Amilomotide

-01-引言阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是发生于老年期和老年前期的神经系统退行性疾病，起病隐袭且病程呈进行性发展，临床表现以获得性认知功能损害为核心症状，涉及记忆、学习、定向、理解、判断、计算、语言和视空间等认知域，不同程度地影响日常生活能力及社会职业功能，最终进展为全面性痴呆。根据GBD数据，2019年全球AD及相关痴呆的患病人数达到5162万，总体患病率为 667.2/10万，年龄标化患病率为 682.5/10万。同年，我国 AD 及相关痴呆总人数为1314 万， 大约占全球AD患者总人数的25.5%，我国AD及相关痴呆总体患病率为924.1/10万，年龄标化患病率为788.3/ 10万。目前我国国家药品监督管理局批准用于治疗 AD的一线药物包括胆碱酯酶抑制剂，如多奈哌齐、 卡巴拉汀等 ，以及N‑甲 基‑D‑门冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂美金刚。2019年国家药品监督管理局有条件批准了甘露特钠胶囊上市注册申请，用于治疗轻度至中度AD。2024 年 1 月仑卡奈单抗（lecanemab）注射液获国家药品监督管理局批准上市，用于治疗由 AD引起的 MCI和轻度痴呆。然而，这些方法多半是对症治疗，近一半的患者对现有药物治疗的效果不满，其次是药物价格贵。因此，亟须针对这些问题和痛点进一步改善我国AD患者的治疗现状。主动免疫疗法，即疫苗接种，是针对淀粉样β（Aβ）的阿尔茨海默病（AD）研究最彻底的治疗方法之一。在20多年前， AN1792疫苗在临床进行了研究，虽然因为毒性问题没有继续开发，然而人们也从中看到了疫苗预防AD的潜力。AD的疫苗预防可能改变阿尔茨海默症目前的困境。-02-一、AD的发病机制目前，AD研究的主流观点认为，AD的发病机制是Aβ与Tau蛋白的协同作用结果：Aβ的毒性级联反应Aβ由淀粉样前体蛋白（APP）裂解产生，其可溶性寡聚体（AβOs）是神经毒性的“真凶”。它们攻击突触功能，触发炎症，并诱导Tau蛋白过度磷酸化，形成NFTs。研究表明，可溶性AβOs比斑块与认知衰退的相关性更强。Tau蛋白的雪崩效应Tau蛋白过度磷酸化后脱离微管，形成NFTs，破坏神经元运输系统。这种病理过程存在“交叉播种效应”：AβOs加速Tau病变扩散，而NFTs恶化神经元死亡。炎症与免疫失衡小胶质细胞和星形胶质细胞的慢性炎症反应进一步破坏脑内稳态，形成“病理恶性循环”。-03- 二、疫苗：AD预防的免疫堡垒传统药物治疗聚焦症状缓解，疫苗则直击疾病上游，提供“治未病”的可能。其核心策略包括：1. 精准打击Aβ毒性寡聚体AD疫苗通过诱导抗体中和AβOs，阻止其破坏突触并触发炎症。动物模型显示，靶向AβOs的疫苗可显著延缓认知衰退。2. Th2极化理想疫苗需诱导抗炎性Th2免疫反应，避免促炎性Th1反应加重脑损伤。佐剂选择是关键：传统铝佐剂（Alum）可能引发炎症副作用，而新型Th2偏向佐剂（如TLR9激动剂）可能解决上述问题。3. 被动免疫的局限性单克隆抗体（如Lecanemab、Donanemab和Aducanumab）虽可快速清除Aβ，但需频繁注射且成本高昂。主动免疫疫苗通过激发自身免疫记忆，提供长期保护，更适合预防性应用。-04-三、AD疫苗的开发现状AN-1792是第一个人类Aβ主动免疫疗法，由合成全长人类Aβ42和佐剂QS-21组成。AN-1792的1期临床研究包括372名轻度至中度AD患者。第1阶段试验的结果表明，该疫苗可诱导对Aβ42的抗体反应，并可清除大脑中的斑块。然而，在II期试验中，由于患者发展为脑膜炎，临床试验暂停。尽管AN-1792临床试验有副作用，但该研究的结果鼓励开发新的主动抗Aβ免疫治疗方法。 CAD106疫苗由诺华公司研发，通过诱导抗体产生来减少β淀粉样斑块。该疫苗由截短的β-淀粉样蛋白片段（Aβ1-6）组成，以避免T细胞活化。在第一阶段试验的52周内没有出现脑膜炎的迹象。然而由于缺乏疗效，目前已停止开发。ABvac40疫苗由Araclon Biotech开发，其结构针对Aβ40的C末端，包含与KLH偶联的Aβ33–40。ABvac40 2023年公布了II期临床结果，达到了主要终点，与安慰剂相比，ABvac40治疗可将疾病进展的速度减慢38%。ACI-24疫苗由AC Immune开发，包含Aβ1-15表位，不包括T细胞表位，以避免T细胞反应。ACI‐24的 II期临床试验由于低免疫原性撤回，正在继续优化；新分子ACI-24.060被武田以里程碑总价22亿美元引进。UB-311疫苗由United Biomedical开发，含有Aβ1-14表位，并与辅助T细胞肽表位融合，利用CpG作为佐剂。肽混合物将诱导B细胞反应，同时避免T细胞的炎症反应。2023年发表的2期研究结果显示，UB-311治疗达到了主要终点，该疗法具有良好安全性、耐受性，并产生稳健的免疫应答。-05-四、AD疫苗研发开发的挑战虽然AD疫苗展现出缓解AD进展的前景，但AD疫苗研发仍面临多重“拦路虎”：1. 免疫衰老（Immunosenescence）:老年人群免疫应答低下，疫苗需克服T细胞功能衰退和慢性炎症背景。2. 血脑屏障（BBB）阻碍98%的大分子抗体无法穿透BBB，新型的递送技术是破局方向。3. 患者异质性：AD亚型复杂，需基于生物标志物（如Aβ-PET、脑脊液pTau）细分人群，实现精准免疫。4. 临床试验设计困境：AD进程缓慢，需超长随访（10年以上）和替代终点（如Aβ清除率）加速验证。5. 安全性红线：避免诱发自身免疫性脑膜炎（如AN1792）或微出血，是疫苗设计的核心原则。-06-五、未来方向：多靶点联合与技术创新1. 靶向“Aβ-Tau轴”复合疫苗：同时激活针对AβOs和异常Tau的免疫应答，阻断病理级联。2. 新型递送系统：鼻内疫苗、DC细胞疫苗或外泌体载体可能增强脑内抗体渗透。3. 佐剂革命：开发纯Th2极化佐剂，平衡免疫激活与安全性。4. 人工智能助力设计：AI预测抗原表位和抗体结合构象，缩短疫苗开发周期。-07-结语AD是一种严重影响人类健康的多因素异质性神经退行性疾病，目前还没有能够治愈的药物，已获得批准的药物也只能减缓疾病的进展。因此，AD最好在发生严重认知障碍之前进行早期干预，AD预防有潜力可能实现延迟或预防AD痴呆的治疗目标。AD疫苗研发虽荆棘密布，但随着对病理机制的解码和技术迭代，未来十年或有革命性疫苗问世。“疫苗或许不能逆转时光，但能让我们优雅地老去。”愿未来AD将不再成为困扰我们的严重疾病。参考资料：1. The Importance of Vaccines in Preventing Impending Alzheimer's Epidemic. Rev Recent Clin Trials.2025 Apr 14.2. The informed road map to prevention of Alzheimer Disease: A call to arms. Mol Neurodegener.2021 Jul 21;16(1):49.公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

摘要：病毒样颗粒（VLPs）已成为生物学、医学甚至工程学中的关键工具。在最初用于解析病毒原子级结构之后，VLPs迅速被用于开发抗病毒疫苗，随后作为展示平台用于生成各种疫苗。最近，VLPs被用作纳米机器，将药物活性产品输送到体内的特定部位和特定细胞。在这里，我们专注于使用VLPs开发疫苗，其应用范围广泛，从针对病毒的经典疫苗到针对慢性炎症、疼痛、过敏和癌症的治疗性疫苗。在这篇综述中，我们穿越时间，从最新的实验性基于VLP的疫苗开发开始，以每年赚取数十亿美元的上市疫苗结束，为已经出现在地平线上的下一波预防性和治疗性疫苗铺平了道路。 1.病毒样颗粒（VLPs）的概念 病毒样颗粒（VLPs）是指由于表达编码病毒的衣壳、核心或包膜蛋白而自行组装成的颗粒，甚至是源自多层病毒的单层颗粒的制剂。由非病毒或人工蛋白形成的对称颗粒也可以被视为VLPs；在这种情况下，对称性指的是衣壳单元在几何上的组织方式。然而，这类VLPs不在本综述中讨论。此外，VLPs自行组装成模仿原始病毒的结构、大小和对称性的颗粒，但VLPs不能复制，因为它们缺乏基因组和复制酶。关于VLP结构、免疫原性和表达的详细描述，以及它们与疫苗接种的相关性，已在其他地方进行了综述。 乙型肝炎病毒的结构蛋白，主要是核心蛋白（HBc）和表面抗原（HBsAg），是最早在异源表达系统中表达的VLPs之一。这些努力促成了1986年首个针对HBV的重组人用疫苗的使用，该疫苗利用了表面抗原。接下来，引入了一种针对人乳头瘤病毒（HPV）的疫苗，该病毒会导致宫颈癌，使用的是L1结构蛋白。HPV疫苗在2006年和2007年上市。在此成功之后，2011年中国批准了一种针对戊型肝炎病毒（HEV）的疫苗。总的来说，使用VLPs作为传统疫苗平台具有几个优点，如表1所列。 当前的综述旨在通过首先描述一些基于VLP的疫苗在临床前开发和临床试验中的实例，最后描述目前市场上的基于VLP的疫苗，来讨论一些VLP疫苗开发的最新进展。 2.临床前开发 VLPs已广泛用作预防性或治疗性疫苗平台，用于多种疾病的预防。在本节中，我们旨在讨论一些VLP作为疫苗平台在以下疾病中成功诱导抗体和/或T细胞反应的临床前应用实例：传染病（讨论的实例：中东呼吸综合症、2019冠状病毒病（COVID-19）、流感、疟疾和获得性免疫缺陷综合症（AIDS）、炎症、过敏、疼痛、神经退行性疾病（阿尔茨海默病和帕金森病）和癌症）。 表1. 使用传统病毒样颗粒作为疫苗平台的优势 2.1.用于在预防性或治疗性方案中诱导抗体的基于VLP的疫苗 具有重复表面的颗粒可以最佳地刺激B细胞。20世纪70年代的研究发现，至少有12-16个表位间隔5-10纳米可以诱导最佳B细胞反应（例如，半抗原和人工聚合物），称为免疫子。随后人们意识到，典型的RNA病毒表现出多个免疫子的特征，因为它们通常直径为30纳米，有180个衣壳蛋白副本间隔约5纳米，如图1所示。使用这种颗粒的优势包括有效地交联B细胞受体，以及成功地被天然IgM抗体识别，导致经典补体途径的激活，引起抗原在滤泡树突状细胞（FDCs）上的沉积，增强生发中心（GC）的形成，并诱导持久和长寿命的浆细胞。因此，用全长抗原装饰并装载RNA的VLP被认为是激活B细胞和诱导长寿命B细胞反应的重要工具。此外，对于某些VLPs，特别是RNA病毒衍生的VLPs，可以装载RNA或CpGs（富含非甲基化CG基序的DNA寡核苷酸），分别在B细胞中激活TLR7/8或TLR9。这增强了IgG2a和IgA抗体反应，并增强了浆细胞形成和亲和力成熟。装载在VLPs中的RNA类型也很重要，细菌RNA是最有效的B细胞增强剂。下面，我们讨论了一些预防性和治疗性基于VLP的疫苗的例子，这些疫苗能有效地激发抗体反应，从而介导对疾病的保护。在目标抗原不能很好地诱导TH细胞反应的情况下（例如，自身分子或碳水化合物），针对VLPs的TH是必不可少的，因为它将介导分子间的相互作用，推动针对目标抗原的抗体反应。 图 1 当抗原以颗粒形式存在，并且表面表位每5-10纳米重复出现时，抗原处理得到促进。这种重复结构被免疫系统识别为病原体相关的结构模式（PASPs），这有助于B细胞的交联、天然IgM的结合、补体激活、高亲和力长寿命抗体的诱导以及生发中心的形成。使用 BioRender.com 创建。 2.1.1.传染病 冠状病毒病：冠状病毒是一类最近引起广泛关注的病毒，主要由于SARS-CoV-2引起的持续大流行。冠状病毒是一类具有单链正义RNA分子的RNA病毒，大约30 kB，编码包括四种结构蛋白在内的多种蛋白，如图2A所示：刺突（S）、膜（M）、核衣壳（N）和包膜（E）。人们已经做出了巨大努力，使用传统的VLP平台来开发针对这类病毒的疫苗。然而，除了一些针对SARS-CoV-2的候选疫苗目前正在I、II和III期临床试验中外，这些努力的大部分仍处于临床前阶段，如表2所总结。 图 2 A 一种典型的冠状病毒基于四种结构蛋白：刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。B 通过基因融合将MERS-CoV的RBD（受体结合域）融合到优化的CuMVTT-VLPs中，开发马赛克VLP基础疫苗的策略，这些VLPs包含一个通用的TT表位和TLR7/8配体。使用 BioRender.com 创建。 表 2. 临床试验中的基于病毒样颗粒（VLP）的疫苗列表。 中东呼吸综合症（MERS）：中东呼吸综合症冠状病毒（MERS-CoV）在人类中引起严重的呼吸道疾病，并在十年前沙特阿拉伯首次注册大流行后，继续在全世界超过27个国家构成威胁。MERS的死亡率非常高，大约在40%的范围。MERS-CoV包含几种免疫原性蛋白，包括刺突（S）蛋白，该蛋白通过其受体二肽基肽酶4（Dpp4）介导病毒进入宿主细胞。因此，受体被用作疫苗开发中针对病毒的主要靶向剂。已经进行了临床前研究，使用不同的平台，包括VLPs，来开发针对MERS-CoV的疫苗。 我们最近优化了一种称为黄瓜花叶病毒样颗粒（CuMVTT）的植物源性VLP，通过遗传融合将破伤风毒素（TT）表位整合到其中，作为改进的疫苗平台。TT表位的整合被认为可以增强B细胞和TH细胞之间的相互作用，特别是在老年人中，这是由于存在预先存在的TT特异性记忆TH细胞。此外，CuMVTT-VLPs在表达过程中结合了来自大肠杆菌的RNA，作为TLR7/8激动剂。该平台在小鼠、猫、狗、兔子和马中被证明具有高度免疫原性。 使用这个新平台（CuMVTT），我们开发了一种基于MERS-CoV刺突蛋白的受体结合基序（RBM）与CuMVTT-VLPs遗传融合的可扩展疫苗（图2B）。所得的马赛克VLP基疫苗（mCuMVTT-MERS）在大肠杆菌中表达，允许自发包装TLR7/8配体。mCuMVTT-MERS诱导了高水平的特异性抗体，能够中和MERS-CoV/EMC/2012分离株，显示出转化为单峰驼和人类的有希望的潜力。Wang等人使用杆状病毒表达系统构建了MERS-CoV-VLP疫苗，并在恒河猴中进行了测试。开发的疫苗可以诱导特定的抗RBD滴度（ELISA）1:1280以及T细胞介导的免疫。研究表明MERS-CoV-VLPs具有出色的免疫原性，是很有前途的疫苗候选物。同一组还开发了一种表达MERS-CoV RBD的嵌合VLP基疫苗，利用犬细小病毒（CPV）的VP2结构蛋白。用嵌合疫苗免疫也在小鼠模型中诱导了RBD特异性的体液和细胞免疫。不幸的是，到目前为止，还没有基于VLP的疫苗进入临床试验。 严重急性呼吸综合症（COVID-19）：持续的COVID-19大流行已经压倒了全球的卫生系统。大约有三十种不同的疫苗已经获得不同国家的批准用于人类，大约有八十个候选疫苗正在进行临床开发，其中19个处于III期临床试验。然而，随着新的关注变体（VOCs）的不断出现，仍然需要开发有效、可扩展、负担得起和稳定的传统疫苗。 作为一个例子，我们通过将SARS-CoV-2的受体结合域（RBD）化学偶联到我们免疫学优化的CuMVTT VLPs上，开发了COVID-19疫苗。我们利用了VLP表面最流行的修饰目标，其中包含可接近的赖氨酸残基（图3A）。展示的RBD识别病毒受体血管紧张素转换酶2（ACE2），确认了正确的构象结构，并产生了高度特异性的抗体反应，体外中和了SARS-CoV-2[29]和VOCs。类似的平台，CuMVTT-RBD，在小鼠模型中进行了鼻内给药测试。疫苗候选物引发了强烈的特异性系统性和粘膜IgG和IgA反应，有效中和了不同的VOCs。 图 3 以下技术的示意图。A 化学技术将表位结合到病毒样颗粒（VLPs）上主要基于修改VLP表面的化学基团。VLP表面的赖氨酸（Lys）残基（以红点显示）是最常用的修饰目标。表位应该被修改以包含一个自由的半胱氨酸（Cys），以适应所选择的化学结合方法。B 一种遗传融合技术，允许VLP衣壳蛋白和目标表位的共表达。遗传融合技术可能被认为是GMP翻译目的和扩大规模的更好选择[37]。使用 BioRender.com 创建。 为了转化目的，我们接下来设计了一种新的疫苗候选物，通过将SARS-CoV-2的RBM遗传嫁接到CuMVTT VLPs中，称为马赛克CuMVTT-RBM（图3B）。开发的疫苗可以大规模生产（1000升发酵罐运行>250万剂），在4°C下具有高稳定性，持续14个月，并且可以用于多次增强剂量。CuMVTT-RBM还在小鼠和兔子模型中诱导了高特异性抗RBD和抗刺突抗体滴度，对突变RBD和VOCs具有交叉反应性。由于高生产率和在4°C下易于储存，我们预计生产和运输成本将比当前基于RNA的疫苗低几个数量级。使用VLP AP205融合RBM也获得了类似的结果。此外，我们还产生了一个双马赛克颗粒，它诱导了针对S1中的RBM以及S2中的切割位点的中和抗体，这是第二个“次要”中和表位。 使用不同的技术，其他组也成功地使用VLPs开发了针对COVID-19的疫苗。例如，Tan等人设计并在小鼠模型中测试了RBD-SpyAP205疫苗，采用主要/增强方案。他们使用SpyTag/SpyCatcher技术在AP205-VLP平台上展示RBD。他们的结果显示，疫苗候选物可以引发中和抗体反应。 如上所述，SARS-CoV-2包含四种基本结构蛋白，可以在没有病毒基因组的哺乳动物细胞中组装成VLPs。Yilmaz等人描述了一种基于VLP的疫苗，表达六脯氨酸预融合稳定化的刺突（S-6p）以及SARS-CoV-2的N、M和E结构蛋白。该疫苗被吸收到明胶上，并与K型CpG ODN配方。使用HEK293细胞表达疫苗候选物，并产生了表达四种结构蛋白的囊泡VLPs。结果表明，在接种动物中有效产生了抗S、抗RBD和抗N IgG，并防止了肺病理。这种疫苗候选物目前正在进行II期临床试验；请参阅表2。 总的来说，基于重组蛋白的疫苗可以使用不同的宿主表达系统生产，如昆虫细胞、酵母、哺乳动物细胞和植物。最近，随着COVID-19大流行的发展，基于植物的疫苗开发在该领域变得更加被接受。最近发表的一项研究描述了基于植物的SARS-CoV-2疫苗的成功构建。作者将SARS-CoV-2的M、N和E基因克隆到双生病毒载体中，并在N. benthamiana植物中进行了瞬时表达。该过程产生了与原生SARS-CoV-2病毒粒子形状和大小相似的植物源性VLPs，但没有刺突蛋白。图4展示了使用烟草植物中的农杆菌渗透法的植物表达系统过程。作者指出，这样的VLPs将来可以作为携带S抗原的平台。 图 4 利用两个载体在烟草植物中进行共表达的农杆菌渗透法。使用 BioRender.com 创建。 Medicago公司也利用植物衍生的VLP生产方法开发了他们的SARS-CoV-2疫苗（CoVLPs疫苗；Covifenz）。CoVLPs是通过表达修改后的全长S蛋白产生的，该蛋白在植物细胞中表达后三聚体化，并移动到质膜中的脂质筏上，自发组装成从植物细胞表面“出芽”的VLPs。在猕猴中，这些VLPs在AS03佐剂存在的情况下诱导了强烈而持久的IgG反应，并增强了T细胞反应，从而保护灵长类动物免受病毒感染。CoVLPs目前正在进行晚期临床试验，并已在加拿大获得批准用于人类（表2）。 流感：流感病毒是一类属于Orthomyxoviridae科的包膜RNA病毒。病毒表面的糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是疫苗开发的主要靶点。HA由一个球形头部和一个茎组成。目前市场上的季节性流感疫苗针对HA的球形头部进行中和；然而，球形头部的快速抗原变异使得诱导的抗体的亲和力降低，这就需要每年或每两年开发新的疫苗。相反，HA的茎部更加保守；然而，由于球形头部的免疫优势和茎部的空间障碍，可能具有挑战性但并非不可能对茎部产生有效的免疫反应。针对NA，流感病毒的第二大蛋白，可以防止病毒进入宿主细胞，降低疾病严重程度，并抑制病毒复制。与HA和NA类似，M2蛋白是流感病毒的一个完整表面蛋白，M2的细胞外结构域在流感A中高度保守。基质蛋白（M）和核蛋白（NP）是病毒的主要内部蛋白。图5展示了流感病毒的结构和主要抗原。 图 5 一幅卡通插图，展示了流感病毒的主要抗原，包括：血凝素（HA）的球形头部和茎部，M1基质蛋白，M2离子通道，NA神经氨酸酶和核衣壳蛋白（NP）。使用 BioRender.Com 创建。 VLPs构成了一个有吸引力的、替代传统流感疫苗配方的疫苗平台，因为它们模仿了原生病毒但缺乏任何遗传物质。Buffin等人表明，使用哺乳动物细胞进行疫苗生产有许多优势，包括维持糖基化模式。他们开发了一种包含HA、基质（M1）和NA蛋白的VLP疫苗。表达的VLPs模仿了真正病毒的外表面，并显示出高度的免疫原性。 使用噬菌体Qβ，我们设计了一种针对HA球形结构域不同形式的VLP疫苗。球形结构域被化学偶联到VLP的表面。几乎所有疫苗候选物都在小鼠中诱导了保护性抗体，这些抗体也与变异株发生了交叉反应。有趣的是，HA球形结构域是在细菌中产生的，表明糖基化对诱导保护性抗体并非必需，因为小鼠中血凝抑制抗体的水平与经典疫苗获得的水平相似。接下来，这种疫苗在I期临床试验中进行了测试，结果显示这种完全由细菌生产的疫苗至少与经典病毒基础疫苗在人体中对抗体和T细胞的免疫原性一样。 另一种有趣的方法是在铁蛋白纳米颗粒上展示HA，这可以诱导针对H1N1流感病毒株的高水平广泛中和抗体。 由于HA蛋白非常多变且保守性差，基于保守结构的疫苗，如M2的细胞外结构域（eM2）或HA茎部，可能是HA和NA疫苗的一个有趣的替代品。事实上，早期通过遗传融合在HBcAg上展示eM2或通过化学偶联在Qβ上展示的实验，都能诱导能够保护免受多种流感A病毒株侵害的抗体。基于Qβ的M2e疫苗还测试了通过鼻内给药诱导保护性抗体的能力。使用这种途径的疫苗接种在小鼠的血清和肺部诱导了高水平的保护性IgG和IgA抗体。 与Qβ类似，源自噬菌体AP205的AP205-VLPs也通过遗传融合在N-末端展示M2蛋白，显示出高诱导特异性抗体的能力。在针对流感病毒的eM2基疫苗的背景下，有趣的是我们已经提供了证据，在小鼠流感模型中，携带原核RNA的VLPs，一种TLR7/8配体，并展示eM2比携带真核RNA的VLPs诱导了更好的保护性IgG亚类，突出了包装RNA的类型的重要性，并确认了抗-M2 IgG抗体的亚类对保护至关重要。 HA的茎部区域，比HA的球形结构域更保守，可能是另一个有吸引力的靶点。事实上，可以将茎部区域表达为适合化学偶联到VLPs的三聚体，并且当在HBcAg上展示时，它可以在小鼠中诱导强烈的IgG反应。此外，铁蛋白纳米颗粒上展示的HA茎部在小鼠中诱导了广泛的中和和保护性抗体。因此，针对流感病毒保守结构的基于VLP的疫苗候选物，HA或M2蛋白，可能是目前用于对抗季节性和未来流感大流行的流感疫苗的合适替代品。 作为诱导对流感亚型更广泛免疫覆盖的替代方法，已经开发了一种包含来自H5N1、H7N2和H9N2的3或4个全长HA蛋白的马赛克、多亚型VLP疫苗。多亚型VLP疫苗在雪貂中进行了鼻内测试，并显示出有效性和免疫原性。也有几种针对H9N2的基于VLP的疫苗被描述。 疟疾：WHO估计2020年大约有85个疟疾流行国家的241百万疟疾病例，与2019年的227百万病例相比。2016年至2020年间，苏丹的死亡病例增加了49%，报告的80%病例是由于恶性疟原虫（P. falciparum）。针对疟疾的疫苗可以分为三种方法：红细胞前期疫苗、血液期疫苗和阻断传播疫苗（TBV）。最先进的红细胞前期疫苗是RTS,S（MosquirixTM），一种基于VLP的疫苗，WHO在2021年10月推荐在高风险地区使用。RTS,S在下面的“市场上的基于VLP的疫苗”部分讨论。 Chan等人设计并开发了一种通过利用鸭HBV VLPs结合大Pfs230和Pfs25蛋白的阻断传播疫苗。该疫苗在与cGMP兼容的Hansenulla细胞系中表达。诱导的抗体能够识别配子体表面的原生蛋白，并在标准膜喂养测定中降低传播活性。同一组最近使用鸭HBV的小表面抗原（dS）在支架表面上更大一部分展示环孢子蛋白（CSP）。为了克服RTS,S的缺点，CSP只出现在疫苗表面的一小部分。Barillas Mury小组还专注于通过使用Spycatcher-SpyTag技术将Pfs47（一种在配子体表面表达的蛋白）结合到Acinetobacter噬菌体（AP205-VLPs）上，开发一种TBV。候选疫苗诱导了高抗体滴度，对Pfs47具有高亲和力，证实了其潜力。 炎症。病毒样颗粒（VLPs）已被广泛用于开发针对不同慢性炎症性疾病的治疗性疫苗。在这方面，已经在不同动物种类中为不同的临床前疫苗生成了概念验证。在昆虫叮咬过敏（IBH）中，马因蠓（Culicoides）叮咬引起的Ⅰ型/Ⅳ型过敏反应而遭受慢性过敏性皮肤炎，由嗜酸性粒细胞介导。白细胞介素-5（IL-5）被认为是嗜酸性粒细胞的关键刺激因子（图6）。 针对IL-5的单克隆抗体（mAbs）已成功用于治疗具有嗜酸性粒细胞成分的人类疾病，特别是嗜酸性粒细胞性哮喘。因此，可以预期通过疫苗降低IL-5水平会减少一般的嗜酸性粒细胞疾病，包括IBH中马皮肤的嗜酸性粒细胞浸润，扩展了早期在小鼠中的观察。为此，我们将马IL-5共价连接到我们的CuMVTT平台上，并在34匹冰岛马的安慰剂对照研究中测试了疫苗。疫苗未添加佐剂，未显示任何安全问题，但在89%的接种马中诱导了抗IL-5自身抗体，这转化为了临床改善。通过每年加强注射，有效性可以提高到100%，并在几个季节中保持，几乎完全消除了症状。这种方法可能被视为针对马的慢性炎症性疾病的突破性治疗，并有潜力在未来转化为人类。除了IL-5，IL-31在IBH以及人类、狗、猴子和小鼠的过敏性瘙痒中也起着重要作用（图6）。 图 6 IL-31 和 IL-5 是过敏性瘙痒的中心介质。通常，过敏原穿透皮肤，触发肥大细胞和辅助性 T 细胞 2 型（TH2）。IL-31 的分泌刺激周围感觉神经元，导致瘙痒。IL-5 是生成和激活嗜酸性粒细胞所需的主要细胞因子。使用 BioRender.com 创建。 与IL-5不同，IL-31主要促进瘙痒；然而，这种瘙痒导致慢性抓挠引起局部炎症，通常因感染而加剧。基于CuMVTT平台，生成并测试了一种IL-31马用疫苗。结果证明了疫苗的安全性，并揭示了方法的有效性，与安慰剂组相比，治疗组的临床评分显著降低。特应性皮炎是狗最常见的过敏性疾病，导致广泛抓挠和毛发脱落以及继发感染。在对屋尘螨敏感的狗中测试了展示在CuMVTT上的犬IL-31，这些狗在局部挑战过敏原后发展出典型的特应性皮炎症状。免疫的狗在免疫后显示出显著减少的瘙痒，这与诱导的特定抗体滴度相关。然而，在抗体滴度下降时注意到反应较弱，表明维持IgG滴度是未来改进的领域。进行的研究为狗特应性皮炎的有效治疗奠定了基础。还需要进行进一步的研究来增加和延长有效性，并且使用单克隆抗IL-31抗体的结果将指导针对人类IL-31的疫苗开发。除了IL-5，展示IL-13的VLPs也可能是广泛用于治疗特应性皮炎的另一种有趣的方式，并且应该与针对IL-4的VLPs一起更详细地探索。已经证明，针对促炎细胞因子IL-17A的mAbs对银屑病非常有效，银屑病影响全球1%至4%的人口。IL-17生物制剂的高成本限制了患者的获取。使用基于IL-17展示在Qβ或CMVTT上的疫苗针对小鼠的IL-17A，在心肌炎、类风湿性关节炎和多发性硬化症以及银屑病的临床前模型中证明是有效的。针对TNF-α的mAbs在一系列炎症性疾病中显示出疗效，如银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎和溃疡性结肠炎。不幸的是，接受抗TNF-α治疗的患者可能在长期内产生抗药性，除了与治疗相关的高成本外。因此，开发针对TNF的疫苗可能是有吸引力的。已经描述了两种基于VLP的疫苗：一种疫苗基于HPV，使用生物素/链霉亲和素展示了TNF衍生肽，另一种基于全长TNF或在Qβ上使用SMPH化学和在TNF或肽中引入的自由Cys展示的TNF衍生肽。两种策略都诱导了能够中和TNF并消除胶原蛋白诱导的关节炎中的疾病的治疗性抗体。有趣的是，基于整个TNF连接到Qβ-VLPs的疫苗诱导的抗体能够中和跨膜和可溶性TNF。相比之下，基于TNF N-末端20个氨基酸（a.a.）的疫苗候选物（Qβ-C-TNF(4-23)）中和了可溶性TNF，但不是膜形式。尽管如此，两种疫苗都产生了能够保护小鼠免受类风湿性关节炎的特定抗体。相比之下，只有接种全长TNF（Qβ-C-TNF(1-156)）的小鼠显示出对单核细胞李斯特菌感染的增加敏感性以及潜伏的结核分枝杆菌的增强复活，而接受基于肽的疫苗的小鼠没有免疫受损。因此，仅针对可溶性TNF-α可能是一个有效的临床转化策略，可能克服机会性感染的风险。基于HPV和TNF衍生肽的疫苗与单独的融合肽相比，将抗TNF抗体水平提高了1000倍。如上所述，这种疫苗候选物还抑制了小鼠模型中胶原蛋白诱导的关节炎的发展。考虑到这些发现，进行了一项基于（Qβ-C-TNF(3-24)）的临床研究。研究显示了令人失望的结果；然而，基于小鼠TNF衍生肽的疫苗未能在人类中诱导TNF中和抗体（未发表）。 过敏。目前，特异性脱敏是治疗过敏的唯一可用方法。这种策略需要长期应用过敏原，并可能导致危及生命的过敏性休克。因此，能够通过几次注射缓解过敏症状的治疗性非反应原疫苗被认为是一种有吸引力的策略。对于治疗猫过敏，我们之前描述了一种治疗性疫苗，由主要猫过敏原（Fel d 1）与Qβ-VLPs偶联而成。单次注射能够诱导对1型过敏反应的保护。此外，过敏原诱导的系统性嗜碱细胞脱颗粒被特异性IgG抗体抑制，这一特性被FcγRIIb增强。将过敏原偶联到VLPs不仅可以增加过敏原特异性IgG反应，而且显著降低了过敏原引起过敏反应的能力，这是这种新的特异性免疫治疗方法的重要安全特性。在HBcAg上展示的过敏原也发现了类似的结果。为了快速转化，我们开发了一种替代策略，通过给猫接种疫苗来治疗人类的Fel d1过敏。使用基于CuMVTT的偶联疫苗，我们的结果表明在猫中具有耐受性，没有明显的毒性，疫苗还产生了强烈且持久的特异性IgG反应，具有高亲和力和中和能力。人类和猫预计将从这种治疗中受益，这将降低人类患哮喘的风险，并促进宠物主人与他们的猫的互动。Hirschberg等人研究了用屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus，Der p1）致敏后以及用来自携带免疫优势表位Der p1的酵母逆转录转座子的p1蛋白的杂交Ty-VLPs疫苗接种后诱导的免疫反应。他们的结果表明，杂交疫苗取消了过敏原特异性IL-5的产生，并且这种效应是通过CD4+ T细胞介导的。在一项较早的研究中，当Der p 1衍生的肽与Qβ-VLPs化学偶联时，在人类中诱导了强烈的IgG反应。最近的证据表明，基于VLP的过敏原疫苗接种也可能对预防性干预具有吸引力。花生过敏是一种日益频繁的疾病，在美国尤其如此，目前尚无治疗方法。CuMVTT-VLPs被用来展示烤花生（Ara R）提取物或纯化的单一过敏原Ara h1或Ara h2，并通过化学偶联在花生过敏的小鼠模型中进行了测试。所有生成的疫苗的一剂或两剂可以保护对花生敏感的小鼠在用整个花生提取物挑战后的过敏反应。令人惊讶的是，所有三种疫苗候选物，即使是基于单一过敏原的，也能够提供对整个花生提取物的系统性和局部挑战的保护，并且所有疫苗都保护了在用复杂提取物口服挑战后胃肠道的嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润。这些结果表明，针对单一过敏原的疫苗接种可以提供对复杂过敏原混合物挑战的保护。抗体被确定为作用方式，因为纯化的IgG或甚至是单一的单克隆抗Ara h 2抗体的被动转移都能保护小鼠免受过敏反应。也研究了肥大细胞和嗜碱细胞上的FcγRIIb受体的作用，所获得的结果证明了这种抑制性受体在阻止对复杂提取物的过敏反应中的关键作用（图7）。简要地说，对单一过敏原的高水平特异性IgG抗体的诱导将导致免疫复合物的形成，这些复合物将结合FcγRIIb，从而抑制IgE介导的信号，这些信号也由其他过敏原触发。基于Ara h 2的疫苗的GMP材料已经生产出来，并且在美国已经获得了IND（表2）。疼痛。神经生长因子（NGF）对神经系统的早期发育至关重要，但在后期，它成为疼痛的重要介质。mAb tanezumab在几项人类研究中显示出有效性，目前正在注册中，还有许多其他mAbs正在开发中。因此，开发针对NGF的治疗性疫苗可能具有重大兴趣。事实上，我们已经展示了一种基于VLP的疫苗对NGF的强效效力，以控制类风湿性关节炎和骨关节炎中的疼痛。开发的疫苗是基于在CuMVTT VLPs上呈现小鼠NGF蛋白。然而，进一步的研究对于建立针对NGF的疫苗的安全性至关重要。 图7 一个卡通图示，展示了在花生过敏模型中抑制肥大细胞上FcγRIIb的机制。A 花生过敏原与结合在高亲和力Fcε RI上的IgE结合，导致肥大细胞脱颗粒和过敏反应。B 使用基于VLP的疫苗（CuMVTT-Arah2）进行免疫，诱导针对单一过敏原Ara h2的特异性IgG抗体，形成免疫复合物，该复合物结合到FcγRIIb上，抑制IgE介导的信号。通过BioRender.com创建。 2.1.2.神经退行性疾病 阿尔茨海默病：阿尔茨海默病（AD）是导致痴呆的主要因素之一，这是一种随着年龄增长迅速增加的疾病。根据阿尔茨海默协会的数据，在美国，AD影响大约620万65岁以上的人，预计到2060年这个数字将增加到1380万。此外，目前的治疗费用，特别是护理援助，在2020年达到了美国的> 2500亿美元。针对淀粉样斑块的主动免疫是一种有前景的治疗策略。然而，目前还没有针对AD的批准的预防性或治疗性疫苗。在最初的突破性研究将针对AD的潜在疫苗置于聚光灯下之后，开发了一种基于Qβ和Aβ的N末端（CAD106）的VLP疫苗候选物。只选择了前6个氨基酸，因为在用原始疫苗候选物Aβ1-42配制的佐剂进行的临床研究中，诱导了自身特异性T细胞，这些细胞在高达10%的患者中诱发了脑膜炎性脑炎。临床前评估表明，在不使用佐剂的情况下用CAD106免疫可以在淀粉前体蛋白（APP）转基因小鼠中有效清除斑块，重现了使用佐剂配制的Aβ1-42获得的原始发现。此外，没有观察到Aβ特异性T细胞的迹象。随后在AD患者中的临床研究表明，清除斑块没有脑膜炎性脑炎或微出血的迹象。然而，目前没有明确的证据表明CAD106免疫的AD患者的性能有所改善。使用我们的免疫学优化的VLPs（CuMVTT-VLPs）以及Aβ1-6肽，我们建立了一种针对AD的疫苗。如前所述，CuMVTT包含一个TT表位，据提出由于对破伤风的预先存在的存储记忆TH细胞，可以增强老年人的反应。开发的疫苗可以用于预防性和治疗性环境。CuMVTT-Aβ1-6在年轻和老年小鼠中显示出高度的免疫原性，并且对破伤风的预免疫增强了对Aβ1-42的反应。实际上，在CuMVTT表面上展示Aβ1-6诱导的抗体表现出正确的特异性，因为免疫小鼠的血清可以像针对Aβ肽1-17的单克隆抗体一样有效地识别AD斑块在死后大脑切片上。最近的努力利用HBc为特定患者生产个性化的AD疫苗。研究人员通过将SpyCatcher插入截断的HBc的主要免疫优势区域（MIR）构建了一个平台，该平台可以组装成能够轻松结合不同SpyTag表位的均匀VLPs，例如Aβ（1-6），Aβ（1-15），cAβ（1-7）cEP1和cEP2来自β-淀粉样单体或寡聚体，以及来自tau蛋白的T294，pTau396-404和pTau422。一项研究的结果表明，HBc-S-pTau422在转基因小鼠中减轻了认知缺陷以及神经病变进展。对于替代的Qß-，HPV-和逆转录病毒颗粒-基础疫苗候选物也观察到了强大的免疫原性和良好的安全性。Aβ可能不是治疗AD的唯一靶标。事实上，Maphis等人报告了针对tauopathies的治疗性疫苗的开发，包括AD。在苏氨酸181处磷酸化的Tau肽被化学连接到Qβ-VLPs（pT181-Qβ）。该疫苗诱导了一种强大而持久的特定抗体反应，能够识别死后的人脑切片，并能够减少转基因小鼠的皮层和海马中的可溶性和不溶性pTau。因此，针对Aβ或Tau或两者的组合的疫苗可能是AD治疗或甚至预防发展的有希望的途径。 帕金森病：帕金森病被认为是第二常见的神经退行性疾病，与运动障碍、认知障碍和进行性残疾有关。该病影响60岁以上的1%的人。中和有毒的α-突触核蛋白（a-syn）寡聚体被提出在阻止寡聚体和聚集体在大脑中的传播以及细胞毒性方面发挥作用。Doucet等人提出了一种基于将针对α-syn C末端区域的短肽偶联到Qβ平台的主动疫苗策略。所获得的结果证明了疫苗在野生型小鼠和α-syn转基因小鼠中诱导高抗体滴度的能力，并识别了Lewy体。尽管诱导的抗体能够特异性地识别溶液中的寡聚α-syn，但疫苗未能在转基因小鼠模型中产生显著变化，与对照条件相比，对行为表型没有影响。缺乏临床前疗效是否是由于使用的特定小鼠模型尚不清楚，这些结果表明需要优化的临床前模型，这可能是一个具有挑战性的任务。癌症。已经在几种肿瘤中研究和使用了抗体，并已被证明是抗肿瘤免疫的重要参与者。抗肿瘤抗体的效应功能包括诱导凋亡、干扰肿瘤信号通路、抗体依赖性细胞毒性（ADCC）或激活补体。尽管大多数抗肿瘤抗体以mAb的形式被动给药，但疫苗可能是主动诱导抗肿瘤抗体的有希望的替代方案。然而，大多数针对癌症的疫苗旨在诱导T细胞而不是抗体，下面描述的疫苗可能更准确地被描述为“利基候选物”。诱导抗体的癌症疫苗的突出例子是基于AP205的，它已经在临床前用作治疗性疫苗的平台，用于诱导癌症治疗的抗体。作者使用SpyTag/SpyCatcher技术，用人类表皮生长因子受体-2（HER-2）装饰VLPs，这是一个经典的mAb治疗靶标。使用这种策略，他们能够克服B细胞耐受性，并诱导强烈的抗HER2 IgG抗体，阻碍了表达HER-2的小鼠乳腺癌肿瘤的进展。此外，三阴性乳腺癌肿瘤中xCT蛋白的过度表达已被用作靶表位，并插入到MS2-VLPs中。该疫苗引发了强烈的特定抗IgG2a反应，阻碍了肿瘤生长并防止了在已建立的4T1小鼠模型中的转移。与人类乳头瘤病毒相关的癌症占所有恶性肿瘤类型的约4.5%，并且已被证明每年影响超过50万人。与HPV相关的癌症包括宫颈癌（99.7%）和阴道、肛门、阴茎、外阴和口咽的鳞状细胞癌。HPV的衣壳L1蛋白是一个高度免疫原性表位，针对已获得许可的预防性HPV疫苗（稍后在4中讨论）。结构L1蛋白可以自组装成VLPs，形态上类似于亲本原生病毒（图8）。小衣壳蛋白L2是HPV类型中高度保守的蛋白质，因此可以被认为是开发下一代泛HPV疫苗的合适靶标。然而，基于L2的疫苗已被证明比基于L1的疫苗诱导的中和抗体水平低。Schellenbacher等人构建了一种表达L1和L2蛋白的嵌合HPV疫苗（HPV16 L1-HPV16 L2（嵌合体17-36）），并且佐剂化的VLPs诱导了针对与HPV16不同的HPV类型的广泛谱系中和抗体。这些发现表明，这种嵌合疫苗可能对由高风险、低风险和beta HPV相关疾病引起的粘膜感染提供保护。关于RG1-VLP作为另一种使用L2作为疫苗候选物的尝试的临床研究即将开始。RG1-VLPs包含HPV16L2的保守氨基酸17-36，这些氨基酸紧密融合在HPV16L1-VLP的免疫优势表面环中。小动物模型的免疫实验已确认对医学上相关的高风险和低风险HPV类型具有交叉保护。AAVLP-HPV是另一种嵌合疫苗，旨在展示L2表位，来自HPV16和31，显示在腺相关病毒衍生的VLPs上。用这些VLPs在Montanide佐剂中配制的小鼠和兔子的免疫诱导了特定的抗体滴度，能够在伪病毒感染测定中中和几种HPV类型的感染。这种嵌合疫苗已成功完成I期临床试验（表2）。 图8 人乳头瘤病毒（HPV）的L1和L2衣壳蛋白 A. HPV的L1衣壳蛋白是一种高度免疫原性表位，能够组装成VLPs，例如（已获得许可的预防性基于HPV的疫苗：Cervarix®、Gardasil®和Gardasil9®）。B. 一种表达L1和L2两种衣壳蛋白的嵌合HPV疫苗。通过BioRender.Com创建 2.2.病毒样颗粒（VLPs）治疗性疫苗用于诱导治疗性方案中的保护性T细胞 带有T细胞表位的VLPs是有效的工具，可以诱导TH1以及细胞毒性T细胞淋巴细胞（CTLs），尽管VLPs不包含遗传物质。外源性抗原优先进入主要组织相容性类II（MHC-II）途径以启动CD4+ T细胞。然而，以前的研究表明，颗粒状的VLPs可以被APCs成功摄取并通过交叉呈现进入MHC-I途径。通过与抗原处理相关的转运蛋白（TAP）独立的内体途径或TAP依赖的内体至细胞质途径可以实现MHC-I的装载。将VLPs与APCs的刺激因子结合使用可以产生CTL和TH1反应。在小鼠中测试的所有TLR配体中，刺激TLR3、TLR7/8尤其是TLR9最为有效，而其他TLRs，如TLR2和TLR4，对刺激CTL反应的能力较弱。此外，装载有TLR配体的Qβ-VLPs，如RNA或CpGs，能够有效地诱导CTL和TH1反应，但如果装载了多聚谷氨酸或为空载则无法做到这一点。出乎意料的是，我们已经证明VLPs和TLR配体可以分开传递，无需物理连接，只要TLR配体以颗粒形式配制，就可以在体内产生CTL反应。形成沉积物的佐剂可能提供进一步增强诱导的T细胞反应的机会。 2.2.1.癌症 由人乳头瘤病毒（HPV）引起的癌症：预防性HPV疫苗旨在针对晚期蛋白L1和L2产生体液反应。因此，这样的疫苗在治疗环境中不会显示出疗效，因为在病毒感染的增殖细胞中没有检测到病毒衣壳蛋白。HPV治疗性疫苗的主要目标是消除癌前病变和持续的HPV感染。早期E蛋白（E6和E7）是转录因子，负责推动感染细胞的增殖。因此，这两种蛋白在肿瘤细胞中高度表达，使它们成为治疗性疫苗的理想靶标。在宫颈上皮内瘤变（CIN）自发消退中检测到基质中CD4+：CD8+比率的增加，CD4+ T细胞对E2蛋白的反应以及E6和E7特异性CD8+ T细胞的浸润。已经采取了几种不同的临床前方法来开发HPV治疗性疫苗，包括使用VLPs。一些研究设计了一种针对肿瘤蛋白E6和E7的基于T细胞的疫苗，其他研究开发了一种包含衣壳和肿瘤蛋白的嵌合疫苗。例如，Greenstone等人展示了HPV-VLPs通过生成包含主要衣壳蛋白L1加上整个非结构性E7或E2融合到小衣壳蛋白L2中的嵌合VLPs来诱导细胞介导的免疫的能力。HPV16 L1/L2-HPV16 E7嵌合VLPs保护了野生型和MHC-II缺陷小鼠（缺乏Th细胞）免受TC-1肿瘤挑战。另一项研究使用修饰后的兔出血病病毒VLP（RHDV-VLP）作为疫苗平台，装饰有E748-57肽。使用表达E6和E7抗原的TC-1细胞系在小鼠模型中测试了开发的疫苗。作者将疫苗与抗CTLA-4检查点抑制剂或用于Treg耗竭的抗CD25结合使用。结果表明肿瘤负担减少了50%，生存率显著提高。我们已经证明，展示或与E7蛋白混合的Qβ-VLPs可以诱导对肿瘤生长的保护并增强超过80%的接种小鼠的生存。另一项研究生成了一个将长E7蛋白片段结合到禽传染性肿瘤病病毒VLPs中的VLP-E7疫苗。在表达人类HLA-A2的人源化转基因小鼠中，在治疗环境中接种了TC1/A2癌细胞系，测试了VLP-E7疫苗。结果表明完全根除了已建立的肿瘤以及持久的免疫反应。 黑色素瘤：一些临床前实验已经探索了使用VLPs作为针对黑色素瘤的治疗性疫苗的疗效。装载A型CpGs的Qβ-VLPs（Qβ(G10)，也称为CMP-001）不包含任何肿瘤抗原，并且在肿瘤内注射后已测试了抗黑色素瘤反应。Sabree等人证明CMP-001诱导形成抗Qβ抗体，这些抗体使Qβ VLPs包被，随后被浆细胞样树突状细胞（pDCs）摄取，导致细胞因子分泌和抗肿瘤T细胞反应。CMP-001已在临床试验中使用，如表2所示。在最近发表的一篇论文中，Melhim等人表明，CMP-001单独或与pembrolizumab（PD-1抑制剂）联合用于晚期黑色素瘤患者是可耐受的，并且能够逆转抗PD1抗性治疗，具有持久且强烈的临床反应。使用化学偶联方法开发了Qβ(G10)MelanA疫苗，并在II-IV期黑色素瘤患者的I/II期研究中证明了潜在的疗效。超过60%的接受治疗的患者产生了特定的效应和记忆T细胞反应以及高水平的IFN-γ、TNF-α和IL-2细胞因子产生。最近，我们已经将我们的努力转向开发针对患者肿瘤特异性表位的个性化VLPs疫苗，以实现有效的T细胞反应。鉴于针对单一抗原允许肿瘤细胞通过下调这单一抗原来复发，我们设计了一种在具有挑战性的移植小鼠黑色素瘤模型中的多靶标疫苗。我们的结果表明，针对生殖系和突变表位可以增强诱导的抗肿瘤反应。我们还测试了微晶（MCT）佐剂与CuMVTT-p33疫苗结合的沉积效应。结果表明MCT将反应极化为TH1并增强诱导的抗肿瘤反应。 乳腺癌：由于我们已经在黑色素瘤中展示了使用多靶标疫苗策略的增强疗效，我们已经将这些发现扩展到一个侵袭性转移性乳腺癌小鼠模型。为了进一步提高主动免疫疗法，我们设计了一种个性化的多靶标疫苗，使用Qβ-VLPs包装TLR9配体，通过整合基于质谱的免疫肽组学和全外显子测序，展示延长的新生抗原。与短新生抗原的疫苗接种相比，长新生抗原的疫苗接种更有效，并且抗肿瘤效应可以显著重新极化肿瘤微环境，减少肺转移并增强生存。 获得性免疫缺陷综合症（AIDS）。自从20世纪80年代作为获得性免疫缺陷综合症（AIDS）的病原体被发现以来，HIV已成为全球主要的公共卫生问题。尽管抗病毒药物能够控制病毒，但迫切需要一种针对HIV的治疗性疫苗，以消除接受抗逆转录病毒治疗的患者中的长期持久性HIV。对HIV-1发病机制的了解表明，T细胞免疫在控制HIV感染的急性期中起着至关重要的作用，长期研究表明CD8+ CTL反应与HIV复制的控制和感染清除有关。1996年，Wolf等人构建并表达了一种嵌合HIV-1 VLP疫苗。将gp120的第3个可变区域（V3）或CD4结合域插入Pr55gag-VLPs中；这种插入没有干扰VLPs的组装能力。使用不同的途径和不同的嵌合Pr55gag/V3 VLPs对小鼠进行免疫，没有使用任何佐剂。结果表明对V3区域内已知表位有强烈的MHC-I (Dd) CTL反应。此外，已经证明Gag-VLP疫苗能够在处理的单核细胞来源的树突状细胞（DCs）中诱导干扰素α（IFN-α），APOBEC3G和APOBEC3F蛋白mRNA表达增加，这些蛋白已知是HIV-1的抑制剂。此外，包含HIV V3环的酵母衍生VLP已被证明可以被小鼠树突状细胞处理，与MHC类I相关呈递。 3.临床开发 目前有几种预防性和治疗性的基于VLP的疫苗处于临床开发阶段。我们在表2中列出了与上述讨论的疾病相关的临床试验。 4.市场上的VLP疫苗 4.1.人乳头瘤病毒疫苗 Gardasil®是首个获批作为针对人乳头瘤病毒（HPV）的预防性疫苗。Gardasil9®覆盖9种而非4种血清型，已经在美国取代了Gardasil®。Gardasil®、Gardasil9®和Cervarix®疫苗是L1-HPV表位的重组制造VLPs（表3）。然而，Gardasil9®包含比Gardasil®更大的总抗原负荷，以补偿不同共同配方VLPs的数量增加。Gardasil可预防4种HPV（6、11、16和18型），而Gardasil9®可预防另外5种（31、33、45、52和58型）。这些疫苗的设计目的是激发病毒中和抗体，以预防最初的HPV感染。这些上市疫苗已被证明能提供100%的预防宫颈癌前病变和生殖器疣的发展的保护效果，预计保护效果至少持续4.5年。HPV疫苗是安全的，局部不良反应如肿胀、疼痛和发红大多是轻度和短期可逆的。全身反应很少见，可能涉及恶心、发烧、头痛和疲劳。目前酵母或昆虫表达系统中的许可HPV疫苗的成本可能被认为是全球广泛实施的一个障碍。最近在大肠杆菌中表达低成本HPV疫苗的努力已成功。Cecolin®是一种针对HPV16和HPV18的双价L1-HPV疫苗，已成功在大肠杆菌中表达，并在小鼠、山羊和兔子中显示出高度免疫原性。2019年12月30日，Cecolin®正式获得国家药品监督管理局的批准，于2020年5月在中国上市。2021年10月，WHO为Cecolin®授予了预认证，使其成为首个获得WHO预认证的中国制造的HPV疫苗。 表3. 市场上目前批准的基于VLPs的HPV预防性疫苗列表 4.2.乙型肝炎病毒（HBV）疫苗 有几种针对可能危及生命的疾病乙型肝炎的HBV疫苗可供商业使用。HBV感染可能导致慢性感染，并使患有肝硬化和肝癌的人处于危险之中。现有的疫苗对HBV显示出98-100%的保护。 第一代HBV疫苗于1981年获得批准，基于Bulmberg的工作，他因发现澳大利亚抗原（现称为乙型肝炎表面抗原（HBsAg））而获得诺贝尔奖，该抗原在感染者的血清中。独特的疫苗是基于直接从人类携带者中获得HBsAg。然而，由于生物安全问题，这种血液来源的疫苗在1986年被改进的重组HBsAg版本所取代，使用重组DNA方法和在酵母细胞以及目前也在哺乳动物细胞中生产。第二代HBV重组疫苗最初是使用酵母系统生产的。现有的酵母衍生的HBV疫苗基于HBsAg单体自组装成VLPs。几项研究表明，纯化的酵母衍生的HBsAg呈现为∼22 nm VLPs 。形成的HBsAg VLPs中60-70%由HBsAg单体蛋白组成，其余由脂质组成。总的来说，形成的VLPs具有高度免疫原性，能够激发强大的中和抗体，并且是一种安全的疫苗，不含任何病毒基因组。使用单一抗原（HBsAg的小S抗原）进行疫苗接种有一些限制，包括实现血清保护所需的时间延长。30-40%的成年人在接种2剂疫苗后达到血清保护，但即使在接种第3剂后，也可能有10%的人无法达到这一点。最近FDA批准的第三代HBV疫苗PreHevBrio表达三种HBV表面抗原，S、pre-S1和pre-S2，并在哺乳动物细胞中生产。III期临床试验证实了疫苗在老年人和慢性病患者中的高免疫原性。研究得出结论，在第3剂后4周，疫苗在血清保护率上与单一抗原疫苗相比没有劣势。接种2或3剂后的血清保护率高于接种经典HBV疫苗（对照组）。超过90%的参与者在接种2剂后报告了快速诱导的保护性抗体轮廓；此外，观察到良好的安全性。表4总结了不同HBV疫苗的可用性，表5概述了第二代和第三代HBV疫苗之间的主要差异。 表4. 市场上一些基于VLPs的FDA批准的HBV疫苗 表5. 第二代与第三代乙型肝炎病毒（HBV）疫苗的比较 4.3.乙型肝炎病毒（HEV）疫苗 乙型肝炎病毒是印度、中国、肯尼亚、苏丹、尼泊尔和孟加拉国等国家超过50%的急性病毒性肝炎的罪魁祸首。据估计，全球每年约有3500万例病例发生，平均死亡率为0.2-4%，在孕妇中高达25%。HEV是一种无包膜病毒，大小为27-35纳米，分为四种不同的基因型，I、II、III和IV。I型和II型仅限于人类，而III型和IV型感染其他哺乳动物，然后可以将病毒传播给人类。尽管存在这种遗传多样性，但所有HEV都属于同一血清型。病毒的正义链RNA基因组包含三个开放阅读框，其中一个编码病毒衣壳蛋白，是中和抗体的主要靶标。HEV239（Hecolin®）于2012年在中国获得批准作为针对HEV的疫苗。该疫苗是由厦门万泰沧海生物技术有限公司（中国）开发的基于重组VLP的疫苗，编码基因来自ORF2 HEV基因型I菌株。在大肠杆菌表达系统中产生的重组蛋白由368-606个氨基酸组成（p239）4-5，经过复性并自组装成20-30纳米大小的VLPs。形成的VLPs在小鼠和恒河猴中具有高度免疫原性。Hecolin®在人类中显示出良好的安全性和100%的疗效。目前正在进行研究，以评估疫苗在高风险群体中的安全性和有效性，以评估潜在的全球使用，正如WHO推荐的那样。 4.4.疟疾疫苗 RTS,S/AS01（Mosquirix™）被认为是迄今为止针对疟疾红细胞前阶段的最先进疫苗。单价重组疫苗针对环孢子蛋白（CSP）蛋白的片段，这是P. falciparum包膜蛋白的主要成分。CSP蛋白片段被融合到HBsAg作为载体。在RTS,S中，R：代表19个中心串联重复，T：代表C末端的T表位，第一个S代表修饰的表面抗原，第二个S指的是未修饰的表面抗原，允许CSP在粒子表面的马赛克HBsAg颗粒上呈现。该结构组装成VLPs，并与AS01配制而成，AS01是一种有效的佐剂。RTS,S/AS01已在III期临床研究中进行了评估；然而，结果仅显示部分保护，并存在一些令人担忧的安全问题，特别是年轻女性可能增加的死亡率。RTS,S马赛克颗粒包含与CSP-HBsAg融合蛋白相比，有4倍摩尔过量的未修饰HBsAg亚单位。相比之下，下一代RTS,S/AS01疫苗（R21）仅包含CSP-HBsAg融合蛋白，R21因此在表面显示更多的CSP表位，并能在小鼠中诱导无菌保护。正在进行几项晚期临床试验，以测试下一代R21的安全性和有效性，并提高第一代RTS,S的疗效（表2）。2021年10月6日，WHO建议在撒哈拉以南非洲地区以及P. falciparum传播中等至高的地区广泛使用RTS,S/AS01疫苗。 5.结论 VLPs表现出高度免疫原性与卓越的安全性的独特组合，使它们成为疫苗设计的理想平台。自从首次描述基于VLP的HBV疫苗以来，该领域已取得显著进展，VLPs现在是许多上市疫苗的基础，如针对HPV和HEV的疫苗。关于使用VLPs作为展示平台的非常激动人心的新颖发展已经实现，不仅用于病原体衍生的抗原，如针对疟疾免疫的HBsAg上展示的CSP，还用于自身分子，如用于针对阿尔茨海默病的疫苗的Aβ或用于治疗伴侣动物和人类的慢性疾病的细胞因子。因此，我们预计未来几年将有几种新产品，包括针对人类和动物的产品，将进入市场。 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。