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European Journal of Medicinal Chemistry期刊上发表了一篇题目为《通过虚拟筛选和基于片段的药物设计策略合理设计CZL-S092：一种靶向神经母细胞瘤的新型吲唑类PLK4抑制剂》的研究论文。该研究通过虚拟筛选确定吲唑衍生物8为命中化合物，基于合理药物设计策略对该化合物进行结构修饰，得到了34个靶向PLK4的吲唑衍生物，其中化合物34b对神经母细胞瘤细胞系IMR-32和SH-SY5Y表现出显著的抗增殖活性，通过菌落形成、流式细胞术、伤口愈合和免疫荧光分析进一步证实该化合物体外药物渗透性与血浆蛋白结合性良好，体内药代动力学特性可接受，口服生物利用度达22.1%，总体而言，化合物34b可以作为有利的靶向PLK4的先导化合物。 Introduction Polo样激酶（PLK）家族是高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞周期调控与细胞有丝分裂过程，PLK4激酶结构域具有独特差异，作为中心体复制和有丝分裂进程的主控调节因子，其功能异常与肿瘤发生密切相关。已有研究证实PLK4在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、神经母细胞瘤及前列腺癌等多种癌症中存在过表达，且在神经母细胞瘤异种移植小鼠模型中，敲低PLK4基因可显著抑制肿瘤生长，因此PLK4被明确为潜在的抗癌靶点。目前已有大量PLK4调节剂被报道。 已报道的典型PLK4调节剂主要分为三类： 一是吲唑衍生物，如Pauls等人发现的CFI-400945（IC₅₀ = 2.6 nM）是目前唯一进入II期临床的PLK4抑制剂，用于治疗急性髓系白血病和慢性粒单核细胞白血病，其结构简化得到的YLT-11（IC₅₀ = 22 nM）则具备PLK4抑制活性且在体内外均表现出抗乳腺癌活性； 二是氨基吡唑衍生物，代表性药物LCR-263（IC₅₀ = 2.7 nM）对Aurora激酶选择性显著，但因药代动力学性质不佳限制研究进展，另一氨基吡唑衍生物CZS-241（IC₅₀ = 2.6 nM）虽对多种激酶（如TRKA、PLK1、极光激酶A）选择性优异，且口服生物利用度达70.8%，却主要针对慢性粒细胞白血病； 三是PLK4蛋白降解靶向嵌合物，其中首个被报道的强效PLK4降解剂SP-27，对乳腺癌体内外治疗有效。 然而，现有PLK4调节剂存在明显局限。要么适应症不覆盖神经母细胞瘤，要么存在药代动力学差、靶点选择性不足等问题，针对神经母细胞瘤的高效、高选择性PLK4抑制剂仍处于空白状态。基于此，作者采用ChEMBL数据库虚拟筛选的方法结合基于片段的药物设计策略，旨在开发结构新颖、PLK4抑制活性更强、药代性质更优的吲唑类PLK4抑制剂，以填补神经母细胞瘤靶向治疗领域的缺口。 重点内容 1 筛选PLK4抑制剂候选化合物 为筛选靶向PLK4的抑制剂候选化合物，作者团队首先以ChEMBL数据库为筛选来源，设定明确的分子筛选标准：候选小分子需处于临床前研究阶段、符合Lipinski五规则（RO5）、分子量范围限定为130~260 Da，且AlogP值处于2~4之间。依据上述标准，团队从数据库中筛选并导出67077个符合条件的分子。接着采用高容量虚拟筛选（HTVS）对这67077个分子进行初步筛选，筛选后选取得分最高的100个分子，进一步通过超高精密度（XP）对接进行优化验证。XP对接结果的判断，主要基于已报道PLK4抑制剂的共同结构特征——需具备能与PLK4蛋白Glu90和Cys92结合的铰链结合区，且需含有朝向溶剂区的亲水片段；同时，为便于后续结构修饰，候选化合物还需满足结构简单的要求。 最终，吲唑衍生物8被确定为命中化合物。分子对接结果显示，化合物8的吲唑核心可与PLK4蛋白Glu90和Cys92的铰链区稳定结合，从而将自身定位于PLK4蛋白的激酶结构域内；其吡啶基团则通过乙炔基连接于吲唑核上。体外PLK4激酶抑制实验进一步证实，化合物8对PLK4激酶具有一定抑制活性，半数抑制浓度（IC₅₀）为1.015 μM，因此被认定为具有进一步开发潜力的候选化合物。 2 目标化合物的优化 作者通过LanthaScreen Eu激酶结合试验评价合成化合物的体外PLK4激酶抑制活性，基于命中化合物8与PLK4的结合模式（（吲唑核心结合Glu90和Cys92的铰链区、乙炔基连接的吡啶部分连接溶剂区Arg28），但化合物8存在关键缺陷——未能占据PLK4蛋白抑制活性所必需的关键疏水口袋。 为弥补这一缺陷，作者采用片段生长策略对其进行优化。将不同疏水片段引入吲唑核心，2-巯基乙酸乙酯取代的化合物28a（IC₅₀ = 0.307 μM）活性增强，而硫原子被氮等排取代的化合物21（IC₅₀ = 19.00 μM）活性显著降低，证实硫醚键的重要性；因28a的乙氧基未充分占据DFG-邻近疏水口袋，保留关键羰基并替换乙氧基得28b-28f，其中28b（氨基取代，IC₅₀= 0.101 μM）活性略增，28c（氨基甲基化，IC₅₀ = 0.480 μM）活性降低，28f（N-甲基苯胺为疏水片段，IC₅₀ = 0.07μM）活性显著优于28a、28c及28e；后续用氨基取代氟原子得28v-28w、引入额外氟原子得28q-28s、用乙基/异丙基取代甲基得28t-28u，活性均因体积互补性不足或空间不相容性降低；为研究构效关系，引入不同片段取代3-乙炔基吡啶得31a-31e和34a-34b，31a（疏水苯环取代亲水吡啶基，IC₅₀= 263 nM）因丧失与Arg28的氢键活性降低，31e（2-乙炔基吡啶取代）保留活性，再以E-乙烯基连接基替代乙炔基得34a-34b，其中34b（CZL-S092，E-3-乙烯基吡啶取代）抑制活性最优（IC₅₀ = 0.9 nM），34a（E-2-乙烯基吡啶取代，IC₅₀= 8.3 nM）保留活性。 分子动力学模拟显示，200 ns MD模拟中34b与PLK4蛋白结合构象稳定，其结合模式为：吲唑核心通过氢键结合Glu90和Cys92的铰链区，羰基通过氢键结合Lys41，3-氟苯基占据疏水口袋且氟原子与Asn141、Ala153形成卤键，吡啶基团延伸至溶剂区并与Leu18形成π-烷基相互作用，共同将34b定位在PLK4的ATP结合口袋内。 抗增殖活性评价中，选取PLK4抑制活性低于10 nM的28l、31e、34a、34b，基于TRIM37扩增的乳腺癌和神经母细胞瘤对PLK4抑制更敏感的特性，检测其对MCF-7（乳腺癌）、IMR-32和SH-SY5Y（神经母细胞瘤）细胞的作用，结果显示34b抗增殖活性最佳，IC₅₀值分别为2.828 μM、1.143 μM和1.329 μM，优于阳性对照LCR-263（IC₅₀值分别为4.804 μM、1.886 μM和1.558 μM），故选择34b进一步评价其抗神经母细胞瘤活性。 3 化合物34b关键特性 3.1 激酶选择性概况 在0.5 μM浓度下对37种激酶进行筛选发现，化合物34b对PLK4的抑制率>80%（红色柱），对FGFR1、AuroraA、PAK4这3种激酶的抑制率为50%-80%（黄色柱），对其余33种激酶的抑制率<50%（绿色柱）；尤其相对于其他PLK家族成员表现出优异选择性，整体激酶选择性良好。 3.2 对菌落形成的影响 由于神经母细胞瘤细胞系IMR-32粘附性差且在低细胞密度下存活能力有限，研究选用乳腺癌细胞系MCF-7评估化合物34b的克隆形成抑制能力。化合物34b以浓度依赖性方式抑制MCF-7细胞集落形成——1.0 μM浓度时可显著抑制MCF-7细胞生长，2.5μM浓度时则几乎完全抑制其集落形成。 3.3 对细胞凋亡的影响 采用流式细胞术结合Annexin V/碘化丙啶（PI）双染色法，评估化合物34b诱导IMR-32细胞凋亡的能力。IMR-32细胞经不同浓度化合物34b或二甲亚砜（DMSO，对照）孵育48h后，结果显示化合物34b以浓度依赖性方式强效诱导细胞凋亡。2.50 μM时总凋亡率达84.30%，浓度升至5.0 μM时凋亡率进一步增至90.20%，显著高于同等浓度阳性对照LCR-263的凋亡诱导效果（2.5 μM时31.4%、5.0 μM时60.70%）。 3.4 对细胞周期的影响 以LCR-263为阳性对照，通过流式细胞术分析化合物34b对IMR-32细胞周期的影响。结果表明，化合物34b以剂量依赖性方式抑制IMR-32细胞分裂，且在同等浓度下比LCR-263显著更有效。在2.5 μM的浓度下，化合物34b可诱导87.4%的细胞发生G2/M期阻滞，而LCR-263仅为33.5%。当浓度上升至5.0 μM时，G2/M期阻滞率进一步增加至89.6%。表明化合物34b可通过抑制PLK4来调节S/G2期中心体复制，从而阻止IMR-32细胞分裂。 3.5 对细胞迁移的影响 作者采用伤口愈合实验评估化合物34b对IMR-32细胞迁移的影响。IMR-32细胞经DMSO或不同浓度化合物34b孵育24h后，通过ImageJ对显微照片及伤口面积进行定量分析。结果显示DMSO处理组24h内可重新覆盖超过50%的伤口区域，而5.0μM化合物34b可抑制90%以上的伤口愈合；相比之下，同等浓度阳性对照LCR-263处理组伤口愈合率仍超70%，表明化合物34b能有效抑制IMR-32细胞迁移。 3.6 IMR-32细胞中化合物34b的免疫荧光分析 作者为研究化合物34b对中心粒复制的影响，在IMR-32细胞系中进行免疫荧光分析。细胞经2.5 μM化合物34b或DMSO（对照）处理48h后，用Centrin-2（标记中心粒，绿色）、γ-微管蛋白（标记有丝分裂纺锤体，红色）及DAPI（标记细胞核，蓝色）进行染色。结果显示，DMSO对照组细胞保持正常中心体结构，含两个Centrin-2阳性的中心粒；而化合物34b处理组细胞出现中心体复制紊乱，导致中心粒丢失。这表明化合物34b可诱导IMR-32细胞有丝分裂紊乱、促进基因组不稳定性，最终推动细胞凋亡。 3.7 Caco-2细胞渗透性评估 通过Caco-2细胞单层模型（体外药物渗透性评价经典模型）评估化合物34b的双向转运特性。化合物34b的顶侧至基底侧（A→B）渗透性为16.9×10⁻⁶ cm/s，基底侧至顶侧（B→A）渗透性为4.79×10⁻⁶ cm/s，外排比为0.28。A对B的高渗透性与低外排比共同证明化合物34b属于高渗透性分子。 3.8 体外血浆蛋白结合（PPB） 化合物34 b在不同物种中表现出高血浆蛋白结合，在人、大鼠和小鼠血浆中的血浆蛋白结合率分别为99.8%、99.9%和99.6%；且实验中回收率与稳定性均在80%以上，表明化合物34b在体内可能具有较长的保留时间。 3.9 体内药代动力学性质 在Sprague-Dawley（SD）大鼠中，分别通过静脉注射（1mg/kg）与口服（10mg/kg）给药，评估化合物34b的体内药代动力学性质。结果显示，静脉给药后，化合物34b的血药浓度-时间曲线下面积（AUC₀₋ₜ）为466±40.4 ng・h/mL，半衰期（T₁/₂）为0.709±0.0892 h；口服给药后，AUC₀₋ₜ为1030±661 ng・h/mL，T₁/₂为0.387h，计算得口服生物利用度（F）为22.1%。综上，化合物34b具备可接受的体内药代动力学性质，可作为后续结构优化的潜在先导化合物。 研究总结 该研究以ChEMBL数据库为基础，通过虚拟筛选策略，将吲唑衍生物8确定为PLK4抑制剂的候选热门化合物。随后采用片段生长策略以完全填充PLK4的活性疏水口袋，并结合全面的结构-活性关系（SAR）分析，最终优化得到化合物34b（CZL-S092）是一种有效的PLK4抑制剂，IC50值为0.9 nM。 优化后的化合物34b显示出比阳性对照LCR-263更优异的抗增殖活性，特别是对神经母细胞瘤细胞系IMR-32的IC50值为1.143 μM。同时，化合物34b在0.5 μM的浓度下对37种激酶表现出良好的激酶选择性。而一系列体外抗肿瘤实验揭示了化合物34b的多模式抗肿瘤机制研究。在2.5 μM时，不但显著抑制MCF-7细胞的菌落形成，而且显著诱导IMR-32细胞凋亡并使细胞周期阻滞于G2/M期；5.0 μM浓度可显著抑制IMR-32细胞迁移，减少肿瘤侵袭转移潜力。2.5 μM浓度下还可通过PLK4靶向作用导致IMR-32细胞中心粒消融，破坏中心体复制功能。体外药物样性质初步评价表明，化合物34b具有良好的药物渗透性和血浆蛋白结合性，为后续体内研究奠定基础。SD大鼠体内药代动力学研究表明，化合物34b的口服生物利用度为22.1%。 总体而言，化合物34b（CZL-S092）不仅是PLK4靶向抗癌药物研发中的新型先导化合物，还可作为神经母细胞瘤治疗的有效化学工具，同时为新型PLK4抑制剂或降解剂的开发提供了重要分子见解。  参考文献： European journal of medicinal chemistry,2025,296,117867. https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2025.117867.

本文为转化医学网原创，转载请注明出处  作者：Tracy 【导读】对化疗的耐药性，一直是限制许多类型癌症治疗的主要障碍。本研究通过对多种癌细胞中的7种化疗药物，进行 30 次基因组规模的 CRISPR 敲除筛选，系统地鉴定了化疗耐药性的遗传驱动因素。本研究不仅为化疗耐药性的分子基础提供了信息和见解，而且还提出了针对这种耐药性的潜在生物标志物和治疗策略。 2024年6月29日，东北大学生命与健康学院费腾团队在期刊《Nature Communications》上发表了题为“CRISPR screens reveal convergent targeting strategies against evolutionarily distinct chemoresistance in cancer”的研究论文。本研究通过关注结直肠癌中的奥沙利铂和伊立替康耐药性，揭示了进化上不同的化疗耐药性，进一步将 PLK4 确定为通过遗传消融或药理学抑制，在各种模型中克服奥沙利铂耐药性的治疗靶点，强调了一种拮抗进化上不同的化疗耐药性的单药策略。 https://www.nature.com/articles/s41467-024-49673-4 研究背景  01  尽管靶向治疗和免疫治疗进展迅速，但使用细胞毒性化学药物破坏快速生长的细胞的化疗，继续在癌症治疗中发挥关键作用。对于许多恶性肿瘤，化疗仍然是首选的治疗方案。在某些不可切除或转移性癌症病例中，化疗可能是唯一的治疗方案。化疗药物更常用于在手术前或手术后，缩小肿瘤或根除残留的癌细胞。此外，通过以序贯或组合方式应用化疗，以及靶向治疗和免疫治疗等其他治疗方式，可以获得增强的治疗效果。然而，化疗的耐药性，仍然是癌症患者治疗失败和疾病复发的主要原因。 尽管有证据表明，几个单独的基因与化疗耐药性有关，但对这种现象的理解仍然不完整，并且仍然缺乏克服化疗耐药性的有效治疗策略。最新的基因组分析和功能基因组学，是实现这一目标的巨大贡献。然而，目前仍然缺乏对实体瘤中广泛使用的化学疗法耐药性的遗传驱动因素和脆弱性的系统描述。 为了填补这一空白，本研究进行了30次全基因组CRISPR敲除筛选，探索7种广泛使用的化疗药物（奥沙利铂、伊立替康、5-氟尿嘧啶、多柔比星、顺铂、多西紫杉醇和紫杉醇）在实体瘤癌细胞中化疗耐药的遗传原因。本研究揭示了化疗耐药性的多样化驱动力和分子特征，提出了可操作的靶向策略，以克服进化上不同的化疗耐药性。 研究进展  02  通过包括CRISPR筛选、多种奥沙利铂耐药模型的细胞和分子表征在内的组合努力，本研究获得了一些关于结直肠癌如何产生奥沙利铂耐药性的初步见解。在敏感细胞中，奥沙利铂-DNA加合物的形成，会产生可被p53感知的DNA损伤。然后，激活的 p53-p21 通路诱导 G1 和 G2/M 细胞周期停滞，从而阻断奥沙利铂敏感细胞的细胞生长。一旦细胞发生某些阻断 p53-p21 通路功能的遗传或表观遗传改变（例如，敲除 TP53、CDKN1A 或 SLC43A2），细胞就会因不受限制的周期进程，对奥沙利铂治疗产生耐药性。本研究结果，支持以细胞周期为中心的理论，作为解释结直肠癌奥沙利铂耐药性的主要机制。当细胞对奥沙利铂产生耐药性时，它们也可能具有某些特殊的脆弱性，这些脆弱性伴随着因果改变。事实上，在存在奥沙利铂诱导的 DNA 损伤的情况下，多个奥沙利铂耐药细胞更依赖于 PLK4 功能来完成细胞分裂。这种脆弱性，为应用单药PLK4靶向药物治疗奥沙利铂耐药结直肠癌，创造了机会。 在人类肿瘤中，PLK4在许多类型的癌症中，经常发生突变，包括结直肠癌。携带突变体PLK4的肿瘤，往往具有较高的肿瘤突变负荷，通常与结直肠癌肿瘤进展的晚期有关。与正常组织相比，在结直肠肿瘤样本中发现， PLK4 的 RNA 表达增加。由于难以获得明确的奥沙利铂耐药临床样本，本研究采用了从结直肠癌患者身上切除的肿瘤组织，并成功建立了7种患者来源的类器官（PDO）模型。这些肿瘤组织中的PLK4蛋白水平，也显著高于匹配的相邻正常对应物。因此，PLK4抑制剂CFI-400945的单药给药，可能是一种有前途的治疗策略，可以克服结直肠癌中奥沙利铂参与的化疗耐药性。 所有7种肿瘤衍生类器官（C-1 至 C-7）响应奥沙利铂（左图：0、1、5、10 和 20 μM 奥沙利铂）或 CFI-400945（右图：0、5、15、20 和 40 nM CFI-400945）的相对活力的反相关模式。 研究结论  03  本研究发现细胞周期的异常变化、DNA损伤反应和肿瘤微环境重塑，代表了基因改变驱动多药耐药性的主要机制，补充了以前关于多药耐药性的理论。对于具有相同作用机制的药物，如多西他赛和紫杉醇，它们的一般耐药机制之间也存在显著差异，尽管主要的遗传驱动因素和功能仍然相同。 因此，使用单一药物，而不是复杂的联合疗法的收敛方案，来克服由多样化的遗传改变，或分子途径引起的化疗耐药性，可能是一种很有前途的策略。 本研究有几个局限性。首先，研究设计侧重于主要由细胞自主效应驱动的化疗耐药性，而涉及肿瘤微环境和细胞-细胞相互作用的其他类型的化疗耐药性则未涵盖。其次，化学基因组筛选仅基于特定细胞系的体外培养为2D单层细胞。3D球体和体内小鼠模型中的进一步筛选，可能会产生更多的发现和见解。第三，本研究中应用了功能丧失的CRISPR筛选。研究的下一阶段应转向碱基编辑筛选，以更好地研究化疗耐药期间的癌症基因突变。第四，本研究优先检查了每种药物的化疗耐药性效应，而药物组合通常用于临床环境，剂量效应也可能影响药物反应。最后，本研究无法充分探索每个化疗耐药基因背后的详细机制。需要作出更多努力来填补这些空白。对这些潜在的生物标志物和治疗干预措施进行全面评估，有望使患有化疗耐药的患者受益。 【参考资料】 https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-024-03085-w#auth-Lin-Fang-Aff1 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓