HRO-761

微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）是指由于在DNA复制时插入或缺失突变引起的微卫星序列长度改变的现象，由错配修复功能（Mismatch repair, MMR）缺陷引起，是公认的重要致癌途径之一。MSI是一种遗传缺陷，常见于多种癌症中，包括结直肠癌、子宫内膜癌等。WRN（Werner syndrome RecQ helicase）作为一种RecQ家族的DNA解旋酶，在多项大规模基因组筛选证实是MSI癌症的合成致死靶点。 WRN参与合成致死的机制如下：当 DNA 在复制过程中发生错配，正常细胞主要由 DNA 错配修复蛋白（MSH2或 MLH1）进行 DNA 错配修复，而微卫星不稳定性肿瘤细胞由于缺乏错配修复基因（或错配修复系统存在缺陷），存在大量的TA重复序列，形成十字形的二级结构，使复制叉停滞，并引起ATR依赖的WRN磷酸化，来解旋二级结构及完成复制。当WRN缺失时，结构特异的MUS81-EME1核酸内切酶和SLX4一起切割二级结构以试图恢复复制叉的功能。但是，过多的MUS81切割最终导致了DNA末端切割，染色体破碎甚至细胞死亡。因此，发现WRN的抑制剂对于MSI肿瘤具有重要的治疗前景。 为了获得该抑制剂，来自诺华公司的研究人员利用基于ATP结合的筛选方法，从15万个化合物中筛选到化合物1，并通过基于结构的药物设计，改善渗透性和脂溶性效率得到化合物；继而降低化合物logP并改善渗透性，引入邻甲基苯胺和羟基嘧啶得到化合物3和4。其中化合物4（HRO761）具有良好的物理化学性质和药代动力学，且无明显脱靶效应。 共晶结构显示，HRO761作用于WRN解旋酶核心结构域，结合在D1-D2界面上的一个非保守变构位点，诱导D1和D2结构域发生约180°的相对旋转从而发挥功能。相互作用分析发现几乎所有HRO761上的重原子都参与了与WRN的极性相互作用，从而将WRN锁定在非活性状态。 在高ATP条件下，HRO761在SW48细胞（MSI细胞）中测定的半数生长抑制浓度（GI50）为40nM，而对CAL33（microsatellite-stable, MSS细胞）无显著抑制作用。为了系统评估HRO761的细胞活性，他们对20个MSI（红色）和8个MSS（蓝色）细胞系中普筛了其抗增殖活性，发现HRO761在纳摩尔浓度(IC50:50-1000 nM)下选择性抑制MSI细胞系的克隆形成，且其敏感性与细胞内WRN的依赖性(DRIVE score)相关，对MSS细胞系无影响。 在CellTiter-Glo（CTG）试验中, HRO761与WRN的结合在所有检测的MSI和MSS细胞系中都是相似的，其蛋白稳定化IC50(PS50)在10-100 nM范围内，而带有突变C727A或C727S会降低与HRO761的结合，并削弱其细胞增殖抑制和PD效应，说明尽管HRO761在所有细胞中都能有效结合WRN，但只在MSI细胞中抑制WRN从而产生选择性的细胞毒性。 免疫印迹分析发现，HRO761处理MSI细胞后诱导产生DNA损伤反应，包括ATM、CHK2激酶磷酸化，p53激活和γH2AX增加等，而在MSS细胞系中未见此反应。同时还发现，HRO761可诱导WRN降解和染色质结合增加；蛋白质组学分析表明HRO761处理后的WRN蛋白丰度仅在MSI细胞系中显著下调。之前文献报道，当WRN受到抑制时，WRN在染色质上被困上并被PIAS4 泛素化修饰。泛素化的WRN被泛素E3连接酶RNF4识别，然后泛素化WRN导致p97/vcp介导的染色质提取并运送到蛋白酶体进行降解。RNA测序分析显示，HRO761在4个MSI细胞系中显著调控了多个基因的表达，包括CDKN1A、MDM2等p53靶基因，而在MSS细胞和WRN敲除细胞中没有观察到基因表达变化。因此，WRN抑制剂HRO761仅在MSI细胞中具有细胞毒作用，并诱导WRN蛋白降解。 为了明确HRO761对MSI细胞的治疗作用，研究人员使用不同浓度HRO761 24h处理MSI细胞，发现其剂量依赖性激活ATM和CHK2、增加p21蛋白诱导并对p53依赖的基因呈剂量式调控。免疫荧光分析显示，随HRO761浓度升高，细胞核内绿色荧光显著增强，表明γ-H2AX含量明显升高，DNA损伤增加；细胞周期分析发现HRO761处理会使细胞阻滞在G2/M期。进一步机制研究发现，WRN降解并非细胞周期阻滞的原因，且经HRO761处理后，总CHK2蛋白水平虽有下调，但是由于在HRO761抑制生长的浓度并未导致CHK1/CHK2降解，说明HRO761致死不太可能是由于CHK2（或CHK1）丢失引起。 体外实验显示，HRO761在HCT116 p53野生型和敲除型细胞中的IC50相似，且HRO761处理后两种细胞后均表现出抗增殖活性，表明HRO761作用机制不依赖于p53；同时，在p53野生型和敲除型细胞中，均可以观察到给药后ATM和CHK2磷酸化增加且WRN降解增加。上述结果说明，HRO761选择性诱导持续的DNA损伤反应，并引起细胞周期阻滞和凋亡，主要由ATM-CHK2通路驱动，而非依赖于p53。 为了评价HRO761通过WRN的合成致死性能，研究人员对携带SW48移植瘤小鼠每日1次口服HRO761，发现给药后肿瘤增殖停滞，并在较高剂量下导致75-90%的肿瘤消退长达60天，之后肿瘤由于耐药性会出现剂量依赖性复发。在第7天及91天采集血样分析，HRO761的抗肿瘤功效与与血液中化合物浓度有关，且不会在体内蓄积，在GI90曲线上方的AUC与不同剂量下HRO761对肿瘤的疗效关系密切。小鼠给药后取样发现，HRO761在体内可有效抑制WRN，诱导DNA损伤反应（pKAP1增加）并激活p53通路(p21诱导)，这些变化在60 mg/kg剂量下给药后第8天后达到稳态，并随肿瘤消退而逐渐减弱。组织学分析也证实，HRO761剂量依赖性地抑制肿瘤细胞增殖（Ki67阳性），并引起细胞核增大。 对不同MSI适应症的小鼠肿瘤模型和病人来源异种移植瘤（Patient-derived xenograft, PDX）模型进行大规模体内筛选，发现HRO761展现出广谱的抗肿瘤活性，其中2例完全缓解的模型分别为p53突变型（LS411N）和p53敲除型；同时。HRO761在p53敲除细胞中展现出比p53野生型细胞更好的抑制作用，再次印证了HRO761的p53非依赖性抗肿瘤机制。进一步，研究人员评估了HRO761与伊立替康联用的疗效。体外试验表明，HRO761与伊立替康在低于各自有效浓度时即可产生协同的细胞毒作用，并在高浓度HRO761处理下抑制了细胞再生长。体内研究证实，HRO761与伊立替康联用可在多个剂量组合下诱导肿瘤完全消退。这提示联合用药可能降低HRO761和伊立替康所需的个体给药剂量，从而拓宽治疗窗。     综上，本研究运用化学筛选、药物设计等方法，得到具有高效抑制WRN活性的候选新药HRO761，评估了其在不同癌细胞系中的效果，验证了在MSI癌细胞模型中HRO761的合成致死效应，并对HRO761诱导合成致死效应的分子机制进行研究。目前HRO761正在开展I期临床试验，以评估其在结直肠癌等MSI实体瘤中的安全性和初步疗效。 参考文献 1. van Wietmarschen, N., Sridharan, S., Nathan, W.J. et al. Repeat expansions confer WRN dependence in microsatellite-unstable cancers. Nature 586, 292–298 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2769-8 2. Pérez, Fernando Rodríguez et al. “WRN Inhibition Leads to its Chromatin-Associated Degradation Via the PIAS4-RNF4-p97/VCP Axis.” bioRxiv (2023): n. pag. https://doi.org/10.1101/2023.12.08.570895 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

▎药明康德内容团队报道近期，国际权威期刊Nature同日上线了两篇关于WRN抑制剂研发的论文，其中一篇介绍了拜耳（Bayer）旗下Vividion Therapeutics公司的VVD-133214（也称为RO7589831）的发现过程，另一篇介绍了诺华（Novartis）的HRO761的发现过程。这两篇论文也引起了行业对“WRN”这个“合成致死”新靶点的关注。“合成致死”是指两个非致死基因同时被抑制，导致细胞死亡的现象。PARP抑制剂是全球首个利用合成致死理论成功研发并在临床实践中取得成功的药物。从2014年首款PARP抑制剂获FDA批准到现在，已有近10年的时间，但目前尚无针对其他靶点的“合成致死”药物获批。当前科学家们正在探索一些新型的“合成致死”靶点，以期给更多癌症患者带来新的治疗选择，Werner综合征RecQ解旋酶（WRN）就是被看好的靶点之一。据不完全统计，全球已有十几款WRN抑制剂在开发中。作为合成致死新靶点，WRN与疾病之间有着怎样的联系？靶向WRN的药物又有望治疗哪些癌症患者？全球有哪些管线正在开发？本文将结合公开资料带大家一起来了解下。图片来源：123RF——✦合成致死新靶点：WRN✦——WRN是DNA解旋酶RecQ家族的成员之一，与常染色体隐性遗传病布鲁姆综合征等遗传性疾病或早衰症都有密切关系。DNA解旋酶是一类在DNA或RNA复制过程中起到催化双链DNA或RNA解开的生物酶，参与了DNA复制、修复、转录、重组以及端粒的维持等细胞代谢过程，在维持染色体的稳定性中具有重要的作用。WRN还是RecQ家族成员中唯一具有解旋酶和核酸外切酶活性的多功能酶，两者既独立又相互协同，以分解多种DNA底物。研究发现，WRN参与了很多生物学过程，包括DNA损伤修复、端粒维持、自噬、基因组维护等。2019年，发表于《自然》等期刊的一系列研究发现，WRN和微卫星不稳定性（MSI）癌症之间具有“合成致死”的关系。——✦微卫星不稳定性癌症是什么？✦——在介绍WRN和MSI癌症的关系前，让我们先来了解下它的搭档——MSI癌症。MSI是一种癌细胞中由错配修复（MMR）受损或缺陷导致的、出现新的微卫星等位基因的现象，可以导致癌细胞基因进一步紊乱和突变，从而促进癌症的发生、发展，是公认的重要致癌途径之一。微卫星也称为短串联重复或简单序列重复，约占基因组的3%[1]。根据出现频率，MSI可分为高微卫星不稳定性（MSI-H）、低微卫星不稳定性（MSI-L）和微卫星稳定性（MSS）3种类型。研究显示，MSI存在于20多种不同类型的癌症中，在大约3%的癌症中观察到，全球每年确诊数十万例[2]。MSI结直肠癌是最早被发现的MSI癌症，有5%-15%患者是MSI结直肠癌[3]。此外，在约22%的胃癌[4]、30%的子宫内膜癌[5]、12%的卵巢癌[6]，以及肾上腺皮质癌、淋巴瘤和白血病[7]等恶性肿瘤中，也都能检测到MSI。相比于MSS癌症患者，临床研究显示，MSI癌症患者手术治疗后表现出更好的免疫反应、抑制癌细胞生长的能力以及良好的预后。不过，转移性MSI-H患者的预后并不理想，很多患者出现对化疗耐药和对免疫治疗的应答率低等情况。目前这类患者仍存在巨大的未满足医疗需求。图片来源：123RF——✦WRN与它的“合成致死”搭档✦——2019年，英国Wellcome Trust Sanger Institute和美国Broad研究所的两个研究团队各自通过敲除癌细胞中的特定基因，然后观察癌细胞的生存和健康状况，借此发现对癌症生存起到关键性作用的基因。两个研究团队都不约而同地发现了一个编码WRN的基因对具有MSI-H特征的癌症生存至关重要。进一步分析发现，DNA错配修复缺陷的MSI癌细胞在敲除WRN基因或耗尽WRN蛋白后，会损害MSI细胞的活力，引起细胞周期停滞、DNA损伤、有丝分裂缺陷、染色体破碎和凋亡，而且WRN缺失减少了移植MSI细胞小鼠的异种移植瘤生长和肿瘤形成。引人注目的是，当通过RNA干扰技术对多种MSI细胞和MSS细胞同时进行WRN的基因沉默后发现，MSI细胞在WRN沉默后，细胞发生明显凋亡，而MSS细胞并没有观察到细胞凋亡现象。而且，重新引入缺失MMR成分的MSI细胞的遗传拯救实验未能挽救合成致死关系。此外，使用解旋酶结构域、核酸外切酶结构域或两者的功能缺失突变，解析WRN的各种酶活性时发现，MMR缺陷的合成致死相互作用仅与WRN解旋酶活性相关。当MSI细胞中WRN解旋酶活性丧失时，与MSI的合成致死作用才被激活。在MSI-H细胞中，DNA损伤修复功能高度活跃，几乎不存在内源性双链断裂；当沉默WRN后，细胞内特定基因组位点出现大量双链断裂，进而导致细胞周期停滞、基因组不稳定和细胞凋亡。一系列的研究和实验不仅揭示了MSI-H癌细胞维持基因组稳定性的WRN依赖性分子机制，而且还表明WRN合成致死关系是通过MMR功能障碍的突变后果而不是通过MMR本身缺陷发展的，WRN可能是MSI-H癌症精准治疗的有效靶点之一。——✦10余款WRN抑制剂正在开发中✦——随着WRN可能是MSI癌症合成致死新靶点的发现，基于靶向MSI癌症的WRN抑制剂的研发也引起了科研人员和药物研发人员的兴趣。公开资料显示，全球目前还没有直接靶向人类DNA或RNA解旋酶的获批药物，但有十几款WRN抑制剂处在研发阶段，其中进展最快的是开头提到的拜耳的VVD-133214和诺华的HRO761。VVD-133214是一款WRN共价变构抑制剂，能够选择性地与WRN上的C727位点结合，具有低微摩尔范围WRN解旋酶抑制活性。研究发现，VVD-133214可通过共价抑制WRN，导致MSI-H细胞中广泛的双链DNA断裂、核肿胀和细胞死亡，但在微卫星稳定的细胞中则不会。而且，VVD-133214在小鼠中耐受良好，并在多个MSI-H结直肠癌细胞系和患者来源的异种移植模型中导致稳健的肿瘤消退[8]。在荷瘤小鼠的体内研究中，VVD-133214能抑制WRN杀死MSI型肿瘤，每天一次口服5 mg/kg或更高剂量的VVD-133214，即可导致肿瘤内接近完全的靶点结合。此外，在7个不同的MSI-H结直肠癌患者来源肿瘤异种移植（PDX）模型中进行的抗肿瘤活性测试显示，VVD-133214每日20 mg/kg的口服剂量，成功减少了6个PDX模型中的肿瘤负担；而且在来自同一位患者不同治疗阶段的2种PDX模型中，也显示出了不错的抗肿瘤疗效。2023年VVD-133214获FDA批准开展1期临床试验，评估其单药治疗MSI和/或缺陷错配修复晚期实体瘤的安全性、耐受性、药代动力学、药效学和初步抗肿瘤活性。图片来源：123RF诺华的HRO761是一款非共价别构WRN抑制剂，可在D1和D2解旋酶结构域的界面上变构结合，从而将WRN锁定在非活性构象中。HRO761还以剂量依赖的方式诱导WRN降解，激活DNA损伤反应并诱导p53靶基因。临床前研究结果显示，每日口服HRO761在异种移植物（CDX）和PDX模型中均显示出有效性。对SW48细胞来源的CDX测试结果显示，每日口服一次20 mg/kg的HRO761可导致肿瘤生长停滞。通过监测动物体重推断HRO761没有毒性。此外，在不同MSI适应症的CDX和PDX模型中进行的大规模体内筛选结果显示，所有适应症的疾病控制率约为70%，疾病稳定率为35%，部分缓解率为30%，完全缓解率为9%[9]。而且，体外联合伊立替康可加深对HRO761的敏感性，并在MSI-H结直肠癌细胞系中获得更持久的应答。2024年1月，HRO761在中国获得临床试验默示许可，拟开发治疗晚期不可切除或转移性MSI-H或错配修复缺陷型实体瘤。此外，HRO761在美国、韩国、日本等地也开展了1期临床研究，评估其单药或联合替雷利珠单抗或伊立替康，用于MSI-H或错配修复缺陷肿瘤的安全性、推荐剂量以及初步抗肿瘤活性。除以上进入临床阶段的药物外，公开信息显示，全球还有10多款靶向WRN的药物处于临床前阶段，如英矽智能的SM9432A和ISM2196、勤浩医药的GH1581、先声再明的ZM-3329和浦合医药的PH027等等。此外，GSK、Eikon Therapeutics公司、Syros Pharmaceuticals公司和Nimbus Therapeutics公司等也有研究该靶点。未来和挑战总体而言，WRN在DNA修复途径上是一个很重要的蛋白，许多错配修复存在缺陷的MSI-H癌细胞生存都依赖于WRN活性。作为合成致死的一个新兴靶点，针对WRN的药物研发正在稳步推进，WRN抑制剂有望成为治疗MSI-H癌症的潜在药物。然而这一领域的开发尚处于早期阶段，开发出适用于临床的药物仍有一定难度，比如MSI发展的复杂性及其与癌症演变的关系对研发前景提出了挑战，需要进一步的研究来克服现有挑战，并最终实现在临床上的价值。我们期望，随着研究的进展，靶向WRN的药物研发能取得更多突破，早日为MSI癌症患者带来新的治疗选择。参考资料：（可上下滑动查看） [1] David A.Morales-Juarez,et al.,(2023).Clinical prospects of WRN inhibition as a treatment for MSI tumours.npj Precision Oncology,DOI:10.1038/s41698-022-00319-y.[2] Gabriele Picco,et al.,(2021).Werner Helicase Is a Synthetic-Lethal Vulnerability in Mismatch Repair–Deficient Colorectal Cancer Refractory to Targeted Therapies,Chemotherapy,and Immunotherapy.Cancer Discovery,DOI:10.1158/2159-8290.CD-20-1508.[3] Kai Zimmer,et al.,(2020).WRN-Mutated Colorectal Cancer Is Characterized by a Distinct Genetic Phenotype.Cancers,DOI:10.3390/cancers12051319.[4] The Cancer Genome Atlas Research Network,(2014).Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma.Nature,DOI:10.1038/nature13480.[5] Haruko Kunitomi,et al.,(2017).New use of microsatellite instability analysis in endometrial cancer.Oncol Lett,DOI:10.3892/ol.2017.6640.[6] Tuya Pal,et al.,(2008).Systematic review and meta-analysis of ovarian cancers: estimation of microsatellite-high frequency and characterization of mismatch repair deficient tumor histology.Clin Cancer Res,DOI:10.1158/1078-0432.CCR-08-1387.[7] Russell Bonneville,et al.,(2017).Landscape of Microsatellite Instability Across 39 Cancer Types.JCO Precision Oncology,DOI:10.1200/PO.17.00073.[8] Kristen A. Baltgalvis,et al.,(2024).Chemoproteomic discovery of a covalent allosteric inhibitor of WRN helicase.Nature,DOI:10.1038/s41586-024-07318-y.[9] Stephane Ferrett,et al.,(2024).Discovery of WRN inhibitor HRO761 with synthetic lethality in MSI cancers.Nature,DOI:10.1038/s41586-024-07350-y.本文来自药明康德内容团队，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权请在「医药观澜」微信公众号留言联系我们。其他合作需求，请联系wuxi_media@wuxiapptec.com。免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。