Remdesivir

这里需要复用这样一个观点和立场：完全应该鼓励学生用AI，应该让他们随便用AI，想怎么用怎么用，爱用多少用多少——甚至应该设定一些结构或者采取一些措施来引诱、推动、逼迫学生用AI。 只要当有人基于他所属名的文本提出与这一文本有关的问题是，他的反应是“都闪开我要开始装*了”而不是“歪比巴卜”就行。 不信你问问vibe coding的同志，难道他们不能把自己提交的代码讲清楚吗？他们可太能了，这些人讲代码那个劲儿简直有点欠揍。 我们今天之所以无思地强调AI率，不外乎是因为在答辩这件事上，我们既没有“像组织答辩那样组织答辩”的责任，也没有“不能过就是不能过”的胆识。我们在以一种转移矛盾和撇清责任的方式强调AI率。 鉴定为****。 整合免疫细胞的类器官技术研究进展，及其在生命科学与基础医学中的应用 摘要 传统的类器官模型因缺乏免疫系统、血管网络、基质细胞等关键组分，无法完全模拟复杂的生理与病理过程。近年来，通过将免疫细胞整合到类器官培养体系中，构建“免疫细胞-类器官”共培养模型（或称“免疫类器官”，Immuno-Organoid），成为弥补这一缺陷、提升模型生理相关性的前沿方向。本综述旨在系统性地梳理和总结2020年至2025年间这一新兴领域在模型构建、应用拓展和技术创新方面的核心进展。我们将聚焦于免疫类器官在三大关键研究领域的应用：（1）癌症免疫治疗，如何利用患者来源的肿瘤类器官与自体免疫细胞共培养，预测免疫疗法疗效并开发新型细胞疗法；（2）感染、炎症与自身免疫，如何模拟病原体入侵、免疫防御以及免疫失调导致的组织损伤；（3）组织损伤与修复，如何探究免疫细胞在再生过程中的复杂调控作用。通过深入剖析这些前沿应用，本综述旨在为相关领域的研究者提供一幅关于免疫类器官技术发展现状与未来潜力的全景图。 引言——从二维平面到三维“微器官”的跨越 1.1. 体外模型的发展历程 生命科学与医学研究的进步在很大程度上依赖于能够在实验室中模拟人体生理和病理过程的体外模型。传统的二维（2D）细胞培养技术，即在平坦的塑料或玻璃表面培养单层细胞，自20世纪初问世以来，一直是细胞生物学研究的基石。这种技术成本低廉、易于操作，极大地推动了我们对细胞增殖、分化、凋亡等基本生命活动的理解。然而，2D培养的根本缺陷在于其无法复现细胞在体内的三维（3D）组织结构、细胞-细胞以及细胞-细胞外基质（ECM）之间的复杂相互作用。生长在平面上的细胞其形态、基因表达谱和功能反应与体内组织中的细胞存在巨大差异，这导致基于2D模型的药物研发成功率极低，大量在体外看似有效的候选药物在进入临床试验后宣告失败。 为了克服2D模型的局限性，科学家们开发了多种3D细胞培养技术，如细胞球（Spheroids）、水凝胶包埋培养等。这些技术在一定程度上恢复了细胞的三维生长环境。然而，真正的突破来自于类器官（Organoid）技术的出现。类器官是指利用成体干细胞（Adult Stem Cells, ASCs）或多能干细胞（Pluripotent Stem Cells, PSCs，包括胚胎干细胞和诱导性多能干细胞）在特定3D培养条件下，通过自组织过程发育而成的、具备来源器官关键结构和功能的微型器官样结构。它们不仅拥有3D结构，更重要的是，它们能够模拟体内器官的发育过程，包含多种谱系的细胞类型，并以接近生理的方式排列，从而在结构和功能上都高度逼近真实的人体器官。 1.2. 类器官技术的优势与固有局限 类器官技术的出现被誉为“体外生物学的革命”。相较于传统模型，其优势显而易见： l高度生理相关性： 类器官能够模拟真实器官的多细胞组成、空间结构和特异性功能，例如，肠道类器官拥有隐窝-绒毛结构，能够进行营养吸收和分泌；肿瘤类器官则能保留原发肿瘤的组织病理学特征、基因突变谱和异质性。 l源于人类细胞： 基于人类干细胞或患者组织来源的类器官，克服了动物模型与人类之间的种属差异，为研究人类特有疾病和进行精准药物测试提供了理想平台。 l可长期培养与扩增： 来源于成体干细胞的类器官能够稳定传代和扩增，并可进行冻存和复苏，从而建立“活的生物样本库”（Living Biobank），为大规模、可重复的科学研究和药物筛选提供了可能。 l强大的可操作性： 类器官模型适用于基因编辑（如CRISPR-Cas9）、高通量药物筛选、实时成像等多种现代生物学技术，便于进行机制探索和靶点验证。 然而，正如任何新兴技术一样，标准的类器官模型也存在其固有的局限性。其中最突出的问题是缺乏完整的组织微环境。在体内，器官的功能发挥离不开与其他系统的协同作用，尤其是免疫系统和血管系统。 l免疫系统缺位： 标准的类器官培养体系中不包含免疫细胞。这使得它们无法模拟免疫监视、免疫逃逸、炎症反应、免疫细胞介导的组织损伤与修复等关键生理和病理过程。这一缺陷对肿瘤免疫、感染性疾病和自身免疫性疾病的研究影响尤甚。 l血管系统缺失： 类器官通常依赖于培养基的被动扩散来获取营养和氧气，并排出代谢废物。随着类器官体积增大（通常超过数百微米），其中心区域会因缺血缺氧而发生坏死，限制了模型的长期稳定性和功能成熟度。此外，血管系统是免疫细胞进入和离开组织的主要通道，缺少血管网络也阻碍了对免疫细胞浸润、迁移等动态过程的研究。 l其他组分缺失： 除了免疫细胞和血管，体内组织微环境还包含成纤维细胞、神经元、淋巴管等多种基质细胞和结构，这些在标准类器官模型中也通常是缺失的。 1.3. 构建功能整合的体外微系统 为了突破上述局限，将缺失的关键组分重新引入类器官系统成为该领域发展的必然趋势。其中，整合免疫细胞是近年来最活跃、成果最丰硕的研究方向之一。通过将来源多样化的免疫细胞与类器官进行共培养，科学家们正在构建能够模拟复杂免疫应答的“免疫类器官”（Immuno-Organoids）模型。 第二章：免疫类器官在癌症免疫治疗研究中的应用 癌症免疫治疗，特别是免疫检查点抑制剂（ICIs）和过继性细胞疗法（如CAR-T），已经彻底改变了多种恶性肿瘤的治疗格局。然而，仅有部分患者能从中获益，且治疗反应的预测性生物标志物仍不完善。能够精准模拟肿瘤与免疫系统相互作用、并预测个体患者治疗反应的临床前模型因此显得至关重要。整合了免疫细胞的肿瘤类器官（Tumor Organoids, CTOs）模型，尤其是来源于患者自身的肿瘤类器官（Patient-Derived Organoids, PDOs）与自体免疫细胞的共培养系统，为此提供了前所未有的解决方案。 2.1. 模拟肿瘤免疫微环境（TIME）与T细胞相互作用 肿瘤免疫微环境（TIME）是决定肿瘤进展和免疫治疗成败的关键。传统的肿瘤研究模型，如2D细胞系或免疫缺陷小鼠异种移植模型（PDX），均无法有效复现人类TIME的复杂性。肿瘤类器官-免疫细胞共培养模型，特别是与自体T细胞的共培养，能够高度还原肿瘤细胞与免疫细胞之间的“原生态”对话。近年来的研究表明，将从患者外周血或肿瘤组织中分离的免疫细胞（如外周血单核细胞PBMCs或肿瘤浸润淋巴细胞TILs）与匹配的PDOs进行共培养，可以成功模拟T细胞对肿瘤的识别与杀伤过程。例如，Dijkstra等人的开创性工作展示了，将非小细胞肺癌或结直肠癌患者来源的PDOs与对应患者自体外周血淋巴细胞共培养，能够诱导并扩增出肿瘤新抗原特异性的CD8+ T细胞（DOI: 10.1016/j.cell.2018.07.009）。这些被“激活”的T细胞能够特异性地裂解来源相同的肿瘤类器官，而对来自其他患者或健康组织的类器官无杀伤作用，证明了该模型能够重现MHC限制性的、肿瘤抗原特异的T细胞应答。 这类模型的核心优势在于其“自体性”（Autologous），即肿瘤细胞和免疫细胞均来自同一患者。这保证了免疫识别的遗传背景（如HLA分型）与患者体内完全一致，从而能够最真实地模拟个体化的抗肿瘤免疫反应。通过高分辨率成像、流式细胞术和细胞因子分析等技术，研究者可以动态、定量地评估T细胞的浸润、活化（如IFN-γ、TNF-α分泌）以及对肿瘤类器官的杀伤效率。这些系统不仅是研究肿瘤免疫逃逸机制（如抗原呈递缺陷、免疫抑制细胞因子分泌）的强大工具，也为筛选能够增强T细胞功能的药物提供了高通量平台。 2.2. 预测免疫检查点抑制剂（ICIs）的疗效 免疫检查点抑制剂（如抗PD-1/PD-L1、抗CTLA-4抗体）通过阻断抑制性信号通路来“释放”T细胞的抗肿瘤潜力，是当前癌症免疫治疗的支柱。然而，其在不同患者间的疗效差异巨大。PDO-免疫细胞共培养模型为实现ICI疗效的个体化预测提供了可能。在模型中，研究者可以观察到肿瘤类器官会表达PD-L1，而共培养的T细胞会表达PD-1。通过在共培养体系中加入PD-1或PD-L1抑制剂，可以评估其是否能增强T细胞对肿瘤类器官的杀伤作用。多项研究已经证实，这种体外模型的反应性与患者在临床上对ICI治疗的真实反应具有良好的一致性。例如，一项针对黑色素瘤患者的研究发现，PDO-TIL模型对免疫疗法（包括PD-1抑制剂）的反应与患者临床观察到的反应高度一致；NICHE研究中利用早期结肠癌患者的PBMC与自体PDO共培养，并测试了PD-1阻断抗体的影响，该研究比较了临床反应者与非反应者，发现来自临床反应者的T细胞在体外被激活并能有效杀伤肿瘤器官模型，而非反应者的T细胞则无此反应（doi.org/10.3390/ijms241914609）。这表明，该模型有望成为一种新型的伴随诊断工具，在治疗前筛选出可能获益的患者，从而实现精准免疫治疗，避免无效治疗带来的毒副作用和经济负担。 当然，该模型还能用于探索ICI耐药机制。通过对治疗前后模型中的肿瘤细胞和免疫细胞进行单细胞测序等多组学分析，可以揭示导致耐药的关键基因突变、信号通路改变或免疫微环境重塑，为开发克服耐药的新策略提供线索。 2.3. 评估与优化过继性细胞疗法（ACT） 以CAR-T细胞疗法为代表的过继性细胞疗法在血液肿瘤中取得了巨大成功，但在实体瘤治疗中仍面临诸多挑战，如CAR-T细胞在肿瘤组织中的浸润、存活和功能持久性受限等。肿瘤类器官-CAR-T共培养模型为解决这些问题提供了理想的3D测试平台。研究者可以利用患者来源的PDOs，在体外评估不同设计（如不同靶点、共刺激结构域）的CAR-T细胞的抗肿瘤活性。通过实时活细胞成像，甚至可以直观地观察到CAR-T细胞如何识别、结合并裂解3D结构中的肿瘤类器官。这比传统的2D共培养更能模拟CAR-T细胞在实体瘤组织中遇到的物理屏障和复杂的细胞间相互作用。该模型不仅可以用来评估CAR-T的杀伤效率，还可以研究其“脱靶效应”（on-target, off-tumor toxicity）。通过建立来自同一患者的肿瘤类器官和健康组织类器官（如肠道、肝脏类器官），可以在同一体系中比较CAR-T细胞对两种类器官的杀伤作用，从而在临床前阶段评估其安全性。此外，模型还可以用于优化治疗方案。例如，研究者可以测试联用其他药物（如检查点抑制剂、靶向药）是否能增强CAR-T细胞在实体瘤模型中的功能，或者探索如何改造CAR-T细胞以抵抗肿瘤微环境中的免疫抑制因素（如TGF-β、缺氧等）。这些基于类器官的研究将极大加速更安全、更有效的针对实体瘤的ACT疗法的开发进程。 2.4. 生成并筛选肿瘤反应性T细胞 对于某些缺乏有效靶点的肿瘤，从患者体内分离并扩增具有天然肿瘤识别能力的T细胞（如TILs）是一种重要的治疗策略。然而，从肿瘤组织中获取足够数量和活性的TILs往往非常困难。PDO-免疫细胞共培养模型提供了一种在体外高效生成和筛选肿瘤反应性T细胞的新方法。通过将患者的PBMCs与自体PDOs长时间共培养，可以模拟体内T细胞被肿瘤抗原激活和扩增的过程。该方案不仅可以用来探索特定T细胞克隆对肿瘤类器官表现出特异性杀伤活性的细胞和分子生物学机制，未来甚至有望从共培养体系中分离出这些对肿瘤类器官表现出高度特异性杀伤活性的T细胞克隆，这些在体外“训练”和富集出来的T细胞经过进一步扩增后可能作为一种个性化的细胞治疗产品或用于进一步的基因工程改造。与传统的TIL疗法相比，这种方法可能对初始肿瘤组织的需求更少，且生成的T细胞靶向性更明确，可能为更多实体瘤患者带来了新的治疗希望。 第三章：模拟感染、炎症与自身免疫疾病的利器 免疫系统的核心功能是抵御病原体入侵和维持内环境稳态。当这一功能失调时，便会导致感染性疾病、慢性炎症或自身免疫性疾病。整合了免疫细胞的类器官模型，通过在体外重建“器官-免疫-病原体”三方互作的微系统，为深入理解这些复杂疾病的发病机制和开发新的干预手段开辟了新途径。 3.1. 感染性疾病研究：重现宿主-病原体“战场” 传统的感染模型，如动物模型或永生化细胞系，在模拟人类特异性病原体感染（如多种病毒）和复杂的免疫应答方面存在局限。免疫类器官模型能够更好地模拟病原体入侵、复制以及宿主免疫系统如何识别和清除病原体的过程。 l病毒感染模型： 在COVID-19大流行期间，肺类器官和肠道类器官模型迅速被用于研究SARS-CoV-2的感染机制。研究发现，SARS-CoV-2可以高效感染表达ACE2受体的肺泡和肠道上皮细胞。进一步地，通过将巨噬细胞等免疫细胞整合到这些类器官模型中，研究者得以观察到病毒感染后引发的剧烈炎症反应，即“细胞因子风暴”。例如，与被感染的类器官共培养的巨噬细胞会被激活，并大量释放IL-6、TNF-α等促炎细胞因子，这与重症COVID-19患者的临床表现高度一致。这类模型不仅帮助阐明了病毒的发病机理，还为快速筛选抗病毒和抗炎药物（如瑞德西韦、地塞米松）提供了平台。 l细菌感染模型： 肠道类器官与免疫细胞的共培养模型被广泛用于研究肠道致病菌（如沙门氏菌、艰难梭菌）与宿主的相互作用。例如，可以将从人外周血单核细胞分化而来的巨噬细胞或树突状细胞引入到肠道类器官培养体系的基底侧，模拟固有层中的免疫细胞。当用致病菌从类器官的腔内侧（模拟肠腔）进行攻击时，可以观察到细菌如何穿透上皮屏障，并被下方的巨噬细胞吞噬和清除。同时，可以通过测量屏障完整性（如TEER值）和细胞因子分泌来定量评估感染导致的肠道损伤和炎症反应。这些模型对于理解肠道感染的免疫防御机制以及开发新型抗生素或益生菌疗法具有重要价值。 l寄生虫感染模型： 同样，免疫类器官也被用于研究寄生虫感染，例如隐孢子虫。通过在肠道类器官中模拟隐孢子虫的整个生命周期，并引入免疫细胞，可以研究宿主如何对这种重要的机会性感染病原体产生免疫应答，为免疫功能低下人群的治疗提供新思路。 3.2. 炎症性与自身免疫性疾病建模 慢性炎症和自身免疫性疾病，如炎症性肠病（IBD）、类风湿性关节炎（RA）等，其核心病理是免疫系统对自身组织的错误攻击和持续的炎症反应。免疫类器官模型，特别是利用患者来源的细胞构建的个性化模型，为研究这些疾病的复杂病因提供了强有力的工具。 l炎症性肠病（IBD）模型： IBD（包括克罗恩病和溃疡性结肠炎）是研究最为深入的应用领域之一。通过共培养来自IBD患者的肠道类器官和自体固有层淋巴细胞（包括T细胞、B细胞、先天淋巴细胞ILCs），科学家们能够在体外“复刻”患者肠道的病理状态。2022年发表在《Frontiers in Immunology》上的一项研究，利用自体肠道类器官与黏膜T细胞共培养模型，首次直接证明了来自克罗恩病患者活动期肠段的CD4⁺ T细胞在与自体肠道类器官共培养时，会分泌高水平的IFN-γ和TNF-α，并诱导上皮细胞发生凋亡，从而破坏肠道屏障功能（10.3389/fimmu.2022.1008456），提示肠道类器官与免疫细胞共培养模型能够精确模拟该疾病的关键病理环节。 在此基础上，这类模型还可以用于药物测试。通过在IBD患者的自体共培养模型中加入不同的生物制剂（如抗TNF-α抗体英夫利昔单抗），可以评估药物是否能有效抑制T细胞的攻击行为并修复上皮屏障。这种“体外临床试验”有望在未来用于指导IBD患者的个体化用药选择。此外，通过整合巨噬细胞、树突状细胞等多种免疫细胞，可以构建更复杂的IBD模型，用于研究肠道菌群、上皮细胞和免疫细胞三者之间的互作失调在IBD发病中的作用。 l类风湿性关节炎（RA）模型： 虽然类器官技术在RA研究中的应用尚处于早期阶段，但前景广阔。研究者正在尝试利用iPSCs技术，将RA患者的细胞重编程为多能干细胞，再分化为包含软骨、滑膜细胞的“关节类器官”，并整合来自同一患者的免疫细胞（如Th17细胞、巨噬细胞）。通过在模型中模拟炎症环境（如用IL-17、TNF-α刺激），可以研究免疫细胞如何侵袭关节组织、破坏软骨，为筛选能够保护关节的药物提供新平台。在这些模型中，研究者不仅可以整合不同类型的免疫细胞（如巨噬细胞、树突状细胞、T细胞、NK细胞等，还可以通过外源添加细胞因子（如IFN-γ, TNF-α, IL-1β等）来精确模拟和调控不同的炎症状态，从而深入剖析特定免疫通路在疾病发生发展中的作用。 第四章：探索组织损伤修复中的免疫调控作用 组织损伤后的修复与再生是一个涉及细胞死亡、炎症、细胞增殖、重塑等多个阶段的复杂过程，而免疫系统在其中扮演着至关重要的“双刃剑”角色。免疫细胞不仅能清除死亡细胞和病原体，还能通过分泌生长因子和细胞因子来协调干细胞的活化和组织再生。然而，过度的或失调的免疫反应也会阻碍修复，导致纤维化和功能丧失。整合了免疫细胞的类器官模型为在可控的体外环境中精细解剖这些复杂的细胞互作提供了可能。 4.1. 模拟炎症与再生耦合的动态过程 在组织损伤的早期阶段，会发生急性炎症反应，大量中性粒细胞和巨噬细胞被招募到损伤部位。这些免疫细胞在协调修复过程中发挥着核心作用。通过将巨噬细胞等免疫细胞与正常组织类器官（如肝、肺、肠道类器官）共培养，并用物理或化学方法诱导类器官损伤，可以模拟损伤后的免疫应答和再生过程。 例如，在肺损伤模型中，研究者可以利用病毒感染或化学物质（如博来霉素）处理肺类器官，诱导上皮细胞死亡。随后，加入巨噬细胞进行共培养，可以观察到巨噬细胞如何吞噬凋亡的细胞碎片（efferocytosis），并从促炎的M1表型转化为促修复的M2表型（10.1016/j.stemcr.2021.10.015；10.3390/cells12162067）。理论上，M2型极化的巨噬细胞会分泌多种生长因子（如HGF, KGF），促进肺泡干细胞的增殖和分化，从而修复受损的上皮屏障。通过干扰特定的信号通路或耗竭特定的免疫细胞亚群，研究者可以精确地解析不同免疫信号在再生过程中的功能。 4.2. 血管化与免疫细胞浸润在修复中的协同作用 成功的组织修复离不开新生血管的形成（血管生成），它为再生组织提供氧气和营养，并作为免疫细胞进出的通道。因此，在组织修复的类器官模型中，同时整合血管系统和免疫系统是实现更高生理保真度的关键。 近年来，通过将内皮细胞（如HUVECs或iPSC来源的内皮细胞）与类器官和免疫细胞进行三方或多方共培养，已经能够构建出包含自组织血管网络的免疫类器官模型。在这些血管化的模型中，研究者可以模拟免疫细胞从“血管”中渗出，迁移到损伤部位的动态过程。例如，在皮肤损伤修复模型中，血管化的皮肤类器官在受到损伤刺激后，受损的角质形成细胞会分泌趋化因子（如CXCL1、CXCL2、CXCL8等），这些因子形成化学梯度，引导共培养的巨噬细胞和中性粒细胞穿过内皮屏障，到达损伤区域，参与炎症调控和组织重塑（Emilie Attiogbe学位论文，拉瓦尔大学，https://corpus.ulaval.ca/server/api/core/bitstreams/1fd5a15f-7869-4f26-b451-5de928c50cd7/content）。 4.3. 不同器官修复模型的研究进展 l肝脏修复： 肝脏具有强大的再生能力，而库普弗细胞（肝脏定居的巨噬细胞）在其中发挥核心作用。通过共培养肝脏类器官与巨噬细胞，可以模拟药物性肝损伤（DILI）或病毒性肝炎后的修复过程，研究巨噬细胞如何调控肝细胞的增殖和肝脏纤维化的发生。 l肺修复： 如前所述，肺类器官与免疫细胞的共培养模型是研究急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）以及肺纤维化等疾病病理生理学的重要工具。 l皮肤修复： 整合了免疫细胞和血管的皮肤类器官模型，为研究伤口愈合、慢性溃疡和纤维化疤痕的形成机制提供了复杂的体外系统。 总而言之，免疫类器官模型正在帮助我们从一个全新的、整合的视角来理解组织修复，揭示免疫细胞在从炎症启动到再生解决的整个过程中的多面性作用。 第五章：构建免疫细胞-类器官模型的通用原则与方法学 成功构建功能性的免疫类器官模型，需要系统性地考虑细胞来源、共培养策略、培养环境优化以及先进工程技术的融合。尽管针对不同研究目的的模型设计有所差异，但遵循一些通用的原则和方法是保证模型可靠性和可重复性的关键。 5.1. 细胞来源的选择 l成体干细胞（ASCs） vs. 多能干细胞（PSCs）：成体干细胞通常从患者手术切除的组织或活检样本中分离得到，其优势在于能更好地保留来源组织的成熟特征和（在肿瘤中）的异质性，是进行个性化医学研究的首选。多能干细胞包括胚胎干细胞（ESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）。其优势在于强大的增殖能力和分化潜能，可以从易于获取的细胞（如血液、皮肤细胞）中获得，并能分化为几乎所有类型的器官类器官和免疫细胞，为构建完全“同源”（isogenic）的多组分模型提供了可能。 l自体（Autologous） vs. 异体（Allogeneic）免疫细胞： 在模拟个体化免疫应答（如癌症免疫治疗、自身免疫病）的研究中，强烈推荐使用自体免疫细胞，即免疫细胞和类器官来自同一供体，以避免异体免疫反应的干扰。 l外周血来源 vs. 组织来源免疫细胞： 外周血单核细胞（PBMCs）是最容易获取的免疫细胞来源，包含T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞等多种细胞类型。单核细胞可以被进一步诱导分化为巨噬细胞或树突状细胞。但对于模拟特定组织的免疫微环境，或开展患者个体化研究时，从相应组织中分离的组织驻留免疫细胞是更优选择，例如肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）、肠道固有层淋巴细胞（LPLs）等，因为它们更能代表在局部发挥功能的免疫细胞状态。 liPSC来源： 利用iPSC技术，目前已经可以分化产生各种特定类型的干细胞、类器官和免疫细胞（如巨噬细胞、T细胞、NK细胞），这为构建遗传背景完全一致且细胞类型和数量可控的标准化模型提供了新的方向。 5.2. 共培养策略与系统设计 l直接共培养： 将免疫细胞悬液直接加入到已建立的、包埋在基质胶（如Matrigel）中的类器官培养体系中。这种方法能最大限度地模拟细胞间的直接接触，适用于研究T细胞杀伤、巨噬细胞吞噬等依赖于物理接触的相互作用。 l间接共培养： 利用Transwell小室或其他微孔系统，将类器官和免疫细胞分别培养在上下两层，通过半透膜分隔。这种方法适用于研究由可溶性因子（如细胞因子、趋化因子）介导的细胞间通讯，可以避免直接接触带来的影响，并便于分别收集和分析两种细胞。 l基质胶包埋共培养： 将类器官干细胞与免疫细胞在悬浮状态下混合后，再一同包埋于基质胶中。这种方法可以在类器官形成之初就引入免疫细胞，模拟发育过程中的免疫互作。 l培养基优化： 最大的挑战之一是找到能同时支持类器官和免疫细胞存活与功能的“通用”培养基。通常的策略是在类器官标准培养基的基础上，补充对免疫细胞至关重要的细胞因子（如IL-2, IL-7, IL-15用于淋巴细胞存活；M-CSF用于巨噬细胞分化），并需仔细优化各种成分的浓度，以达到平衡。 5.3. 融合先进工程技术：构建更仿生的微环境 为了克服传统静态3D培养的局限，多种先进工程技术被用于构建更复杂的免疫类器官模型。 l血管化（Vascularization）： 如前所述，构建血管网络对于维持类器官长期活性和模拟免疫细胞运输至关重要。 l内皮细胞共培养： 将内皮细胞（如HUVECs）与类器官祖细胞共培养，内皮细胞可以自组织形成管状网络。 l生物打印（Bioprinting）： 利用3D生物打印技术，可以精确地构建包含中空通道的细胞支架，再将内皮细胞种植于通道内壁，形成可灌注的血管网络。这种方法对血管的几何形状和空间布局有更高的控制力。 l牺牲网络法： 先打印出一种可在后续移除的材料（如明胶）作为血管网络的模板，填充细胞和基质后，再溶解模板材料，留下中空管道，为血管形成提供物理引导。 l微流控器官芯片（Microfluidic Organ-on-a-Chip）：这是将免疫类器官模型推向更高复杂度和生理相关性的关键技术。微流控芯片中的微通道可以模拟血液流动，为类器官提供持续的营养供应和废物清除，有效解决传统培养中的中心坏死问题。通过微流控芯片可以施加流体剪切力、机械拉伸等物理刺激，这些对于模拟肠道蠕动、血管搏动等生理过程非常重要。进一步地，可以将不同器官的类器官模型（如“肠-肝”芯片）通过微流控通道连接起来，研究器官间的相互作用，例如药物在肠道吸收后在肝脏的代谢及其对免疫系统的影响。器官芯片平台的设计可以包含平行的“血管通道”和“组织通道”，中间由多孔膜隔开，从而能够实时观察免疫细胞在趋化因子梯度作用下，如何从血管通道迁移（外渗）到包含类器官的组织通道中，精确模拟体内免疫细胞浸润的过程。然而必须指出的是，尽管想象空间十分丰富，但基于微流控芯片的类器官构建和研究技术目前尚处于发展阶段。 5.4. 功能性读出与分析方法（Readout Assays） 评估免疫类器官模型的功能需要多层次、多维度的分析技术。 l成像分析： 共聚焦、光片、双光子显微镜等高分辨率活细胞成像技术，是可视化细胞动态相互作用（如T细胞在3D类器官中的运动轨迹、对靶细胞的杀伤过程）的最直观工具。 l细胞活力与毒性检测： 通过检测培养基中LDH的释放、Caspase-3/7活性或使用荧光探针（如Calcein-AM/PI）染色，可以定量评估免疫细胞对类器官的杀伤效果。 l细胞因子谱分析： 使用ELISA、Luminex或多重细胞因子阵列（CBA）技术，检测培养上清中关键细胞因子（如IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-10）的水平，以评估免疫应答的类型和强度。 l流式细胞术（Flow Cytometry）：用于分析共培养体系中不同免疫细胞亚群的比例、表型（如活化标志物CD69, CD25）和功能（如胞内细胞因子染色）。 l转录组学： 单细胞RNA测序（scRNA-seq）是解析复杂共培养体系中细胞异质性和相互作用的强大工具，可以同时获得类器官细胞和各种免疫细胞在相互作用后的基因表达谱，揭示新的调控网络和细胞亚型。 l蛋白质组学和空间组学：这些技术可以进一步提供蛋白质水平的信息以及细胞在空间位置上的信息，构建更全面的互作图谱。 通过综合运用上述方法，研究者可以从宏观到微观、从现象到机制，全面地刻画免疫类器官模型中的复杂生物学过程。 第六章：挑战与未来展望 尽管整合免疫细胞的类器官技术在过去五年取得了令人瞩目的进展，但作为一个快速发展的新兴领域，它仍面临着一系列严峻的挑战。克服这些挑战，并与最前沿的科学技术深度融合，将是推动该领域走向成熟和广泛应用的关键。 6.1. 当前面临的主要挑战 l异质性与可重复性（Heterogeneity & Reproducibility）： 这是目前类器官领域普遍面临的最大瓶颈。即便是来自同一患者样本的类器官，在不同批次的培养之间也可能存在显著的形态和功能差异。当引入同样具有高度异质性的免疫细胞后，整个系统的复杂性和不确定性被进一步放大 [[120]]。基质胶（如Matrigel）成分的不明确性和批次差异、培养基配方的细微差别、以及操作人员的技术熟练度，都可能影响最终结果。缺乏标准化的培养方案（SOPs）和质量控制（QC）标准，严重限制了研究结果在不同实验室之间的比较和验证，也阻碍了其向临床应用的转化。 l复杂性与生理保真度（Complexity & Fidelity）： 尽管当前的免疫类器官模型已整合了一到两种免疫细胞，但这与体内组织微环境中包含数十种免疫细胞亚群以及成纤维细胞、血管周细胞、神经元等多种基质细胞的复杂生态系统相比，仍是极大的简化。如何按生理比例和空间分布，将更多类型的细胞整合到一个功能协调的系统中，是一个巨大的技术挑战。此外，长期维持多种细胞的共存和功能稳定也非常困难，例如，许多原代免疫细胞在体外培养条件下寿命有限。 l功能成熟度与规模限制（Functional Maturation & Scale Limitation）： 缺乏有效的血管灌注系统，仍然是限制类器官尺寸增大和功能成熟的核心障碍。没有灌注，大型类器官中心坏死的问题无法根本解决，也无法模拟血液循环带来的系统性信号（如激素、营养物质波动）对器官和免疫系统的调控。同时，现有的大多数复杂免疫类器官模型（尤其是基于微流控芯片的）构建过程复杂、通量较低，难以满足大规模药物筛选的需求。 6.2. 未来发展方向与展望 面对挑战，该领域的研究者正在从多个维度探索创新的解决方案，未来的发展将呈现以下几个主要趋势： l迈向更高维度的“类器官生态系统”： 未来的模型将不再局限于类器官与一两种免疫细胞的简单共培养，而是会发展为包含上皮、基质（成纤维细胞）、血管（内皮细胞、周细胞）、神经和多种免疫细胞组分（髓系、淋巴系）的“多细胞谱系类器官”或“类器官微生理系统”。通过自下而上的组织工程策略，构建更接近真实人体组织的体外模型。 l人工智能（AI）驱动的设计与分析： AI将在免疫类器官研究的多个环节发挥革命性作用。例如，AI辅助模型设计可以利用机器学习算法，可以分析海量实验数据，预测并优化培养基配方、细胞因子组合和培养条件，从而提高模型的稳定性和可重复性。AI赋能的图像分析技术可以基于深度学习的图像识别算法，自动、高通量地分析显微图像，定量评估类器官的形态、免疫细胞的浸润程度和动态行为，将研究从定性观察推向精准定量。AI驱动的多组学数据整合将能够整合和解析来自单细胞测序、空间组学、蛋白质组学等不同层面的海量数据，帮助科学家从复杂的互作网络中发现新的生物学机制、药物靶点和预测性生物标志物。 l合成生物材料与工程化支架的崛起： 为了摆脱对成分不明的Matrigel的依赖，开发化学成分明确、物理性质可调的合成水凝胶是当前和未来的一个重要方向。一些更加先进的“智能”生物材料可以被设计成能够响应特定生物信号（如酶降解），或者可以偶联生长因子和粘附肽，为细胞提供更仿生的微环境，从而提高模型的可重复性和功能性。结合先进的3D打印技术，可以制造出具有精细解剖结构的工程化支架，引导细胞自组织成更复杂的器官结构。 l多组学技术的深度融合： 空间转录组学、空间蛋白质组学等技术的发展，将使我们能够在保持组织空间信息的同时，获得单细胞分辨率的分子图谱。将这些技术应用于免疫类器官模型，将能以前所未有的精度绘制出不同细胞类型在特定微区（如肿瘤-免疫边界）的“社交网络”和分子对话，从而在空间维度上理解免疫应答的调控机制。 l赋能精准与个性化医疗： 随着模型标准化和自动化程度的提高，基于患者来源的免疫类器官模型（PDIOs）在临床转化中的应用将更加广泛。未来或许可以为每一位肿瘤患者建立其个性化的“肿瘤免疫类器官”模型，在体外快速测试一系列免疫治疗方案的有效性，为其量身定制最佳治疗策略。同样，在自身免疫性疾病领域，这类模型也将成为筛选靶向药物和预测患者对生物制剂反应的常规工具，最终实现“一人一策”的精准医疗。 结论 整合了免疫细胞的类器官技术，正引领体外模型从简单的结构模拟迈向复杂的功能重现。在2020至2025这短短数年间，该技术已在癌症免疫学、感染与炎症、组织再生等多个领域展现出巨大的潜力，为我们理解人类健康与疾病提供了前所未有的视角和强大的研究工具。尽管在标准化、复杂性和功能成熟度方面仍有待完善，但随着人工智能、合成生物材料、微流控和多组学等前沿技术的不断融入，我们有理由相信，功能更完善、更仿生的免疫类器官模型将在未来的生命科学基础研究、药物开发和个性化医疗中扮演越来越核心的角色，真正成为连接实验室与临床的桥梁，加速科学发现向临床实践的转化。