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点击上方蓝字 关注我们 编者按：利用细胞内泛素-蛋白酶体系统清除致病蛋白的靶向蛋白降解（TPD）策略，是近年来备受关注的药物研发策略之一，其中发展最迅速、最接近有新药率先获批的模式，无疑是靶向蛋白降解嵌合体（PROTACs），它们的作用机制和临床进展都值得全面盘点和审视。近日，奥地利科学院分子医学研究中心（CEMM）Georg E. Winter团队与英国邓迪大学Alessio Ciulli教授团队在Nature Reviews Cancer共同发表综述[1]，系统介绍了以PROTACs为主的TPD策略最新进展，有望帮助临床工作者提早了解PROTACs这类未来“抗癌新星”。 PROTACs发展史简述 PROTACs这一名词最早出现于美国学者Craig Crews和Raymond Deshaies等人在2001年发表的论文[2]中，其核心理念是设计出一种可同时募集E3泛素连接酶与目标蛋白，进而诱导目标蛋白经泛素化后通过蛋白酶体降解的分子。起初学界对PROTACs的发展前景并不乐观，因为第一代PROTACs需使用分子量较大的肽来募集E3泛素连接酶，而大分子肽难以穿透细胞膜进入细胞，使第一代PROTACs的研发半路折戟。 直到2008年，Crews等人设计出了使用小分子作为E3泛素连接酶MDM2配体的第二代PROTACs[3]，才重燃了PROTACs领域的研究热情，后续在2014年登上Science的两项突破性研究进展[4-5]，则使用当时已获批治疗多发性骨髓瘤的来那度胺，作为PROTACs中E3泛素连接酶CRBN的配体，使PROTACs成功选择性降解了两种既往被视为“不可成药”的致病蛋白，具有成为临床治疗药物的潜力，也开启了后续PROTACs候选药物的井喷趋势。 图1.PROTACs技术的发展时间线。PROTACs概念最早于2001年由Craig Crews和Raymond Deshaies等人提出，并开发了首个基于肽的PROTACs，此后PROTACs技术蓬勃发展，从基于肽的PROTACs演变为基于小分子的PROTACs，识别的E3泛素连接酶类型也不断增多，后续还出现了光控PROTAC（photoPROTAC）等改进版小分子PROTACs。2019年，雄激素受体（AR）抑制剂ARV-110和雌激素受体（ER）抑制剂ARV-471的I期临床试验结果，证实了PROTACs降解致病蛋白、治疗人类疾病的可行性和有效性，而越来越多的PROTACs正被设计出来，用于靶向不同的致病蛋白，并纷纷进入临床研究阶段，有望成为癌症治疗的新势力。（图源：参考文献[6]） PROTACs的核心作用机制 PROTACs之所以能够实现对目标蛋白的有效清除，是因为其利用了细胞内固有的蛋白质质量控制系统——泛素-蛋白酶体系统（UPS）：细胞内约有80-90%旧的、受损的、错误折叠的以及不再需要的蛋白质，需要在严格调控下由UPS负责降解，因此UPS对维持细胞稳态和调节关键功能（如细胞周期进程、信号转导）有至关重要的作用，而PROTACs则是通过重新编程UPS的靶点特异性，诱导目标相关蛋白的选择性泛素化和降解。 泛素化级联反应是UPS的核心，该过程的起点是E1泛素激活酶对泛素标记的激活，随后激活的泛素转移至E2泛素偶联酶，最终通过E3泛素连接酶，泛素被连接到特定的靶点蛋白上。每种E3连接酶都能够特异性识别并结合不同（组）的靶蛋白，从而赋予泛素化过程高度的底物特异性。一旦靶蛋白被多聚泛素化标记，这些泛素链便如同“降解标签”，精确引导被标记的蛋白质进入细胞内的蛋白酶体，蛋白酶体则凭借强大的蛋白水解活性，将多聚泛素化的蛋白质水解为短肽，最终彻底清除。值得注意的是，人类基因组编码了超过600种不同的E3泛素连接酶，这为PROTACs提供了极其丰富的可利用泛素连接酶来源，以实现对各种目标蛋白的降解。 图2.UPS系统及E3泛素酶级联。（图源：参考文献[1]） UPS负责80%至90%的蛋白质降解，包括旧的、受损的或错误折叠蛋白质的“退役”，并在从细胞增殖到细胞凋亡的几乎所有细胞过程中发挥着不可或缺的作用。这些重要功能要求蛋白质降解具有高度的选择性并受到严格调控。 a, 泛素化级联反应。选择性是通过将蛋白水解活性限制在一个封闭的腔室中实现的，该腔室是一个桶状的蛋白质复合体，称为蛋白酶体。底物进入蛋白水解腔室仅限于经过泛素（Ub）标签翻译后修饰的底物。靶蛋白的泛素化标志着一个三步级联反应的结束，该反应始于E1泛素激活酶的激活，然后转移到E2泛素偶联酶，最终通过E3泛素连接酶转移到靶点。每种E3连接酶特异性识别不同（组）的靶蛋白）。 b, E3泛素连接酶的分类。人类基因组编码了超过600种E3泛素连接酶，它们根据结构和功能特征被细分为多个亚家族。Cullin RING E3连接酶（CRLs）是多亚基复合体，由七种不同cullin支架之一（CUL1–CUL5、CUL7和CUL9）组成，每个支架都与一组特征性接头蛋白（SKP1、ELOB、ELOC和DDB1）、RING-box蛋白（RBX1和RBX2）以及底物受体相关联，其中底物受体决定了复合体的底物特异性。HECT家族E3连接酶从E2酶接收泛素，然后将其进一步转移到靶点，而U-box RING型E3连接酶则介导从E2到靶点的直接转移。RBR和RCR型E3连接酶代表了HECT和RING连接酶之间的混合体，其中RING指域介导泛素从E2转移到第二个RING域或串联半胱氨酸域，最终将其连接到靶点。 PROTACs的设计即基于上述UPS调控机制进行，它本质上是一种异源双功能化合物，结构包含两个独立的配体模块，一个特异性结合E3泛素连接酶，另一个特异性结合需降解的目标蛋白（POI），二者间通过化学连接子（Linker）连接，这样的设计使PROTAC分子能同时与POI和E3泛素连接酶结合，将两者空间拉近，形成所谓“三元复合物”（Ternary complex）。在近距离诱导结合状态下，E3泛素连接酶可高效对POI进行泛素化标记，随后由蛋白酶体识别POI并迅速降解；PROTACs分子本身完成催化泛素化后不被降解，而是被释放并继续结合和催化下一个POI分子的泛素化和降解，实现高效的催化循环。 图3.PROTACs的机制示意图。PROTACs通过诱导或增强E3泛素连接酶与目标蛋白（POI）之间的相互作用，促进泛素转移和目标蛋白降解，它是异源双功能化合物，由两个分别结合E3连接酶和目标蛋白的配体组成，并通过一个化学连接体连接。例如，dBET6通过将BET蛋白BRD2–BRD4与CUL4–DDB1–CRBN E3连接酶复合体连接起来，从而降解这些蛋白。（图源：参考文献[1]） 设计PROTACs时通常遵循“即插即用”（Plug and Play）的策略，即灵活利用现有的POI配体和已知的E3泛素连接酶配体，如目前已进入临床试验的在研PROTACs，主要通过募集CRBN、VHL这两种E3泛素连接酶起效，这是由于它们已被识别出有较高亲和力、良好药理特性的特异性配体，如识别CRBN通常使用沙利度胺及其衍生物，即来那度胺和泊马度胺；除CRBN和VHL外，MDM2和凋亡抑制剂家族（IAPs）的E3泛素连接酶也已被多个临床前PROTACs所使用。而PROTAC可针对的靶点范围则非常广泛，在研药物的靶点已经包括了雌激素受体（ER）、表皮生长因子受体（EGFR）、KRAS和BRAF突变等重要靶点。 形成良好的三元复合物，也对PROTACs的降解效率至关重要，例如三元复合物要稳定且足够长，这样才能确保POI被E3泛素连接酶有效泛素化并在随后被降解；而对与POI或E3泛素连接酶结合亲和力相对较弱的PROTACs，三元复合物平衡的正协同作用就尤为重要，这种正协同作用通常需要由复合物内有利的诱导蛋白-蛋白相互作用（PPIs）及其他交叉相互作用促成，例如基于VHL的BRD4靶点PROTAC MZ1[7]，即可通过自身折叠促进紧密且高度协同的三元复合物形成，让PROTACs高效降解BRD4蛋白。 PROTACs的独特优势 PROTACs的独特作用机制，也赋予了它们不同于传统治疗手段或现有靶向药物的独特优势： 1）亚化学计量（Substoichiometric）活性与持久药效：PROTACs并不需要持续结合POI才发挥作用，在亚化学计量下它们仍可促使POI降解，因此疗效往往更为持久且强力，如STAT3降解剂SD-36抑制STAT3活性的效力，比其亲本抑制剂SI-109高出1,000倍以上，同时疗效持久也意味着可降低给药剂量和频率；一些半衰期较长（如＞1天）的蛋白质，被降解后需更长时间再合成，针对此类蛋白质的PROTACs疗效则更为持久。 2）出色的靶点选择性：通过诱导三元复合物形成和独特的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs），PROTACs能对高度相似的蛋白质实现精确选择性降解，即只靶向高度保守蛋白质家族中的某个成员，如上文提到的SD-36仅选择性降解STAT3，而不会像亲本抑制剂一样靶向STAT1/4。 3）克服传统治疗的耐药性：如针对BTK-C481S突变导致的BTK抑制剂耐药，NX-2127、NX-5948和MT-802等在研PROTACs，既能扰乱BTK激酶的活性，又能打碎耐药细胞新获得的支架功能，有效消灭耐药细胞，同样的情况在靶向ER/AR的PROTACs中也有体现。 4）更深层次的生物学扰动：与仅靶向蛋白质某个特定位点，或抑制某一种功能的传统药物不同，PROTACs是通过诱导降解实现对POI的完全清除，从而扰乱其所有细胞功能，更适合针对既往传统药物难以靶向的“不可成药”靶点（如BRD4、IRAK4），疗效也更全面和彻底。 图4.PROTACs等“降解策略”相较传统“基于占位”治疗的优势 a, 抑制剂依赖于对靶点活性位点的高效且持续占据以诱导功能效应。相比之下，PROTACs的作用机制是催化性的，它们诱导靶蛋白与E3泛素连接酶的接近，催化泛素转移及随后的靶点降解；一旦靶点被降解，化合物还可诱导其它靶蛋白分子的降解，因此降解策略在亚化学计量剂量下也有效。 b, 降解剂依赖于靶蛋白与E3连接酶之间稳定三元复合物的形成，这涉及配体结合口袋之外的蛋白质-蛋白质接触。单个氨基酸变化可稳定或破坏三元复合物的形成，可被利用于在高度保守的蛋白质家族中选择性降解单个靶点，如PROTAC化合物10对SMARCA2而非SMARCA4的选择性降解，取决于SMARCA2的Gln1469与VHL的Asn90之间形成蛋白质-蛋白质接触。 c, 降解需要靶蛋白和E3连接酶同时存在。一些E3连接酶在特定组织、细胞类型、亚细胞区室或病变中差异表达。利用这种差异表达可在治疗上实现组织选择性并减轻脱靶毒性。例如，抗凋亡蛋白BCL-XL是T细胞淋巴瘤的药物靶点，但BCL-XL抑制对血小板有毒性，从而限制了治疗窗口；而由于E3连接酶底物受体VHL在血小板表达较少，招募VHL的BCL-XL 靶点PROTAC药物DT-2216可减轻脱靶毒性。 d, 抑制剂需要持续占据靶蛋白才能产生功能效应。一旦化合物被清除，功能效应便不再持续，直到施用下一剂药物。相比之下，靶蛋白降解可产生持久的治疗效果。一旦靶蛋白被降解，降解剂的活性便不再需要，直到靶蛋白被重新合成。这可以在降解剂的药代动力学和药效学特性之间产生脱节，即在降解剂完全清除后，其功能效应仍可持续。 e, 蛋白质靶点支架功能的药理学抑制具有挑战性。相比之下，降解完全消除了靶蛋白，从而扰乱其所有细胞功能。例如，突变型BTK激酶获得了新形态的支架功能，此时抑制已不再有效；而BTK降解不仅破坏其激酶活性，还破坏新形态的支架活性，可能在复发或难治性B细胞恶性肿瘤中，更有效地扰动BTK激酶的促癌功能。 不过，尽管PROTACs潜力巨大，其开发与临床转化仍面临多重挑战，如药物分子量大导致的溶解度低、渗透性差、易药物外排及高清除率等理化性质问题，影响口服生物利用度和血脑屏障穿透；体外高浓度下可能出现罕见“钩状效应”（Hook effect），即PROTACs浓度较高时反而会因为阻碍三元复合物形成，降低目标蛋白的降解效率；同时，癌细胞也可发生获得性耐药，如E3连接酶改变、内源性底物竞争、靶蛋白突变或药物外排泵上调；最后，并非所有靶点都适合降解，特别是半衰期较短的蛋白质，而PROTACs也必然存在一定的治疗毒性，需要更多来自临床研究的安全性数据，并评估相应管理策略。 PROTACs的临床进展 PROTACs正在快速向临床实用转化，目前已进入临床试验的PROTACs靶点非常广泛，包括此前提到的AR、ER、BTK、STAT3以及B细胞淋巴瘤-XL（BCL-XL）等，其中靶向AR和ER的PROTACs进展尤为迅速，多种药物已进入I/II期临床研究，如全球首个进入临床研究的PROTACs药物ARV-110，验证人群是转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）。 而靶向ER的Vepdegestrant（ARV-471）则成为了首个在III期研究中报告阳性结果的PROTAC，于近期ASCO年会上公布的VERITAC-2研究结果显示，Vepdegestrant用于ESR1突变阳性HR+/HER2-转移性乳腺癌患者后线治疗时，较氟维司群治疗显著延长了患者的中位无进展生存期（mPFS, 5.0个月 vs. 2.1个月, HR 0.57; 95%CI: 0.42-0.77; P<0.001）[8]，其上市申请已获得美国FDA受理，有望成为全球首个获批上市的PROTAC药物。 结语 作为靶向蛋白降解（TPD）策略的先锋，PROTACs正引领TPD领域的药物探索和设计全速前进，不仅自身已非常接近有药物获批上市，它身后还有众多采取创新作用机制、前景广阔的在研药物正在追赶，它们都将为推动更精准、高效和个性化的癌症治疗贡献力量。 参考文献 上下滑动查看更多内容 [1] Hinterndorfer M, Spiteri VA, Ciulli A, Winter GE. 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