Galantamine Hydrobromide

题目：Neuroprotective Potential of Origanum majorana L. Essential Oil Against Scopolamine-Induced Memory Deficits and Oxidative Stress in a Zebrafish Model链接：https://doi.org/10.3390/biom15010138 期刊:Biomolecules 摘要 马郁兰（Origanum majorana L.），又称甜马郁兰，是一种具有多种用途的植物，在烹饪领域和传统医学中均有应用，这得益于其强大的抗氧化、抗炎、抗菌和助消化特性。本研究聚焦马郁兰精油（OmEO，浓度分别为25、150和300微升/升）的作用，评估了其化学结构，以及在正常斑马鱼（Danio rerio）和东莨菪碱诱导的遗忘模型（SCOP，100微摩尔）中对认知能力和氧化应激的影响。通过新鱼缸实验（NTT）、Y迷宫实验和新物体识别实验（NOR）对鱼类行为进行了分析。我们还研究了乙酰胆碱酯酶（AChE）活性和大脑的氧化应激状态。同时，我们利用SwissADME、pKCSM、ADMETlab 2.0和ProTox-II等平台，对马郁兰精油中已鉴定的主要化合物的药代动力学特性进行了计算机模拟预测（使用计算模型开展的研究）。结果显示，主要化合物为反式桧烯水合物（36.11%）、4-萜品醇（17.97%）、乙酸芳樟酯（9.18%）、石竹烯氧化物（8.25%）和α-萜品醇（6.17%）。马郁兰精油可通过抑制乙酰胆碱酯酶来增强记忆力，通过增加新鱼缸实验中鱼类在顶部区域的停留时间来减轻东莨菪碱诱导的焦虑，并能显著降低氧化应激标志物。这些发现凸显了马郁兰在改善记忆障碍和减轻与认知障碍（包括阿尔茨海默病（AD））相关的氧化应激方面的潜力。 关键词：ADMET；PASS Online；类药性；pKCSM；牛至精油；挥发油；记忆；焦虑；氧化应激；阿尔茨海默病；痴呆；东莨菪碱；斑马鱼 引言 阿尔茨海默病（AD）具有独特的病理特征，这些特征对其神经退行性过程有显著影响。主要特征包括β-淀粉样蛋白斑块的积累和神经原纤维缠结，这对理解该疾病的进展和潜在治疗靶点至关重要。尽管淀粉样蛋白和 tau 蛋白病变是阿尔茨海默病的核心，但新兴研究表明，其他因素如神经炎症和血管因素，可能也在该疾病的复杂性和进展中发挥重要作用。 目前，阿尔茨海默病有多种治疗方案，主要旨在缓解症状而非治愈疾病。胆碱能抑制剂，尤其是胆碱酯酶抑制剂（ChEIs），如多奈哌齐、卡巴拉汀和加兰他敏，已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准，对轻中度阿尔茨海默病有效，其作用机制是抑制乙酰胆碱的分解，而乙酰胆碱对认知功能至关重要。美金刚用于中重度阿尔茨海默病，常与胆碱酯酶抑制剂联合使用，以改善精神功能。尽管胆碱酯酶抑制剂能改善认知功能和日常生活活动能力，但其疗效通常仅限于延缓疾病进展，而非逆转疾病。胆碱酯酶抑制剂主要是减缓认知衰退，而非阻止或逆转衰退，这可能会让患者和护理者感到沮丧。不同个体对胆碱酯酶抑制剂的反应差异很大，这使治疗方案的制定变得复杂。服用胆碱酯酶抑制剂后常见的副作用包括恶心、呕吐和腹泻，这些可能导致脱水和营养不良。此外，由于胆碱能活性增强，胆碱酯酶抑制剂还可能引起心动过缓和其他心血管并发症。 精油正成为阿尔茨海默病传统药物的一种有前景的替代方案，具有潜在的神经保护作用和症状管理效果。 马郁兰（Origanum majorana L.）因其富含具有神经保护特性的生物活性化合物，已显示出在改善阿尔茨海默病（AD）症状方面的潜在治疗益处。这些化合物包括黄酮类、酚酸类和萜类化合物，它们具有抗氧化、抗炎作用，并能调节胆碱能活性，这些在阿尔茨海默病的病理过程中至关重要。研究表明，马郁兰的植物化学物质，特别是迷迭香酸和百里酚，具有强大的抗氧化和抗炎功效，这对对抗与阿尔茨海默病相关的神经炎症和氧化应激至关重要。 马郁兰还含有多种初级和次级植物成分，这些成分有助于其治疗特性。其中包括香芹酚，它具有抗菌和抗炎活性；芳樟醇，一种具有镇静和镇痛特性的萜烯醇；熊果酸，一种具有抗炎和抗氧化作用的三萜类化合物；以及黄酮类化合物，如芹菜素（以其抗炎和抗氧化作用而闻名）和木犀草素（以其抗氧化和抗炎活性而被认可）。此外，马郁兰还含有大量单宁，单宁具有抗氧化和抗菌作用。 此外，马郁兰精油（OmEO）已被证实能增强脑源性神经营养因子（BDNF）的表达，进一步支持阿尔茨海默病模型中认知功能的改善。组织学分析显示，经治疗的小鼠神经退行性病变减轻，这表明马郁兰对脑损伤具有保护作用。研究表明，马郁兰提取物可能抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）——这种酶会降解乙酰胆碱，从而增强胆碱能信号传导。 东莨菪碱（SCOP）是一种毒蕈碱型乙酰胆碱受体拮抗剂，被广泛用于实验研究中，以诱导模拟阿尔茨海默病（AD）某些特征的认知和记忆障碍。斑马鱼（Danio rerio）因其在遗传、生化和行为方面与人类具有相似性，已成为研究东莨菪碱作用的重要模式生物。 本研究旨在评估OmEO在改善SCOP诱导的记忆损伤和减轻脑氧化应激方面的潜力，并利用斑马鱼模型作为临床前神经药理学研究的一种多功能且有效的平台。本本研究首次重点揭示了OmEO的详细化学成分，包括反式桧烯水合物、4-萜品醇和乙酸芳樟酯，并将这些化合物与其药理作用相关联。同时，本研究运用计算机模拟预测方法，呈现了OmEO中检测到的主要化合物的药代动力学和毒理学特性。此外，通过结合多种行为测试（NTT、Y迷宫和NOR），本研究对焦虑和记忆进行了全面评估，而以往大多数研究仅关注单一类型的行为测试。再者，本研究还考察了OmEO对乙酰胆碱酯酶（AChE）活性和氧化应激的影响，包括超氧化物歧化酶（SOD）、羰基化蛋白和丙二醛（MDA）等标志物，这些方面在先前的研究中尚未得到充分探索。 材料与方法 植物材料与精油制备 牛至（全草）在克利文杰装置（埃及开罗AlBouroge公司）中进行了5小时的水蒸气蒸馏。所产精油呈淡黄色，具有草本甜香气味。该精油购自埃及开罗的Somitt芳香公司，装于深色瓶中。 气相色谱/质谱（GC/MS）分析 气相色谱/火焰离子化检测器分析 GC/FID分析在Varian 3400仪器（Varian GmbH，德国达姆施塔特）上进行，该仪器配备有FID检测器和Rtx-5MS熔融键合硅胶柱（30米×0.25毫米内径；膜厚度：0.25微米；美国俄亥俄州俄亥俄河谷）；操作条件如下：初始柱温保持在45℃恒温2分钟，然后以5℃/分钟的速率程序升温至300℃，并保持5分钟。检测器和进样口温度分别为300℃和250℃。 样品体积为0.03微升。氦气载气流速为2毫升/分钟。使用Peak Simple 2000色谱数据系统（SRI Instruments公司，美国加利福尼亚州托兰斯）记录和积分色谱图。 气相色谱/质谱（GC/MS）分析 这些分析是在一台惠普气相色谱仪（GC HP 5890 II；德国巴德洪堡的惠普有限公司）上进行的，该色谱仪配备了与GC/FID相同的色谱柱，并在相同条件下运行。毛细管柱直接与四极杆质谱仪（SSQ 7000；德国不来梅的赛默飞世尔科技）相连。进样口温度为250℃。氦气载气的流速为2毫升/分钟。 所有质谱均在以下分析条件下记录：灯丝发射电流60毫安；电子能量70电子伏特；离子源温度200℃；扫描范围为40至400原子质量单位。稀释后的样品（使用0.5%体积分数的正己烷作为溶剂）以分流模式进样（分流比1:15）。通过将化合物的质谱数据和保留指数与《Wiley质谱数据注册表》第8版以及美国国家标准与技术研究院（NIST）质谱库（https://chemdata.nist.gov/，访问日期2023年5月1日）中的数据进行比对，对化合物进行鉴定。通过在相同实验条件下计算相对于正构烷烃同系物（C6–C22）的保留指数（RIs），并与文献中的保留指数进行匹配，进一步确认了鉴定结果。 化合物的计算机模拟药代动力学特征估算 在计算分析中，我们使用了简化分子线性输入规范（SMILES）来处理SCOP、加兰他敏（GAL）以及牛至精油（OmEO）的主要化合物（反式水合桧烯、4-萜品醇、乙酸芳樟酯、石竹烯氧化物和α-萜品醇）。这些数据是2023年11月从PubChem平台获取的。研究使用了五个免费计算器，如PASS Online、SwissADME、pKCSM、ADMETlab 2.0和ProTox-II。为了对从不同网站获得的预测结果与实验数据进行比较，必须对测量单位（如溶解度、log S和清除率）进行标准化。对于其他参数，如吸光度和渗透性，则需要将数据转换为二元类别（例如，是/否）。这一点至关重要，因为一些网站采用了不同的分类标准，而标准化处理有助于对预测结果进行评估。 选定的概率如下：1. Caco2渗透性，2. 肠道吸收（人体），3. 皮肤渗透性，4. 表观分布容积（人体），5. 血脑屏障渗透性，6. 中枢神经系统渗透性，7. 细胞色素P450 3A4底物，8. 细胞色素P450 1A2抑制剂，9. 总清除率，10. 肾脏有机阳离子转运蛋白2底物，11. 最大耐受剂量（人体），12. 大鼠经口急性毒性（半数致死量），13. 大鼠经口慢性毒性（最低可见有害作用水平），14. 肝毒性，15. 皮肤致敏性，16. 呼吸毒性。 估计的毒性途径 为了评估SCOP、GAL、反式桧烯水合物、松油烯-4-醇、乙酸芳樟酯、石竹烯氧化物和α-松油醇的毒性途径，使用了ADMETlab 2.0工具以及ProTox-II，后者的预测基于定量高通量筛选（qHTS）测定，包含来自Tox21数据集的超过10,000种化合物的化学库。这些筛选测试主要关注核受体以及细胞如何应对应激。 化合物预测与药物类比 为了评估所研究化合物在体内发挥最佳作用的结构标准，我们使用了SwissADME在线工具，计算了主要的药物设计规则，如Lipinski规则、Weber规则、Ghose规则和Egan规则。这些计算方法基于在大型数据集上训练的算法，并通过交叉验证具有较高的准确性。Lipinski规则涉及以下标准：（1）分子质量必须低于500道尔顿；（2）氢键供体的最大数量为10；（3）氢键受体的最大数量为5；（4）辛醇/水分配系数的对数（Log P(o/w)）必须低于5。Weber规则涉及分子中旋转键的数量（也称为规则复杂度）。戈斯规则施加了以下限制：（1）分子质量必须在160至480道尔顿之间；（2）辛醇/水分配系数的对数（Log P(o/w)）必须在0.4至5.6之间；（3）折射率必须在40至130之间；（4）原子总数必须在40至130之间，这一点可作为一种分子描述符。 伊根法则主要关注肝脏毒性，其依据如下参数：（1）肝脏毒性指数。该指数根据分子的某些化学性质计算得出，且必须低于特定的规定阈值；（2）水溶性与辛醇溶解度的比值（Log P（o/w））。该比值必须处于特定范围内，以表明肝脏毒性的可能性降低。 动物与研究设计 本研究旨在阐明牛至精油（OmEO）对斑马鱼认知过程、类焦虑行为及氧化状态的神经药理学影响。为此，研究使用了100条成年野生型斑马鱼（莱茵河鲃，图宾根品系），年龄为5-7个月，鳍较短。雌雄比例为1:1。这些鱼的平均体长在3至4厘米之间。本研究中所有的鱼均购自德国毒理学与遗传学研究所的欧洲斑马鱼资源中心。购买后，本研究中使用的所有动物立即被隔离在60升的水箱中，并监测两周。之后，所有斑马鱼以10条为一组进行饲养，饲养在一个由透明玻璃制成的水箱，内装有10升经Tetra AquaSafe（德国梅勒的Tetra公司产品）处理过的除氯水，每两天更换一次。水温保持在28±2℃。水质每天监测两次（上午8点和晚上8点），并维持在以下参数范围内：pH值在7至7.5之间，溶解氧在8±1 mg/L范围内，电导率在1500至1600 µS/cm之间，氨和亚硝酸盐含量低于0.001 mg/L，光照周期为14小时光照和10小时黑暗的标准模式。实验动物每天喂食三次（上午8点、下午2点和晚上8点），所用饲料为Norwin Norvitall薄片饲料（丹麦加斯特鲁普的Norwin公司产品），喂食量以鱼类在10分钟内可吃完为宜。喂食期间关闭气泵，以方便鱼类摄食。关于动物研究的伦理问题，所有动物操作均遵循欧洲议会2010/63/EU号指令，并经过罗马尼亚雅西亚历山德鲁·扬·库扎大学生物学院动物研究伦理委员会批准（编号1714/2023年7月6日）。 这些动物被随机分为10个实验组，如图1A所示：（I）对照组；（II）加兰他敏（GAL，1 mg/L）处理组，在行为学和生化测试中作为阳性对照组；（III、IV和V）三个牛至精油（OmEO）处理组，浓度分别为25、150和300 µL/L；（VI）东莨菪碱（SCOP，100 µM）处理组；（VII）SCOP（100 µM）+GAL（1 mg/L）处理组；（VIII、IX和X）三个SCOP（100 µM）+OmEO处理组，OmEO浓度分别为25、150和300 µL/L。在行为学测试和安乐死之前，（II）组和（VII）组的鱼均在500 mL贝采利乌斯量筒中单独接受GAL（1 mg/L）处理，持续3分钟。实验组III–V和VIII–X的鱼接受牛至精油的慢性处理，牛至精油先溶解在1%吐温80溶液中，浓度分别为25、150和300 µL/L，随鱼缸换水进行给药。处理剂量的选择基于以往的报道，其中已证实，精油在微升每升范围内的低浓度下，可有效调节斑马鱼的记忆缺陷。在新型水槽测试（NTT）和安乐死程序前，通过SCOP（100 µM）处理30分钟诱导斑马鱼出现类似痴呆的状态。对于Y型迷宫测试和新物体识别测试（NOR），在训练结束30分钟后给予SCOP（100 µM）。这是按照先前研究中已确立并详述的方法进行的。该浓度已被证实能有效诱导认知缺陷、焦虑，以及胆碱能损伤和氧化失衡。 在实验组VII中，根据图1B所示，鱼在施用东莨菪碱（SCOP，100µM）后，额外接受了1mg/L的GAL处理，持续3分钟。此外，我们通过基于R语言（版本4.4.2）的统计软件包InVivoStat v4.10确认，(n=10 fish/group)是合适的。在显著性水平为0.05的情况下，检测20%生物学相关变化的检验效能为98%。 为了减少偏差，每组鱼的数量保持平衡（n=10），且试验条件一致。此外，负责评估生化和行为参数的人员并不知晓所施加的处理方式。 图1. 本研究实验设计的示意图。（A）实验组；（B）行为学和生化测试。 行为分析 为了评估OmEO对本研究中受试动物行为的影响，我们使用罗技HD网络摄像头C922 Pro Stream（罗技公司，瑞士洛桑）监测了斑马鱼的活动。随后，使用美国伊利诺伊州伍德戴尔市Stoelting公司提供的ANY maze® 7.44软件对获得的视频进行了分析。 新型水槽潜水试验 斑马鱼在进入新的陌生环境时会自然表现出焦虑情绪。为了评估这些行为，人们开发了许多测试方法，例如新型水槽潜水试验（NTT）。该试验利用了斑马鱼的自然潜水反应，非常适合评估焦虑程度，同时还具有可靠的表面效度。新型水槽潜水试验也经过了结构验证，因为已有研究表明，抗焦虑药物和致焦虑药物都会影响鱼类在试验中的反应强度。这凸显了在斑马鱼焦虑相关研究中使用新型水槽潜水试验的价值。 为了评估OmEO对对照组斑马鱼以及在新鱼缸试验（NTT）中经东莨菪碱（SCOP，100μM）处理的斑马鱼，还有在新鱼缸试验中接受东莨菪碱（100μM）急性处理的斑马鱼焦虑状态的影响，采用了Cachat等人建立的方案。为此，使用了一个带有梯形壁的玻璃缸，该玻璃缸具有完美的透明度（图2A）。这个玻璃缸的尺寸如下：高度15.1厘米，底部长度23.9厘米，顶部长度28.9厘米，宽度6.1厘米。该玻璃缸实际上被分为两个相等的水平部分：一个上部和一个下部（图2A）。 图2. 新型水槽潜水试验（NTT）。（A）用于评估斑马鱼在NTT试验中行为的水槽及其尺寸：（a）水槽的顶部区域和（b）水槽的底部区域。（B）试验的实验装置。 测试期间，水箱中注入了1.5升取自鱼类饲养缸的水，并放置在平坦的白色表面上。每条鱼样本单独测试一次，时长为6分钟（图2B）。在此期间，类焦虑行为通过潜伏期（秒）、在水箱顶部区域停留的时间（秒）和移动的距离（米）来衡量。计算进入顶部区域潜伏期（秒）的公式为（首次进入顶部区域的时间）减去（测试开始时间）。此外，在新环境测试（NTT）中，我们通过记录以下参数来评估斑马鱼与运动相关的表型：静止持续时间（秒）和鱼的平均游泳速度（米/秒）。因此，这些测量使我们能够研究鱼类在新环境中的类焦虑行为和运动反应。 Y迷宫实验 斑马鱼被用作研究学习和记忆表现的药理学模型，对这些方面的评估包括监测多种行为类型，其中有运动能力（斑马鱼如何移动和探索其所处环境）、类焦虑情绪（鱼类对有压力或威胁性情境的反应）以及认知能力（对认知技能的评估，如学习、物体识别和空间记忆）。作为一种模式生物，斑马鱼并不能用于评估所有形式的记忆。与啮齿类动物模型类似，斑马鱼主要被用于研究三种常见的记忆类型：空间记忆、识别记忆和联想记忆。为了评估记忆，在训练阶段（熟悉过程）和实际测试阶段之间需要一段延迟时间。使用Y型迷宫有几个显著的优势。首先，它是一种简单有效的记忆评估方法，训练过程可以快速进行。这使得可以进行特定的记忆训练，而无需涉及复杂的条件学习。此外，Y型迷宫能将可能影响动物表现的潜在因素（如情绪和动机状态）降到最低。通过这种方法，在受控且标准化的环境中，可以更清晰、更有针对性地评估动物的记忆和行为反应。为了评估OmEO对斑马鱼空间记忆和新奇反应的影响，我们按照Cognato等人建立的方案使用了Y迷宫测试。用于Y迷宫的水槽是由透明玻璃制成的Y形结构。该水槽由三个相等的臂组成，每个臂长25厘米、宽8厘米、高15厘米，形成120°的夹角（图3A）。为便于视频分析，水槽底部覆盖白色塑料材料，其余区域覆盖黑色塑料，内部还贴有正方形、圆形和三角形等几何形状的视觉线索（图3B）。第一个（训练）阶段为5分钟，在此期间，鱼只被允许探索迷宫三个臂中的两个，即起始臂和熟悉臂，而代表新奇臂的第三个臂在该阶段被阻挡（图3B）。在Y迷宫测试中，迷宫中心被视为预选区域，不纳入结果的分析和解释。测试阶段在训练阶段结束一小时后进行（图3B）。在测试阶段，鱼再次被放入同一起始臂，但可以自由进入所有三个臂，持续5分钟。鱼对新奇事物的反应能力通过安装在水槽上方天花板上的摄像头进行记录。随后对记录进行检查，以确定自发交替率（%）、转向角度（°）以及鱼在新奇臂中花费的时间相对于起始臂和熟悉臂的百分比（%）。自发交替率的计算公式为（交替次数/总可能交替次数）×100。计算鱼在新奇臂中花费的时间相对于起始臂和熟悉臂的百分比时，使用以下公式：（在新奇臂中花费的时间/在所有臂中花费的总时间）×100。 图3. Y型迷宫。(A) 用于评估斑马鱼在Y型迷宫测试中行为的水槽及其尺寸；(B) 测试的实验装置。 新物体识别测试 新物体识别测试（NOR）已成为记忆神经生物学研究中的基本工具。这些研究被用于探究广泛的记忆过程，例如信息的获取、巩固（及再巩固）和重新获取，同时能够详细揭示参与这些过程的大脑机制。 为了确定OmEO是否有可能对斑马鱼的恢复记忆产生影响，研究采用了Stefanello等人建立的方案进行新物体识别（NOR）测试。在该测试中，我们使用了一个宽和高均为30厘米的立方体形玻璃缸（图4A）。玻璃缸的外壁覆盖有黑色布料，这样既能减轻测试过程中鱼的压力，又能将实验误差降至最低。玻璃缸放置在平坦的表面上，注入来自鱼类饲养缸的水，水位距离测试缸上边缘5厘米。选择这一水位是为了让鱼能够水平游动，从而减少它们在测试过程中的垂直活动。  测试为期四天（图4B）。在前三天，每条鱼每天有两次机会在测试缸中适应5分钟，两次适应之间的间隔为5小时。训练环节在最后一次适应环节结束12小时后进行，让鱼对两个相同的物体（边长为2.5厘米的黄色立方体）进行10分钟的探索。这两个立方体被放置在玻璃缸的两个角落，呈平行摆放，彼此间距10厘米。训练环节结束后，有1小时的 retention期。在此期间，其中一个黄色立方体被换成了白色立方体。因此，黄色立方体被视为熟悉物体（F），白色立方体被视为新物体（N）。在测试环节中，每条鱼有10分钟的时间探索这两个立方体。鱼的识别记忆通过其偏好百分比来评估。鱼对两个立方体中某一个的偏好百分比（计算方法为探索新物体的时间与探索熟悉物体的时间之差）按照以下公式确定：（探索新物体的时间）（探索熟悉物体的时间 + 探索新物体的时间）× 100。 图4. 新物体识别测试（NOR）。（A）用于评估斑马鱼在NOR测试中行为的水槽及其尺寸；（B）该测试的实验装置。 匀浆的制备和生化参数的分析 在上一次行为测试结束后，研究中的动物立即被单独转移到装满冰水的玻璃容器中（温度范围为（2–4摄氏度），持续10分钟。随后，按照既定程序和先前所述，通过断头术迅速且人道地对动物实施安乐死。完整取出大脑，仔细称重后转移至0.5毫升的试管。这些样本随后被储存在–20°C的低温下，直到用于后续步骤。第二天，从同一组动物中取出的鱼脑被逐个称重（每个重量约在3–6毫克范围内），然后按照1:10的比例在磷酸盐提取缓冲液（0.1M磷酸钾缓冲液，pH 7.4，其中氯化钾的添加浓度为1.15%）中匀浆。匀浆过程使用球磨机（Mikro-Dismembrator U；赛多利斯，纽约，美国）进行。匀浆后，所得悬浮液以14,000转/分钟的速度离心15分钟，随后上清液用于测定生化参数。 乙酰胆碱酯酶活性的测定 为了评估斑马鱼脑匀浆中的乙酰胆碱酯酶（AChE）活性，我们采用了Ellman论文中详细描述的光度法。将碘化乙酰硫代胆碱（ATCh）混合物（购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma公司）与二硫代双硝基苯甲酸（DTNB）试剂（购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma公司）在磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中混合。碘化ATCh发生水解，生成硫代胆碱和乙酸根离子。随后，通过分光光度法在412 nm波长处测量酶活性，监测硫代胆碱与DTNB反应后产生的黄色物质的生成速率。酶活性以每分钟每毫克蛋白质中ATCh的纳摩尔数表示。脑样本的蛋白质含量采用Bradford法测定。 超氧化物歧化酶活性的测定 在本研究中，我们采用Winterbourn等人改良的方案评估了超氧化物歧化酶（SOD）的比活性。该酶能够抑制超氧自由基对硝基蓝四唑（NBT）的还原作用，而超氧自由基是通过核黄素在反应介质中的光还原产生的，我们对这种抑制能力进行了测定。样品中含有0.067 M磷酸钾、酶提取物、0.1 M乙二胺四乙酸（EDTA）、0.12 mM核黄素和1.5 mM硝基蓝四唑（NBT），在560 nm处测定吸光度。超氧化物歧化酶（SOD）的比活性以每毫克蛋白质的酶单位表示，这是采用Bradford法测定的。因此，我们以一种定制化且标准化的方式有效地评估了酶活性。 过氧化氢酶活性的测定 为了评估过氧化氢酶（CAT）活性，我们采用了Sinha最初描述的一种简单比色法。首先，将125微升的酶匀浆和125微升的0.16M (H_{2} O_{2})底物溶液移液至反应池中。3分钟后，通过加入500微升重铬酸钾-冰醋酸溶液终止反应，并将试管在95℃下孵育。10分钟后，将试管以14,000转/分钟的速度离心5分钟，然后在570纳米处读取上清液的吸光度。酶活性以每分钟每毫克蛋白质消耗的(H_{2} O_{2})皮摩尔数表示。蛋白质的量采用Bradford法测定。 谷胱甘肽过氧化物酶活性的测定 在本研究中，谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）的比活性是按照Fukuzawa和Tokumura详述的步骤测定的。该方法基于GPX以谷胱甘肽（GSH）为还原剂催化(H_{2} O_{2})分解的能力。此反应会生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）和水等产物。如先前报道[40]所述，实验步骤为：向各1.5 mL离心管中加入特定体积的酶提取物、磷酸钠缓冲液、EDTA溶液和Na (NaN_{3})溶液。在37℃下孵育10分钟后，向每个离心管中补充GSH和(H_{2} O_{2})溶液，随后在相同温度下再孵育10分钟。然后用偏磷酸终止反应，并进行离心。获取上清液所遵循的步骤如下。为评估酶活性，将上清液转移至新试管中，并向其中加入磷酸二钠溶液和DTNB溶液。经过精确的10分钟间隔后，在412纳米处测量吸光度。将此结果与包含蒸馏水、(Na_{2} HPO_{2})溶液和DTNB溶液的参考混合液的吸光度进行比较。结果为谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）比活性的计算值，以每毫克蛋白质的酶单位表示；蛋白质的含量采用Bradford法测定。 还原型谷胱甘肽含量的测定 在本研究中，我们采用了Salbitani等人详述的方法来测定还原型谷胱甘肽（GSH）的含量。具体操作如下：向微量离心管中加入70微升蒸馏水、1100微升(0.3 M Na_{2} HPO_{4})溶液、200微升匀浆以及130微升0.04%的DTNB溶液。将管中的试剂混合后，以对照溶液（不含匀浆）为参照，在412纳米波长下通过分光光度法测定GSH含量。最后，将GSH的量与蛋白质浓度相关联，结果以每毫克蛋白质中GSH的微克数表示。蛋白质的含量采用Bradford法测定。 羰基化蛋白水平的测定 通过测量蛋白质羰基的含量来评估脑蛋白的氧化程度，所采用的方法最初由Oliver等人描述。得到上清液部分后，将其分成两等份，每份含有约2毫克蛋白质。随后，两份样品均用10%三氯乙酸（TCA）进行沉淀处理，直至达到最终浓度。另一份样品用2N盐酸处理，而第三份样品则用含0.2%二硝基苯肼（DNPH）的2N盐酸溶液以同等比例处理。 体积。然后将两个样本均在25℃下孵育，并每隔5分钟振荡一次。所得结果以每毫克蛋白质中的羰基基团纳摩尔数表示。这是所分析脑样本中蛋白质氧化水平的一种衡量指标。 丙二醛水平的测定 斑马鱼大脑中脂质过氧化水平（MDA水平）的评估是按照Ohkawa等人详述的方案进行的。该方法基于动物组织中的脂质过氧化物与硫代巴比妥酸的相互作用，产生粉红色。在532纳米处测量了这种颜色的强度。该程序可准确评估所分析脑样本中脂质过氧化的程度，从而能够研究斑马鱼脑组织中的氧化应激水平。 统计分析 结果以平均值±均值标准误（SEMs）表示。采用双因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验，以处理因素为考量，分析组间均值差异。统计学显著性水平设定为(p<0.05)。统计学分析使用GraphPad Prism 9.4软件（GraphPad Software, Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥）。我们还采用皮尔逊相关系数（r）评估了行为评分与酶活性及脂质过氧化水平之间的相关性。 结果 马郁兰精油的化学成分 气相色谱/质谱分析共鉴定出17种成分，占OmEO的93.52%，如表1所示。主要化合物为反式桧烯水合物（36.11%）、4-萜品醇（17.97%）、乙酸芳樟酯（9.18%）、石竹烯氧化物（8.25%）和α-萜品醇（6.17%）。 表1. 通过气相色谱/质谱法鉴定牛至精油化合物。 Cal：计算的；Lit：文献；u.i.：未鉴定的；RI：保留指数；MS：质谱。 化合物的药代动力学特征 化合物的ADMET特性，包括吸收、分布、代谢、排泄和毒性，是评估其成药潜力的关键方面。尽管有评估这些特性的实验方法，但计算方法因其在分析所需的成本和时间方面具有高效性而变得越来越受欢迎。其中一些ADMET特性在阿尔茨海默病（AD）等疾病的治疗方法开发以及具有神经保护潜力的化合物研发中尤为重要。不存在适用于所有候选药物的理想药代动力学行为，因为这取决于目标治疗的具体要求。这种药代动力学要求的多样性源于治疗方法的多样性。为了达到最佳治疗效果，药物必须具备与其特定靶点相匹配的适当药代动力学特征。在这种情况下，药物的药理特性对于实现预期的生物效应同时最大限度地减少相关不良反应至关重要。为了预测SCOP、GAL以及牛至精油（OmEO）的主要化合物（反式-水合桧烯、4-萜品醇、乙酸芳樟酯、石竹烯氧化物和α-萜品醇）的特性（图5），使用了五个不同的平台，即PASS Online、SwissADME、pKCSM、ADMETlab 2.0和ProTox-II。 图5. 东莨菪碱（SCOP）、加兰他敏（GAL）以及牛至精油主要化合物（反式-水合桧烯、4-萜品醇、乙酸芳樟酯、石竹烯氧化物和α-萜品醇）的化学结构。 对以数值形式表示的ADMET数据（表观渗透系数log Papp，单位为10⁻⁶ cm/s）的解读表明，数值高于0.9阈值的物质具有良好的Caco2渗透性，而数值低于0.9的物质则表现出低渗透性甚至无Caco2渗透性。在肠道吸收方面，吸收率低于30%的物质属于吸收不良。此外，一个分子要具有皮肤渗透性，其log Kp值必须＞-2.5。我们的药基因组学预测结果（如表2所示）显示，通过Caco2渗透性、人体肠道吸收率和皮肤渗透性评估（除GAL外，其log Kp值＞-3.75），GAL、反式桧烯水合物、松油烯-4-醇、乙酸芳樟酯、石竹烯氧化物和α-松油醇均表现出高吸收率。关于SCOP，我们的预测数据显示其Caco2渗透性较低（0.059），皮肤渗透性也较低（-4.097），但肠道吸收率较高（72.626）。为了预测药物给药后在体内的分布情况，我们计算了分布容积（VDss）、未结合分数（人体）、血脑屏障（BBB）渗透性和中枢神经系统（CNS）渗透性。通常，在静脉给药期间对药物血药浓度曲线有显著影响的参数包括VDss，它用于衡量药物在人体内的分布情况。当VDss值低于0.71 L/kg（log VDss＜-0.15）时，认为其分布容积减小；当VDss值高于2.81 L/kg（log VDss＞0.45）时，则认为其分布容积增大。因此，松油烯-4-醇和乙酸芳樟酯的VDss值处于中等水平（log VDss分别为0.21和0.069），而其他化合物则具有较高的VDss值（表2）。未与血浆结合的药物有可能通过与蛋白质、酶、受体和通道等多种靶点相互作用而发挥其药理活性。在药代动力学模型的构建中，药物在血浆中的未结合分数（“fu,p”值）是决定药物疗效的关键因素。研究发现，“fu,p”值还会影响药物疗效的其他多个方面以及副作用的发生，涉及从肾小球滤过到总清除率和肝脏代谢等多个过程。我们的预测显示，石竹烯氧化物的未结合分数最小（0.327 Fu），而α-松油醇的未结合分数最大（0.565 Fu）。 表2. Caco2通透性、肠道吸收（人类）、皮肤通透性、表观分布容积（人类）、血脑屏障通透性、中枢神经系统通透性、CYP3A4底物、CYP1A2抑制、总清除率、肾脏OCT2底物、最大耐受剂量（人类）、大鼠经口急性毒性（半数致死量）、大鼠经口慢性毒性（最低观察到有害作用剂量）、肝毒性、皮肤致敏性、致癌性和呼吸道毒性的预测。 血脑屏障（BBB）是一种具有选择性的半透膜屏障，能维持中枢神经系统（CNS）的内环境平衡。评估化合物穿过血脑屏障的通透性是中枢神经系统靶向药物研发的关键环节，但这一问题难以用简单的语言概括。logBB值为(<-1)的分子在脑中的分布极差，而logBB值为(>3can)的分子则容易穿过血脑屏障。我们的预测数据显示，所有OmEO化合物都具有穿过血脑屏障的潜力，而SCOP和GAL在脑中的分布较少。 尽管母体化合物的渗透性较低，但其代谢物可能具有穿过血脑屏障的潜力。一些代谢物可能具有更强的亲脂性，或者可能作为主动转运系统的底物，从而在中枢神经系统层面发挥作用。然而，认知改善可能通过间接途径而非直接的神经元调节来介导。例如，全身性氧化应激或炎症的减轻可能改善神经元健康和认知功能。全身性生化标志物（如氧化应激标志物和炎症细胞因子）的变化可能反映出间接影响中枢神经系统稳态的外周作用。此外，某些生物活性化合物可能影响与认知相关的关键神经递质（如乙酰胆碱、多巴胺、血清素和谷氨酸）的合成、释放或降解，或者调节NMDA和AMPA受体的活性。生化制剂支持认知功能的另一种机制是，它们可能增强血管舒张并减少血小板聚集，从而增加流向大脑的氧气和营养物质。 中枢神经系统（CNS）的通透性可通过计算血脑屏障（BBB）通透性与比表面积的乘积来预测，该乘积用logPS表示。换句话说，要确定一种化合物能否进入中枢神经系统，需用到一个称为−2logPS的值。如果某一化合物的−2logPS值超过特定阈值或限值（通常为(-2 log P S>-2），则该化合物被认为具有成功穿过血脑屏障并进入中枢神经系统的潜力。相反，−3logPS值的化合物被认为无法穿透中枢神经系统。因此，−2logPS可作为化合物中枢神经系统通透性的指标。总体而言，如表2所示，除了东莨菪碱（SCOP）对中枢神经系统的通透性较低外，半乳糖（GAL）和牛至精油（OmEO）中的五种化合物对中枢神经系统均表现出中等或良好的通透性。 CYP3A4被认为是最重要的解毒P450酶，因为它能够促进多种不同结构外源性物质的代谢，从而促进它们的排泄。这包括目前使用的所有临床相关药物中的50%以上，如可待因、地西泮和氯喹。CYP3A4还参与一些类固醇和致癌物的代谢。有些药物可被P450激活，而另一些则可被灭活。从表2可以看出，SCOP和GAL与CYP3A4底物相互作用，而异桧烯水合物、萜品烯-4-醇、乙酸芳樟酯、石竹烯氧化物和α-萜品醇则不与CYP3A4底物相互作用。CYP1A2也是细胞色素P450家族中的一种酶，在体内药物和其他化学物质的代谢中发挥重要作用。CYP1A2酶的外源性底物包括多种化合物，如咖啡因、黄曲霉毒素B1和对乙酰氨基酚。这些化合物在生物转化过程中会被CYP1A2代谢，这可能会影响这些外源性物质对人体的作用。在我们测试的化合物中，只有石竹烯氧化物能与CYP1A2底物相互作用。 清除率是用于评估药物或物质从血液中清除速度的指标。它通过将消除速率（以毫克/分钟表示）与血液中该物质的浓度（以毫克/毫升表示）相关联来计算。总清除率是所有参与将药物从体内消除的不同器官和组织的清除率之和。ADMET和PkCSM预测显示，乙酸芳樟酯的清除率最高（1.627），其次是4-萜品醇（1.269）、α-萜品醇（1.219）、SCOP（1.096）、反式水合桧烯（1.011）、GAL（0.991）和石竹烯氧化物（0.905），所有这些数值均以对数单位表示（毫升每分钟每千克的对数），详见表2。有机阳离子转运蛋白2（OCT2）是一种负责有机阳离子吸收的转运蛋白，由SLC22A2基因编码。这种OCT2转运蛋白在肾脏中表达，具体位于近端小管上皮细胞的基底外侧膜上。由于其主要功能是将底物从血液转运至肾脏，OCT2在这些化合物从体内经肾脏排泄的过程中发挥着重要作用。我们的预测表明，在所分析的化合物中，只有GAL能与OCT2底物相互作用。药物毒性和安全性评估是药物发现与开发过程中的重要环节。目前，肝脏、心脏、肾脏和大脑等器官的药物毒性占药物退市原因的70%以上。 毫克每千克每天对数值小于或等于0.477的物质被认为在人体中具有低耐受性，而超过该值的物质则被认为具有高耐受性。根据ADMET和PkCSM，SCOP（-0.319）、GAL（-0.423）和石竹烯氧化物（0.148）表现出低耐受性，反式桧烯水合物（0.637）、萜品烯-4-醇（0.857）、乙酸芳樟酯（0.547）和α-松油醇（0.886）具有高耐受性。在研究的化合物中，根据表2，石竹烯氧化物对大鼠的急性经口毒性最高（半数致死量为1548 mol/kg），而GAL的急性经口毒性最低（2728 mol/kg）。关于大鼠的慢性经口毒性（最低可见有害作用水平），根据表2发现，在长期施用这三种化合物的情况下，最低耐受浓度出现在SCOP（0.736 mg/kg体重/天），而最高耐受浓度出现在乙酸芳樟酯（2256 mg/kg体重/天）。 此外，我们的预测表明，在分析的化合物中，只有GAL可能具有肝毒性。关于皮肤致敏性，SCOP和GAL没有表现出致敏性；相反，OmEO中的五种化合物可能会在易感人群中引发过敏反应。物质如果经吸入、摄入、皮肤涂抹或注射后，能够诱发恶性肿瘤的形成、增加其发病率或恶性程度，或缩短肿瘤发生所需的时间，则具有致癌性。从表2中可以看出，α-松油醇和4-萜品醇可能具有致癌性。同时，SCOP、GAL和乙酸芳樟酯可能会引起呼吸系统的毒性反应。 OmEO化合物对毒性通路的影响 在毒理学研究领域，机器学习方法和化学结构描述符已被用于预测与毒性相关的生物活性。本研究基于机器学习模型，分析了牛至精油中主要化合物的毒性相关蛋白质组学特征，以预测Tox21和ADMET2.0数据集化合物毒性所涉及蛋白质的最显著特征。Tox21是治疗发现平台CANDO（新型药物机会的计算分析）的一部分。Tox21包含超过10,000种化合物，并提供多种信息，包括12种体外测定，其中7种与核受体（NR）信号传导相关，5种来自应激反应（SR）通路，但其特点是化合物类别之间存在显著的不平衡。在此，我们使用Tox21来预测化合物的活性（有毒或无毒），从而确定我们研究中的哪些化合物会影响六种核受体（AR、AR-LBD、ER、ER-LBD、AhR和PPAR-γ）和五种应激反应通路（ARE、ATAD5、HSE、人体中的MMP和p53）。使用ADMETlab 2.0和ProTox-II运行后获得的数据如表3所示。 表3. Tox21通路预测。 NR-AR——雄激素受体；NR-AR-LBD——雄激素受体配体结合域；NR-AhR——芳香烃受体；NR-ER——雌激素域；NR-ER-LBD——雌激素域配体结合域；NR-PPAR-γ——过氧化物酶体增殖物激活受体γ；SR-ARE——抗氧化反应元件；SR-ATAD5——含AAA结构域的ATP酶家族蛋白5；SR-HSE——热休克因子反应元件；MMP——线粒体膜电位；SR-p53——肿瘤蛋白P53。 化合物药代动力学性质的相似性 在药物化学性质方面，我们选取了五个互补的类药规则，包括Lipinski规则、Weber规则、Ghose规则和Egan规则，同时还计算了生物利用度评分。这些规则是在世界知名制药公司的长期药物研发过程中逐步形成的。对于上述化合物，我们计算了其理化性质，如分子量、疏水性、氢键供体和受体原子数量、可旋转键数量、极性分子表面积（表4）等。当发现化合物的这些性质超标时，就认为该化合物不符合药物的标准。这种分析有助于评估这些化合物的成药潜力。 表4. 化合物的性质。 所选化合物的计算类药性和药物化学性质如表5所示。根据所得结果，SCOP和GAL化合物符合所使用的所有五种筛选条件（Lipinski、Ghose、Veber、Egan和Muegge），没有任何违反情况。相比之下，其他化合物主要存在于OmEO中。（水合反式桧烯、4-萜品醇、乙酸芳樟酯、石竹烯氧化物和α-萜品醇）至少违反了这些类药筛选条件中的一项。对所有化合物计算得出的雅培生物利用度评分将它们归入55%概率类别，详见表5。 表5. 本研究中所分析化合物的类药性和药物化学性质的估计药代动力学参数。 OmEO在新型水槽潜水试验中对类焦虑行为的影响 焦虑是许多情感障碍的一个特征，是新药研发或现有药物重新评估的重要研究课题。为了研究这一问题，斑马鱼被广泛用于情感障碍的神经科学研究，尤其侧重于焦虑研究。新型水槽潜水试验（NTT）是许多研究团队用于分析焦虑或应激状态下游泳行为的重要方法。成年斑马鱼在新型水槽潜水试验中的行为表明，它们最初会下沉并停留在水槽底部，然后逐渐适应水槽的其他空间。这种特定行为与预防性的反捕食者反应相关，随后焦虑水平会降低。这一解释基于以下观察结果：在实验室条件下，适应环境的斑马鱼白天大部分时间都在水槽表面活动。 在新水槽试验（NTT）中，在整个6分钟的测试过程中观察到了不同的运动行为模式（图6A）。对照组表现出斑马鱼在NTT中的典型行为。相比之下，经东莨菪碱（SCOP，100µM）处理的组对底部区域的偏好增加。关于经不同浓度牛至精油（OmEO，25、150和300µL/L）处理的斑马鱼的运动行为模式，我们观察到它们表现出与对照组相似的运动行为。在上述浓度的OmEO处理后再经SCOP（100µM）处理的鱼中，也记录到了类似的行为。同样，经加兰他敏（GAL，1mg/L）处理的组以及经SCOP（100µM）+GAL（1mg/L）处理的组，其运动活动与对照组鱼的运动活动相似。Tukey事后分析显示，SCOP（100µM）处理增加了潜伏期（p<0.0001)（图6B），减少了鱼在顶部区域的停留时间（p<0.01）和移动距离（p<0.05）（图6C、D），增加了冻结时间（p<0.01)（图6E），并降低了平均游泳速度（p<0.05）（图6F）。所有这些行为变化表明，SCOP可诱导焦虑样反应和运动活动减少反应。 图6. 在新鱼缸实验（NTT）中，分别给予浓度为25、150和300 µL/L的马郁兰精油（OmEO）处理对原生斑马鱼和东莨菪碱（SCOP，100 µM）处理的斑马鱼产生的影响。加兰他敏（GAL，1 mg/L）被用作阳性对照（A）。斑马鱼在新鱼缸实验中游泳情况的图示。（B）鱼开始探索鱼缸顶部区域所需的潜伏期（秒）。（C）鱼在鱼缸顶部区域花费的时间。（D）鱼在鱼缸顶部区域游动的距离。（E）静止持续时间。（F）斑马鱼在新鱼缸实验（NTT）中的游动速度。数值以平均值±标准误表示（每组10只动物）。在Tukey事后分析中，*p < 0.05，**p < 0.01，****p < 0.0001。 本研究中观察到的东莨菪碱（SCOP）效应与Hamilton等人先前发表的结果相反，他们的研究表明东莨菪碱具有抗焦虑作用，并描述了一种双相关系，在800μM浓度时效果达到最大值。此外，在他们的研究中，东莨菪碱（800μM浓度）在群体行为测试中显示出抗焦虑作用，显著降低了动物的逃跑倾向。然而，使用东莨菪碱（100μM）产生的效应可能与其较低的浓度和急性给药有关。就此而言，de Abreau等人指出，在人体中急性给予东莨菪碱可能会引起混乱、焦虑、恐惧、躁动和易怒，这可能是由于其众所周知的兴奋作用叠加或包含其中，而这种兴奋作用可能导致谵妄状态。同样，Abdelghany等人注意到，东莨菪碱会引发焦虑、回避和恐惧，同时它也被用于治疗人类的恶心和晕动病。与此一致的是，美国食品药品监督管理局（FDA）将坐立不安、混乱、躁动和幻觉列为东莨菪碱在人体中可能产生的副作用。此外，Ramandeep等人将东莨菪碱描述为一种用于研究神经表型的可靠且明确的行为模型，特别是在斑马鱼焦虑状态的产生方面。 如图6B所示，长期给予浓度为150和300 µL/L的OmEO可延长斑马鱼在鱼缸顶部区域游动的潜伏期（p<0.05），而浓度为25 µL/L时则无此效果。关于OmEO对东莨菪碱（SCOP）诱导的健忘斑马鱼模型的影响，观察到只有在最高浓度（150和300 µL/L）时，OmEO才能缩短潜伏期（p<0.05）。此外，Tukey事后分析显示，各实验组鱼之间存在统计学差异（III、IV、V组与VIII、IX、X组）（p<0.0001），这凸显了OmEO对斑马鱼的抗焦虑作用。另外，反映在鱼缸顶部区域停留时间的数据也支持了OmEO的抗焦虑效果。从图6C可以看出，浓度为300 µL/L的OmEO能够恢复鱼在鱼缸顶部区域的停留时间（p<0.01）。然而，OmEO的两个较低浓度组（25和150 µL/L）与VI组中经SCOP处理的鱼之间未观察到显著性差异。同时，对X组动物给予浓度为300 µL/L的OmEO处理，通过显著增加在鱼缸顶部区域的移动距离（p<0.05）（图6D）、缩短冻结持续时间（p<0.01）（图6E）以及恢复斑马鱼在新型水槽实验（NTT）中的平均游泳速度（p<0.05）（图6F），成功对抗了SCOP诱导的运动机能减退效应。 在我们的研究中，在接受GAL处理的组内，与对照组或SCOP处理组相比，未观察到统计学上的显著差异（图6F）。这可能是由于潜在的内源性防御机制掩盖了组间差异，例如抗氧化酶或神经递质活性的增强。 我们的研究结果与文献中的结果一致。Amaghnouje等人发现，给实验室小鼠口服马郁兰的水乙醇提取物，能通过增加其在明暗箱试验中对明亮区域的探索及停留时间，产生显著的抗焦虑和抗抑郁效果，这种行为与溴西泮诱导的行为相似。此外，Tripathy等人表明，马郁兰（O. majorana）可作为神经系统的滋补剂，有助于增强神经系统功能，而且这种植物具有抗焦虑潜力，在传统医学中被用于缓解压力和紧张情绪。 通过Y迷宫实验评估OmEO对斑马鱼空间记忆的影响 空间记忆是指保留与重要位置相关信息的能力，这些位置包括家、食物来源地或其他相关场所，这是一种在从无脊椎动物到人类等多种物种中都能观察到的现象。这种记忆形式涉及到对多种类型信息或线索的运用，其中视觉地标、距离和方向在空间信息的存储和提取中往往起着关键作用。在诊断阿尔茨海默病（AD）时，需要注意空间定向障碍可能是这种疾病的早期表现之一。具体来说，超过60%的这类痴呆症患者存在空间记忆缺陷，并表现出漫游行为。 为了评估OmEO对空间记忆的影响，研究人员对斑马鱼进行了Y型迷宫测试，并记录和分析了其自发交替率（%）、转弯角度（°）以及在新臂中花费的时间（%）。图7A展示了在不同测试组中观察到的斑马鱼的特定运动模式。在Y迷宫任务中，Tukey事后分析显示，与未接受东莨菪碱（SCOP）处理的斑马鱼（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组）相比，接受SCOP处理的斑马鱼（Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ组）的自发交替百分比更低（p<0.01）（图7B），转弯角度减小（◦p<0.001）（图7C），在新臂中停留的时间更短（p<0.05）（图7D）。这些行为变化表明，SCOP会影响斑马鱼的运动活动，并导致其认知过程受损。此前，大量研究强调了SCOP在啮齿类动物[98,99]和斑马鱼中引起的记忆缺陷。Tukey事后分析显示，与对照组（Ⅰ组）相比，牛至精油（OmEO）处理组（Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ组）未产生影响，这表明OmEO不会影响正常斑马鱼的记忆或运动能力。 图7. 在Y型迷宫中，分别对正常斑马鱼和东莨菪碱（SCOP，100μM）处理的斑马鱼施用浓度为25、150和300μL/L的马郁兰精油（OmEO）的效果。加兰他敏（GAL，1mg/L）用作阳性对照。（A）斑马鱼在Y型迷宫第二次测试中的路线图示。（B）自发交替率（%）。（C）转向角度（°）。（D）鱼类在新臂中花费的时间占比（%）。数值以平均值±标准误表示（每组(n=10)只动物）。对于Tukey事后分析，**p<0.05   **p<0.01，以及 ***p<0.001。 关于OmEO对经SCOP急性处理的鱼类（VII、IX和X组）的影响，观察到只有浓度为300 µL/L的OmEO能够恢复自发交替百分比（p<0.05)（图7B）。此外，OmEO对斑马鱼的运动能力有统计学上的显著影响，尤其是在300 µL/L的浓度下，能够恢复斑马鱼的转向角度（°）（p<0.01)，且在较低浓度（25和150 µL/L，(p<0.05）时也有显著效果（图7C）。同时，浓度为150 µL/L（p<0.05）和300 µL/L（p<0.01）的OmEO能够通过增加鱼类在Y型迷宫新臂中停留的时间，完全抑制SCOP对斑马鱼记忆的影响（p<0.001)（图7D）。这些效果与GAL的效果相似，GAL显著提高了……的百分比。 在Y迷宫中对新臂的探索（p<0.05)（图7D））。这些观察结果表明，OmEO具有防止斑马鱼记忆衰退的潜力。先前的数据表明，在Y迷宫测试中，OmEO对大鼠（Aβ1-42）的记忆表现有积极影响，并且可能对神经炎症引起的认知障碍具有保护作用。 通过新物体识别试验评估OmEO对斑马鱼参考记忆的影响 再认记忆是一种复杂的认知过程，对个体的正常功能至关重要。记忆的这一方面使我们能够识别曾经遇到过的物体、事件或人物，并将它们与新的刺激区分开来。然而，在多种神经和精神疾病中，如阿尔茨海默病（AD）或精神分裂症，再认记忆可能会受损。了解再认记忆背后的神经机制对于开发有效的治疗方法至关重要。因此，相关研究仍在继续探索这一领域，并为涉及再认记忆功能障碍疾病的治疗进展做出贡献[。斑马鱼主要在简单几何形状的再认方面得到研究，包括二维和三维形状，有报告显示它们具有再认记忆。 在新物体识别测试（NOR）中，为评估识别记忆，会让一条鱼接受这样的测试：首先让它接触两个相同的物体。一段时间延迟后，将这条鱼放回相同的环境中，该环境包含一个原来的物体和一个新物体。如果受试鱼花更多时间探索其中一个物体，这种行为可被解读为记忆的表现，因为受试鱼认出了它之前见过的物体。在本研究中，我们旨在探究OmEO是否会影响野生型斑马鱼以及经东莨菪碱（SCOP）急性处理的斑马鱼的参考记忆。这项评估使用了复杂的几何物体，即黄蓝两色的立方体。图8A显示了不同研究组中斑马鱼的典型运动模式。Tukey事后分析结果显示，与对照组相比，经100μM SCOP处理的斑马鱼对新物体（N）的偏好百分比显著降低（p<0.01)，图8B）、对新物体（N）的探索时间显著减少（p<0.05)，图8C），而对熟悉物体（F）的探索时间显著增加（p<0.01)，图8D），这表明SCOP对斑马鱼的识别记忆具有致遗忘作用。以往的数据表明，SCOP会影响猴子、啮齿类动物以及实验室鱼类的识别记忆。 相反，对经东莨菪碱（SCOP）预先急性处理的斑马鱼施用牛至精油（OmEO）（第VIII、IX和X组），以剂量依赖性方式显著提高了偏好百分比（浓度为25μL/L时为(p<0.01)，浓度为150μL/L时为(p<0.001)，浓度为300μL/L时为(p<0.0001），其水平接近加兰他敏（GAL）处理组（第VII组）（p<0.05)（图8B）。此外，在新物体识别（NOR）试验中，牛至精油在所有三个测试浓度下均能增加对新物体（N）的探索时间（25μL/L浓度时为(p<0.05)，150μL/L浓度时为(p<0.01)，300μL/L浓度时为(p<0.001）（图8C），并减少对熟悉物体（F）的探索时间，尤其是在最高浓度（300μL/L，(p<0.01）时，与仅用东莨菪碱处理的组（VI组）相比（图8D），这表明牛至精油改善了东莨菪碱对鱼类识别记忆的负面影响。此前，马郁兰（O. majorana）对识别记忆的有益作用在小鼠中也得到了强调。Raafat等人表明，马郁兰提取物通过调节抑制性甘氨酸受体（GlyRs）和逆转士的宁对小鼠的毒性，对神经退行性变具有保护作用。 图8. 在新物体识别测试（NOR）中，分别以25、150和300 µL/L的浓度施用马郁兰精油（OmEO）对原生斑马鱼和东莨菪碱（SCOP，100 µM）处理的斑马鱼的影响。加兰他敏（GAL，1 mg/L）被用作阳性对照。（A）NOR测试中测试阶段斑马鱼轨迹的图形表示。熟悉物体区域用首字母（F）表示，新物体区域用首字母（N）表示。（B）NOR测试中对两个物体之一的偏好百分比（%）（C）转向角度（°）。（D）对新物体的探索时间（秒）。数值以平均值±标准误表示（每组(n=10)只动物）。对于Tukey事后分析，**p<0.05、*p<0.01、***p<0.001和****p<0.0001)。 OmEO对乙酰胆碱酯酶活性的影响 胆碱能神经传递在阿尔茨海默病（AD）和成年型痴呆症患者的认知功能损伤中起着关键作用。多项研究发现，在与动物认知过程相关的大脑区域（如大脑皮层和海马体）中，乙酰胆碱水平较低，且在AD进展过程中，颞叶和海马体中乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性较该酶的正常活性水平有所升高。因此，目前用于治疗AD的主要药物类别（加兰他敏和多奈哌齐）是胆碱酯酶抑制剂，这并不奇怪。基于此，我们的研究旨在探究牛至精油（OmEO）对正常斑马鱼和东莨菪碱（SCOP）诱导的胆碱能损伤模型斑马鱼大脑中AChE活性的影响。 如图9所示，与对照组（Ⅰ组）相比，使用SCOP处理的Ⅵ组斑马鱼，其大脑中的乙酰胆碱酯酶（AChE）活性显著升高（p<0.0001）。令人惊讶的是，给正常斑马鱼施用牛至精油（OmEO）的Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组，与对照组相比，其AChE活性有所降低（浓度为25μL/L和150μL/L时，(p<0.01)；浓度为300μL/L时，(p<0.05）。这可能意味着牛至精油能够提高正常斑马鱼大脑中的乙酰胆碱水平，进而改善胆碱能神经递质功能，表明牛至精油在调节胆碱能神经传递方面具有潜力。先施用浓度为25、150和300μL/L的牛至精油，随后再用100μM的SCOP进行急性处理的各组斑马鱼，在这三个测试浓度下，其大脑中的AChE活性均显著降低。大脑（p<0.0001）。将这一观察结果与仅用东莨菪碱（SCOP）处理的鱼类组（第六组）进行了比较。在用东莨菪碱和加兰他敏（GAL）处理的鱼类组（第七组）中也观察到了类似的效果。因此，牛至精油（OmEO）可以防止胆碱能神经递质的降解，从而降低失忆鱼类大脑中的乙酰胆碱酯酶（AChE）水平，进而可以调节因东莨菪碱给药而不足的乙酰胆碱水平。 图9. 在正常斑马鱼和经东莨菪碱（SCOP，100μM）处理的斑马鱼中，施用浓度分别为25、150和300μL/L的马郁兰精油（OmEO）对乙酰胆碱酯酶（AChE）比活性的影响。加兰他敏（GAL，1mg/L）用作阳性对照药物。数值表示平均值±标准误（n=10）。在Tukey事后分析中，* p<0.05、**p<0.01和****p<0.0001。 OmEO对氧化应激的影响 阿尔茨海默病（AD）患者大脑中的氧化损伤显著加剧，且与β淀粉样蛋白（Aβ）斑块的异常积聚以及神经原纤维缠结的沉积相关。在正常情况下，活性氧（ROS）的生成与抗氧化系统之间保持着平衡。然而，在病理状态下，这种平衡会被打破，此时抗氧化防御机制变得不足，从而导致氧化应激的产生，并常常引发细胞凋亡。氧化应激是一种随着年龄增长而强度增加的过程，它由氧化还原平衡失调引起，涉及活性氧的过量产生或抗氧化系统的功能障碍。线粒体电子传递链在线粒体细胞色素氧化酶复合体水平消耗了近98%的分子氧。剩余的氧被还原为过氧化氢（H_{2} O_{2}）和超氧阴离子自由基（O_{2}-）。在正常代谢和各种功能过程中，(O_{2}-)和(H_{2} O_{2})作为非自由基被生成。氧化剂，以及次氯酸[。线粒体具有调节机制以防止活性氧的过度积累，并维持足够的(O_{2}-)浓度膜间隙。这些机制包括超氧化物歧化酶（SOD），其作用是通过将(O_{2}-)歧化为(H_{2} O_{2})，然后再转化为水；谷胱甘肽过氧化物酶（GPX），主要分解(O_{2}-)并将OH转化为反应性较低的形式；以及过氧化氢酶（CAT），它是过氧化物酶体中发现的另一种重要解毒酶，有助于清除(H_{2} O_{2})=。 如图10所示，就氧化状态而言，Ⅰ组的原生鱼与经OmEO处理的未处理鱼（Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组）所受影响之间没有显著差异。这可能表明OmEO对斑马鱼的氧化系统没有不良影响。然而，Tukey事后分析显示，用100μM的SCOP处理斑马鱼30分钟（Ⅵ组）后，与对照组（Ⅰ组）相比，特异性超氧化物歧化酶（SOD）活性（p<0.01)，图10A）、特异性过氧化氢酶（CAT）活性（p<0.0001)，图10B）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性（p<0.01)，图10C）、羰基化蛋白含量（p<0.001)，图10E）以及丙二醛（MDA）水平（p<0.01)，图10F）均显著降低。不过，在我们的研究中，用100μM的SCOP处理30分钟对还原型谷胱甘肽（GSH）含量没有显示出任何统计学上的显著影响（图10D）。此前，已有研究报道，在小鼠、大鼠和斑马鱼中，施用SCOP后实验动物的大脑会产生氧化应激。如图10所示，长期用OmEO处理对氧化应激具有保护作用，它能在正常生理条件下维持SOD的特异性活性（浓度为150和300μL/L时，(p<0.01）（图10A）、CAT活性（浓度为300μL/L时，(p<0.01）（图10B）以及GPX活性（浓度为25μL/L时，(p<0.05)；浓度为150μL/L时，(p<0.01)；浓度为300μL/L时，(p<0.001）（图10C）。OmEO对蛋白质羰基含量也显示出剂量依赖性影响（浓度为25μL/L时，(p<0.05)；浓度为150μL/L时，(p<0.01)；浓度为300μL/L时，(p<0.001），这与半乳糖（GAL）处理组（Ⅶ组）的情况类似（p<0.01)，图10E）。此外，浓度为150和300μL/L的OmEO降低了MDA水平（p<0.05)，图10F）。然而，OmEO对斑马鱼大脑中还原型GSH的含量没有任何影响（图10D）。先前的报道表明，阿尔茨海默病（AD）患者的MDA水平显著高于年龄匹配的对照组。此外，有报道称，AD患者的不同脑区（如颞上中回、顶叶和海马体）中蛋白质羰基含量较高。GSH是大脑中最重要的抗氧化防御分子之一。体外研究和动物研究均表明，GSH耗竭在氧化应激诱导的神经元死亡中起着重要作用，并且与包括AD在内的多种神经退行性疾病中的神经元丢失有关。 通常情况下，GPX的活性取决于谷胱甘肽（GSH）还原过氧化物的可用性，而GPX活性的降低与GSH水平的下降相关。然而，在我们的研究中，并未观察到GSH水平的变化，这表明GPX存在更复杂的调节机制，例如翻译后修饰（包括磷酸化或乙酰化），这些修饰可独立于GSH水平影响酶的效率。例如，磷酸化可激活或抑制GPX的功能，而这些变化可能受到细胞内应对氧化应激或环境因素的信号传导的影响。尽管GSH是GPX的主要底物，但它也可以利用其他化合物来还原过氧化物，如脂质过氧化物或(H_{2} O_{2})。在氧化还原失衡的环境中，即使GSH水平没有显著变化，这些底物浓度的改变也可能影响GPX的活性。此外，GPX的活性可在抗氧化网络中受到调节，该网络包括超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等酶。这些酶活性的改变可能间接影响GPX的活性，即使GSH水平保持恒定。例如，在SOD和CAT失衡的情况下，GPX可能会被更多地调动起来对抗氧化应激，从而导致其活性发生变化。在其活性中。这些机制表明，GPX活性的调节是一个复杂的过程，受多种通路和因素的影响，并非仅依赖于谷胱甘肽（GSH）水平。 图10. 在野生型斑马鱼和经东莨菪碱（SCOP，100 µM）处理的斑马鱼中，施用浓度分别为25、150和300 µL/L的马郁兰精油（OmEO）对（A）超氧化物歧化酶（SOD）、（B）过氧化氢酶（CAT）和（C）谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）比活性；（D）还原型谷胱甘肽（GSH）水平；（E）羰基化蛋白水平；以及（F）丙二醛（MDA）含量的影响。加兰他敏（GAL，1 mg/L）用作阳性对照。数值表示平均值±标准误（n=10）。对于Tukey事后分析，**p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)和(****p<0.0001)。 研究发现，GAL处理仅在调节蛋白质羰基化水平方面有效（p<0.001)（图10E）），这间接表明了其抗氧化特性。马郁兰（O. majorana L.）的抗氧化作用在Taha的研究中也有提及，该研究中，马郁兰提取物预处理显著改善了乙酸诱导的溃疡性结肠炎。这种效果可归因于该提取物的保护、抗氧化、抗炎和抗凋亡特性。此外，有报道称，阿尔茨海默病（AD）患者的不同脑区（如颞上回中部）中蛋白质羰基含量较高，而马郁兰和柳氮磺胺吡啶对乙酸诱导的大鼠溃疡性结肠炎中的氧化应激具有保护作用，表现为丙二醛（MDA）水平降低，以及一些抗氧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH））的活性升高。这些作用是通过核因子E2相关因子2/血红素氧合酶-1（Nrf2/HO-1）信号通路介导的，并且通过减轻结肠炎症，抑制核因子κB（NFκB）、肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL6）、白细胞介素23（IL23）、白细胞介素17（IL17）、环氧化酶-2（COX-2）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）等重要炎症标志物，从而导致Janus激酶2/信号转导和转录激活因子3（JAK2/STAT3）信号通路下调。此外，该研究的作者报告称，通过caspase-3进入凋亡过程的上皮细胞数量有所减少。Seif等人和Wagdy等人也提到了马郁兰（O. majorana L.）的抗氧化作用。 本研究中观察到的氧化应激标志物的变异性反映了氧化还原过程的复杂性以及与之相关的方法学局限性。首先，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、丙二醛（MDA）和羰基化蛋白等个体标志物对处理的反应不同，这可以通过抗氧化系统的补偿机制、标志物的敏感性差异以及可能的翻译后修饰（如GPX磷酸化）来解释。对谷胱甘肽（GSH）水平（GPX的一种必需底物）没有显著影响，这表明存在更复杂的调节机制，包括使用其他底物（如脂质过氧化物）或抗氧化酶之间的相互作用。此外，个体之间的变异性可归因于遗传、生理或环境差异，而处理持续时间和所用生化方法的敏感性可能会影响结果的准确性。此外，牛至精油（OmEO）和没食子酸丙酯（GAL）的抗氧化作用虽然对某些标志物而言较为明显，但并不一致，这表明两种处理之间存在潜在的机制差异，包括OmEO对Nrf2/HO-1通路的激活以及GAL特定的抗氧化特性。 行为学参数与生化参数的相关性分析 采用皮尔逊相关系数（r）来研究行为得分与酶活性及脂质过氧化之间的关系，其中包括的变量有：新物体识别实验（NTT）中鱼在水箱顶部区域停留的时间（秒）、Y型迷宫中鱼在新臂停留的时间（秒）、新物体识别实验（NOR）中的偏好度（%）、乙酰胆碱酯酶（AChE）活性、超氧化物歧化酶（SOD）比活性、过氧化氢酶（CAT）比活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）比活性，以及鱼脑内羰基化蛋白水平相对于丙二醛（MDA）水平的比值。 结果显示，在新物体识别实验（NTT）中在顶部区域花费的时间（图11A）、在Y迷宫中探索新臂的时间（图11B）、新物体识别实验（NOR）中的偏好百分比（图11C）、超氧化物歧化酶（SOD）比活性（图11E）、过氧化氢酶（CAT）比活性（图11F）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）比活性（图11G）与丙二醛（MDA）水平之间存在显著的负相关，相关系数（r）范围为：谷胱甘肽过氧化物酶与丙二醛之间为-0.6790，Y迷宫中探索新臂的时间与丙二醛水平之间为-0.7563。 相比之下，乙酰胆碱酯酶（AChE）的比活性（图11D）和羰基化蛋白水平（图11H）与丙二醛（MDA）水平呈显著正相关，相关系数（r）在0.5951至0.6096之间。这些结果表明，行为、酶活性和脂质过氧化之间存在复杂的关系，这可能为理解与治疗反应相关的病理生理机制以及对神经系统的影响提供重要见解。因此，鉴于其对氧化应激标志物的影响以及在行为测试中观察到的改善效果，牛至精油（OmEO）可能成为治疗与健忘症和焦虑相关症状的一种有前景的选择。 图11. 行为学参数与生化参数的相关性分析（皮尔逊相关）。所示数据为（A）鱼类在新缸试验（NTT）顶部区域停留的时间与丙二醛（MDA）的相关性（n = 10，r = -0.7372，p < 0.0001）；（B）鱼类在Y迷宫新臂停留的时间与MDA的相关性（n = 10，r = -0.7563，p < 0.0001）；（C）新物体识别试验（NOR）中的偏好率（%）与MDA的相关性（n = 10，r = -0.6790，p < 0.0001）；（D）乙酰胆碱酯酶（AChE）与MDA的相关性（n = 10，r = 0.6096，p < 0.001）；（E）超氧化物歧化酶（SOD）与MDA的相关性（n = 10，r = -0.7023，p < 0.0001）；（F）过氧化氢酶（CAT）与MDA的相关性（n = 10，r = -0.7120，p < 0.0001）；（G）谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）与MDA的相关性（n = 10，r = -0.6925，p < 0.0001）；（H）羰基化蛋白与MDA的相关性（n = 10，r = 0.5951，p < 0.001）。（ ）对照组，（ ）加兰他敏（GAL，1 mg/mL）组，（ ）牛至精油（OmEO，1 µL/L）组，（ ）OmEO 3 µL/L组，（ ）OmEO 6 µL/L组，（ ）东莨菪碱（SCOP，100 µM）组，（ ）SCOP（100 µM）+ GAL 1 mg/mL组，（ ）SCOP（100 µM）+ OmEO 1 µL/L组，（ ）SCOP（100 µM）+ OmEO 3 µL/L组，（ ）SCOP（100 µM）+ OmEO 6 µL/L组。 讨论 在本研究中，采用气相色谱/质谱联用技术（GC/MS）对OmEO的化学成分进行了分析，鉴定出17种化合物，占该油成分的93.52%。其中主要化合物包括反式水合桧烯（36.11%）、4-萜品醇（17.97%）、乙酸芳樟酯（9.18%）、石竹烯氧化物（8.25%）和α-萜品醇（6.17%）。这些物质与抗氧化作用和认知功能增强相关。  通过计算平台对某些化合物的ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）特性进行了评估，包括SCOP、GAL以及OmEO的主要成分（反式水合桧烯、4-萜品醇、乙酸芳樟酯、石竹烯氧化物和α-萜品醇），以预测这些化合物在人体内的行为。结果显示，GAL和OmEO化合物具有高吸收性和血脑屏障渗透性，而SCOP的渗透性较低。此外，GAL和SCOP与CYP3A4底物相互作用，而石竹烯氧化物与CYP1A2相互作用。例如，4-萜品醇和α-萜品醇被发现毒性较低，但具有潜在的致癌性，而SCOP和GAL在肝脏和呼吸系统层面表现出较高的毒性。毒性预测表明，与耐受性较低的SCOP和GAL相比，α-萜品醇和4-萜品醇具有更高的耐受性。  毒性通路分析揭示了这些化合物与核受体及应激反应通路的多种相互作用，例如石竹烯氧化物与核受体相互作用并影响氧化应激机制。在本研究中，我们使用斑马鱼作为模式生物，这是一个明显的局限性，因为从动物模型中获得的结果并不总是能直接外推到人类。尽管斑马鱼因其生物学特性提供了有价值的实验模型... 尽管它们具有透明性、生长迅速和遗传简单等逻辑特征，但其生理机能与包括人类在内的哺乳动物存在显著差异。这些差异会影响它们对治疗的反应，而且在该模型中观察到的效果并非总能直接外推到高等物种。此外，哺乳动物研究对于验证这些结果以及更深入理解马郁兰及其活性化合物在人类疾病（尤其是阿尔茨海默病）背景下可能影响认知功能和氧化应激的机制至关重要。我们研究的另一个重要局限性是实验持续时间较短，可能不足以评估马郁兰精油给药的长期效果。鉴于阿尔茨海默病等神经退行性疾病的进行性特征（这类疾病会持续数年发展），有必要开展纵向研究，以更好地了解该治疗对认知状态和氧化过程的长期影响。行为测试（Y型迷宫和新物体识别实验）表明，马郁兰精油给药改善了正常斑马鱼和东莨菪碱诱导的失忆斑马鱼的心智表现。先前的研究已证实，马郁兰精油对Aβ1-42诱导的认知缺陷大鼠的记忆表现有有益影响。这种精油还显示出减轻东莨菪碱诱导的焦虑的潜力，这一点可从斑马鱼在新型水槽上区停留时间增加得到证明。Tripathy等人此前强调了马郁兰精油的抗焦虑作用。此外，我们的结果表明，马郁兰精油可能通过调节超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，以及降低蛋白质羰基水平和丙二醛，来保护斑马鱼大脑免受氧化应激的影响。Seif等人和Wagdy等人也强调了马郁兰的抗氧化特性。关于将马郁兰精油用于阿尔茨海默病相关治疗的转化意义，所得数据表明马郁兰精油在改善与该疾病相关的认知功能障碍和氧化应激方面具有显著的治疗潜力。马郁兰精油对乙酰胆碱酯酶活性的抑制可能有助于提高乙酰胆碱水平，而乙酰胆碱是一种参与学习和记忆过程的神经递质，在阿尔茨海默病中会受到显著影响。通过降低脂质过氧化和羰基化蛋白质的标志物来减轻氧化应激，这支持了马郁兰精油可通过抑制氧化损伤（氧化损伤在疾病进展中起核心作用）提供神经元保护的假设。然而，为了支持其作为阿尔茨海默病治疗药物的应用，还需要进一步研究马郁兰精油的生物利用度、药代动力学和长期疗效，以及它与其他用于神经退行性疾病的药物疗法之间的相互作用。关于安全性，马郁兰精油的给药可能存在某些风险，在推荐将其用于治疗之前必须加以考虑。尽管在我们的研究中，马郁兰精油在改善认知表现和减轻氧化应激方面显示出有益效果，但精油可能会引起不良反应，包括皮肤刺激或过敏反应，尤其是在高剂量或长期给药的情况下。它还可能与其他药物发生相互作用，这凸显了在临床应用之前进行全面安全性评估的必要性。高剂量或长期给药可能会产生毒性作用，必须通过毒性和安全性研究来调查这些风险，以确保在患者中，特别是在患有合并症或正在接受特定药物治疗的患者中安全使用。因此，尽管我们的研究表明马郁兰及其精油在阿尔茨海默病治疗中具有广阔的潜力，但仍需要进一步的研究，包括临床前哺乳动物研究、长期安全性评估和临床调查，以证实它们在神经退行性疾病治疗中的有效性和安全性。 结论 本研究采用计算机模拟技术，预测了牛至精油中主要化合物（反式桧烯水合物、4-萜品醇、乙酸芳樟酯、石竹烯氧化物和α-萜品醇）的药代动力学特性。此外，本研究旨在探讨其作用关于OmEO对痴呆动物模型（以斑马鱼为例）记忆过程的影响。结果证实了OmEO中主要化合物的神经保护潜力，与参考药物（GAL）相比，一些已鉴定的化合物与靶蛋白表现出很强的结合亲和力。此外，ADMET结果显示，OmEO中的五种化合物均具有高吸收性和分布性，且能轻易穿过血脑屏障。毒性数据还表明，这些化合物均无肝毒性，但松油烯-4-醇和α-松油醇可能具有致癌性，乙酸芳樟酯可能对呼吸系统产生负面影响。 与我们的体内试验结果相反，我们的研究结果表明，用浓度为25、150和300微升/升的牛至精油（OmEO）长期处理后，对正常斑马鱼的行为和抗氧化状态没有影响。然而，在通过浸泡东莨菪碱（SCOP，100微摩尔）诱导的斑马鱼健忘症模型中，牛至精油（尤其是较高浓度，即300微升/升时）在新鱼缸试验（NTT）中对焦虑的斑马鱼具有显著的行为改善作用，具体表现为恢复其在顶部区域的探索时间并减少冻结期。牛至精油处理还恢复了Y型迷宫任务中的自发交替率（%），显著延长了对新臂的探索时间，以及斑马鱼在新物体识别试验（NOR）中的偏好。同时，牛至精油处理通过提高大脑的抗氧化活性水平（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶）和谷胱甘肽含量，降低羰基化蛋白水平和丙二醛含量，有效恢复了抗氧化防御机制。牛至精油还能抑制乙酰胆碱酯酶的活性，从而改善认知活动。因此，我们的研究首次证实了牛至精油对东莨菪碱处理的斑马鱼具有抗健忘和神经保护作用，并表明牛至精油是预防或控制类焦虑行为和健忘状态的潜在天然候选物。此外，这些结果为进一步研究开发认知和行为障碍的天然疗法奠定了基础。 未来的研究方向应包括利用啮齿动物模型在体内验证这些效应、开展评估在人类中疗效的临床研究、探索与其他治疗方法的相互作用，以及更深入地研究涉及的分子机制。这些研究将有助于开发治疗认知障碍的创新疗法。 如有实验需求，可扫描下方二维码或后台 私信客服~

> 2026年3月24日至26日，万邦德医药控股集团股份有限公司（002082.SZ）股价在连续三个交易日内收盘价格涨幅偏离值累计超过20%，收获两个涨停板，触发交易异常波动。 然而，在市场情绪高涨之际，公司于26日晚间发布公告，为其备受关注的创新药管线“降温”，明确提示研发具有高投入、高风险、长周期等特点，未来临床试验结果与市场竞争形势均存在不确定性。股价的短期躁动与公司的冷静警示，形成了鲜明对比。 ## 股价飙涨的多重推力 此次股价异动背后，是多重利好因素的叠加驱动。市场分析指出，核心推力来自公司在创新药研发上取得的实质性进展。 - **关键临床里程碑**：公司的重点在研产品——用于治疗阿尔茨海默病的**石杉碱甲控释片**，其II/III期关键注册临床试验已于近期完成**100例受试者入组**。 - **国家级背书**：该项目成功入选由中国科学院上海药物研究所牵头的**创新药物研发国家科技重大专项**，获得了政策与资源层面的重要认可。 - **业绩预期强劲**：2026年第一季度，公司净利润同比预增**985.4%**，扣非净利润大幅扭亏为盈，这显著提振了投资者信心。此外，公司处于由仿制药向创新药战略转型的关键期，并获得国资入股带来的战略协同想象空间。 ## 风险提示背后的行业本质 在股价狂欢中，万邦德的公告直指创新药研发的固有规律。公告强调： > “创新药（石杉碱甲系列、多肽系列等）研发具有高投入、高风险、长周期等特点，临床试验进度及结果、未来产品市场竞争形势均存在不确定性，会受到不可预测因素的影响。” 这并非泛泛而谈，而是基于现实挑战的陈述： - **高投入与长周期**：一款创新药从研发到上市通常耗时十年以上，并需持续投入巨额资金。公司表示，研发资金需求将通过**企业自有资金和适当的银行贷款**来满足。 - **高风险贯穿始终**：药物研发在临床前、临床各阶段乃至审批环节均可能失败。即便进展顺利，石杉碱甲控释片目前仍处于II/III期临床，距离最终上市销售尚有较长路程。 - **市场竞争前路未卜**：即便成功上市，产品也将面临激烈竞争。在阿尔茨海默病治疗领域，已有石杉碱甲的其他剂型（如注射液、片剂）及多奈哌齐、加兰他敏等同类机制药物，以及丁苯酞等治疗领域品种。 ## 资金流向揭示的市场博弈 涨停日的资金数据，揭示了市场内部的分化。**3月26日，万邦德股价涨停收盘，但主力资金却呈现净流出1.07亿元**，占总成交额的9.4%。与此同时，散户资金净流入8627.4万元。 这种“主力撤离、散户接盘”的资金结构，往往反映出机构投资者在短期股价冲高后的获利了结行为，以及对创新药长期投资属性的认知差异。 ## 核心管线的机遇与挑战 展望未来，万邦德创新药管线的价值兑现仍面临多重考验。 - **石杉碱甲控释片**：作为国内首个设置双主要疗效终点并检测Aβ-PET影像学的高标准研究，其旨在验证延缓疾病进展的潜力。该项目承载着应对中国近**1700万**阿尔茨海默病及相关痴呆症患者需求的期望，但高标准也意味着更高的临床开发难度与成本。 - **多肽系列新药**：针对肥胖、糖尿病等适应症的小分子多肽新药目前处于**临床前阶段**，公司称已取得良好前期数据并计划推进临床转化。其靶点与作用机制与当前火热的GLP-1类药物（如司美格鲁肽）不同，旨在提供差异化疗法。 然而，从临床前到人体试验的有效性转化，是又一重大风险关口。 市场情绪的短期波动无法掩盖创新药研发的客观规律。万邦德的公告是一次必要的风险揭示，提醒投资者在关注管线潜力与业绩增长的同时，必须正视研发过程中的不确定性、漫长的等待周期以及未来激烈的商业化竞争。 投资创新药企，本质上是投资于科学探索的概率，理性与耐心远比追逐涨停板更为重要。