Polymyxin B Sulfate

2025年10月3日，Nature Microbiology上发表文章“A generative artificial intelligence approach for the discovery of antimicrobial peptides against multidrug-resistant bacteria”。 1.引言 针对临床超级细菌发现新型的抗菌肽，是应对当前抗生素耐药性危机的迫切需求。而与传统抗生素相比，抗菌肽具有广谱活性、快速杀菌机制和不易诱导耐药性等优势，是极具潜力的候选药物。 受大语言模型进展的启发，作者提出了一个预训练的蛋白质大语言模型ProteoGPT，并通过迁移学习将其发展为多个专用的子模型，构建出一个序列化的工作流程。该流程能够从数亿个肽序列中实现快速筛选，在保证强效抗菌活性的同时，最大限度地降低了细胞毒性风险。这一个统一的框架实现了抗菌肽的高通量挖掘与从头生成。实验测试表明，无论是挖掘获得还是生成的新型抗菌肽，在体外对ICU来源的碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌都不易诱发耐药性。在小鼠大腿感染模型中，这些抗菌肽还展现了与临床抗生素相当或更优的疗效，而且没有引起器官损伤或肠道菌群紊乱。作用机制研究表明，这些抗菌肽通过破坏细胞质膜和引起膜电位去极化来发挥功能。综上所述，该研究发展了一种生成式人工智能驱动的新方法，为发现针对多重耐药菌的新型抗菌药物提供了高效且可广泛探索抗菌肽序列空间的解决方案。 2.方法 2.1 模型架构 图1 ProteoGPT预训练模型构建 本项研究的核心是构建了一个名为ProteoGPT的蛋白质大语言模型作为基础架构。该模型是基于GPT-2的Transformer架构，在高质量的UniProtKB/Swiss-Prot数据库（超过60万条非冗余蛋白质序列）上进行训练，参数量达到1.24亿，从而获得了对蛋白质序列语言的通用理解能力（图1a）。ProteoGPT的独特之处在于其训练数据源于高质量、经人工审阅的Swiss-Prot数据库，这为其提供了更可靠的生物学知识基础，相较于基于未整理数据训练的模型，其生成的序列或提取的特征更具有生物学合理性。 在此基础上，作者通过迁移学习这一关键的技术，将ProteoGPT的通用蛋白质知识适配到三个特定的下游任务中，衍生出三个功能专一的子模型：①AMPSorter：负责从海量序列中精准识别出具有抗菌肽潜力的序列，是一个分类器；②BioToxiPept：负责预测肽序列的细胞毒性，作为安全性筛选的关键关口，同样是一个分类器；③AMPGenix：负责从头生成全新的、具有抗菌肽特征的序列，是一个生成器。这三个模型共同构成了一条名为SPEL的自动化流水线，实现了从“挖掘”与“生成”候选分子，到“功能筛选”与“安全评估”的全流程覆盖。 2.1.1 AMPSorter：高精度抗菌肽分类器 AMPSorter是一个为精准识别抗菌肽而设计的分类模型。AMPSorter通过对大量抗菌肽和非抗菌肽序列进行训练，实现了对AMP的高效识别，其核心目标是从海量肽序列中准确区分出具有抗菌活性的肽段。该模型在训练过程中表现出优异的鲁棒性，未出现欠拟合或过拟合现象，训练集和验证集的损失函数及准确率曲线高度一致（如图2所示），体现了其稳定的学习能力。 图2 模型训练结果图 它的实现方式是在ProteoGPT的末端嫁接了一个分类模块，该模块由一个层归一化层和一个Softmax输出层组成。具体的工作流程是，输入的肽序列经过ProteoGPT的Transformer块处理，得到其高维语义表征；这个表征随后进入分类模块，经过层归一化以确保训练稳定性，最后通过Softmax层输出该序列为“抗菌肽”或“非抗菌肽”的概率。模型的训练目标是最小化交叉熵损失函数，从而驱动模型学会区分两者的关键特征。为了检验其泛化能力，作者采用了严格的基准测试集——使用CD-HIT工具剔除了测试集中与训练集序列相似度高于70%的序列。在这种挑战下，AMPSorter依然达到了0.97的AUC值和0.96的AUPRC值，性能显著优于包括AMPlify、Macrel在内的多个现有分类器（图3b,3c），这表明它并非简单地记忆序列，而是真正学会了抗菌肽的深层模式。此外，一个突出的优点是它能灵活处理含有非天然氨基酸的肽序列，在此类序列上的识别精度高达96.43%，这大大增强了其在探索非天然肽库时的实用价值。 图3 AMPSorter训练结果展示 2.1.2 BioToxiPept：细胞毒性预测分类器 BioToxiPept是一个专注于预测肽序列细胞毒性的分类器，其模型架构与AMPSorter完全相同，可以看成是ProteoGPT在毒性预测领域的另一种体现。它的工作原理也是相同的，只是训练数据换成了经过实验验证的有毒肽与无毒肽数据集。通过在这种特定数据上的微调，BioToxiPept学会了识别可能导致细胞毒性的序列特征。在性能上，它与目前领先的毒性预测工具ToxIBTL和ToxinPred2.0-RF表现相当，其AUPRC值达到0.92（图4d,e）。这个指标非常重要，因为它反映了模型在“正样本”（有毒肽）中的识别能力，高AUPRC值意味着BioToxiPept能非常有效地将真正有毒的肽筛选出来，从而大幅降低漏报风险，避免将有毒性风险的候选肽推进到昂贵的实验验证阶段，为整个筛选流程提供了至关重要的安全保障。 图4 BioToxiPept与其它毒性预测模型的性能对比 2.1.3 AMPGenix：抗菌肽序列生成器 AMPGenix是整个研究中最具创造性的部分，它是一个能够从头地生成全新抗菌肽序列的生成模型。与前面讲的两个分类器不同，AMPGenix完全保留了ProteoGPT的生成式架构，它的工作机制是通过在大量已知抗菌肽序列上进行继续训练，让模型内部参数适应AMP的特征。在生成新序列时，用户可以通过设定温度参数来精确控制模型生成新的抗菌肽序列的水平：较低的温度使模型输出更保守、概率最高的氨基酸，生成结果更可靠但多样性较低；提高温度则会增加随机性，鼓励模型探索更多可能性，从而产生更具独特性和新颖性的序列。评估数据显示，随着温度从0.5升至3，生成序列的独特性从0.81提升至1.00，且其整体分布与真实AMP库的弗雷歇距离从13.61降至9.26，说明生成的序列在保持多样性的同时，也越来越贴近真实AMP的统计特征。为了验证其生成质量，作者使用六个外部AMP分类器对AMPGenix生成的序列进行鉴定，发现其中被判定为AMP的比例显著高于未经过AMP数据微调的原始ProteoGPT模型（图5f、5g），这强有力地证明了该领域知识迁移的成功——AMPGenix确实学到了抗菌肽的核心特征。 图5 AMPGenix与基础模型及其它生成模型的生成质量对比 综上所述，AMPSorter、BioToxiPept和AMPGenix三个模型共同构建了一个功能互补的协同系统。AMPGenix作为序列生成模块拓展了候选空间，AMPSorter作为高精度分类器实现初步功能筛选，BioToxiPept则作为安全过滤器评估潜在毒性风险。三者集成于SPEL流程中，实现了从虚拟设计、高效筛选到安全预判的自动化抗菌肽发现闭环。 2.2 抗菌肽的高通量挖掘方法 该研究通过整合数据挖掘与文本生成两种策略，构建了一个统一且高效的高通量抗菌肽发现框架。该框架的核心在于利用经过迁移学习定制的大语言模型，对超过4.1亿个天然肽片段进行系统性筛选，并同时从头生成近8000条全新的人工设计序列。通过一个集成了识别（AMPSorter）、毒性预测（BioToxiPept）功能的自动化流程 （图6b），作者从上述海量序列中快速精炼出数万个兼具高预测抗菌活性与低预测细胞毒性的候选肽，分别形成了“数据挖掘候选池”与“文本生成候选池”。这一种方法不仅大规模地发掘了自然界中隐藏的抗菌肽资源，更是突破了天然序列的限制，主动创造了结构新颖的抗菌肽，实现了对抗菌肽序列空间广度与深度的并行探索。 图6 迁移模型全流程 2.2.1 数据挖掘 数据挖掘策略的核心思想是，由于自然界现有的蛋白质序列中潜藏着大量未被发现的、具有抗菌活性的短肽片段，为了实现这一挖掘，研究团队首先将UniProtKB/Swiss-Prot数据库中的所有609,216条非冗余蛋白质序列，通过一种滑动窗口技术进行碎片化处理（图7a）。窗口大小L设置为8至30个氨基酸，步长为窗口长度的一半L/2，以此生成了5个不同长度范围的、总数高达410,192,277个的非冗余短肽数据集（NRSPDs）。 图7 滑动窗口工作流程 随后，SPEL管道启动筛选：首先，AMPSorter模型对这海量的短肽进行初步筛选，识别出其中可能具有抗菌活性的肽段m_AMPs，共得到约1.21亿个候选肽。紧接着，这些候选肽再经过BioToxiPept模型的毒性预测过滤，最终得到了约8269万个被预测为无毒的“加密”抗菌肽m_AMPs_nontox，构成了数据挖掘的候选池。 2.2.2 文本生成 文本生成策略代表了一种更具有创造性的方法，它不依赖于现有的天然蛋白质序列，而是利用生成式人工智能模型AMPGenix直接从头设计全新的抗菌肽（图8c）。作者将AMPGenix的温度参数默认设置为1，并基于对已知抗菌肽起始氨基酸频率的分析，选取了包括甘氨酸（G）、赖氨酸（K）、色氨酸（W）等在内的10个高频氨基酸作为前缀prefix，生成了7,798条独特的短肽序列，构成了生成的短肽数据集GNRSPDs。在这批生成的序列中，有76.1%（5,938条）被AMPSorter识别为抗菌肽（g_AMPs）。随后，这些生成的抗菌肽同样经过BioToxiPept的毒性筛选，最终得到了4,736条（占生成序列总数的60.7%）被预测为无毒的生成抗菌肽（g_AMPs_nontox），形成了文本生成的候选池。 图8 AMPGenix从头设计全新的抗菌肽 为了初步验证生成模型的有效性，研究人员从生成候选池中挑选了AMPSorter预测概率最高的20条肽PT-series进行体外抗菌活性测试。结果如下：高达90%（18/20）的生成肽对至少一种测试菌株表现出抑制活性（MIC≤512µg ml⁻¹），其中多条肽（如PT-1,PT-4,PT-18等）对临床耐药菌株（CRAB和MRSA）和真菌（C.albicans）显示出强效、广谱的抗菌能力，最低抑菌浓度（MIC）可低至1µg ml⁻¹。这直接证明了AMPGenix能够成功生成具有实际应用潜力的功能性抗菌肽序列，而不仅仅是模仿已知序列。 3.实验 3.1 体外抗菌活性初步筛选实验 该实验的目的是从大量候选肽（196条：154条挖掘的m_AMPs和42条生成的g_AMPs）中，快速、定性地筛选出具有抗菌活性的肽。作者使用了改良的Kirby-Bauer纸片扩散法来实现这一目的。具体的过程是，将标准测试菌株大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923混入软琼脂中，倾注成双层平板，然后将定量的肽溶液（初始剂量为128μg）滴加在置于平板表面的无菌滤纸片上。经过37°C孵育16小时后，通过测量抑菌圈的直径来评估抗菌活性。结果分析显示，在128μg剂量下，有75.97%的m_AMPs和61.91%的g_AMPs对至少一种测试菌表现出抑菌圈。随后，将肽的剂量降低至64μg进行复筛，并以抑菌圈直径≥10mm作为更严格的标准，最终成功筛选出83条m_AMPs和17条g_AMPs进入下一阶段的定量测试，这一初步筛选过程及其结果总结如图9a所示。 图9 筛选过程及结果展示 3.2 最小抑菌浓度测定与生物安全性评估实验 在获得初筛阳性候选肽后，研究进入了精确定量与安全性评估阶段，这个实验的目的是精确量化这些肽的抗菌强度，并评估其对哺乳动物细胞和红细胞的潜在毒性，从而筛选出高效低毒的领先肽。MIC的测定采用国际通用的肉汤微量稀释法，将候选肽在培养基中进行一系列2倍梯度稀释，然后加入一定浓度的菌液（分别使用了高接种量10^8CFU/mL和标准接种量10^5CFU/mL），孵育后通过观察或测量光密度来确定完全抑制细菌生长的最低肽浓度。与此同时，还要展开生物安全性评估。溶血活性通过将绵羊红细胞与肽共孵育后测量上清液在540nm的吸光度来计算，其计算公式为： 其中PBS和TritonX-100分别作为0%和100%溶血的对照。 而针对细胞毒性则使用MTT法检测，通过测量人胚胎肾细胞HEK293在与肽共孵育后的代谢活性来反映细胞存活率，计算公式为： 实验结果表明，部分肽在不同接种量下对测试菌株表现出极低的MIC值（例如，部分g_AMPs对金黄色葡萄球菌的MIC≤0.625μg/mL），如图10b所示。综合低溶血率（<8%）和高细胞存活率（≥50%），研究者最终筛选出20个最具潜力的领先肽（10个m_AMPs和10个g_AMPs），其细胞毒性和溶血率数据汇总于图11c。随后，在标准接种量下对这些领先肽进行更广泛的测试，证实了其中的5个肽（如g_AMP14,g_AMP41,m_AMP46,m_AMP76等）对包括临床耐药菌CRAB、MRSA乃至真菌白色念珠菌在内的多种病原体均具有强效且广谱的抗菌活性（MIC<32μg/mL），其MIC值分布详见图12d和12e。 图10 m_AMPs和g_AMPs对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值 图11 前20个候选抗菌肽的细胞毒性和溶血率 图12 MIC值的分布（d）排名前20的候选AMPs对应的MIC值（e） 3.3 体内治疗效果验证实验 在证实了领先肽的体外高效性和安全性后，研究进一步在活体动物模型中评估其治疗效能，即体内治疗效果验证实验，这个实验的目的是在模拟临床感染，评估这些AMP在活体动物体内对抗超级细菌的实际效果、稳定性和全身安全性。作者建立了小鼠大腿感染模型，通过腹腔注射环磷酰胺诱导小鼠中性粒细胞减少，使其更易感染，随后在其右后肢大腿肌肉内注射定量的CRAB或MRSA菌液。在感染后的特定时间点（1,3,5,7小时），通过腹腔注射给予AMP治疗（剂量为10倍MIC），并以无菌水作为阴性对照，多粘菌素B（针对CRAB）或万古霉素（针对MRSA）作为阳性对照。治疗24小时后，收集感染部位的大腿组织，通过匀浆、稀释和涂板培养来计数残留的活菌数（CFU）。实验结果表明，多个AMP表现出与临床抗生素相当甚至更优的清除效率。例如，针对CRAB感染，g_AMP42和m_AMP76的清除率分别达到83%和87%，与多粘菌素B（86%）相当；针对MRSA感染，g_AMP14的清除率高达85%，与万古霉素（89%）相当，实验数据如图13b、c中。 图13 CRAB和MRSA感染小鼠大腿组织细菌计数 然而，实验也出现了稳定性的问题，g_AMP41和g_AMP42在体外活性极强，但在体内效果不佳。为此，研究者设计了抗蛋白酶降解实验进行探究，将AMP置于含有多种活性蛋白酶的马血清中孵育4小时，在不同时间点通过液相色谱-串联质谱法LC-MS/MS定量剩余完整肽的浓度。结果如图14d、e所示，g_AMP41和g_AMP42在4小时后剩余浓度低于60%，而其他在体内有效的肽（如g_AMP14,m_AMP76等）则能保持80%以上的稳定性，这明确指出肽在体内的蛋白酶稳定性是其发挥疗效的关键因素之一。在安全性方面，则是对治疗后小鼠的肠道菌群进行16S rRNA测序分析，发现AMP治疗组与对照组在微生物群落结构、多样性及Firmicutes/Bacteroidetes比率上均无显著差异，表明这些肽没有扰乱肠道微生态平衡。组织病理学检查H&E染色进一步显示，有效AMP治疗组的结肠组织未见明显炎症浸润，肾脏仅见轻微静脉淤血，而万古霉素治疗组则出现了明显的肾小管上皮细胞损伤，如胞浆空泡化和核固缩，这些发现综合证实了领先肽在体内的治疗安全性。 图14 抗酶解实验过程与结果 3.4 耐药性诱导实验 由于耐药性是传统抗生素面临的最大挑战，本研究作者针对这一方面，专门设计了耐药性诱导实验，用来评估细菌在长期接触亚致死浓度AMP后产生耐药性的风险。这个实验采用经典的连续传代法，将CRAB和MRSA分别在含有0.5倍MIC浓度的AMP或对应抗生素（多粘菌素B或万古霉素）的培养基中连续培养20天（即20代），并每日监测MIC值的变化。结果非常显著，如图15f、g所示，与多粘菌素B（MIC增加32倍）和万古霉素（MIC暴增≥128倍）相比，所有测试的AMP诱导耐药性的能力均微弱得多。例如，g_AMP14和g_AMP33对CRAB的MIC在20代后完全没有变化，而m_AMP76的MIC也仅增加了8倍。这一关键实验强有力地证明，本研究发现的抗菌肽相较于传统抗生素，具有一个巨大的潜在优势——极不易诱导细菌产生耐药性。 图15 CRAB和MRSA在0.5倍MIC浓度的AMPs和抗生素 4.讨论 该研究开发了SPEL，这是一个集成大型语言模型的生成式人工智能框架，用于高效发现针对多重耐药菌的抗菌肽，仅需设定序列长度、前缀等基本参数即可从海量序列空间中生成候选AMP。我们为数据挖掘和文本生成两种策略设计了统一的计算流程，并通过湿实验验证了其在发现新型抗菌肽方面的强大能力。 本篇论文的研究提出的方法能够直接从预训练的蛋白质语言模型中生成多样化的功能性AMP序列，这与严重依赖已知天然肽库进行同源筛选或有限物理化学修饰的传统方法截然不同。通过迁移学习，我们将通用的ProteoGPT模型微调为具备AMP特异性知识的子模型（如AMPGenix和AMPSorter），从而在生成和筛选阶段就嵌入了对抗菌活性和低细胞毒性的双重考量，这不同于在获得庞大候选库后才进行单一性质筛选的常规流程，极大地提升了发现效率。 通过对临床分离的超级耐药菌（如CRAB和MRSA）进行系统的体外和体内评估，我们证实了由SPEL框架发现或生成的AMP变体均能有效保留其靶向结合与杀菌能力。尤为引人注目的是，部分最优的AMP变体（如m_AMP76和g_AMP14）甚至展现出比传统临床抗生素更优异的体内清除效率和显著降低的耐药性诱导倾向。作用机制研究表明，这些活性AMP通过破坏细菌细胞膜完整性与导致膜电位去极化来发挥其杀菌作用，这种物理性作用模式可能有助于解释其难以产生耐药性的特点。 SPEL框架的灵活性在于，其数据挖掘策略（m_AMPs）可直接从蛋白质组数据库中解密具有潜力的天然加密肽，而其文本生成策略（g_AMPs）则能创造出与已知AMP分布相似但序列新颖的非天然肽。UMAP可视化分析和FCD指标表明，生成的g_AMPs在序列空间中的分布更为分散，这凸显了我们的方法不仅限于模仿，更具备了创新的能力。此外，生成策略所表现出的更高预测活性和更低预测毒性，凸显了经过AMP领域知识微调的语言模型在捕获功能序列关键特征方面的卓越能力。 当然，该研究的当前方法也具有一定的局限性。例如AMPSorter等模型目前主要作为定性分类器，尚不能精确量化预测抗菌活性的强度。另外，作者采用的QSAR模型对带正电且疏水的阳离子肽存在固有偏好，这可能限制了研究发现其他类型AMP（如阴离子肽）的能力。未来的研究方向将致力于开发基于序列的、无偏见的定量活性预测模型，并探索将蛋白质结构信息整合到框架中，以生成不仅序列优化、其三维构象也更利于稳定结合的AMP，从而从另一个维度增强抗菌肽的发现与优化过程。综上所述，SPEL框架为应对日益严峻的抗生素耐药性危机提供了一条极具前景的新途径。 论文链接： https://www.nature.com/articles/s41564-025-02114-4 本文转自【Al in Graph】公众号 --------- End --------- 感兴趣的读者，可以添加小邦微信加入读者实名讨论微信群。添加时请主动注明姓名-企业-职位/岗位或姓名-学校-职务/研究方向。

摘要 abstract 2025年9月，15个1类新药、13个改良型新药申请上市，238个品种按新分类仿制申请申报，其中35个品种暂无国内仿制获批，硫酸氨基葡萄糖胶囊仿制申报企业最多，有6家，山东齐都药业仿制申报品种数最多，有5个；17个存量品种有企业申报一致性评价；2个1类新药首次获批上市，8个品种获批新适应症；25个品种首家过评，其中13个为首仿。 创新药品种上市申请情况 2025年9月有15个1类新药申请上市，化学药有6个，中成药有2个，生物制品有7个，除北京天广实生物的重组人源化单克隆抗体MIL62注射液外，其他品种均为首次上市申报。 2025年9月创新药上市申请承办情况 改良型新药品种上市申请情况 2025年9月有13个改良型新药品种的上市申请获CDE承办，均为新适应症上市申请。 2025年9月改良型新药上市申请承办情况 一致性评价申请情况 2025年9月，238个品种按新分类仿制申请获CDE承办，其中35个品种在中国境内暂无仿制药获批。申报厂家数前三位分别为硫酸氨基葡萄糖胶囊（6家）、沙库巴曲缬沙坦钠片（5家）、聚多卡醇注射液（4家）。企业申报数量方面，山东齐都药业申报品种数最多，有5个。 2025年9月一致性评价申请情况(新分类仿制申请) 2025年9月，17个存量品种的一致性评价补充申请获CDE承办。坎地沙坦酯氢氯噻嗪片(Ⅰ)、盐酸乙哌立松片、注射用硫酸多黏菌素B等3个品种首次有企业通过补充申请启动一致性评价。 2025年9月一致性评价申请情况(存量品种) 获批情况 2025年9月有2款1类新药首次获批上市，8个品种获批新适应症，3个生物类似药获批上市。 240个品种按新分类仿制申请获批并视同过评，40个品种按存量品种一致性评价补充申请过评。其中25个品种为首家过评，阿仑膦酸钠口服溶液(秦皇岛爱晖药业)、比拉斯汀口崩片(山东新时代药业)、丙酸氟替卡松吸入粉雾剂(润生药业)、波生坦分散片(华润双鹤利民药业(济南))、恩那度司他片(深圳信立泰药业)、磷/碳酸氢钠血滤置换液(山东齐都药业)、硫酸艾沙康唑胶囊(杭州沐源生物医药)、培哚普利氨氯地平片(Ⅱ)(江西施美药业)、托吡酯口服溶液(梦阳药业(上海))、盐酸纳呋拉啡口崩片(成都苑东生物制药)、盐酸曲唑酮缓释片(深圳泛谷药业)、注射用醋酸地加瑞克(正大天晴药业集团)、注射用头孢唑肟钠/氯化钠注射液(北京锐业制药(潜山))等13个品种为首仿品种。 2025年9月主要注册类型品种获批情况 数据来源：米内网中国申报进度数据库（MED）、CDE、NMPA；相关统计字段按药品名称统计，申报企业数按主申报企业统计，时间截至2025年9月30日；获批品种按NMPA批件发布时间统计；药物作用靶点以及适应症整理自公开资料；首仿品种指中国内地首仿品种。 免责声明：本文仅作医药信息传播分享，并不构成投资或决策建议。本文为原创稿件，转载文章或引用数据请注明来源和作者，否则将追究侵权责任。投稿及报料请发邮件到872470254@qq.com稿件要求详询米内微信首页菜单栏商务及内容合作可联系QQ：412539092 【分享、点赞、在看】点一点不失联哦