PF-562271

喜欢我们，设为星标，接收最新类器官进展与资讯！知识星球搜索“肠道类器官”获取更加专业的培养基配方、标准方案、AI类器官工具和技术手册。  传播科学知识 促进同行交流 推动产业发展 服务国家战略  本公众号由Organoid Agent智能体强力赋能，让您的类器官研究始终站在潮头浪尖！ 推荐语       该研究针对缺血性中风后血管重建难、传统修复基质亲水肿胀或支撑不足、Matrigel 临床转化受限等核心问题，提出 “恒定空间再生” 理念，研发出非膨胀可生物降解基质（NEBM）。其以临床级丝素蛋白与透明质酸为原料，通过共价 - 非共价组装仿生脑 ECM，兼具脑适配刚度（HS-75 存储模量 282.0±4.0Pa）、抗肿胀稳定性及渐进降解特性。体外实验显示，NEBM 可促进血管类器官（BVO）发育，形成更高密度、更大直径且动脉特征更明显的血管网络（EC 比例从 7.7% 升至 23.7%）；体内移植能实现 BVO 与宿主血管吻合，显著提升缺血灶脑血流（灌注下降从 60% 缩至 20%），激活神经发生并改善小鼠运动功能，12 周仍保持组织修复效果。该研究为受限环境下器官修复提供临床可转化基质设计范式，推动血管类器官在中风治疗中的应用，对再生医学具有重要启发意义。 技术路线图 科学背景与研究现状 缺血性中风（Ischaemic Stroke, IS）是全球致死率和致残率最高的神经系统疾病之一，核心问题在于局部脑血管阻塞导致脑血流（Cerebral Blood Flow, CBF）中断，最终引发脑组织缺血缺氧、神经元坏死和功能障碍 [1]。疾病进展到亚急性期后，缺血核心区会慢慢形成局部坏死腔（Necrotic Cavity），同时脑内细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）大量流失 —— 这不仅挡住了血管内皮细胞、神经干细胞等修复相关细胞的浸润路径，还把再生过程局限在病灶边缘，严重影响患者的自然恢复 [8,9]。因此，实现坏死腔区域的血管重建（Revascularization）成了缺血性中风修复的关键：不仅能恢复局部血供、改善组织微环境，更能通过刺激神经发生（Neurogenesis）和轴突再生（Axonal Regeneration），为神经功能恢复打下基础 [3-7]。 早期研究主要聚焦于激活机体自身的内源性修复通路，比如促进内源性神经干细胞（Neural Stem Cells, NSCs）向神经元分化、提高血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）等促血管生成因子的表达、抑制胶质瘢痕（Glial Scar）过度形成等。但缺血性中风后，人体自身的修复能力其实非常有限：一方面，坏死腔形成导致的 ECM 缺失，相当于破坏了细胞存活和迁移的 “土壤”，就算额外补充生长因子，也很难让修复细胞有效聚集并发挥作用 [8]；另一方面，缺血区域的炎症微环境、氧化应激等问题，还会进一步抑制修复细胞的活性，让内源性修复通路难以持续激活 [9]。这些问题导致单纯依赖内源性修复的治疗方案效果不佳，根本满足不了临床需求。为了突破这个瓶颈，外源性干预策略逐渐成为研究热点，其中组织工程介导的血管重建技术尤为关键。这个领域的研究也经历了从单一细胞移植到 “细胞 - 基质” 复合体系的演变：早期尝试直接移植血管内皮细胞（Endothelial Cells, ECs）或间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）来促进血管生成，但这些细胞在缺血环境中存活率低，还难以形成功能性血管网络，疗效并不理想 [10-12]。近年来，血管类器官（Blood Vessel Organoids, BVOs）的出现给缺血性中风修复带来了新希望。这种通过体外诱导多能干细胞（Pluripotent Stem Cells, PSCs）分化形成的三维结构，不仅有器官特异性的血管网络，还能和宿主血管系统实现功能吻合（Anastomosis），刚好能解决传统细胞移植的短板 [10-13]。已有研究证实，把血管类器官移植到缺血性中风病灶区域，能显著促进局部血管新生 [11]，但它的临床转化还面临一个核心难题 —— 没有合适的支撑基质。 血管类器官要实现体外成熟和体内功能发挥，离不开支撑基质（Scaffold）的调控 [18,19]。一款理想的基质需要同时满足四个关键条件：既要在狭窄的中风坏死腔内提供抗肿胀的稳定支撑，又要通过降解为血管类器官发育和血管新生腾出空间；力学性能得和脑组织匹配，避免因硬度不合适导致细胞功能异常或组织损伤 [21,22]；必须用临床级材料制作，保证生物相容性，避免引发免疫反应或带来肿瘤相关风险；还得具备调控血管类器官发育的生物活性，为细胞粘附、增殖和分化提供必要信号 [23]。但目前主流的基质材料，都存在难以克服的缺陷。现在血管类器官培养和移植最常用的是基质胶（Matrigel），它的优势是富含生物活性因子、应力松弛速度快，能给类器官发育提供不错的体外环境 [16]。但这款材料有个致命短板：它来自肿瘤组织，成分复杂且不同批次差异大，存在潜在的肿瘤相关风险，严重阻碍了临床转化 [10-12]；而且它的微观结构太致密（平均孔径仅 8.9±1.7μm），满足不了血管类器官成熟过程中血管出芽和网络扩展的空间需求 [2]；力学性能也和脑组织（存储模量约 250Pa）不匹配，没法为脑内移植提供稳定支撑 [21]。为了替代 Matrigel，研究人员也曾尝试开发合成水凝胶（比如聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG）水凝胶）或单一天然聚合物基质（比如纯透明质酸（Hyaluronic Acid, HA）凝胶、胶原蛋白凝胶），可惜这些材料同样不尽如人意：合成水凝胶虽然能精准调控力学性能，却缺少细胞识别信号，部分成分（比如 PEG）还可能引发免疫反应 [24,25]；纯 HA 凝胶降解速度太快，没法提供长期的力学支撑 [32]；胶原蛋白凝胶则有亲水肿胀的问题，植入脑内后容易导致组织压迫、脑水肿甚至脑疝，反而造成二次神经损伤 [2,20]。更关键的是，缺血性中风的坏死腔属于典型的 “受限环境”，对基质材料的要求更苛刻：传统多孔基质植入后会因为吸收脑脊液而肿胀，压迫局部组织；可要是为了追求结构稳定而降低降解速度，又会阻碍血管类器官和宿主组织的整合，没法实现血管重建 [2]。这种 “肿胀 - 塌陷” 的矛盾、“稳定支撑 - 动态降解” 的平衡难题，成了脑内血管类器官移植基质研发的核心技术瓶颈，也是目前研究还没解决的关键空白。 总的来说，缺血性中风修复领域虽然已经明确 “血管重建是核心、血管类器官是理想工具”，但基质材料的缺陷却成了阻碍这一策略走向临床的最大障碍。现有基质要么存在临床转化风险（比如 Matrigel），要么满足不了脑内受限环境的特殊需求（比如传统水凝胶的肿胀或降解失衡），更没有一款能同时实现 “抗肿胀支撑、脑适配力学、动态降解、血管类器官调控” 的一体化设计。在这样的背景下，本研究提出了 “恒定空间再生（Regeneration in Constant Space）” 的创新理念，核心目标就是解决一个关键科学问题：如何通过仿生设计，开发出一种非膨胀可生物降解基质（Non-expansive Biodegradable Matrix, NEBM），既能在缺血性中风的受限坏死腔内提供稳定、抗肿胀的力学支撑，又能通过动态降解为血管类器官发育和血管新生创造空间；同时，这款基质还得具备和脑组织匹配的力学性能、临床级的生物相容性，并且能通过生物活性修饰调控血管类器官的成熟和功能整合，最终实现缺血性中风区域的有效血管重建和神经功能恢复。之所以说这项研究至关重要，原因有三点：一是它直面当前血管类器官移植的核心瓶颈，为解决 “基质 - 类器官 - 脑环境” 的适配问题提供了全新方案，突破了传统基质的固有缺陷；二是它采用临床级天然聚合物（丝素蛋白（Silk Fibroin, SF）和透明质酸）构建基质，结合仿生组装技术，为血管类器官的临床转化打下了材料基础；三是它提出的 “恒定空间再生” 理念不仅适用于缺血性中风修复，还能为其他受限环境（比如脊髓损伤、心肌梗死坏死灶）的器官修复提供通用的基质设计思路，对整个再生医学领域都有重要启发。 实验技术方法 一、核心重点：血管类器官（BVO）的制备、培养与检测技术 血管类器官是本研究的核心工具，其制备和功能检测贯穿整个研究，从体外诱导到体内验证的每一步都有明确的技术规范，具体过程如下：1. 血管类器官的体外诱导与制备起始细胞选择 ：采用人类诱导多能干细胞（hiPSCs，型号 DYR0100）和带绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的 hiPSCs（hiPSC-GFP-AAVS1），前者用于常规实验，后者方便体内追踪类器官存活和整合情况。诱导分化步骤 ：严格按照已建立的成熟方案进行诱导，先将 hiPSCs 在低粘附孔板中培养 5 天，使其定向分化为血管谱系的早期类器官（这一步是为了让干细胞初步形成血管细胞的雏形，为后续成熟做准备）。关键培养基配方 ：诱导阶段使用 StemPro-34 基础培养基，添加 1.3ml StemPro-34 补充剂、10ml 胎牛血清、0.5ml Glutamax（维持细胞活性）、0.5ml 青霉素 - 链霉素（防污染），以及关键的促血管生成因子 ——100ng/ml 血管内皮生长因子（VEGF-A）和 100ng/ml 成纤维细胞生长因子（FGF-2），每 3 天更换一次培养基，保证类器官持续发育。2. 血管类器官的基质封装与成熟培养封装基质选择 ：将培养 5 天的早期 BVO 分别封装到两种基质中对比 —— 实验组为不同交联度的 HS 系列非膨胀可生物降解基质（NEBM 的核心类型，按 H₂O₂浓度分为 HS-50、HS-75、HS-100 等），对照组为传统基质胶（Matrigel）。封装操作细节 ：每个孔加入 50-60 个类器官，封装后继续在上述血管成熟培养基中培养，每天用光学显微镜观察类器官形态变化，重点记录血管出芽情况，直到培养第 6 天进行后续检测。关键控制变量 ：为保证实验可比性，所有 NEBM 都统一添加 0.2mM 的 RGD 粘附肽（促进细胞贴附）和 0.2mM 的 MMP-2 切割肽（实现基质动态重塑），且交联用的辣根过氧化物酶（HRP）浓度固定为 10U/ml，仅通过调整 H₂O₂浓度改变交联度。3. 血管类器官的功能检测技术细胞活力检测（Live-Dead 染色） ：培养 12 小时和 5 天后，用钙黄绿素 - 乙酰甲氧基酯（Calcein-AM）和碘化丙啶（PI）染色，活细胞会被染成绿色，死细胞为红色。染色后用共聚焦显微镜或倒置荧光显微镜成像，通过 ImageJ 软件计算活细胞面积占比，判断不同基质对类器官存活的影响。血管形态与成熟度检测（免疫荧光染色） ： 固定与透化：将培养 5 天的 BVO 用 4% 多聚甲醛固定 2 小时，再用 0.5% 曲拉通 X-100 透化 15 分钟，封闭液用山羊血清孵育 2 小时（减少非特异性结合）。 抗体孵育：一抗选择 CD31（血管内皮细胞标志物，1:200 稀释）、α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA，血管平滑肌细胞标志物，1:200 稀释），4℃孵育过夜；二抗用荧光标记抗体（1:1000 稀释），室温孵育 2 小时，同时加入鬼笔环肽（1:500 稀释）标记细胞骨架、DAPI 染细胞核。 结果分析：用 Leica TCS SP8 共聚焦显微镜成像，通过 AngioTool 软件量化血管参数 —— 包括血管面积、血管密度、血管长度、分支指数和血管直径，以此判断类器官的成熟程度（比如 CD31 阳性面积大、血管直径粗，说明类器官更成熟）。单细胞水平机制解析（scRNA-seq 技术） ： 样本处理：将培养 5 天的 BVO 用胶原酶溶液（2mg/ml 胶原酶 + 2.5mM 氯化钙）37℃消化，再用 TrypLE 消化两次（每次 5 分钟），过 40μm 细胞筛获得单细胞悬液，离心后保存于冰上。 测序平台与文库构建：采用 10X Genomics Chromium 系统，用 Next GEM Single Cell 3' v3.1 试剂盒构建文库，最终在 Illumina NovaSeq 6000 平台测序。 数据分析：用 Scanpy 软件进行质控、降维和聚类，Harmony 软件校正批次效应，Monocle2 软件做拟时序分析，最后通过 clusterProfiler 软件进行 KEGG 和 GO 通路富集分析（通俗说就是通过基因表达差异，搞清楚不同基质下类器官里各种细胞的类型变化和功能差异，比如 HS-75 基质中内皮细胞比例更高的原因）。二、非膨胀可生物降解基质（NEBM）的制备与表征技术 NEBM 是本研究的核心创新点，其制备工艺和性能表征直接决定后续实验效果，关键技术如下：1. 核心基质成分的制备关键原料与试剂 ：采用临床级丝素蛋白（SF，来自家蚕茧，20mg/ml）和酪胺修饰的透明质酸（HT，10mg/ml，HT 由透明质酸与酪胺盐酸盐通过 1 - 乙基 - 3-（3 - 二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和 N - 羟基琥珀酰亚胺（NHS）催化偶联制备，透析后冻干保存）。交联体系构建 ：通过 HRP-H₂O₂酶促交联反应，结合 SF 和 HT 的共价 - 非共价相互作用（SF 的疏水性和氢键、HT 的亲水性），同时加入 RGD 粘附肽和 MMP-2 切割肽，形成稳定且可动态重塑的基质网络。不同交联度基质制备 ：通过调整 H₂O₂浓度（0.005%、0.0075%、0.01%）制备 HS-50、HS-75、HS-100 三种基质，另外设置不含 H₂O₂的 HS-0 作为对照，后续通过实验筛选出最优的 HS-75（其力学性能最接近脑组织）。2. 基质性能的全面表征微观结构观察（Cryo-SEM 技术） ：将基质样本快速投入液氮冷冻固定，通过低温冷冻转移系统转移到扫描电镜（Hitachi Regulus 8100），经升华除冰、冷冻断裂、喷金处理后成像，用 ImageJ 软件测量孔径和面积（科普：Cryo-SEM 能避免常规 SEM 样本脱水导致的结构变形，真实还原基质的多孔结构，HS-75 的平均孔径约 28μm，远大于 Matrigel 的 8.9μm，更适合血管出芽）。力学性能测试 ： 流变学测试：用 TA DHR-1 流变仪，在 37℃下对基质进行频率扫描（0.1-10Hz，1% 应变），测量存储模量（G'），判断刚度（HS-75 的 G' 约 282Pa，与脑组织的 250Pa 接近）。 应力松弛测试：用 ZhiQu 力学测试仪，对基质施加 15% 恒定压缩应变，记录应力随时间的变化，用广义 Maxwell-Wiechert 模型拟合，获得弹性成分（σ₀）和松弛半衰期（τ₁/₂），评估基质的应力缓冲能力。降解与溶胀测试 ：将基质样本分别浸泡在 PBS、BVO 培养基和含 MMP-2（100nM）的 PBS 中，37℃孵育，定期测量体积和干重，计算溶胀率（体积变化）和质量降解率（质量损失），验证 HS 基质 “抗肿胀、可降解” 的特性（HS-75 在 28 天内体积基本不变，质量逐渐下降，符合 “恒定空间再生” 理念）。化学结构分析（FT-IR 技术） ：用 PerkinElmer Spectrum Two 红外光谱仪，在 4000-450cm⁻¹ 波数范围扫描，重点分析酰胺 I 带（1700-1580cm⁻¹），通过高斯曲线拟合计算 β- 折叠、α- 螺旋等二级结构含量，验证交联反应是否成功（H₂O₂浓度升高会导致 β- 折叠含量增加，增强基质稳定性）。三、体内实验验证技术1. 皮下移植实验（验证基质与类器官的体内相容性）动物模型与分组 ：选用 8-10 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠和 NOG 免疫缺陷小鼠，分为三组 ——BVO+HS-75 组、HS-75 单独组、BVO 单独组。移植操作 ：小鼠麻醉后（1.0% 异氟醚），在背部皮下注射 100μl 基质（含 50 个 BVO 或不含 BVO），C57BL/6J 小鼠每天腹腔注射环孢素抑制免疫排斥。检测方法 ：移植后 3、7、14 天，通过尾静脉注射荧光标记的凝集素（Vector Laboratories, DL-1177-1），5 分钟后处死小鼠，取移植样本固定，用共聚焦显微镜观察血管网络形成，AngioTool 软件量化血管参数，验证 BVO 与宿主血管的吻合情况。2. 缺血性中风模型构建与脑内移植实验中风模型制备 ：雄性 C57BL/6J 小鼠尾静脉注射 100μl 15mg/ml 孟加拉玫瑰红，10 分钟后用 3mm 直径冷光源照射右侧大脑皮层（0mm 前囟、1.5mm 侧方）6 分钟，诱导局灶性皮层缺血（即光化学血栓性中风模型）。脑内移植操作 ：中风后 5 天，小鼠麻醉后固定在立体定位仪上，在右侧大脑（0.5mm 前囟、2mm 侧方）钻孔，用微量注射器向梗死腔注射 5μl 移植材料（分为 PBS 组、BVO 单独组、HS-75 单独组、BVO+HS-75 组），注射速度 1μl/min，注射后留针 5 分钟再缓慢拔出，缝合头皮并消毒。术后检测 ： 血管再生检测：移植后 14 天和 12 周，用激光散斑对比成像（LSCI）检测脑血流灌注，免疫荧光染色（CD31、α-SMA）观察梗死区血管密度，Western blot 检测 CD144（内皮细胞标志物）和 α-SMA 蛋白表达。 神经再生检测：免疫荧光染色检测 NeuN（成熟神经元标志物）、MAP2（神经元骨架标志物）和 NF200（轴突标志物），观察梗死区神经发生和轴突浸润情况。 行为学评估：在中风后 7 天和 14 天进行网格行走测试（检测运动协调）、转棒测试（检测平衡能力）、握力测试（检测肌肉力量）和旷场测试（检测整体运动活性），评估小鼠功能恢复情况。四、其他关键辅助技术免疫组织化学技术 ：用于小鼠脑组织切片的标志物检测，步骤包括脱蜡、水化、抗原修复（EDTA 溶液煮沸 15 分钟）、封闭、一抗孵育（GFAP、Iba-1、NeuN 等，1:200 稀释）、二抗孵育、DAPI 染色、封片，最后用共聚焦显微镜成像，ImageJ 软件量化阳性信号面积。Western blot 技术 ：提取 BVO 或小鼠脑组织蛋白，用 BCA 法测定蛋白浓度，SDS-PAGE 电泳分离蛋白，转印到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5% 脱脂牛奶封闭 1 小时，一抗 4℃孵育过夜，HRP 标记二抗室温孵育 1 小时，化学发光显色，用 ImageJ 软件量化条带灰度值。MRI 成像技术 ：中风后 12 周，用 7.0T 小动物 MRI（Bruker Biospec 70/20 USR）进行 T2 加权成像，参数设置为重复时间 4000ms、回波时间 45ms、激发次数 6，评估梗死灶体积和组织修复情况。 关键结果图表 本研究围绕缺血性中风修复的核心瓶颈展开，研究问题聚焦于：缺血性中风后坏死腔形成导致内源性血管重建不足，传统移植基质存在亲水肿胀、结构塌陷或临床转化受限等缺陷，血管类器官（BVO）缺乏理想的支撑基质以实现有效移植修复。基于此，研究提出核心假说：通过仿生设计构建非膨胀可生物降解基质（NEBM），践行 “恒定空间再生” 理念，既能在受限的中风坏死腔内提供抗肿胀的稳定支撑，又能通过动态降解为 BVO 发育创造空间，同时匹配脑组织力学性能与生物相容性，最终促进 BVO 介导的血管重建与神经功能恢复。 研究思路与方法上，研究首先以临床级丝素蛋白（SF）和酪胺修饰的透明质酸（HT）为原料，通过 HRP-H₂O₂酶促交联结合 RGD 粘附肽与 MMP-2 切割肽修饰，制备不同交联度的 HS 系列 NEBM；随后以传统基质胶（Matrigel）为对照，系统表征 NEBM 的微观结构、力学性能、降解与溶胀特性；接着将人类诱导多能干细胞（hiPSCs）诱导形成的 BVO 封装于 NEBM 中，通过体外实验评估 BVO 的存活、血管发育及成熟度；进一步借助单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）解析 NEBM 调控 BVO 发育的分子机制；最后在小鼠皮下移植模型和光化学血栓性中风模型中，验证 BVO-laden NEBM 的体内相容性、血管重建效果及对神经功能恢复的作用，并通过长期实验评估其持续疗效。一、NEBM 的制备与关键性能表征结果 研究成功制备出 HS-50、HS-75、HS-100 等不同交联度的 NEBM，核心性能表征结果显示：微观结构方面，扫描电子显微镜（SEM）成像（图 2b）揭示 HS-50 平均孔径达 42.8±8.3μm，随 H₂O₂浓度升高（交联度增加），HS-75 和 HS-100 的孔径逐渐减小至 19.5±4.2μm 和 15.1±3.9μm，而 Matrigel 的平均孔径仅 8.9±1.7μm，HS 系列基质的大孔径结构更适配血管细胞行为与 BVO 发育；力学性能上，流变学测试（图 2e）表明 HS-75 的存储模量（G'）为 282.0±4.0Pa，与天然脑组织（约 250Pa）高度匹配，且在 5 天培养期内呈现渐进式刚度下降，仅保留初始刚度的 19.4%，实现稳定支撑与动态降解的平衡；溶胀与降解特性验证（图 2g）显示，HS-75 在 28 天内体积基本保持不变，展现出优异的抗肿胀能力，同时质量逐步下降，证实其可控降解特性，完美契合 “恒定空间再生” 理念，而传统基质则存在明显的肿胀或结构塌陷问题。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析（图 2d）进一步证实，HS 基质中存在丰富的共价与非共价交联，且 H₂O₂浓度升高可促进 β- 折叠结构形成，增强基质稳定性。二、NEBM 调控 BVO 体外发育的核心结果 体外实验中，BVO 在不同基质中的发育差异显著：细胞活力检测显示，HS-50 和 HS-75 组 BVO 的存活率与 Matrigel 组相当（图 3f），而 HS-100 组因交联度过高导致活力明显下降；血管发育方面，明场成像与量化分析（图 3b-d）表明，HS-75 组 BVO 在培养 1 天的出芽效率接近 100%， sprout 长度增长速度与 Matrigel 组相当，且显著优于 HS-50 和 HS-100 组；免疫荧光染色结果（图 3g-i）显示，HS-75 组 BVO 的 CD31 阳性血管面积、血管密度、血管长度及分支指数均显著高于 Matrigel 组，血管直径更大，且在血管生成前沿可见内皮细胞（ECs）被 α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性的平滑肌细胞包裹，呈现更明显的动脉特征与成熟表型；scRNA-seq 分析（图 4）进一步揭示，与 Matrigel 组相比，HS-75 组 BVO 中 ECs、周细胞和平滑肌细胞的比例显著升高，其中 ECs 比例从 7.7% 增至 23.7%，且动脉样 ECs 亚型富集，血管相关标志物（CD31、PDGFR-β、α-SMA）的表达水平显著上调，证实 HS-75 可更高效地促进 BVO 向血管谱系分化。机制研究表明，HS-75 的适配刚度可激活 BVO 的力学传导通路，促进 MMP-2 分泌，进而介导基质的动态重塑，形成有利于 BVO 发育的微环境，而抑制力学传导通路或破坏细胞粘附、基质降解位点则会显著阻碍 BVO 发育。三、BVO-laden NEBM 的体内实验验证结果 体内实验进一步证实了 NEBM 的临床应用潜力：皮下移植实验（图 6）显示，HS-75 封装的 BVO 在移植 14 天后可形成丰富的血管网络，通过尾静脉注射的凝集素可标记这些血管，证实其与宿主血管系统实现功能吻合，而 HS-75 单独组仅形成微量血管；脑内移植的生物相容性评估表明，将 HS-75 注射到小鼠纹状体后，不同时间点的免疫荧光染色未检测到 GFAP（星形胶质细胞标志物）和 Iba-1（小胶质细胞标志物）的显著激活，证实其无明显炎症反应；缺血性中风模型的治疗结果（图 7）显示，BVO+HS-75 组在中风后 14 天，梗死区 CD31 阳性血管密度、血管长度及分支指数显著高于 PBS 组、BVO 单独组和 HS-75 单独组，激光散斑对比成像（LSCI）显示该组脑血流灌注下降幅度从 PBS 组的约 60% 降至 20%，Western blot 结果证实 CD144 和 α-SMA 的蛋白表达水平显著上调；神经再生检测（图 8）表明，BVO+HS-75 组梗死区 NeuN 阳性成熟神经元和 MAP2 阳性神经元骨架的面积显著增加，NF200 阳性轴突向梗死区的浸润程度明显高于其他组，且胶质瘢痕厚度显著变薄；行为学评估（图 8g-j）显示，中风后 14 天，BVO+HS-75 组小鼠在网格行走测试、转棒测试、握力测试和旷场测试中的表现均显著优于其他治疗组，运动协调能力、肌肉力量和整体运动活性接近正常水平。长期实验（12 周）结果进一步证实，BVO+HS-75 组的血管重建效果持续存在，梗死灶体积显著缩小，神经功能恢复保持稳定，展现出良好的长期疗效。四、研究总结与结论 本研究成功研发出基于 “恒定空间再生” 理念的 NEBM，该基质通过临床级原料的仿生组装，实现了抗肿胀稳定性、脑适配力学性能、动态降解特性与 BVO 发育调控功能的一体化设计。核心结论如下：一是 NEBM 的大孔径结构、渐进式降解特性和脑匹配力学性能，使其显著优于传统 Matrigel 和其他天然 / 合成基质，为 BVO 发育提供了理想的微环境；二是 NEBM 可通过激活力学传导通路、促进基质动态重塑，高效调控 BVO 的血管成熟与动脉特征形成，显著提升 BVO 的体外发育质量；三是 BVO-laden NEBM 在缺血性中风模型中可有效促进梗死区血管重建、神经发生和轴突再生，显著改善小鼠的神经功能恢复，且具有良好的生物相容性和长期疗效；四是研究提出的 “恒定空间再生” 理念和 NEBM 设计策略，不仅为缺血性中风修复提供了全新的治疗方案，更为其他受限环境（如脊髓损伤、心肌梗死）的器官修复提供了通用的基质设计范式，推动了血管类器官的临床转化进程。五、延伸问题与下一步实验方向 本研究虽取得显著进展，但仍存在一些值得深入探索的问题：一是 NEBM 调控 BVO 发育的分子机制尚需进一步细化，尤其是力学信号如何通过整合素 - FAK-YAP 通路精准调控血管细胞分化的具体下游靶点仍不明确；二是研究主要在小鼠模型中开展，NEBM 和 BVO-laden NEBM 在大型动物（如非人灵长类）模型中的安全性和疗效尚未验证，这是其走向临床应用的关键步骤；三是 BVO-laden NEBM 在其他器官缺血性损伤（如心肌梗死、肾脏缺血）中的治疗潜力有待评估；四是 NEBM 的降解速率和力学性能可进一步优化，以适配不同病程阶段的中风修复需求。下一步实验可聚焦于上述问题，通过基因编辑、蛋白质组学等技术深入解析分子机制，开展大型动物实验验证临床转化潜力，拓展其在多器官修复中的应用，并优化基质配方以提升治疗效果。 特色与创新之处 提出 “恒定空间再生” 全新理念，精准破解脑内受限环境修复的核心矛盾：针对缺血性中风坏死腔 “空间狭窄” 的特殊病理环境，突破传统基质 “亲水肿胀致组织压迫” 或 “快速降解失支撑” 的双重困境，创新性地提出基质需兼具 “体积稳定抗肿胀” 与 “内部动态可降解” 的设计原则。这一理念不再局限于单一性能优化，而是通过结构与功能的协同设计，为血管类器官（BVO）发育和血管新生提供 “恒定空间支撑 - 动态生长空间” 的理想微环境，从根本上解决了脑内移植基质的核心技术瓶颈，为受限环境下的器官修复提供了全新的设计思路。 构建仿生临床级 NEBM 材料体系，实现多性能协同的一体化设计：摒弃肿瘤来源的 Matrigel 和单一成分的传统基质，以天然脑内细胞外基质（ECM）的组装方式为灵感，采用临床级丝素蛋白（SF）和透明质酸（HA）为核心原料，通过共价 - 非共价复合交联结合 RGD 粘附肽、MMP-2 切割肽修饰，成功制备出非膨胀可生物降解基质（NEBM）。该体系实现了多重关键性能的精准匹配：SF 的疏水性赋予抗肿胀稳定性，HA 的降解性提供动态重塑空间，调控交联度使力学性能与脑组织高度适配（HS-75 存储模量约 282Pa），且所有成分均符合临床植入标准，彻底解决了传统基质 “临床转化难、性能单一、生物相容性不足” 的问题，为 BVO 的临床应用奠定了核心材料基础。 揭示 NEBM 调控 BVO 定向发育的全新机制，显著提升血管类器官功能成熟度：突破以往基质仅作为 “物理支撑” 的局限，通过体外实验结合单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）技术，首次明确 NEBM 可通过 “力学传导 - 基质重塑” 协同机制调控 BVO 发育。其适配的刚度可激活 BVO 的整合素 - FAK-YAP 力学传导通路，促进 MMP-2 分泌，进而介导基质的精准降解，形成动态适配的生长微环境；最终使 BVO 的血管密度、直径显著提升，动脉特征更明显，内皮细胞比例从 7.7%（Matrigel 组）增至 23.7%，且实现内皮细胞与平滑肌细胞的功能性组装。这一发现不仅阐明了基质力学与生物信号协同调控类器官发育的分子机制，更显著提升了 BVO 的体外成熟质量和体内功能整合能力。 建立 “BVO-NEBM” 协同修复体系，实现缺血性中风从血管重建到功能恢复的全程优化：不同于以往单一细胞或基质移植的零散探索，本研究构建了 “血管类器官 - 非膨胀基质” 的协同治疗体系，通过小鼠皮下移植、脑内移植及长期疗效验证，系统证实该体系可在体内实现 “血管重建 - 神经发生 - 功能恢复” 的递进式修复效果。在中风模型中，该体系使梗死区脑血流灌注下降幅度从 60%（PBS 组）降至 20%，显著促进神经元再生和轴突浸润，且小鼠运动功能在 14 天内大幅恢复，12 周仍保持稳定疗效，同时有效减少胶质瘢痕形成。这一体系不仅为缺血性中风提供了更高效的治疗方案，更实现了从 “结构修复” 到 “功能恢复” 的关键跨越，为再生医学技术的临床转化提供了可复制的研究范式。 可以改进的地方[AI基于大数据总结，仅供参考] 一、不足之处 动物模型局限性显著，临床转化关联性不足：本研究的体内实验主要依赖小鼠光化学血栓性中风模型，该模型虽能模拟局灶性皮层缺血，但与人类缺血性中风的病理特征（如大血管阻塞、梗死范围更广、炎症微环境更复杂、病程更长）存在较大差异。同时，小鼠的脑结构、血管网络及免疫反应机制与人类相差甚远，导致研究结果在向临床转化时可能面临 “物种差异” 带来的疗效衰减问题，缺乏大型动物模型的验证支撑。 机制解析深度不足，关键调控通路的因果关系未完全明确：尽管通过 scRNA-seq 鉴定出 HS-75 基质可激活整合素 - FAK-YAP 等力学传导通路，但研究仅停留在 “相关性” 分析层面，尚未明确通路中关键分子的调控作用。例如，未验证 YAP 蛋白的激活是否为 BVO 动脉特征形成的必要条件，也未阐明 MMP-2 介导的基质降解与力学信号传导之间的协同调控时序，导致对 “NEBM 调控 BVO 发育” 的分子机制理解不够透彻，难以精准优化基质的调控功能。 NEBM 的个性化适配性不足，未覆盖不同病程的修复需求：研究中仅聚焦于中风后 5 天（亚急性期）的移植治疗，且仅优化了 HS-75 一种基质配方。但临床中缺血性中风患者的病程存在差异（如亚急性期、慢性期），不同阶段的坏死腔微环境（炎症程度、ECM 残留量、细胞浸润状态）截然不同，对基质的降解速率、力学刚度、生物活性因子释放的需求也不同。现有 NEBM 无法适配不同病程的修复需求，缺乏个性化治疗的设计考量。 长期生物安全性评估不全面，潜在风险未充分排查：研究虽进行了 12 周的长期疗效观察，但未系统评估 NEBM 降解产物的生物安全性。NEBM 的核心成分（丝素蛋白、透明质酸）降解后产生的小分子肽段、糖胺聚糖等代谢产物，可能在脑内长期蓄积并引发慢性炎症或神经毒性；同时，对 BVO 移植后可能存在的 “异常血管增生”“免疫排斥长期风险” 等问题也未深入研究，这些均为临床应用埋下潜在隐患。 BVO 制备的标准化程度不足，临床应用可行性受限：研究中 BVO 的诱导分化依赖 hiPSCs，但未解决 hiPSCs 来源的异质性问题（不同供体 hiPSCs 的分化效率、BVO 功能存在差异），且诱导流程未进行规模化优化。此外，BVO 的质量控制标准（如血管成熟度、细胞纯度的量化指标）未明确，难以满足临床应用中 “批次稳定、质量均一” 的核心要求，限制了 “BVO-NEBM” 体系的临床转化效率。二、改进建议 开展大型动物模型验证，提升临床转化可靠性：优先选用非人灵长类（如恒河猴）或小型猪构建缺血性中风模型，这类模型的脑结构、血管分布及病程特征更接近人类。在大型动物模型中，系统评估 “BVO-NEBM” 体系的移植安全性（如是否引发脑水肿、脑疝）、血管重建效率及长期功能恢复效果，同时优化移植剂量、注射方式等关键参数，为临床研究提供更具参考价值的数据。 深化机制研究，明确关键分子的因果调控关系：采用 “基因编辑 + 抑制剂干预” 的联合策略，例如通过 CRISPR-Cas9 技术敲除 BVO 中 YAP 基因，或使用 FAK 抑制剂（如 PF-562271）阻断力学传导通路，观察 BVO 血管成熟度、动脉特征形成等指标的变化，验证关键分子的必要性；同时通过实时荧光成像技术追踪 MMP-2 分泌与基质降解的动态关联，明确 “力学信号 - 基质重塑” 的协同调控时序，为基质的精准优化提供机制依据。 优化 NEBM 配方设计，实现病程个性化适配：针对中风亚急性期、慢性期的微环境差异，调整 NEBM 的关键参数：亚急性期需增强基质稳定性以抵抗炎症破坏，可适当提高交联度；慢性期需加快降解速率以促进宿主组织整合，可增加 MMP 切割肽的修饰比例。同时，在基质中负载针对性的生物活性因子（如亚急性期负载抗炎因子 IL-10，慢性期负载神经营养因子 BDNF），进一步提升不同病程的修复效果。 补充全面的长期安全性评估，排查潜在风险：延长实验观察周期至 6-12 个月，通过 MRI、组织病理学检测等技术，评估 NEBM 降解产物在脑内的代谢情况及是否引发慢性炎症、神经细胞凋亡；采用免疫组化检测 CD31 + 异常血管增生情况，通过流式细胞术监测长期免疫细胞浸润状态；同时对 BVO 进行染色体核型分析，排除异常增殖风险，确保体系的长期生物安全性。 建立 BVO 制备的标准化流程，提升临床应用可行性：一方面，优化 hiPSCs 的诱导体系，采用 “小分子化合物联合因子” 的方法提高 BVO 分化效率的均一性，或选用临床级 iPSC 细胞系（如经严格筛选的通用型 iPSC）降低供体异质性；另一方面，制定 BVO 质量控制标准，明确血管密度、CD31 + 细胞比例、动脉样 ECs 含量等量化指标，并开发规模化培养工艺（如生物反应器培养），实现 BVO 的批量、稳定制备。 求点赞 求分享 求推荐 如果你想在此显示您的广告信息，请联系我们。 与万千同行共同关注类器官！ 关注我们  肠道类器官（Organoid Bulletin） 本公众号由AI智能体ORGANOID AGENT驱动赋能，您可以直接与公众号对话，获得最专业的类器官知识指导与信息。      我们致力于发布本领域优质资讯与评述，推送国内外类器官与干细胞相关领域最新研究论文、综述与技术进展。发布科普文章、专家观点评论、行业分析、招聘信息和会议通知。您可以在微信、小红书、百家号、企鹅号、今日头条、知乎和Bilibili关注我们。秉承干细胞与类器官创新计划组织(ISCO)愿景，我们积极传播科学知识，促进同行交流，推动产业发展，服务国家战略，积极为类器官与干细胞技术发展提供助力。欢迎各位关注、分享、转载、投稿！原创内容欢迎转载，直接私信即可，完全免费授权。内容多来自学术论文或网络公开资源，如有侵权还请联系删除。 编辑部联系邮箱：zj@organoid.ac.cn 广告赞助 欢迎找到组织 类器官创新计划组织 类器官创新计划组织（Innovations in organoids organization）是由来自中国科学院、北京大学、清华大学和复旦大学等多个顶级研究机构的头部研究团队组织发起的，完全公益的学术与研究技术交流合作组织，成员主要由来自类器官行业内的企业高管、技术经理、高级PI等构成。加入“类器官创新计划”后，您将以极低的成本实现类器官资源的互换与共享，基于肠道类器官和类器官创新计划组织微信公众号平台，您将获得来自全行业的赋能与指导，进行标准化的类器官制备与检测，保证您的研究顺利且高质量开展。我们会将你纳入本组织“技术研发”、“开源公益”和“产品服务”等多个微信群，这样您能够与所有参与计划的成员及时沟通，您所有的类器官问题都能最及时的得到解答和帮助，互换类器官品系和干细胞研究工具资源，解决技术难题，获得技术支持。我们已有上万个来自全国顶级类器官研究机构、大学和企业的注册认证会员，大家一起为类器官事业发展点燃星星之火，推动类器官产业发展壮大。我们还建立了AI知识问答和开源类器官分析工具等多个公益项目为类器官研究提供帮助，构建开放包容的领域生态。在这里,我们敢为人先，始终积极寻求更新类器官更优的解决方案，勇于突破经验与预想的界限，致力打造科学卓越的行业新标准。 官方网站：www.organoid.ac.cn 联系邮箱：info@isco.ac.cn 组织愿景 1.共建开放协作生态：搭建行业资源共享平台，促进技术互通与经验共享，降低类器官研究门槛。 2.引领标准与规范：推动制定行业与国家工程标准，实现类器官培养与应用的规范化、全流程标准化。 3.打造国际级资源枢纽：推动建设全球认可的类器官库与智库平台，加速技术向精准医学与药物研发转化。 4.驱动技术融合创新：推动整合生物材料、智能装备等工程技术创新，突破类器官规模化制备与功能重建瓶颈。 5.强化技术自主可控：推进国产化试剂、仪器研发与技术体系替代，保障核心研发链安全与战略主动权。 加入交流       ISCO面向类器官全领域同行提供交流平台和会员身份认证服务，可以加入“技术研发”、“开源公益”、“产品服务”和“专属领域”等多个类型的交流群，涵盖科学研究技术、开源工具和公益、销售产品与服务、细分领域如类器官芯片、生物材料等专属群等平台，参与讨论。高级研究员或独立PI可以申请成为荣誉发起人，成为类器官创新计划贡献者与受益者。本公益组织目前已有8000+会员，期待您加入讨论分享，让我们共同促进类器官产业发展。      现在，您只需添加发起人微信，备注自己的真实姓名与单位例如“李四-中国科学院大学”，说明申请加入类器官创新计划，提供有效身份证件如学生证、身份证、工作证或其他任何可以证明身份的真实性的证件，即可加入对应社群。而这一切都是公益的，免费的，不收取任何费用。 欢迎您找到组织！~ 扫描二维码添加发起人微信以进群交流 专业收费资源 面向专业科普需求和企业级资源共享，现在扫描二维码加入“肠道类器官”知识星球，就能获得来自顶级研究机构分享的类器官培养基配方和方案，类器官创新计划组织发布的官方标准指南、AI类器官分析工具等更加专业的资料。与1000+位行业精英共同交换类器官技术资料和资源，向行业专家提问，免费参与国内领先的类器官品牌产品内测试用，获得类器官工程师认证等。全行业最专业的类器官知识社区和公益平台，让您的类器官研究少走弯路！ #为什么要加入知识星球？ 1.最新最专业的培养基配方和技术资料即时获取。 2.标准类器官培养方案和技术标准材料发布唯一渠道。 3.最强AI智能体和类器官分析软件和工具解析和下载。 4.类器官领域TOP专家一对一沟通，权威资料触手可及。 5.类器官企业新产品评测和免费试用特权通道。 6.定期发放免费会议入场券和资料，提供演讲机会。  更多福利，请移步知识星球内部了解。 开源公益 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