是 0.9% 的氯化钠注射液。给药体积为 2 mL/kg。1.2 结果分析1）死亡率溶媒对照组与 Fitusiran 各剂量组均可见雌雄动物死亡，但与对照组相比，Fitusiran各剂量组死亡率均未见统计学差异及剂量反应关系。1 例中剂量组雄性动物和 1 例高剂量组雌性动物可见与 Fitusiran 相关的死亡（因血栓导致的大脑坏死，该效应与药理作用相关）。表 6. SD 大鼠致癌性试验死亡汇总2）常规指标临床观察、体重、摄食量、大体解剖均未见 Fitusiran 相关异常。3）肿瘤发现在非计划解剖和终末解剖中，在溶媒对照组及 Fitusiran 各剂量组动物观察到的肿瘤主要为雄性和雌性大鼠下丘脑垂体远端腺瘤，以及雌性大鼠乳腺肿瘤。上述肿瘤发现为此年龄段的 SD 大鼠常见的自发性肿瘤类型，其发生率与背景数据一致；且对照组与供试品组间的肿瘤发生率相近，故认为上述肿瘤发现与 Fitusiran 无关。综上，Fitusiran 每周皮下注射给药，在雄性大鼠≤ 0.3 mg/kg、雌性大鼠≤ 1 mg/kg 剂量下未表现出致癌性。经 FDA 统计分析确认，大鼠致癌性数据中未观察到具有统计学差异的剂量-反应关系或组间差异。4）毒代动力学毒代动力学分析显示，在第 1 天（D1）和第 176 天（D176），大鼠体内的全身暴露水平（AUC）约为人类的 1-2 倍【以最大推荐人体剂量（MRHD）为基准计算】。未进行 ADA 检测，可能与此前的试验已提示的免疫原性发生率较低有关。1.3 提前终止根据存活的动物数量，所有组别的雌性大鼠（含溶媒对照组）以及雄性大鼠低剂量组在 93/94 周终止；溶媒对照组（雄性）及雄性大鼠中、高剂量组在第 98/99 周终止。表 7. 提前终止情况汇总上述提前终止符合以下标准中的 ② 和 ③：① 如果濒死/死亡有剂量相关性，当高剂量存活主试验动物数为 20 只时，停止高剂量组给药；如果低剂量存活 18 只，高剂量剩余 20 只时，继续给药，不认为是剂量相关；② 如果对照组动物单性别的存活动物数剩余 20 只时，该性别所有剂量组动物均进行终末处理；③ 当给药时间＜100 周时，如果某个剂量组单性别存活动物数剩余 15 只，则仅将该剂量组该性别动物进行终末处理；④ 当给药时间≥100 周时，如果某个剂量组单性别的存活动物数剩余至 15 只，则该性别所有组动物（包括对照组）均进行终末处理。⑤ 当试验早期阶段发现动物生存率降低或动物有明显毒性反应时，可适当降低某个/全部供试品组剂量。1.4 生存率和生存曲线图 3. Fitusiran SD 大鼠致癌性试验生存率和生存曲线（图片来源：Fitusiran Integrated Review）1.4.1 分析方法1）死亡数据合并与分析方法将死亡时间相近的动物数据合并至同一观察区间内，并统一纳入生存分析统计。本试验采用 Peto 现患率法进行死亡率分析，按固定时间间隔（0-52 周、53-78 周、79-91 周、92-104 周及终末解剖期，或类似区间）划分观察期，该方法参考自 FDA 行业指南[11]。2）生存率估计与曲线绘制使用 Kaplan-Meier 乘积极限法估计各组的生存率与平均生存时间，并绘制生存曲线。在分析中，将明确与供试品不相关的死亡数据按截尾数据处理，而明确因供试品影响致死或濒死状态下安乐死的动物数据则作为完整死亡事件纳入。3）统计比较与趋势检验按性别分别采用对数秩检验比较各组生存曲线是否存在统计学差异。若检验显示差异显著（P ≤ 0.05），则进一步采用 Peto 双侧趋势检验分析死亡率的整体剂量相关性，并比较各给药组与溶媒对照组的差异。所有统计分析均在 5% 的显著性水平下进行。1.4.2 结果雄性大鼠低、中、高剂量组、溶媒对照组分别存活至终末解剖 20 只（33%）、15 只（25%）、15 只（25%）、18 只（30%），雌性大鼠分别存活至终末解剖 20 只（33%）、27 只（45%）、21 只（35%）、26 只（43%）。未见与 Fitusiran 相关的死亡率增加，亦未见死亡率统计学上的显著变化。1.5 肿瘤发生率分析与对比为验证申请人提交的分析结论，并应毒理审评要求进行补充分析，监管机构基于申请人提供的电子数据，对生存率及肿瘤发生率进行了独立统计分析。在生存率分析中，采用 Kaplan-Meier 乘积极限法估计生存率、绘制生存曲线，并通过 Log-rank 检验比较各组差异。统计分析结果显示，监管机构的独立分析与申请人报告结论一致。肿瘤分析对比过程见表 8。表 8. 申请人与监管机构肿瘤分析及对比过程CB6F1-TgN (RasH2) 转基因小鼠致癌试验2.1 方案设计☆ 种属和周龄CB6F1-TgN (RasH2) 小鼠，给药开始时 9 周龄[12]。☆ 剂量设计依据转基因小鼠致癌性试验的给药剂量为：◆ 雄性：0（0.9% 氯化钠注射液），0.05、0.15 和 0.5 mg/kg；◆ 雌性：0（0.9% 氯化钠注射液），0.025、0.08 和 0.25 mg/kg。◆ 同时设置阳性对照组（MNU）75 mg/kg。剂量选择依据：与 2 年大鼠致癌性试验有所不同，转基因小鼠致癌性试验更关注的是动物的耐受性，即基于毒性改变来选择高剂量，而非体内特定暴露量倍数[13]-[16] ，这一思路与 ICH S1C(R2)中“需要采取灵活的方法选择剂量”的原则相呼应；同时，ICH S1B(R1)增补文件也明确，在 RasH2-Tg 小鼠模型中，ICH S1C(R2)中列出的在剂量限制性毒性或其他标准不适用时，采用血浆暴露量（AUC）比值选择高剂量尚未被全球接受。在血友病 A 型和 B 型以及野生型小鼠中，单次皮下注射 1-30 mg/kg futusiran后，可见 AT 被剂量依赖性的抑制（通过 mRNA、抗原水平和活性的下降来测量）。Fitusiran 高剂量的设计基于 28 天重复给药剂量探索试验中出现的体重下降，而低、中剂量的设置是基于适当的剂量间隔。☆ 给药周期溶媒对照组和供试品组皮下注射连续给药 26 周，每周给药 1 次（共给药 27 次），阳性对照 MNU 在 D1 腹腔注射给药1次。详见表 9。☆ 观察指标死亡/濒死、临床观察、体重、摄食量、大体观察、组织病理学检查、毒代动力学。☆ 分析参数：生存率、肿瘤发生率表 9. CB6F1-TgN (RasH2) 转基因小鼠致癌性试验剂量与组别设计注：供试品配制采用的是 0.9% 的氯化钠注射液，MNU（N-甲基-N-亚硝基脲）配制采用的是柠檬酸缓冲液（pH 4.5）。给药体积为 10 mL/kg。2.2 结果分析1）死亡率除了阳性对照组，各组雄性或雌性小鼠的死亡率在所有剂量组间均未见统计学上显著的剂量反应关系以及两两比较结果。表 10. CB6F1-TgN (RasH2) 转基因小鼠致癌性试验死亡汇总2）常规指标临床观察、体重、摄食量均未见 Fitusiran 给药相关的异常。大体观察：未见与 Fitusiran 相关的肉眼异常。对照组和 Fitusiran 各剂量组的小鼠胃中均可见凸起、结节和/或肿块，但发生率较低，与鳞状或腺体增生相关。观察结果总体上与该年龄段的 RasH2 Tg/WT 小鼠品系常见情况一致。表 11. CB6F1-TgN (RasH2) 转基因小鼠致癌性试验大体观察结果汇总a：阳性对照组（MNU），D1 单次给药。3）组织病理学肿瘤相关：肺脏细支气管肺泡癌和细支气管肺泡腺癌和脾脏血管肉瘤◆ 肺脏：可见细支气管肺泡癌和细支气管肺泡腺癌，未见剂量相关性。考虑为自发性肿瘤；◆ 脾脏：仅 Fitusiran 给药组可见血管肉瘤，且略高于机构历史对照数据，但未见剂量相关性亦未见统计学差异，为偶发性肿瘤。非肿瘤相关：胃部可见混合细胞浸润发生率增加，鳞状黏膜增生的严重程度增加。表 12. CB6F1-TgN (RasH2) 转基因小鼠致癌性试验肿瘤相关组织病理学结果汇总a：阳性对照组（MNU），D1 单次给药。4）毒代动力学：毒代动力学分析在给药后第 1 天（D1）和第 183 天（D183）进行暴露量测定，由于采血量不足，毒代动力学仅针对第 183 天的结果进行解释分析。以最大推荐人体剂量（MRHD）为基准，并将给药频率换算为双月剂量后，小鼠的系统性暴露量（AUC）低于人类（暴露倍数＜1倍）。Fitusiran 致癌性试验给予的启示监管基于其分子特性（持续降低抗凝血酶，可能带来长期代偿性细胞增生的潜在风险）与适应症（血友病长期预防治疗>6 个月）进行风险研判，且缺乏同类 ONTs 针对该靶点的长期致癌性历史数据，因此无法豁免致癌性试验。申请人于 IND 获批后分别向监管机构提交了大鼠和转基因小鼠的致癌性试验方案，并进行会议沟通。试验设计上严格遵循 ICH S1C(R2)、ICH M3 及 ICH S6 等国际指导原则，体现了 ONTs 致癌性评价应“基于分子特性灵活适配现有监管框架”的基本思路。剂量设计上以 MTD、药代动力学暴露量、药效学指标等为依据，试验结果结合 SD 大鼠与 CB6F1-TgN (RasH2) 转基因小鼠的背景肿瘤数据进行综合评估。尤为值得关注的是，监管机构基于申请人提供的电子数据开展了独立验证分析，并得出与申请人一致的未见药物相关的致癌性的结论，这不仅增强了评价结论的公信力，也提示在后续 ONTs 开发中，高质量、可追溯的原始数据以及申请人与监管方的良性互动，将是推动致癌性评价科学认知积累的关键。04从 Avacincaptad pegol 经验看如何运用 WoE 证据进行致癌性评估基于 WoE 的豁免案例我们的观点回顾随着药物安全评估对科学性和伦理要求的不断提高，国际协调会议（ICH）在 2022年修订的 S1B（R1）指南中，引入了基于 WoE 的安全性评价方法[17]。WoE 的核心是六个互相关联的因素，分别为：◆ 靶点生物学◆ 次要药理学◆ 慢性毒性试验组织病理学◆ 对激素的影响◆ 遗传毒性◆ 免疫调节作用依据 ICH S1B(R1) 及 FDA 发布的《寡核苷酸治疗药物：非临床安全性评价指南》，ONTs 的致癌性评价决策应当基于“WoE”进行。ONTs 若存在人类特异性的脱靶杂交依赖性活性，并可能带来致癌风险，则可采用 WoE 综合评估、临床监测、知情同意说明潜在风险以及合适的产品标签等策略，而非仅依赖动物实验数据。2023 年上市的 ONTs Avacincaptad pegol（玻璃体内注射，每月一次），根据指导原则，除非有明显的全身暴露或相关担忧，经眼给予的药物通常不需要进行致癌试验。申请人基于 WoE 证据申请豁免致癌性试验，并获得 FDA 认可。本文对其主要依据梳理如下：1）作用机制作为 C5 抑制剂，其作用机制不涉及核/激素受体结合、遗传物质相互作用、激素干扰或已知与人类癌症发展相关的细胞通路。2）给药途径与系统暴露  临床采用玻璃体内注射，在 SD 大鼠和食蟹猴中系统暴露量远低于静脉给药，且该途径在啮齿类动物中长期给药不可行。临床推荐剂量下引发全身性药理/致癌效应的可能性极低。3）非临床数据未发现提示肿瘤形成、转化或增生性病变风险增加的迹象；未见免疫抑制，所有毒性改变均局限于眼部。4）遗传试验所有遗传毒性试验结果均为阴性。5）临床数据迄今为止的临床试验未观察到免疫毒性或增生性病变，无致癌风险担忧。6）文献调研同类药理学靶点或结构相似的药物均未提示致癌性风险。综合以上证据，FDA 最终同意免除该药物在大鼠和小鼠中的致癌性试验要求。05未来方向从“常规范式”到“科学化、个体化的整合性评估”目前，ONTs 的致癌性评估通常仍需参照小分子药物标准思路，对于有必要开展致癌性试验的，通常建议开展两种啮齿类动物的长周期试验。虽然多数监管机构在实践中仍倾向于要求传统的致癌性试验，但随着对特定化学修饰结构安全性数据的积累，未来有望开发出更具针对性的补充方法[18]-[21]。☆ 关键建议1）早期规划：基于“证据权重”的评估框架；2）科学设计：合理选择试验种属与剂量设计；3）提前沟通：积极与监管机构沟通，提前预期并充分设计和评估潜在的致癌性风险或探讨试验豁免（WoE）的可能性；4）深化理解：持续加强药物作用机制与潜在风险的理解。☆ 常规范式基础上整合新思路1）新工具：开发寡核苷酸特异性致癌风险预测模型针对 ONTs 独特的分子结构与作用机制，开发基于机器学习/人工智能（ML/AI）的专属预测模型，整合序列特征、化学修饰、递送系统及免疫调节潜能等关键参数，为评价策略的早期设计提供科学依据。2）新技术：推动基于 NAMs 与转录组生物标志物的辅助评价工具一方面，发展人源 3D 类器官等模型，模拟药物在关键靶器官长期暴露后慢性炎症微环境的变化；另一方面，挖掘与致癌性早期事件相关的转录组生物标志物，构建基于分子标志物的辅助评价体系，实现致癌风险的早期识别。3）新平台：利用数字病理与 AI 图像识别技术，建立跨项目数据共享平台借助数字病理与 AI 图像识别技术，实现组织切片的高通量分析与微小病变的精准识别，提升检出灵敏度与判读一致性。同时，建立跨项目数据共享平台，整合历史对照数据与同类药物试验结果，为 WoE 评估提供更坚实的参考基准。06结语ONTs 的致癌性评价正经历从“常规范式”向“科学化、个体化评估”的重要转变。随着 WoE 理念的逐步应用，传统的致癌性试验策略可能不能充分满足此类新型疗法的评价需求，更需要基于药物作用机制（MoA）、分子结构特征、药代动力学及平台安全性数据积累的整合性评估框架。未来，ONTs 致癌性评价的发展方向应聚焦于以下几个方面：深入解析 ONTs 与致癌性风险相关的可能机制（如免疫调节、RNAi 脱靶、组织蓄积与慢性炎症等），为非临床评价策略的设计提供坚实的科学基础；充分利用同类药物的安全性数据，探索 3R 原则下的优化和补充评估工具，如体外细胞转化模型、类器官及生物信息学预测等，与传统长期动物试验形成互补性证据；申请人应积极与监管机构开展早期沟通，基于药物特性与研究基础，就致癌性试验的必要性、模型选择、剂量设置和给药方案等达成共识；并探索与自身项目整体开发进程、关键性临床试验和 NDA 申报进度相匹配、资源合理配置的致癌性试验研发策略。总之，ONTs 致癌性的科学评估与监管考量，本质上是在新兴疗法快速发展与传统评价体系之间寻求动态平衡的过程。坚持以科学证据为基础、以作用机制为导向、以沟通为桥梁，有助于构建既符合监管机构安全性评价要求又契合药物技术特点的评价路径，最终推动 ONTs 这一药物创新“第三次浪潮”行稳致远。参考资料：[1]PMDA, Preclinical safety assessments of mRNA-targeting oligo nucleotide therapeutics.  2020.[2]余珊珊, 治疗用单链寡核苷酸药物的非临床研究评价概述.中国新药杂志. 27(6):  2018.[3]王恒, 小核酸药物非临床特点和药理毒理评价策略. 新药述评与论坛.31(12):2022.[4]M. 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新兴基因递送平台中的工程挑战与转化机遇 「BioMedDaily」 研究概述 2026年5月6日，美国德克萨斯大学MD安德森癌症中心Betty Y. S. Kim教授团队在Nature Biomedical Engineering期刊在线发表题为“Engineering challenges and translational opportunities in emerging gene delivery platforms”的综述文章。本综述系统比较了腺相关病毒（AAV）、脂质纳米颗粒（LNP）和细胞外囊泡（EV）三类代表性基因递送平台在遗传载荷兼容性、靶向能力、胞内表达效率、免疫原性及临床转化方面的优势与局限。 文章指出，AAV具有持久转基因表达和较成熟的临床转化基础，但受限于载荷容量小、既往免疫和高剂量毒性；LNP具备可规模化生产、RNA载荷适配性强和临床安全性较好的特点，但仍面临肝脏富集、内体逃逸效率低和重复给药免疫反应等问题；EV则因低免疫原性、天然屏障穿越能力和生物相容性受到关注，但其载荷效率、批次一致性、纯化标准和GMP生产仍是主要瓶颈。文章进一步讨论了平台杂交、AI辅助设计、非水剂型、局部给药和个体化递送策略在提升组织特异性、安全性和可及性方面的潜力。 总体而言，本综述强调下一代基因治疗递送系统不应局限于单一平台竞争，而应通过标准化比较研究、疾病场景适配和工程化组合设计，实现更安全、可扩展且功能精准的体内基因递送。 导读 「BioMedDaily」 基因治疗旨在通过递送核酸来调节患者体内的细胞功能，从而治疗遗传性疾病。治疗疗效的一个关键决定因素在于能否将这些遗传载荷精准、高效且具有组织特异性地递送至目标部位，而这一挑战依赖于专门化载体的开发。尽管数十年来不断创新，生物学和生理学屏障仍持续阻碍体内基因递送，限制了基因治疗的临床转化。这些障碍推动了递送策略的重大进展，并在过去五年中促使该领域重新兴起，其标志是多种已显示临床获益的基因治疗产品获得监管批准。 在过去六十年中，基因递送系统经历了一系列技术变革。在最突出的平台中，腺相关病毒（AAVs）、脂质纳米颗粒（LNPs）和细胞外囊泡（EVs）分别代表病毒载体、合成非病毒载体和天然载体（图1）。病毒载体最早进入临床，并且仍然是基因治疗中的基础性平台。AAVs因其非整合型附加体特性而受到青睐，这种特性降低了早期病毒系统（如逆转录病毒和腺病毒）所见的插入突变和免疫原性风险。尽管如此，AAVs仍存在重要局限，包括载荷容量小、既存免疫的存在以及染色体整合风险，这些问题持续引发人们对其安全性和疗效的关注。 图1. AAVs、LNPs和EVs作为基因递送平台的概述。 这些局限促使人们更加关注非病毒载体，尤其是脂质基系统。其中，LNPs已显示出高递送效率、可调节的组成、临床规模化生产能力以及良好的安全性特征。LNPs在2019冠状病毒病（COVID-19）信使RNA疫苗成功中的关键作用凸显了其临床潜力，并加速了其在更广泛基因递送应用中的采用。与此同时，EVs作为天然分泌的脂质双层囊泡，因其内在生物相容性、低免疫原性、长循环时间以及跨越生物屏障的能力而受到越来越多关注。这些特性使EVs成为核酸治疗中具有吸引力且可与合成纳米载体互补的递送工具。 该领域目前正经历一种范式转变：从病毒系统转向非病毒系统，从合成构建体转向生物来源载体。这一演变反映出人们对更安全、更高效且可规模化的基因递送技术的需求不断增加。与此同时，基因递送领域的进展已推动其应用范围不断扩大，包括离体和体内基因转移、基因编辑治疗以及过继性细胞治疗（表1，见https://www.nature.com/articles/s41551-026-01643-5/tables/1）。AAVs产品是最早获得监管批准的基因治疗产品之一，始于2012年获批的Glybera。此后，越来越多AAVs治疗产品获得批准，例如Luxturna、Zolgensma、Hemgenix、Roctavian、Elevidys、Beqvez和Upstaza，主要用于罕见单基因疾病（图1b）。与此同时，COVID-19大流行推动了LNPs配方mRNA药物的发展，并建立在Onpattro等既往LNPs成功案例的基础之上。尽管EVs基因治疗尚未获得监管批准，但过去五年中，其临床前和临床开发工作呈指数级增长。 除罕见病和感染性疾病预防外，基因治疗平台目前也正在被探索用于更广泛的适应症，包括癌症、神经系统疾病、心血管疾病、肺部疾病、代谢性疾病和免疫性疾病，以及再生医学。值得注意的是，若干过继性细胞治疗和基因编辑治疗，例如嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）以及基于CRISPR的产品Casgevy，已经获得监管批准，但主要应用于离体工程化自体细胞的背景下。随着AAV、LNP和EV递送技术的持续进步，这些治疗模式正越来越多地被改造用于直接体内应用。 在本综述中，作者对AAVs、LNPs和EVs作为代表性基因递送平台进行了系统性比较分析。研究团队考察了它们的关键特征，包括遗传载荷兼容性、靶向精准性、细胞内表达和生物相容性，并评估这些特性如何影响其转化潜力（图1d）。作者进一步探讨了各平台特有的挑战和局限，尤其是在临床应用背景下，并评估它们在多种疾病中的作用（图1e）。研究团队特别关注过继性细胞治疗和基因组编辑治疗，因为这些载体在其中发挥着关键赋能作用。最后，本研究讨论了克服当前递送障碍的策略，并强调了下一代基因递送系统设计中的创新机遇。 正文 「BioMedDaily」 1. AAVs、LNPs和EVs的功能比较 AAVs、LNPs和EVs表现出不同的理化性质，这些性质会影响其生物学性能、工程化需求和转化潜力（框1，见原文）。AAVs能够实现持久且强效的基因表达，但受到宿主免疫反应的限制，其给药资格因载体衣壳和患者特征而异。LNPs作为合成载体，支持广泛类型核酸的包封，但其递送效率在很大程度上依赖于配方优化。EVs作为天然来源囊泡，具有低免疫原性和穿透屏障的能力，但其治疗应用受到核酸装载效率有限和生产规模化能力不足的阻碍。为了评估这些平台的临床转化潜力，有必要从几个关键维度对其进行比较：载荷兼容性、靶向性、基因表达和耐受性（表2，见原文）。 1.1 遗传载荷兼容性 高效的遗传载荷包装是实现治疗疗效和规模化生产的前提。 AAVs主要用于DNA递送，可提供长期表达，但其载荷容量限制在约4.7 kb。这使其无法容纳大型基因（例如DMD）以及碱基编辑器（约5.2 kb）或prime editors（约6.3 kb）等基因编辑工具。尽管多载体系统、最小化调控元件以及片段化共递送策略已被探索，但这些方法通常会导致滴度较低和基因组片段化。 相比之下，LNPs能够包封广泛类型的核酸，包括小干扰RNA、microRNA、环状RNA、质粒DNA、mRNA和自扩增RNA（saRNA）。经过临床优化的LNPs能够高效包封1–5 kb的载荷，其中mRNA疫苗的包封效率超过90%。更大的saRNA构建体（9–12 kb）在定制化脂质组成和配方方法的支持下，也可达到约70–90%的效率。 EVs天然携带小型非编码RNA，并在较低程度上携带编码RNA和DNA片段，具体取决于其细胞来源。为了装载治疗性核酸，研究人员已开发出多种主动和被动工程化方法。尽管小RNA的装载效率可达10–30%，但较长转录本的递送效率仍然较低。长度可达4,000个核苷酸的全长mRNA（例如TP53、I型胶原α1链、骨形态发生蛋白-2、血管内皮生长因子A、白细胞介素-12（IL-12）和干扰素-γ）通常每个囊泡只能装载约1–10个拷贝，且电穿孔法很少能达到超过30%的效率，远低于LNPs（表2）。为了利用LNPs更优越的装载能力，研究人员提出了LNP–EV杂交体。这类杂交体通过直接膜融合和脂质混合形成，通常由物理或化学干预诱导，例如冻融、超声处理、挤出、聚乙二醇（PEG）、促融合肽或病毒促融合蛋白；其配方参数（例如EV:LNP比例、pH和PEG-脂质含量）可被调节，以最大化双层膜混合，并尽量减少载荷泄漏或EV表面功能丧失。 简而言之，AAVs是小型DNA构建体的可靠载体，但并不适合大型基因和基因编辑技术。LNPs可通过配方调节，为多样化且较大的RNA载荷提供稳健的包封能力。EVs尽管具有良好的生物相容性，但在高效装载和递送较长转录本方面仍面临重大限制，因此带来了显著的转化挑战。 1.2 靶向特异性 靶向递送通过确保遗传载荷在正确时间到达正确组织来决定治疗疗效。它还会影响给药途径、安全性和免疫反应。靶向特异性受到给药后事件的影响，例如生物分子冠形成、循环清除、肝脏蓄积以及跨越生理屏障的能力（图2a）。 AAVs主要依赖其衣壳实现组织嗜性。衣壳特异性嗜性已经实现了中枢神经系统（CNS）和心脏递送，例如Zolgensma中通过AAV9介导SMN1递送治疗脊髓性肌萎缩症。除天然衣壳外，衣壳工程也可通过定向进化（例如易错PCR或DNA改组）、理性设计（例如在表面环中插入肽或蛋白，或偶联抗体、纳米抗体或设计型锚蛋白重复蛋白）以及人工智能（AI）驱动的方法（例如利用机器学习模型设计具有多重特性的衣壳并筛选测序变体）对AAVs进行重新靶向，从而获得具有定制嗜性的工程化衣壳，改善非肝脏靶向、降低免疫原性，并可能允许再次给药。 图2. AAVs、LNPs和EVs的体内命运与细胞内转运途径。 LNPs在历史上一直受到肝脏蓄积的限制。通过改变LNPs的理化性质（大小、电荷和脂质组成），研究人员已经实现了选择性器官靶向，并将递送扩展至肝外组织。替代给药途径，如吸入、鼻内、口服或玻璃体内给药，也可增强组织特异性，尽管这些方式通常需要定制化配方（例如气溶胶或水凝胶）。然而，LNPs仍容易通过调理作用和生物分子冠形成被快速清除（框2），其生物分布也会受到年龄和性别的影响。 EVs表现出内在归巢能力，这由其膜相关脂质、蛋白和聚糖驱动。它们的嗜性反映了供体细胞来源。例如，肿瘤来源EVs可靶向肿瘤，并可能刺激抗肿瘤免疫。EVs还能够比合成载体更有效地跨越血脑屏障（BBB）。然而，由于冠介导的清除，EVs同样存在非特异性摄取以及肝脏或脾脏蓄积的问题（框2）。改善靶向性的策略包括用抗吞噬分子修饰EVs、工程化亲本细胞以表达靶向配体，以及用单克隆抗体或肽进行表面修饰。一项直接比较显示，在胰腺癌模型中，双靶向EVs的跨胞转运和肿瘤蓄积水平是LNPs的2–3倍。 总体而言，在临床前研究中，EVs在靶向和与生物屏障相互作用方面显示出内在潜力。AAVs具有更成熟的重新靶向工具箱和系统性递送能力，并已有跨越屏障的临床证据。LNPs同样已经获得临床验证，并且在肝脏靶向方面最为成熟，但其屏障应用仍处于探索阶段。关于组织嗜性和基因表达效率的比较研究仍然有限（表2），这凸显了开展标准化评估的必要性，以指导不同疾病背景下的平台选择。 1.3 细胞内基因表达 高效的细胞内基因表达不仅依赖于平台本身的性质，还依赖于关键细胞过程：（1）内吞作用；（2）内体逃逸；以及（3）细胞质表达或核转运（图2b）。这些步骤在很大程度上决定了基因递送的总体效率。 AAVs通过受体介导的内吞作用进入细胞，主要经由网格蛋白包被小窝。不同衣壳与不同的表面聚糖和共受体相互作用，从而决定内化途径和转导表现。例如，AAV2结合硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，AAV5靶向唾液酸，AAV9结合半乳糖；对于大多数衣壳，包括许多工程化变体，其高效进入还依赖多衣壳AAV受体（KIAA0319L）。这些机制性认识推动了衣壳工程的发展，以提高细胞摄取效率。 LNPs也通过网格蛋白介导的内吞作用或巨胞饮作用被内化，其过程受到脂质组成和细胞类型的影响。可电离脂质（例如DLin-MC3-DMA（MC3））可增强囊泡摄取，而胆固醇和辅助脂质支持膜融合。PEG化可在循环中稳定颗粒，但如果使用过量，则可能阻碍摄取。 相比之下，EVs利用多种内吞途径，包括网格蛋白和小窝蛋白介导的途径、巨胞饮作用、吞噬作用，甚至直接融合。EVs的摄取受表面蛋白（例如四跨膜蛋白）调控，并因供体和受体细胞类型而异。尽管这种多样性增强了生物相容性，但也带来了递送变异性。 对于所有这些平台而言，内体逃逸都可能构成一个主要瓶颈。AAVs优于非病毒平台，原因在于其衣壳介导的、pH依赖性膜穿孔过程，并受到VP1磷脂酶A2结构域的辅助。LNPs的逃逸率较低（约1–2%），因为大多数LNPs会被转运至溶酶体并被降解，这促使当前研究致力于开发具有内体裂解能力的配方。在脂质化学层面，调节可电离脂质的表观pKa（约6.2–6.8）和结构（改变头基，例如叔胺；可降解连接臂，例如酯或缩酮；以及疏水尾部，例如支化或不饱和基团）可增强其在晚期内体中的质子化，并促进其与阴离子脂质之间的静电相互作用，从而驱动膜不稳定化和半融合。为缓解PEG困境（延长循环时间但阻碍内体逃逸），PEG-脂质被最小化使用，或被设计为可裂解形式以在内体中脱落；此外，模块化干预措施（例如pH响应性促融合肽、质子海绵添加剂或病毒–脂质杂交体）可在相关模型中进一步增加胞质释放，同时维持耐受性。有趣的是，LNPs也可能通过继发性EV介导途径转移mRNA。 与LNPs相比，EVs通过磷脂酰丝氨酸和四跨膜蛋白与内溶酶体膜融合，天然表现出更好的逃逸能力（约20%）。借鉴LNPs的经验，EV内体逃逸工程已经探索了pH响应性促融合肽和细胞穿透肽、病毒来源促融合蛋白的引入，以及赋予质子海绵样效应的杂交配方，以进一步增强内体释放。在匹配的肽工程条件下，EVs发生溶酶体蓄积的倾向低于LNPs（分别约为5.7%和26%），这凸显了EVs内在优势可通过工程化进一步放大，并带来更优越的胞质递送能力。 基因表达结果会因载荷和定位而异。AAVs通过importin或核孔蛋白介导的机制将DNA递送至细胞核，但其效率取决于衣壳。例如，AAV2的体外研究显示，仅约17%的细胞质颗粒能够到达细胞核。鉴定AAV核导入的分子决定因素，并相应地工程化衣壳与importin和核孔蛋白之间的相互作用，是增强转导效率的一种有前景策略。相比之下，LNPs和EVs主要在细胞质中发挥作用，依赖mRNA修饰（例如5′帽修饰、UTR调节和密码子优化）来增强表达。例如，携带mRNA的内源性EVs可介导血浆和器官中功能性人促红细胞生成素的产生，但其水平比递送匹配剂量合成mRNA的LNPs低6–8倍，这揭示了RNA工程在增强表达效力中的关键作用。 总体而言，AAVs由于具有高效核递送能力和DNA载荷，可提供最持久的基因表达。LNPs受到较差内体逃逸能力的限制，而EVs虽在逃逸方面表现突出，却面临载荷装载和一致性翻译方面的挑战。直接头对头比较仍然稀少（表2），尽管近期数据提示，在某些情境下EVs可能优于LNPs（或脂质体）。例如，吸入给药后，EV递送的mRNA在肺组织中产生的IL-12蛋白约为脂质体的2.2倍。 1.4 生物学耐受性 生物学耐受性是基因递送平台安全且有效应用的核心，会影响免疫原性、毒性和再次给药可行性。尽管自2017年以来已有多种AAVs治疗获得美国FDA批准，但其更广泛应用仍受到免疫原性、剂量相关毒性和患者特异性变量的限制。既存中和抗体存在于相当一部分人群中（例如AAV1/AAV2的血清阳性率为60–80%），会损害转导并阻碍再次给药。替代衣壳（例如人源AAV9和非人源AAV8及AAVrh74）以及更新的工程化变体（例如肽修饰AAV2P2和AAV2P4）已被筛选或设计用于降低血清阳性率并逃避常见抗体，从而提升临床可用性和安全性。系统性高剂量AAVs可触发严重免疫反应，包括T细胞介导的肝毒性和补体驱动的微血管病，偶尔会导致死亡。值得注意的是，近期多例与Elevidys（重组AAV（rAAV）rh74血清型）相关的患者死亡导致试验暂停。尽管近期声明指出，单例死亡中巨细胞病毒共感染可能是一个促成因素，但因果关系尚不确定，AAV毒性很可能是多因素造成的，包括剂量相关免疫激活和宿主特异性易感性。 鉴于这些免疫原性挑战，患者年龄是一个关键变量，因为婴儿和幼儿具有未成熟的免疫系统和较低水平的AAV中和抗体，因此较不容易产生强烈的细胞毒性反应，从而允许使用更高的载体剂量。婴儿表现出较低的免疫反应性和更好的耐受性。例如，全球已有超过800名脊髓性肌萎缩症婴儿接受基于rAAV9的Zolgensma治疗，并显示出一致的治疗获益和可接受的毒性特征。对于血清阳性患者以及其他存在免疫反应风险的患者，研究人员正在探索降低AAV免疫原性的新兴策略，包括衣壳再工程化、短暂免疫调节和递送优化。其中一种策略是使用EV相关AAVs，即在生产细胞生物发生过程中进入EVs的一部分AAV颗粒，可通过基于大小或密度的分离进行富集；EV包膜能够屏蔽衣壳表位，从而减少体液免疫识别、提高循环稳定性并增强转导效率。尤其值得注意的是EV–AAV6/9构建体，它们在免疫化条件下表现出更好的免疫逃逸能力，并使心脏转导效率提高超过两倍；与单独AAVs相比，这些构建体在心脏和肺部模型中还表现出更强的报告基因表达和更好的功能改善。 相比之下，LNPs在COVID-19大流行期间表现出良好的耐受性。尽管其免疫原性低于AAVs，但重复或高剂量LNP给药可激活先天免疫通路（例如Toll样受体（TLRs）、NOD样受体和补体），引起细胞因子释放和短暂炎症。LNPs的免疫原性可通过优化配方和定制脂质结构进行调控。PEG化脂质是一个关键设计变量；尽管它们能够延长循环时间，但也可能诱发抗PEG抗体反应，从而限制再次给药。聚（2-恶唑啉）、聚羧基甜菜碱、聚肌氨酸以及无PEG配方等替代方案正在被探索。此外，遗传载荷本身，尤其是体外转录mRNA和saRNA，也可能诱发先天免疫反应，特别是通过双链RNA（dsRNA）副产物；这些副产物在疫苗中可能可被耐受，但在再生医学或基因编辑中则可能构成问题。因此，这些缺陷已通过成熟的良好生产规范（GMP）流程得到缓解，尤其是核苷修饰和严格去除dsRNA；在适当情况下，还可通过短暂表达或共递送先天免疫调节因子来降低风险。 EVs由于其内源性来源和天然组成，具有更优越的生物相容性，通常可避免先天或适应性免疫激活。这些优势推动了EV–病毒和EV–合成杂交体的发展，以降低免疫原性。直接比较研究仍然有限，但一项研究发现，装载I型胶原α1链mRNA的EVs比基于MC3的LNPs引起更少的局部炎症。另一项研究显示，与LNPs和AAVs相比，通过EVs递送血管内皮生长因子A诱导的细胞因子释放最低，免疫激活也最小。然而，供体细胞来源、纯化方法和生物工程化步骤都可能影响EV免疫原性，这强调了随着临床应用扩展，仍需进一步开展安全性评估。 2. 临床转化方面的考量 AAVs、LNPs和EVs具有不同的生物学和理化特征，因此若要实现成功的临床转化，需要为其量身定制生物工程化、生产制造和递送策略。每个平台在规模化、靶向性、安全性和监管合规方面都面临独特挑战，因此需要根据预期治疗应用制定相应的定制化解决方案。配方和工程化策略 AAV载体的转导效率可通过遗传修饰来提高，包括衣壳工程和表达盒优化（图3a）。利用定向进化或理性设计进行衣壳工程，可以重新编程组织嗜性和免疫逃逸能力；而优化表达盒（例如密码子使用、启动子强度或多载体策略）则可用于应对载荷限制。通过改善受体结合、内体逃逸和第二链合成等步骤，还可以进一步提升效果。若干下一代衣壳（例如AAV-PHP.eB、AAV-CAP.B10/B22、AAV9.452sub.LUNG1、AAV-MYO和PAL家族衣壳）已显示出有效的嗜性重定向能力，尤其是在肝脏去靶向方面，并正在推进临床转化。然而，旨在降低先天免疫激活的方法，例如插入可避免TLR9识别的寡核苷酸或去除CpG，显示出的临床获益并不一致，并且常常增加复杂性和成本，却没有明确疗效。同样，用于递送大型基因的多载体系统与单载体方法相比仍表现较差，这是由于其转导效率较低、生产成本增加，并且存在产生异常转基因产物的风险。 图3. 工程化策略、平台杂交与给药途径。 LNPs为基因递送提供了模块化且可规模化的平台框架。LNP设计涉及定制化脂质化学（例如pKa、结构和含量）、表面修饰（例如PEG化和用于主动靶向的配体）以及核酸工程（例如假尿苷或N1-甲基假尿苷），以提高稳定性、递送特异性和内体逃逸能力（图3a）。严格的RNA纯化对于减少dsRNA污染物和免疫原性是必要的。高通量筛选结合AI驱动的脂质库和配方设计，正越来越多地用于预测和优化结构–功能关系。计算算法进一步帮助匹配新型脂质与mRNA载荷，以增强递送效率和翻译水平。LNP生产相对稳健且可规模化，但在获取GMP级脂质、维持批次间一致性以及实现高RNA包封效率方面仍存在挑战。 尽管EVs具有生物相容性和天然嗜性，但在大规模生产和高效基因装载方面仍面临持续挑战。生物工程化策略（图3a）包括外源性修饰（例如表面偶联、膜融合和杂交）以及内源性细胞工程（例如遗传操作和物理刺激）。尽管外源性方法可提供更直接的控制，但通常存在包封效率和回收率较低的问题。内源性策略更具规模化潜力，但也存在免疫激活或不需要的生物活性污染物风险。这两类方法都劳动密集、成本高昂，并且难以在GMP条件下标准化。此外，EV亚型的内在异质性使可重复性更加复杂，并仍然是主要的转化障碍，使EVs成为工程化难度最高的平台。 2.1 杂交递送系统 除平台特异性生物工程化之外，跨平台杂交策略也已出现，用于整合不同递送系统的互补优势（图3b）。病毒–非病毒杂交体，例如包裹于脂质膜中的LNP或EV相关AAVs，可降低免疫原性、提高血清稳定性、增强跨屏障效率，并实现剂量降低。同样，合成–天然杂交体（主要是EV相关LNPs）将LNPs的高载荷容量与EVs的天然嗜性和低免疫原性结合起来，从而改善组织穿透和屏障跨越能力。 尽管具有应用前景，杂交纳米颗粒平台仍面临规模化和制造方面的障碍。对于EV–AAV杂交体而言，其生物发生机制的不匹配限制了共包装效率；传统AAV生产无法有效富集EV相关AAVs，导致杂交体产率较低（例如，对于EV相关AAV1/2/5/6/8/9，其占总载体基因组的比例低于20%），并且会夹带游离AAV颗粒，因此需要额外的分级分离步骤（例如密度梯度或尺寸排阻色谱）。对于LNP–EV杂交体，关键转化障碍包括颗粒群体异质性，以及在剧烈干预下由融合诱导的载荷损失；例如，基于冻融循环的融合可促进EV聚集或破裂，从而扩大粒径分布并导致载荷泄漏。与EV–AAV类似，LNP–EV杂交体融合后的混合物中也会引入未融合组分、残留试剂或泄漏载荷，因此在GMP条件下需要额外的纯化和质量控制步骤。近期利用具有正高斯曲率的促融合立方液晶纳米颗粒（fusogenic cubosomes）的创新方法，可在10 min内实现自发融合，并在无需额外生物工程化的情况下实现接近100%的mRNA装载，这代表了杂交配方效率方面的重要进展。这些杂交体的成功转化需要在平衡两种组分优势的同时，减轻任一组分的主要弱点。 2.2 给药途径和递送设计 给药途径是治疗成功的另一个关键决定因素，必须通过定制化配方、剂量指标和递送设计与疾病适应症相匹配（图3c）。AAVs通常以水性配方进行静脉给药，临床剂量通常以单次给药中每千克体重的载体基因组总数表示。被转导组织可维持长期表达（例如Roctavian可维持凝血因子VIII水平长达5年），但AAVs会从血浆中快速清除，并且大多数衣壳在系统性注射后优先转导肝脏。局部给药途径（例如视网膜下、颅内或气管内）以及与包封材料（例如聚合物或水凝胶）联合使用，已被开发用于重定向嗜性，并通过增加靶部位暴露、同时减少系统性暴露和中和抗体接触来改善靶部位药代动力学，从而增强组织特异性并提高安全性。对于LNPs，剂量通常表示为每千克体重或每剂的核酸质量。LNPs循环时间短，并迅速被肝脏摄取（例如，约90%的静脉注射LNP剂量可在1 h内被肝脏摄取），其表达通常在数小时内达到峰值，并在数天内下降。基于这些特征，临床方案通常采用重复给药，并以数周为间隔（例如Onpattro（patisiran）每3周给药一次）。EV剂量通常以颗粒数和/或蛋白或RNA载荷表示。从药代动力学角度看，天然EVs循环时间最短（血浆半衰期为数分钟量级），并主要被肝脏和脾脏摄取；因此，研究通常采用连续给药方案，包括在某些适应症中每2–3天给药一次。 这三类平台都可以被制备为水溶液以外的形式，而非水性形式更常用于LNPs和EVs，因为与AAVs相比，它们通常产生短暂表达、稳定性较低，并且在体内清除更快，因此需要能够保存其功能并提供更持久组织暴露的配方。在实践中，冻干粉末和可吸入气溶胶可实现局部肺靶向递送；LNP–mRNA疫苗和EVs均已被工程化为可吸入载体，其中肺来源EVs与合成LNPs或脂质体相比，表现出较低的黏液黏附性、在细支气管和肺泡内更深的分布，以及增强的抗体反应。将LNPs或EVs嵌入缓释生物材料（例如胶囊、水凝胶、微球或微针）可进一步改善局部滞留和疗效，而微流控和生物打印等技术能够精细控制释放动力学和结构特性。然而，这些非水性递送形式需要谨慎配方设计，以维持囊泡完整性和生物活性。整合到生物材料中也会增加复杂性，需要对无菌性、释放动力学和功能保留进行额外验证，以确保临床成功。 2.3 跨平台GMP生产和质量保证 将基因递送系统推进至临床应用，需要在GMP标准下严格优化上游和下游工艺（图4）。这些工艺包括起始材料选择、细胞基质、可规模化生物工程化、纯化流程以及平台特异性质量控制，以确保安全性、一致性和疗效。 图4. AAVs、LNPs和EVs在生产制造与转化流程中的关键差异及特异性考量。 对于AAVs、LNPs和工程化EVs，质粒DNA或合成寡核苷酸是基础输入材料。AAV生产通常依赖生产细胞的三质粒转染或感染。尽管目前尚无通用的质粒标准，但FDA和欧洲药品管理局（EMA）均建议根据其对最终产品质量的影响，采用基于风险的GMP合规要求。对于由LNPs和工程化EVs递送的合成RNA治疗产品（主要通过外源性装载），GMP流程始于化学合成寡核苷酸，或使用DNA模板和RNA聚合酶进行体外转录，随后进行酶促加帽、化学修饰（例如假尿苷）和纯化，以增强翻译和稳定性并降低免疫原性。 生产细胞是AAV和EV平台的关键GMP材料。HEK293细胞因其高转染效率、可规模化能力和监管先例，被广泛用于AAV和EV生产。对于AAVs，还可使用HeLa、A549或Sf9昆虫细胞等其他细胞系，每种细胞系都需要完整的来源证明、双层细胞库体系和安全性检测。然而，EV平台涵盖更广泛的来源，包括间充质干细胞、诱导多能干细胞、树突状细胞，甚至植物、乳制品或细菌来源材料。这种多样性增加了生物工程化和监管复杂性，尤其是在使用原代免疫细胞或应激刺激系统时，这些系统可能释放不需要的副产物，因此需要严格控制培养条件。当前工作强调建立GMP级细胞库（例如经供体资质确认的主细胞库和工作细胞库），并进行身份或遗传稳定性检测、外源因子控制、来源适配且经过验证的培养基（例如用于人源细胞来源EVs的明确成分无异种培养基），以及采用生物反应器系统（例如中空纤维、灌流或填充床系统）来稳定关键工艺参数。 AAVs和LNPs的纯化策略更为成熟。AAV纯化采用可规模化色谱方法（亲和、离子交换或整体柱色谱），可提供超过50%的产率和超过99%的宿主杂质清除率；新兴的非色谱方法，如三相分配和阴离子交换流穿式精抛光，也提供了具有成本效益的替代方案。LNP纯化包括两个阶段：核酸纯化（通过色谱或沉淀去除dsRNA和截短转录本）以及LNP配方清理（使用尺寸排阻色谱、切向流过滤或基于PEG的方法）。新型纤维素基柱可回收超过65%的mRNA，并清除超过90%的dsRNA，从而提高saRNA疫苗效力。由于缺乏GMP标准化流程，EV纯化仍然具有挑战。现有方法（超速离心、尺寸排阻色谱、切向流过滤和免疫亲和）显示出很大的变异性（5–60%产率），常常以牺牲纯度为代价，并可能富集不需要的亚群或游离生物活性污染物。工程化EVs进一步加剧了这一问题，因为修饰过程（例如用于基因装载）可能引入更难分离和去除的外源材料。 质量保证和关键质量属性（CQAs）的识别对于一致性和监管批准至关重要（图4）。AAVs和LNPs受益于已建立的GMP流程。AAV CQAs包括衣壳化学计量、满/空颗粒比例、基因组完整性和残留宿主污染物，可通过PCR、酶联免疫吸附测定、分析型超速离心或质谱进行定量。LNP质量保证强调理化性质（例如粒径及其分布、表面电荷）、包封效率、药典检测（例如无菌、内毒素和渗透压）以及被包封核酸的稳定性和完整性，可使用动态光散射、色谱和核酸效力测定等工具。然而，批次间变异仍是共同关注点，包括AAV空/满衣壳比例的波动，或LNP脂质组成和理化性质的变化。缺乏标准化杂质清除方法和参考材料也使CQA定义更加复杂，尤其是对于个体化产品而言。 基于EV的治疗仍处于质量保证标准化的早期阶段。诸如《细胞外囊泡研究最低信息指南》（Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles）等指南强调的指标包括供体细胞活力、EV大小、表面标志物、纯度和生物活性。分析平台包括纳米颗粒追踪、纳米流式细胞术、冷冻电子显微镜，以及越来越多使用的液相色谱–质谱和单EV分析（例如全内反射荧光显微镜）。定量基因载荷并评估其生物活性仍是一项主要障碍。由于囊泡异质性、效力测定不一致以及缺乏统一载荷标准，EVs的批次变异尤其突出。生物工程化EVs由于制造过程中引入的游离核酸或副产物，使污染控制进一步复杂化。迫切需要借鉴AAV和LNP的先例，采用经过验证的GMP流程，以支持EV产品的标准化、可重复性和临床安全性。 2.4 配方稳定性和储存考量 保质期和储存是影响基因递送系统成本效益和治疗可靠性的关键因素。这些平台的长期稳定性取决于其活性药物成分的性质、配方形式、配方是水性、冷冻还是冻干状态，以及是否使用甘油、蔗糖、海藻糖、甘露醇或PEG等冷冻保护剂。三大主要载体系统在超低温条件下（低于−65 °C）均具有较高稳定性，其中AAVs和LNPs在此类条件下可保持感染性和转染效率超过12个月。相比之下，EVs在长期超低温储存过程中更容易发生聚集和功能退化。这种脆弱性归因于其天然来源以及对其来源细胞的依赖性。 对超低温储存的依赖给所有平台都带来了物流和成本相关挑战，尤其是在大规模生产和全球分发中。为解决这一问题，用于−20 °C或4 °C短期储存的配方通常会加入稳定剂和冷冻保护剂。例如，AAV载体通常包含Pluronic F-68和甘油，以减轻聚集并在反复冻融循环中保持感染性，在4 °C下可维持感染性长达两周。LNP–mRNA配方在2–8 °C储存时可维持效力长达30天，这得益于添加5%（质量/体积）蔗糖或海藻糖等稳定糖类。 与合成载体相比，EVs在常规储存条件下的稳定性面临更大挑战。储存在4 °C或−20 °C下的EVs通常会在一个月内开始降解，并常观察到粒径增大和聚集。将冻干与冷冻保护剂结合的新兴方法在提高天然EVs的货架稳定性方面显示出前景，可能将其在室温（>25 °C）下的储存时间延长至超过一个月，并减少对冷链基础设施的依赖。然而，生物工程化EVs，尤其是那些带有非共价结合表面修饰基团或敏感腔内载荷（如内源性mRNA）的EVs，仍容易受到热不稳定性的影响，尤其是在冻融循环过程中。仍需进一步研究，以确定能够在多种储存条件下保持这些复杂构建体完整性和功能的最佳配方。 2.5 监管合规和安全性考量 监管合规和安全性评估对于确保基因治疗产品符合GMP标准、接受严格患者安全性检测，并监测潜在长期风险至关重要。对于基于AAV和LNP的治疗，由于其较早进入临床试验并获得上市批准，监管预期相对明确。FDA、EMA及其他监管机构维持着相互协调的标准，涵盖材料质量、工艺验证、可追溯性和产品安全。 AAV治疗受益于广泛的全球指导原则，包括EMA的基因治疗指南以及FDA关于基因治疗化学、制造和控制（CMC）信息的要求，并且针对基因组编辑另有专门文件。这些文件概述了有关载体设计、基因组完整性、生物分布、病毒脱落、免疫原性、脱靶效应和长期安全性监测的预期。 LNP平台在mRNA疫苗紧急批准期间获得了监管推动，这加速了相关指导文件的发展，例如FDA关于病毒安全性的ICH Q5A(R2)，以及世界卫生组织和EMA关于mRNA疫苗质量与疗效的立场文件。然而，非疫苗类LNP治疗的监管框架仍在演变中，包括用于蛋白替代或基因组编辑的LNP治疗。在重复给药、肝脏以外组织靶向、辅料安全性以及通过TLR7/8等受体激活先天免疫方面，仍存在挑战。LNPs正越来越多地在纳米医学框架下进行评估，这类框架要求对脂质和核酸组分进行详细的理化特征和安全性表征。 相比之下，基于EV的基因治疗处于更加模糊的监管环境中，目前尚无获批产品，也尚未建立正式框架。分类工作主要由国际细胞外囊泡学会主导，该学会提出可将天然EVs归类为生物药物或非活性辅料，在这种情况下通常只评估安全性。然而，生物工程化EVs引入了更大的复杂性。其分类取决于修饰性质和预期功能。例如，装载外源性载荷的EVs可能被视为辅料，而膜修饰EVs或来源于基因工程细胞的EVs则可能被指定为活性生物制剂或先进治疗药物。这种监管分层仍不完善。在实践中，很难将EVs本身的治疗作用与其工程化载荷的作用区分开来，尤其是考虑到生物工程化可能改变EV生物发生过程，并产生影响功能或安全性的副产物。因此，全球监管机构和EV领域研究群体呼吁建立更加细致、基于共识的指南，以应对EV治疗所特有的挑战，尤其是那些包含工程化或具有生物活性载荷的EV治疗。 3. 平台特异性治疗部署 AAVs、LNPs和EVs不同的生物学特性决定了它们在不同疾病背景和基因治疗模式中的应用价值。每个平台在应对系统性疾病、涉及生理屏障的疾病以及免疫学复杂疾病时，都具有独特优势和局限。随着基因治疗越来越多地从离体方法转向直接体内给药，尤其是在基因组编辑和过继性细胞治疗领域，对具有更高精准性、效率和安全性的递送系统的需求持续增长。这一不断演变的格局凸显了临床实施中持续存在的转化挑战以及平台特异性考量。 3.1 系统性疾病 系统性基因递送对于治疗影响多个器官系统的血液系统疾病、代谢性疾病和原发性肌肉疾病仍然至关重要。 AAV载体目前在临床转化方面处于领先地位，已有三种获得FDA或EMA批准的治疗产品，即valoctocogene roxaparvovec（Roctavian）、etranacogene dezaparvovec（Hemgenix）和fidanacogene elaparvovec-dzkt（Beqvez），它们在血友病A和B中显示出持久的治疗性凝血因子表达，并减少出血。例如，在Hemgenix的III期HOPE-B试验中，96%的患者在维持凝血因子IX水平的同时停止了预防性治疗；Roctavian在GENEr8-1研究中显示出持续至第5年的持久疗效。这些成功推动了基于AAV的治疗在代谢性疾病（例如用于芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症的eladocagene exuparvovec）和肌肉疾病（例如用于杜氏肌营养不良症（DMD）的delandistrogene moxeparvovec）中的应用探索，目前已有多项III期试验正在进行。然而，近期AAV基DMD试验（Elevidys）中因急性肝衰竭导致的患者死亡，再次引发了人们对免疫原性和肝毒性的担忧。除当前的衣壳工程和免疫抑制策略外，临床前生物材料包封和局部化AAV方法（例如聚（β-氨基酯）包被载体以及水凝胶或微球储库）已经实现了靶向肌肉组织转导，同时扩散最小，并可保护载体免受中和抗体影响，提示其可能成为一种降低风险的途径。 LNPs已成为系统性基因治疗中一种有前景的非病毒替代方案，尤其适用于血液系统和代谢性疾病中的基因组编辑。与AAVs不同，LNPs能够容纳大型载荷，例如碱基编辑器和引导RNA，并且可进行静脉给药（框3）。体内LNP介导的编辑已实现对造血干细胞和祖细胞的高效靶向，包括利用CD117–LNP递送腺嘌呤碱基编辑器和单向导RNA，以纠正镰状细胞病中的β-珠蛋白基因，在长期重建细胞中编辑率最高可达48%，并强效诱导胎儿血红蛋白。在代谢性疾病中，NTLA-2001在转甲状腺素蛋白淀粉样变性患者单次输注后，使转甲状腺素蛋白降低最高达96%。靶向遗传性血管性水肿中激肽释放酶B1的NTLA-2002，使蛋白敲低超过85%，并使几乎所有患者达到无发作状态。其他例子包括用于家族性高胆固醇血症的VERVE-101，以及用于氨甲酰磷酸合成酶1缺乏症的N-of-1碱基编辑治疗，二者均显示出显著临床获益和良好安全性。这些结果标志着LNPs在系统性应用，尤其是体内基因编辑中的转折点。 基于EV的系统性基因治疗仍处于早期开发阶段，受到组织蓄积低、快速清除以及活性成分定义不清的限制。CAP-1002（HOPE-3）是一种用于DMD的心球来源EV产品，但因疗效有限以及化学、制造和控制问题尚未解决而未获FDA批准。尽管如此，生物工程化策略正在帮助EVs克服关键局限。表面修饰以及明确的RNA和蛋白载荷装载已经改善了其循环时间和靶向性。临床前研究已证明，可通过工程化EVs递送CRISPR–Cas9 RNP，实现体外和体内Pcsk9沉默约28%的编辑效率，从而降低低密度脂蛋白胆固醇。然而，EVs的包装效率仍低于LNPs，并且仍缺乏可规模化、标准化的GMP制造流程。与AAVs和LNPs相比，这些障碍使EVs在系统性基因治疗中处于相对劣势。 3.2 生理屏障相关疾病 血脑屏障（BBB）、肺上皮、眼部屏障和肿瘤基质等生理屏障对体内基因递送构成重大挑战。由于具有内源性膜组成，EVs已显示出通过受体介导的跨胞转运和膜融合跨越这些屏障的独特能力。临床试验正在研究天然EVs在CNS疾病（例如帕金森病、卒中和阿尔茨海默病）、眼部疾病以及肺部疾病气溶胶递送中的应用。为进一步增强EV嗜性和循环时间，生物工程化策略引入了抗吞噬信号（例如CD47）以及RGD肽等靶向配体，以跨越BBB或眼部屏障。雾化或干粉等配方可在肺组织中实现EV–mRNA的强效转基因表达；可生物降解聚合物包封系统（例如聚乳酸-羟基乙酸共聚物ExoCap微胶囊）可在眼内持续释放EV超过一个月，延长囊泡半衰期并改善视网膜修复。尽管目前尚无基于EV的产品获批用于这些适应症，但其天然生物分布和低免疫原性使其成为克服屏障限制性疾病背景的有力候选平台。 尽管AAVs和LNPs在临床上更加成熟，但它们通常需要局部递送或特定患者背景才能绕过屏障。例如，基于AAV2的治疗产品Luxturna通过视网膜下递送治疗遗传性失明；基于AAV9的Zolgensma能够进入脊髓性肌萎缩症婴儿的CNS，是因为婴儿BBB尚未成熟。在成年人中，完整的生理屏障限制了系统性AAV和LNP递送，因此需要侵入性给药途径（例如鞘内或脑室内给药；见AAV试验NCT04120493、NCT05243017和NCT02362438，以及LNP试验NCT05034497）。鼻内递送提供了一种侵入性较低的选择，但仍处于临床前开发阶段。 衣壳工程创新已扩展了AAVs的能力；例如，BI-hTFR1等工程化衣壳通过靶向脑内皮上的人转铁蛋白受体，可实现比AAV9高约40–50倍的CNS转导。类似地，LNP设计也在快速推进，具有脑穿透能力的脂质化学（例如MK16）以及利用肽或寡核苷酸与跨BBB内源性转运机制相互作用的功能化配方正在发展。在肺部应用中，优化LNPs正在接受研究（例如用于囊性纤维化的MRT5005），尽管历史上黏液屏障和先天免疫一直是挑战。将EV样特性引入合成载体，或使用囊泡相关LNPs（主要是脂质体）和AAVs的杂交方法，显示出增强的屏障穿透能力，尤其是在CNS和视网膜中。与此同时，以口服胶囊RNACap形式存在的生物材料包封LNPs，通过在胃肠道转运过程中保护LNP–IL-10 mRNA，并触发肠道释放，克服了严苛的胃肠屏障，实现了局部肠道表达。这些进展表明，对于屏障受限疾病，有效基因治疗的关键将是配方创新，而不仅仅是平台类型本身。 3.3 免疫学疾病 基因递送平台在感染性疾病、癌症和自身免疫性疾病治疗中正发挥越来越核心的作用。LNP–mRNA疫苗引领了这一变革，COVID-19疫苗的快速开发和全球部署确立了其临床实用性。目前正在进行的试验正在检测LNP–mRNA疫苗用于流感（NCT04956575、NCT06602024和NCT05827978）、呼吸道合胞病毒（NCT05127434和NCT06067230）、巨细胞病毒（NCT03382405和NCT05085366）、Epstein–Barr病毒（NCT05164094）、寨卡病毒（NCT03014089）、疟疾（NCT05581641）和人类免疫缺陷病毒（HIV）（NCT05217641）；肿瘤学项目也正在利用类似平台推进个体化和共享抗原癌症疫苗。其设计速度快、载荷容量灵活和安全性良好，已经加速了预防性和治疗性适应症中的转化。 除疫苗外，AAV载体还通过在体内表达具有免疫活性的蛋白质（如抗体或抗原）提供一种互补策略，从而实现长期保护。例如在HIV中，单次注射编码广谱中和抗体（VRC07）的AAV8，可在人类体内维持表达长达3年。类似方法在新生儿和临床前模型中进一步扩展了这一概念，用于围产期免疫预防；在出生时向恒河猴一次性注射编码HIV-1广谱中和抗体3BNC117的AAV，可实现持续数年的抗体表达，并对猿猴免疫缺陷病毒攻击提供强效保护。AAV介导的表达也正在被探索用于对抗埃博拉等病原体，以及用于泛呼吸道病毒保护，为传统疫苗提供一种“一针式”替代方案。 基于EV的疫苗则源于另一种范式：利用树突状细胞或肿瘤细胞来源的囊泡递送具有免疫学相关性的信号。黑色素瘤和肺癌中的早期试验显示了其安全性和免疫原性；新的研究则利用植物来源EVs进行口服递送，或工程化EVs以携带免疫调节性mRNA，用于炎症性肠病和结肠癌（NCT01294072和NCT04879810）。例如，与脂质体相比，吸入IL-12 mRNA装载EVs在肺癌模型中表现出更强的免疫激活和肿瘤退缩，这提示EVs作为递送系统具有独特的生物分布和耐受性优势。 过继性细胞治疗也正在经历递送平台变革，尤其是在癌症和自身免疫性疾病背景下。利用基因递送载体在体内工程化CAR-T细胞或携带T细胞受体的免疫效应细胞，旨在取代复杂的离体制造流程（框3）。AAVs能够提供持久表达，但受到大小限制和整合风险的制约。相比之下，LNPs可提供短暂、可滴定的CAR表达，并能够在不同免疫细胞类型中再次给药或重新靶向。临床前数据显示，抗体导向的LNPs可将CAR mRNA递送至T细胞，从而导致肿瘤清除；首批使用基于LNP–mRNA的CAR治疗的临床试验正在开展，靶向髓系细胞（例如MT-302（NCT05969041）），类似的体内CAR-T治疗平台预计也将很快跟进。 EVs为体内过继性免疫治疗提供了一种受细胞启发的平台。工程化EVs可被靶向至免疫细胞亚群，并装载CAR mRNA，以在原位直接重编程免疫细胞。其非免疫原性以及不含病毒成分的特点降低了安全性担忧。然而，低载荷容量、产率不一致和生产挑战仍是关键障碍。创新性制造方法正在被开发，以克服这些障碍。 总体而言，这些应用表明，AAVs、LNPs和EVs为免疫驱动性疾病提供了不同但互补的能力（表3）。它们在持久性、靶向性、免疫原性和可规模化方面的相对优势，将继续塑造疫苗和免疫治疗的未来。 4. 结论和未来方向 基因治疗的发展受到三大主要递送平台的塑造，即AAVs、LNPs和EVs，它们涵盖了从病毒载体到非病毒载体、从合成载体到天然载体的不同类型。每个平台都具有不同的优势和挑战，而比较分析对于指导基于疗效和安全性的合理平台选择至关重要。AAVs因其高转基因表达水平、相比其他整合型载体更低的插入突变风险，以及成熟的GMP生产体系，在病毒基因递送领域处于领先地位，并支持了全球范围内的产品批准。然而，安全性问题，尤其是免疫原性和有限的载荷容量，推动了人们对非病毒替代方案的兴趣。LNPs在COVID-19疫苗成功的推动下，展现出可规模化生产、高效核酸递送和良好的安全性特征。然而，与AAVs类似，LNPs也面临免疫原性问题，并且在很大程度上受限于肝脏或局部递送。目前的创新工作集中于优化脂质化学和配方，以增强靶向性、屏障穿透能力和内体逃逸。EVs提供了一种低免疫原性并具有天然跨屏障能力的自然替代方案，使其在CNS等难以到达的组织中具有吸引力。近期进展已改善EV装载和靶向，但规模化生产、异质性和监管不确定性仍是障碍。借鉴AAV和LNP开发中已建立的框架，可能会加速EV转化。与其将这些平台视为相互竞争，不如将其视为互补平台。整合其优势的杂交设计和定制化递送途径，为拓展基因治疗的应用范围提供了有前景的策略。 4.1 对标准化比较研究的需求 尽管这些平台已经取得令人鼓舞的进展，并出现了若干从实验室到临床的转化案例，但在功能表现和转化能力两个层面对AAVs、LNPs和EVs进行头对头比较的研究仍然稀少。这一空白阻碍了知情的平台选择、适应症特异性优化以及个体化治疗的合理设计。 尽管比较研究和综述正在增加，但其中许多研究无意中存在偏倚，往往旨在强调某一特定平台的优越性，或使用不等效的对照或次优配方，从而限制了其普适性。因此，仍需要无偏倚且标准化的比较评估，并严格控制关键变量，包括匹配的理化性质、等效剂量方案、一致的给药途径、可比的活性药物成分，以及相似的细胞摄取或表达动力学。此类控制良好的研究对于建立具有广泛适用性的设计原则至关重要，可用于指导临床转化和平台选择。 4.2 整合生物学背景和计算工具 生物学复杂性是基因递送平台选择中另一个常被忽视的维度。年龄、性别、代谢状态和免疫状态等患者特异性因素，可显著影响生物分布、载荷表达和免疫反应，并最终塑造治疗结果。然而，临床医生和研究人员通常缺乏能够在实时决策中纳入这些因素的框架。 为应对这一挑战，计算工具已开始支持配方设计和平台优化。基于大型数据集训练的深度学习模型能够捕捉配方变量与生物学表现之间细微的非线性关系。大型语言模型，如生成式预训练转换器变体，正作为智能助手出现，可快速分析文献并提出合理的设计策略。 例如，AI copilot NanoSafari从超过20,000篇纳米医学出版物中提取配方知识，并在提出有效递送策略方面优于标准生成式预训练转换器模型。作为这些计算方法的补充，多组学和高分辨率成像技术如今能够提供对递送平台–生物学相互作用的精细理解。当与计算分析整合时，这些工具可将递送结果与患者特异性分子特征相关联，为个体化递送平台选择奠定基础。 4.3 成本、监管和规模化 基因治疗更广泛采用的一个主要障碍是成本。由于载体制造成本高昂，并且需要个体化GMP流程，针对罕见病的AAV基治疗每剂费用通常超过200万美元。LNPs在个体化应用中也面临障碍。EVs虽然具有前景，但由于生产不一致以及缺乏效力标准，带来了更大的成本和监管复杂性。 为应对这些挑战，监管改革正在出现。FDA Modernization Act 2.0目前允许使用非动物测试替代方法，例如器官芯片模型和计算模拟。FDA也正在试点用于基因递送候选物的AI安全性预测工具，这可能降低临床前负担并简化审批路径。然而，这些进展也带来了新的验证需求，需要协调各方努力，以建立可重复的标准和支持性监管框架。最终，整合平台比较分析、患者定制化设计和监管创新，对于充分实现基因治疗潜力至关重要，可使其更安全、更高效，并惠及更广泛人群。 你可能还想看 关于BioMedDaily：我们比过去更渴望疾病知识 #遗传学与药物发现 Nature | 首次发现肌萎缩性侧索硬化症存在针对C9orf72蛋白的自身免疫反应 Nature | 用新鲜的免疫细胞交换大脑中的旧免疫细胞可以治疗疾病 Nature | 全球首次使用基因疗法治疗亨廷顿舞蹈症 Nat Biomed Eng | 四川大学华西医院魏霞蔚团队报道新型鼻喷联合疫苗为奥密克戎提供更优免疫保护 Nat 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