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免费早鸟票，200 张限量领取 2026 年 4 月 13 日 医麦客新闻 eMedClub News 步入 2026 年，基因治疗依然书写「一次治疗，终生治愈」的传奇。从 AAV 介导的基因替代疗法到 LNP 介导的碱基编辑和 CRISPR/Cas9，从罕见病到向患者基数更大的适应症扩容，更有管线迎来加速上市或 BLA 申报的关键节点。 下面小编梳理了截至 2026 年 4 月全球基因治疗领域取得的关键进展（仅梳理代表性管线）。 Ultragenyx：UX111、DTX401 4 月 2 日，Ultragenyx 宣布美国 FDA 已受理其重新提交的生物制品许可申请（BLA）并展开审查，该申请旨在寻求加速批准 UX111（rebisufligene etisparvovec）基因疗法用于治疗 IIIA 型黏多糖贮积症（MPS IIIA）患者。PDUFA 日期为 2026 年 9 月 19 日，若顺利获批，UX111 将成为全球首个获批上市的治疗 MPS IIIA 的疗法。 MPS IIIA 又称 Sanfilippo 综合征，是一种由编码 N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶 (SGSH) 的基因发生突变所引起的常染色体隐性遗传的溶酶体贮积病。UX111 是一款利用自互补 AAV9 载体递送功能性 SGSH 基因的体内基因疗法，通过单次静脉注射将由 U1a 启动子驱动的正常 SGSH 基因递送至脑部细胞，使其恢复产生功能性酶的能力。 该疗法最初由 Abeona Therapeutics 开发，后转移至 Ultragenyx 以完成后续开发。UX111 已在美国获得再生医学先进疗法、快速通道、罕见儿科疾病和孤儿药认定，并在欧盟获得了 PRIME 和孤儿药认定。 2 月 23 日，Ultragenyx 宣布美国 FDA 已受理其用于治疗糖原贮积病 Ia 型（GSDIa）的 AAV8 基因疗法 DTX401 的 BLA，并授予优先审评资格，PDUFA 日期为 2026 年 8 月 23 日。如果顺利获批，这将是全球首款从根本病因层面治疗该疾病的药物。 随机双盲安慰剂对照的 Ⅲ 期 GlucoGene 研究结果显示，接受 DTX401 治疗的患者在每日玉米淀粉摄入量和频率上均实现显著且具有临床意义的降低，同时低血糖发生率持续维持在低水平，血糖稳态和空腹耐受能力得到明显改善，安全性良好，能够提升患者生活质量。 Rocket：Kresladi 3 月 27 日，美国 FDA 已加速批准基因疗法 Kresladi（marnetegragene autotemcel），用于治疗由于 ITGB2 双等位基因变异导致重度 I 型白细胞黏附缺陷（LAD-I）儿科患者，这些患者无法获得匹配的同种异体造血干细胞移植。根据 FDA 新闻稿，这是 FDA 批准的首款针对 LAD-I 的基因疗法。 Kresladi 由患者自身的造血干细胞构成，这些细胞经过基因修饰以导入功能性 ITGB2 基因拷贝。在预处理后，通过单次静脉输注 Kresladi，可恢复白细胞（包括中性粒细胞）表面 CD18 和 CD11a 的表达，从而针对重度 LAD-I 的根本病因发挥作用。 此次获批基于一项开放标签、单臂、多中心研究：在给药后第 12 个月，中性粒细胞 CD18 和 CD11a 细胞表面表达增加，且该效果可持续至给药后第 24 个月。中性粒细胞 CD18 和 CD11a 细胞表面表达的增加，反映了这两种生物标志物在中性粒细胞表面形成的蛋白复合体功能改善，该指标作为替代终点，被认为在 LAD-I 中可合理预测临床获益，从而支持加速批准。 Beam：BEAM-302 3 月 25 日， Beam Therapeutics 公布了正在进行的 BEAM-302 治疗 α1 抗胰蛋白酶缺乏症（AATD）的 Ⅰ/Ⅱ 期试验的最新安全性和有效性数据，并选定 60 mg 作为推进至关键性开发的最佳生物学剂量，以支持潜在的加速批准。全球关键性队列预计于 2026 年下半年启动。 截至 2026 年 2 月 10 日数据截止日期，60 mg BEAM-302 治疗使平均稳态总 AAT 水平达到 16.1 µM，所有患者持续稳定地高于 11 µM 的保护性 AAT 阈值，最长随访达 12 个月；校正型 M-AAT 占总 AAT 的 94%，同时突变型 Z-AAT 降低 84%。 Sangamo：ST-920 3 月 9 日，Sangamo Therapeutics 宣布, 其用于治疗成人法布雷病的基因疗法 ST-920（Isaralgagene Civaparvovec）已向美国 FDA 正式提交了 BLA 的临床与临床前模块，并寻求加速批准。 STAAR 研究显示，所有接受治疗的患者在第 52 周时的平均年化估算肾小球滤过率（eGFR）斜率呈阳性，美国 FDA 已同意将此作为支持加速审批途径的终点指标。 ST-920 是一种利用 AAV2/6 载体将优化后的肝脏特异性启动子元件驱动的功能性 GLA 基因导入肝脏的基因疗法，旨在使患者肝细胞能够持续产生并分泌 α-Gal A 酶，从而纠正潜在的生化缺陷，有望从根本上解决酶缺乏的问题。ST-920 已获得美国 FDA 的孤儿药资格认定、快速通道认定和再生医学先进疗法资格认定。 Intellia：Nex-z 3 月 2 日，Intellia Therapeutics 宣布 FDA 已正式解除对其 Ⅲ 期临床试验 MAGNITUDE 的搁置。这项试验旨在评估 LNP 递送 CRISPR/Cas9 体内基因编辑疗法 Nex-z 用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性心肌病（ATTR-CM）的疗效与安全性。 今年早些时候， Nex-z 针对遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性多发性神经病（ATTRv-PN）的关键 Ⅲ 期临床试验 MAGNITUDE-2 获 FDA 批准恢复。 随着 FDA 临床搁置的解除，Intellia 正积极与临床试验研究者、伦理委员会、国际监管机构及其他利益相关方协调，以恢复 MAGNITUDE 和 MAGNITUDE-2 试验的入组活动。 Life Biosciences：ER-100 1 月 28 日，Life Biosciences 宣布其用于治疗视神经病变的候选疗法 ER-100 的 IND 申请已获美国 FDA 批准，针对视神经病变。此次获批临床是「抗衰老」从概念走向临床应用的一个标志性事件。 ER-100 基于 PER 技术平台开发，采用 AAV2 载体递送并表达由 TRE 启动子驱动的转录因子 Oct4（Pou5f1）、Sox2 和 Klf4（统称为 OSK），从而诱导细胞发生部分表观遗传重编程，旨在恢复视网膜神经节细胞功能和视觉通路。 在国内多家企业亦获得关键进展，以信念医药和尧唐生物为例，后续不再一一介绍。 信念医药：信玖凝 3 月 19 日，信念医药宣布，其自主研发的基因治疗药物信玖凝™（BBM-H901 注射液, 通用名称：波哌达可基注射液）正式获得中国澳门药物监督管理局批准，用于中重度血友病 B（先天性凝血因子 IX 缺乏症）成年患者的治疗。该产品是中国大陆及澳门首个上市的血友病 B 基因治疗药物。 该药物应用了工程化改造的肝脏靶向性 AAV843 衣壳、高活性 FIX-Padua 基因以及肝脏特异性强启动子和双链 AAV 设计，旨在实现静脉给药后基因的快速、高效且持久表达。 Ⅲ 期临床研究中，52 周随访结果显示，年化出血率（ABR）为 0.60（95% CI: 0.18-1.99），较优效界值（中国接受预防治疗的血友病 B 患者平均 ABR）5.0 显著下降；52 周时平均 FIX:C 为 55.1（SD35.9）IU/dL（OSA, SynthAsil）；年化 FIX 制品平均输注次数由治疗前的 58.20 次/年（SD 30.67）下降至治疗后的 2.90 次/年（SD 10.71）；关节出血次数明显下降，靶关节数目降至 0。 尧唐生物：YOLT-202 3 月 13 日，尧唐生物宣布其体内基因编辑候选药物 YOLT-202 注射液已获美国 FDA 批准临床，将正式启动一项开放标签、单次给药的扩展 II/III 期临床研究，用于治疗 AATD。该研究为国际多中心临床试验，计划在美国及其他地区多家临床中心开展。 YOLT-202 基于尧唐生物自主开发的新一代腺嘌呤碱基编辑器 YolBE，可在 SERPINA1 PiZ 位点实现高效、精准的基因修复，将 AATD 高风险突变 PiZ 矫正为正常 PiM，从而恢复肝细胞功能性 AAT 蛋白表达，该疗法在实现精准靶向编辑的同时，几乎完全避免了周边碱基的旁观者编辑。此前，YOLT-202 已获得 FDA 孤儿药资格认定。 责任编辑丨菊 校对丨菊 参考资料： 1.各企业官网 精彩活动 长按识别二维码立即参与↓ 4 月 16 日 19:00-20:30 2026 核酸药物爆发启示，开发、药效机制研究与爆发的底层逻辑 声明：本文旨在于传递行业发展信息、探究生物医药前沿进展。文章内容仅代表作者观点，并不代表医麦客立场，亦不构成任何价值判断、投资建议或医疗指导，如有需求请咨询专业人士投资或前往正规医院就诊。 版权说明：欢迎个人转发文章至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。如需转载请在文章下方留言获取授权。 封面来源网络，如有侵犯版权，请联系删除 点点“分享”、“点赞”和“在看” 给我充点儿电吧~

摘要 嵌合抗原受体 (CAR)-T 细胞疗法改变了血液恶性肿瘤的治疗格局。然而，其广泛的临床应用受到与体外（ex vivo）细胞制造相关的后勤、财务和安全负担的限制。体内（In vivo）CAR-T 工程已成为一种变革性的替代方案，能够通过病毒或非病毒载体系统性递送编码 CAR 的构建体，直接重编程内源性 T 细胞。该策略消除了白细胞清除术、基因修饰和回输的需要，为简化、可扩展且具有潜力的“现货型（off-the-shelf）”免疫疗法铺平了道路。虽然诸如细胞因子释放综合征 (CRS) 和免疫效应细胞相关神经毒性综合征 (ICANS) 等挑战仍然是共同的障碍，但体内方法引入了额外的复杂性，包括载体免疫原性和先天免疫感知。通过利用基于 RNA 的平台，体内 CAR-T 工程正在发展成为超越肿瘤学的可编程免疫治疗模式。与此同时，系统性体内重编程的监管框架仍不完善，突显了需要协调指南以平衡创新与患者安全。本综述综合了主要递送平台的进展，分析了特定于体内方法的关键转化和监管障碍，并重点介绍了在载体嗜性、免疫调节和可扩展制造方面的新兴创新。随着该领域的成熟，体内 CAR-T 策略可能会解锁在肿瘤学和自身免疫性疾病中更广泛的治疗应用，重新定义细胞免疫疗法的可及性和精准度。 关键词 (Keywords): 嵌合抗原受体-T 细胞，体内细胞工程，基因递送，白血病，B 细胞恶性肿瘤，靶向治疗 背景 采用嵌合抗原受体 (CAR)-T 细胞的过继细胞疗法已经重塑了血液恶性肿瘤的治疗范式，目前正被积极探索用于自身免疫性疾病 [1-4]。自 2017 年获得具有里程碑意义的监管批准以来，靶向 CD19 和 B 细胞成熟抗原 (BCMA) 的 CAR-T 疗法在复发或难治性 (R/R) 环境中显示出巨大的疗效，特别是在儿童急性淋巴细胞白血病 [5] 和弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 [6-9] 中。为了进一步提高治疗效果，已开发了先进的方法，例如 CAR-T 产品的序贯给药、多靶点 CAR 构建体，以及将 CAR-T 细胞与其他免疫疗法相结合的联合策略 [10-13]。然而，这些方法通常会带来高得多的总体成本，限制了更广泛的临床采用。此外，CAR-T 疗法继续受到当前制造方案复杂性的制约 [14]。传统的 CAR-T 生产依赖于个性化的、多步骤的体外工作流程，包括白细胞清除术、基因修饰、在良好生产规范 (GMP) 条件下的细胞扩增以及全面的质量控制——这通常需要数周时间 [15] 并产生巨额成本 [16]。这些后勤负担限制了及时的治疗，限制了可扩展性，并对全球实施的可行性提出了挑战 [17]。此外，免疫相关毒性如细胞因子释放综合征 (CRS) 和免疫效应细胞相关神经毒性综合征 (ICANS) 是在体外和体内 CAR-T 治疗平台中都必须解决的关键安全考虑因素 [18-21]。为了解决这些局限性，体内 CAR-T 细胞工程已成为一种变革性策略 [22-24]。通过病毒或非病毒载体将编码 CAR 的构建体直接递送到循环 T 细胞中，该方法旨在消除对体外操作和回输的需要（图 1）[25]。重要的是，尽管制造过程不同，但该策略有着共同的核心治疗目标——生成功能性 CAR 阳性免疫细胞——并遇到与体外方法许多相同的生物学障碍 [26]。多个递送平台——包括脂质纳米颗粒 [27]、工程化病毒载体和蛋白质-纳米颗粒结合物 [28]——已显示出令人鼓舞的临床前疗效，其中一些目前正在进入早期临床试验（表 1）[29]。支持该策略的首个临床证据来自一项针对接受 ESO-T01 治疗的 R/R 多发性骨髓瘤患者的研究。在最低给药剂量下，所有四名患者均获得客观缓解，包括两名完全缓解，从而为体内 CAR-T 疗法的安全性和临床可行性建立了初步的概念验证 [20]。尽管这些进展令人鼓舞，但重大的转化挑战依然存在。其中最主要的是缺乏长期安全数据，需要具有精确细胞嗜性的载体系统，以及缺乏针对原位（in situ）基因修饰量身定制的标准化方案。本综述旨在全面探讨体内 CAR-T 工程的最新创新，批判性地评估转化瓶颈——如递送特异性和免疫原性——并探讨监管框架正在如何演变以适应细胞免疫疗法中这一改变范式的模式。 图 1 CAR-T 细胞生成的体外和体内策略。 (a) 在体外 CAR-T 细胞疗法中，通过白细胞清除术从患者或健康供体分离 T 细胞，使用病毒载体进行基因修饰以表达嵌合抗原受体 (CARs)，并在良好生产规范条件下扩增。经过质量控制后，将 CAR-T 细胞回输以介导肿瘤细胞溶解。(b) 体内 CAR-T 细胞疗法通过系统性递送编码 CAR 的构建体——通过病毒或非病毒载体——绕过体外操作。这些载体转导内源性循环 T 细胞，使其在原位被重编程为能够靶向肿瘤抗原的效应 CAR-T 细胞。新生成的 CAR-T 细胞随后在体内识别并消除肿瘤细胞。缩写：CAR，嵌合抗原受体。 表 1 体内 CAR-T 细胞疗法的商业管线（注：保留原文表格结构）产品名称公司/合作者递送平台 (靶向)治疗载荷靶向免疫细胞疾病开发阶段CPTX-2309Capstan TherapeuticsLNPs (CD8抗体)CD19 CART 细胞自身免疫疾病I期 (NCT06917742)ESO-T01EsoBiotecLVs (抗体未披露)BCMA CART 细胞R/R 多发性骨髓瘤I期 (NCT06791681、NCT06691685)INT-2104Interius BioTherapeuticsLVs (CD7 scFv)CD20 CART细胞/NK细胞NHL，前体淋巴细胞白血病I期 (NCT06539338)KLN-1010Kelonia TherapeuticsLVs (CD3抗体)/IGPSBCMA CART 细胞多发性骨髓瘤I期 (NCT07075185)MT-302Myeloid TherapeuticsLNPs (非靶向)TROP2 CAR (mRNA)髓系细胞恶性上皮肿瘤I期 (NCT05969041)MT-303Myeloid TherapeuticsLNPs (非靶向)GPC3 CAR (mRNA)髓系细胞肝细胞癌I期 (NCT06478693)UB-VV111Umoja Biopharma, AbbVieLVs/VivoVecCD19 CAR; RACRT 细胞NHL, R/R LBCL, CLLI期 (NCT06528301)UB-VV400/410Umoja Biopharma, IASOLVs/VivoVecCD22 CAR; RACRT 细胞R/R LBCLI期 (NCT06743503)LVIVO-TaVec100Legend BiotechLVs (抗体未披露)CD19/CD20 CART 细胞R/R B细胞恶性肿瘤I期 (NCT07002112)STR-P004Starna TherapeuticsLNPs/STAR™未披露T 细胞NHLI期 (NCT07003178) 体内 CAR-T 细胞工程的原理 直接在人体内工程化 T 细胞的能力代表了过继细胞疗法的范式转变，为传统体外 CAR-T 平台的后勤和制造限制提供了一个引人注目的解决方案。与需要 T 细胞分离、外源基因转移和在受控生物反应器环境中广泛扩增的传统方法不同，体内 CAR-T 细胞工程在原位重编程内源性 T 淋巴细胞，将患者转变为一个自给自足的、自体生物反应器 [30]。这种方法消除了对集中式制造设施的需求，缩短了从诊断到治疗的时间，并可能扩大在基础设施或供体可用性有限的地区的治疗可及性 [30]。此外，通过绕过体外扩增的选择压力，体内策略可以减少产品表型、功能和效力方面的患者间差异——这是一个继续挑战个性化 CAR-T 生产的问题 [31]。从外部操作过渡到内部基因重编程引入了与载体设计、细胞靶向特异性、生物安全性和免疫耐受相关的新考量因素。尽管存在这些挑战，核心目标保持不变：生成大量抗原特异性、具有细胞毒性的 T 细胞群，能够识别并根除恶性或致病细胞 [30]。体内工程力求以更高的速度、可扩展性和全球适用性来实现这一目标——将其定位为细胞免疫疗法的下一代模式。 以下部分将首先剖析两种主要的递送模式（病毒和非病毒），概述每种模式的独特优势和固有局限性。随后将综合探讨所有平台面临的共同转化挑战——如靶向保真度、免疫原性和制造——以及正在开发的克服这些挑战的创新策略。这种结构旨在提供一个清晰的框架，以理解体内 CAR-T 发展的平台特定方面和普遍方面。 体内 CAR-T 细胞生成的递送策略 体内 CAR-T 疗法的发展取决于递送载体的选择，这决定了持久性、安全性和可制造性等关键参数。以下小节对主要的病毒和非病毒平台进行了比较分析，其优势和弱点的直接对比总结在表 2 中。 表 2 病毒和非病毒递送平台的比较特征病毒载体非病毒载体代表性系统慢病毒载体 (LVs)、腺相关病毒 (AAVs)、γ-逆转录病毒载体脂质纳米颗粒 (LNPs)、聚合纳米颗粒、细胞外囊泡 (EVs)CAR 整合稳定的基因组整合或游离体维持瞬时表达 (无基因组整合)持久性长期 (数周至数年)短期 (数天至数周)制造生物生产；需要病毒滴度测定和质量控制化学合成，可扩展且模块化安全顾虑插入突变风险，器官特异性毒性脱靶效应，剂量依赖性细胞毒性有效载荷能力载荷能力有限载荷设计灵活临床准备度经临床验证，多个 FDA 批准的产品新兴技术，多个候选药物处于 I/II 期试验中主要优势持久的 CAR 表达；高基因转移效率快速制造；可调的表达动力学，低免疫原性主要局限性免疫清除；基因组不稳定的风险较低的转染效率；瞬时表达 病毒载体平台 病毒载体构成了体内 CAR-T 细胞工程最成熟、经过临床验证的模式，具有强大的基因转移能力和高转导效率。尽管病毒和非病毒平台都在积极研究中（图 2），但病毒系统目前因其卓越的递送性能和监管熟悉度占据主导地位。典型的病毒载体由三个基本成分组成：决定细胞嗜性的包膜或衣壳，治疗性转基因（如 CAR 构建体），以及控制转基因表达（游离或通过基因组整合）的调控元件 [32]。靶向特异性由病毒表面蛋白的原生嗜性决定，或通过用配体、肽或抗体片段工程化这些蛋白质以选择性结合明确的表面标志物来决定 [33]。有效的载体设计需要平衡有效载荷能力、基因组整合风险、免疫原性、生产可扩展性和细胞类型特异性 [34, 35]。在用于体内 CAR-T 递送的病毒平台中，慢病毒载体、γ-逆转录病毒载体和腺相关病毒 (AAV) 得到了最广泛的研究，每种都具有独特的优势和监管考量 [34, 35]。 图 2 病毒和非病毒载体介导的体内 CAR 基因递送机制。 该示意图说明了将嵌合抗原受体 (CAR) 基因递送至循环 T 细胞的慢病毒载体 (LVs; a) 和脂质纳米颗粒 (LNPs; b) 的生产过程和细胞内机制。两种载体系统均通过系统性给药，并通过受体介导的内吞作用进入靶细胞。在内化后，慢病毒载体对其 RNA 基因组进行逆转录，产生的 DNA 整合到宿主基因组中，促进稳定的长期 CAR 表达。相反，LNPs 递送非整合性核酸货物，质粒 DNA 可以以游离体形式存留而不发生整合，而 mRNA 则保留在细胞质中，并由核糖体翻译产生 CAR 蛋白，导致瞬时表达。缩写：CAR，嵌合抗原受体；LV，慢病毒载体；LNP，脂质纳米颗粒；LTR，长末端重复序列；ORF，开放阅读框；PEG，聚乙二醇；RRE，Rev 响应元件；SIN，自失活。 慢病毒载体 慢病毒载体源自 1 型人类免疫缺陷病毒 (HIV-1)，能够实现持续的转基因表达——这一特性使其成为体外 CAR-T 生产的骨干 [32]。随着靶向递送系统和安全优化的构建体的开发，其向体内环境的临床转化获得了关注。一个著名的例子是 Umoja Biopharma 的 VivoVec™ 平台，它采用 CD3 特异性假型慢病毒颗粒来递送 CD20 导向的 CAR。在人源化小鼠中的临床前研究表明，该平台能高效地在体内生成功能性 CAR-T 和 CAR-NK 细胞，并产生持久的 B 细胞耗竭 [29]。通过在病毒载体颗粒中加入如 CD80 和 CD58 等共刺激配体，这种方法能够在体内直接转导和激活 T 细胞。单次给药无需事先进行淋巴细胞清除，即可在外周产生持续的 CAR-T 细胞持久性并诱导 B 细胞再生障碍超过 10 周，代表了向非清髓性 CAR-T 细胞疗法迈出的重要一步 [36]。尽管有这些创新，慢病毒载体因其整合特性，仍存在插入突变的持续风险 [37]。第三代自失活 (SIN) 慢病毒载体通过消除 LTR 区域的增强子活性，去除了 tat 等辅助基因，并采用分离基因组设计将 gag/pol、rev 和 env 分布在不同的质粒上，从而降低了重组和生成具有复制能力的病毒的风险，改善了其安全曲线 [26]。然而，长期遗传毒性仍然是监管的首要任务，需要在临床应用中进行治疗后监测。为了应对随机病毒整合带来的遗传毒性风险和靶向特异性不足的挑战，目前正在开发几种下一代慢病毒载体策略。这些包括用于空间基因递送的光可激活“笼式（caged）”载体 [38]、限制嗜性的受体特异性假型技术 [39] 以及允许组成型 CAR 表达同时通过诱导型启动子控制辅助因子释放的模块化构建体 [40]。在一个代表性的例子中，将工程化慢病毒载体暴露于长波紫外线 (UVA) 光下可去除笼式基团并在细胞和动物模型中恢复转基因递送能力 [38]。虽然这种方法提供了高度的时空精确度，但其临床转化仍受到 UVA 光组织穿透力差和诱变潜力的限制 [41]。总而言之，这些创新反映出在平衡转导效力、靶向精度和临床可扩展性方面日益增长的努力——这是体内基因治疗平台（如 CAR-T）更广泛应用的关键要求。 γ-逆转录病毒载体 主要源自莫洛尼鼠白血病病毒 (MoMLV) 的 γ-逆转录病毒载体是最早用于 CAR-T 开发的载体之一 [42]。与慢病毒一样，它们通过逆转录并通过长末端重复序列 (LTRs) 和病毒整合酶将互补 DNA 插入宿主基因组来介导稳定的基因整合 [43]。然而，γ-逆转录病毒由于在进入细胞核期间需要细胞分裂，其固有局限性使其非常不适合靶向体内的静息 T 细胞 [44]。虽然在早期的体外 CAR-T 制造中发挥了作用，但由于安全问题，γ-逆转录病毒载体的临床应用受到了极大限制 [45]。值得注意的是，临床试验中已记录了由于 LTR 驱动的原癌基因激活导致的插入突变事件，这突显了这些载体的遗传毒性潜力 [46]。在逆转录病毒载体制造过程中，必须对载体上清液、生产终末细胞 (EOPC) 和体外转导细胞进行具有复制能力的逆转录病毒 (RCR) 测试——这是一项关键的安全预防措施，很大程度上将其使用限制在体外环境中，在那里受控的条件能够进行严格的监控和细胞选择，以减轻致癌风险 [47]。为了解决这些局限性，已采用了几种工程策略，包括降低增强子活性的 SIN 配置以及排除可选标记基因的设计 [48]。尽管有这些改进，它们对有丝分裂活性的严格依赖仍然是体内有效应用的主要障碍 [49]。因此，具有更广泛嗜性并能够转导非分裂细胞的慢病毒载体已经在体内 CAR-T 领域中很大程度上取代了 γ-逆转录病毒。 腺相关病毒载体 AAV 为体内 CAR-T 递送提供了一种具有出色安全曲线的非整合平台，这得益于数十年的基因治疗研究的支持。与整合载体不同，AAV 在转导后主要保留为游离体，从而最小化了插入突变的风险 [50]。它们在多种临床基因治疗产品中的获批进一步验证了其转化潜力 [51]。AAV 可以有效地转导分裂和静止的细胞，并且可以通过衣壳工程和血清型优化来定制以靶向特定的免疫亚群 [52]。AAV 设计的最新创新——如新型衣壳库、肽展示技术和聚糖结合修饰——显著改善了临床前模型中的 T 细胞嗜性 [53, 54]。编码 CAR 的 AAV 的系统性给药已成功重编程循环 T 细胞并诱导人源化小鼠中的肿瘤消退 [55, 56]。尽管前景广阔，但几个挑战阻碍了其广泛的临床转化。其中最主要的是预先存在的对 AAV 衣壳的免疫力，这在人群中很普遍，并且会削弱转导效力，特别是在静脉内途径时 [57]。此外，AAV 有限的包装能力（约 4.7-5.0 kb，包括 ITR）限制了大型或多组分 CAR 构建体的掺入 [57]。在原代 T 细胞中的次优表达，尤其是某些血清型，进一步限制了治疗效力 [58]。为了克服这些障碍，正在开发具有增强的淋巴细胞选择性、改善的免疫逃避特性和扩大的有效载荷能力的下一代 AAV [59]。除了瞬时免疫抑制、抗体降解酶和 B 细胞调节疗法等辅助方法外，还在探索衣壳去免疫化策略、基因组压实 [60] 和合成启动子 [61, 62]。此外，下一代 AAV 衣壳的理性设计现在越来越受到人工智能 (AI) 驱动方法的指导 [63]。通过整合高通量测序、结构建模和功能筛选数据，机器学习 (ML) 算法可以识别同时优化多个属性的序列变体——如包装稳定性、跨物种转导效率和组织嗜性 [64]。最近建立的 Fit4Function 框架就证明了这种多维优化，该框架系统地预测和验证了具有增强的跨物种性能和改进的治疗可预测性的 AAV 变体 [64]。总之，这些创新旨在释放 AAV 载体在体内 CAR-T 工程中的全部治疗潜力。 病毒载体平台的临床转化考量 病毒载体仍然是体内 CAR-T 细胞疗法发展的基础，为高效基因递送提供了一个经过充分验证的平台。慢病毒载体支持在分裂和非分裂细胞中稳定整合和稳健转导，使其非常适合需要持续 CAR 表达的应用。然而，尽管 SIN 设计有所改进，但由于制造过程复杂以及对插入突变的持续担忧，其临床部署受到了抑制 [32, 37]。γ-逆转录病毒载体在历史上对体外 CAR-T 开发至关重要，生产起来更简单、更具成本效益，但它们依赖于有丝分裂活性并与遗传毒性相关，这限制了它们在直接体内应用中的使用 [46, 49]。相比之下，AAV 载体提供了良好的安全性曲线并支持可扩展的生产。然而，它们面临着显著的障碍，包括普遍存在的预存免疫力以及限制包含多结构域 CAR 架构的有限基因组有效载荷能力 [50, 57]。病毒平台之间的异质性突出了将载体特性与特定治疗环境相匹配的必要性。衣壳工程、嗜性修饰和免疫调节设计方面的持续创新扩大了病毒载体工具包，并提高了靶向精度 [35, 65]。要实现基于病毒的体内 CAR-T 策略的临床潜力，将需要一个协调的监管基础设施，包括标准化的制造方案、经验证的遗传毒性检测，以及减轻载体相关免疫原性的策略 [30, 33, 66]。 非病毒平台 非病毒递送系统正迅速成为体内 CAR-T 工程的引人注目的替代方案，解决了病毒方法固有的一些局限性——即免疫原性、整合风险、有限的有效载荷能力和制造复杂性 [67]。在非病毒策略中，脂质纳米颗粒 (LNPs) [68]、聚合纳米载体和工程化细胞外囊泡在将核酸货物递送至 T 细胞方面表现出了巨大的潜力 [69, 70]。这些平台能够瞬时、无整合地将治疗有效载荷——包括 mRNA、质粒 DNA 和成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白 (CRISPR-Cas) 核糖核蛋白——递送到内源性 T 细胞中，而无需白细胞清除或体外操作 [69, 71, 72]。 脂质纳米颗粒 LNPs 已经成为一个多功能和可扩展的基因递送平台，因其在 COVID-19 大流行期间的 mRNA 疫苗递送中发挥的关键作用而备受瞩目 [73]。在结构上，LNPs 由四个主要成分组成：可电离脂质，促进核酸封装和内体逃逸；磷脂，构成囊泡结构；胆固醇，用于膜稳定性；以及聚乙二醇 (PEG)-脂质偶联物，通过减少调理作用和清除来延长循环时间。这些成分自组装成纳米级囊泡，保护遗传货物免受酶降解并促进高效的细胞摄取 [74]。越来越多利用 LNP 配制的 mRNA 疗法的临床项目——涵盖传染病、肿瘤学和罕见遗传性疾病——进一步支持了将该模式扩展到体内 CAR-T 细胞工程 [75]。临床前研究表明，封装 CAR 编码 mRNA 的靶向 T 细胞的 LNPs 可以在体内成功重编程循环 T 淋巴细胞，在小鼠模型中诱导强大的抗肿瘤反应 [27]。一项著名的策略是涉及 CD3 靶向的 LNPs 共同递送 CD19 CAR mRNA 和 IL-6 短发夹 RNA (shRNA)，导致延长存活期和肿瘤清除，效果可与传统的体外扩增 CAR-T 细胞相媲美 [69]。最近的研究表明，将新型可电离脂质 (L829) 整合到抗 CD5 抗体片段功能化的 LNPs 中，可以有效地将 mRNA 递送从肝组织重定向到外周 T 细胞 [76]。L829 的包含不仅增强了内体逃逸，还提高了整体转染效率，从而在多个临床前模型（包括非人灵长类动物）中实现了强大的体内 CAR-T 生成和持久的肿瘤抑制 [76]。这些结果强调了靶向 LNP 平台增强的递送特异性和治疗功效。该方法的转化相关性得到了 2025 年《新英格兰医学杂志》的一篇报道的进一步支持，该报道描述了一种封装 CD19-CAR mRNA 的 CD8 靶向 LNP 配方 [77]。在这项首次人体研究中，输注后 6 小时内观察到了完全的外周 B 细胞耗竭，为支持系统性红斑狼疮 (SLE) 体内 CAR-T 疗法的可行性提供了令人信服的临床证据 [77]。这一概念验证为将体内 CAR-T 策略扩展到自身免疫疾病和其他免疫介导的疾病奠定了基础。除了生物学性能外，LNP 还具有重要的制造优势，如基于微流控的可扩展性、批次间一致性以及与良好生产规范 (GMP) 标准的兼容性。这些特点促进了临床转化和商业可行性 [78]。然而，仍然存在一些挑战。与病毒载体相比，LNPs 通常表现出较低的转染效率，并且 mRNA 表达的瞬时特性需要重复给药以维持治疗水平 [71, 79, 80]。基于 RNA 的疗法持续缺乏精确定向的 LNP 系统突出了人们对递送至肝细胞和其他非免疫组织的脱靶现象的持续关注 [79]。有趣的是，mRNA 短暂的表达动力学虽然通常被视为一种限制，但在自身免疫适应症中可能提供临床优势。通过实现可控的、暂时性的 B 细胞耗竭然后免疫重建，这种方法允许有效的免疫重置，同时最大限度地减少长期免疫抑制 [76]。为了克服目前的局限性，下一代 LNPs 正在采用电荷辅助稳定 (CAS) 策略 [81]、受体靶向配体 [82] 和优化的可电离脂质化学 [83] 进行工程化。使用 T 细胞特异性肽（例如，CD5 结合配体）或膜锚定部分进行表面修饰进一步提高了靶向精度 [84, 85]。这些复杂的设计为能够进行智能响应和精确决策的系统铺平了道路。现在的最前沿在于利用这些进步来开发下一代平台，这些平台能够克服肿瘤异质性和免疫逃避，最终通过刺激触发的药物释放和算法优化的配方实现完全个性化的癌症免疫治疗 [86, 87]。在这些工程进展的基础上，几种基于 RNA 和 DNA 的治疗平台已成为体内细胞工程的候选平台。值得注意的是，Orna Therapeutics 正在开拓基于工程化环状 RNA (oRNA) 的原位嵌合抗原受体 (isCAR) 治疗平台 [73, 88]。oRNA 设计结合了一个不依赖帽的内部核糖体进入位点 (IRES)，与传统的线性 mRNA 相比，赋予了卓越的分子稳定性和更长的蛋白质表达时间 [73, 88]。另一个重大进展是新开发的 NCtx 系统，这是一个突破性的基于 LNP 的平台，可共同递送微环 DNA 和转座酶 mRNA，以实现体内高效生成具有有效抗肿瘤效力的持久 CAR-T 细胞 [89]。除了 DNA 和传统的 mRNA 方法，自扩增 RNA (saRNA) 和反式扩增 RNA (taRNA) 代表了有前途的替代方案。与标准的体外转录 mRNA 不同，这些基于复制子的 RNA 在存在复制酶的情况下会在细胞内发生大量扩增，从而以最小的 RNA 剂量实现增强的免疫反应 [90]。此外，为了解决 mRNA 半衰期相对较短的问题，通过 LNP 递送的质粒 DNA 也在探索用于抗炎脂质递送等应用中，尽管还需要进一步优化以改善其安全性和疗效特征以用于更广泛的治疗用途 [91]。总的来说，这些创新正在推动 LNP 平台朝着增加功效、安全性和在体内 CAR-T 细胞治疗的临床实用性的方向发展。 聚合纳米颗粒 聚合纳米颗粒提供了一个高度可定制的、非病毒的基因递送平台，其特点是可调的物理化学性质和广泛的治疗适应性 [92]。例如，聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物 (PLGA) 通过静电和疏水相互作用机制促进纳米颗粒与囊泡膜之间的相互作用，这种机制诱导局部和短暂的膜流化和透化作用，最终通过膜融合和非破坏性脂质交换过程介导纳米颗粒的高效胞质释放 [93]。表面修饰策略进一步增强了功能性：像聚乙烯亚胺 (PEI) 这样的阳离子聚合物可以调节 PLGA 纳米颗粒的表面电位，改善内体逃逸和细胞内化，同时实现与带负电荷核酸的静电复合，从而拓宽了载货通用性和靶向潜力 [94]。此外，带有靶向配体的表面功能化促进了选择性细胞摄取，从而增强了递送特异性并减少了脱靶效应 [95]。与脂质纳米颗粒相比，聚合载体表现出更大的设计灵活性、复杂配方更好的包封效率以及增强的结构稳定性 [41, 96, 97]。尽管前景广阔，但聚合纳米颗粒面临一些递送和转化障碍。细胞外和细胞内屏障——如黏膜清除、内体截留和免疫原性——可能会限制其生物利用度和细胞内基因转移效率 [98]。PEG化虽然常被用于延长循环时间，但可能会损害细胞摄取并在敏感个体中引发抗 PEG 免疫反应。此外，聚合纳米颗粒面临着低效内体逃逸的独立挑战，这仍然是细胞质递送核酸的关键瓶颈 [99]。从临床转化的角度来看，可扩展生产和批次间的一致性构成了重大挑战 [92]。纳米沉淀等技术虽然通用，但容易产生变异，需要仔细优化配方参数——如粒径分布 [95]、包封效率和胶体稳定性 [98, 100]，以确保可重复性、治疗效力和安全性。 细胞外囊泡 细胞外囊泡 (EVs)，包括外泌体和微囊泡，是天然分泌的纳米载体，能够递送多种生物活性货物，包括蛋白质、microRNA 和 mRNA [101]。由于其内源性脂质双分子层结构，EV 表现出固有的生物相容性、良好的药代动力学和细胞类型特异性嗜性——这些特征使其成为基于 CAR 的基因和蛋白质递送的新兴非病毒载体 [102]。在 CAR-T 细胞工程的背景下，EVs 提供了独特的转化优势，包括低免疫原性、能够递送功能性 CAR 构建体或调节性货物，以及降低了全身毒性的风险 [103, 104]。例如，源自 CAR-T 细胞的外泌体在小鼠模型中已证明具有肿瘤抑制活性 [1]，并可以作为免疫调节 microRNA 或抗炎蛋白的天然载体 [103, 105]。一个显著的例子是一种靶向肺部的混合系统，结合了展示抗间皮素/PD-L1 单链可变片段 (scFvs) 的 CAR-T 衍生外泌体和载药脂质体，显示出肺部积聚增加和强效的抗肿瘤作用 [104]。此外，能够连续分泌装载 mRNA 的外泌体的可植入的基因工程生产细胞，为持久的、原位治疗递送提供了一个有前途的平台 [106]。尽管具有潜力，但关键障碍阻碍了基于 EV 的递送系统的临床转化 [107]。传统的分离方法——如超速离心和体积排阻色谱——会产生异质的囊泡群，且存在可扩展性差和批次间可重复性差的问题。此外，EVs 的全身半衰期较短，且载货效率有限 [108]。最近的努力旨在改造供体细胞，使其成为连续产生具有明确分子含量的 EV 的生物反应器。通过遗传编码膜融合蛋白也可以增强靶向特异性，从而实现选择性嗜性，如在靶向神经元的 siRNA 递送中所证明的那样 [109]。还需要在机制理解、免疫原性分析和功效优化方面取得进一步进展，以实现体内 CAR-T 的 EV 应用 [103, 110]。合成 EV 模拟物和工程化外泌体平台的并行发展旨在提高靶向精度和免疫刺激功能 [107, 111]。需要继续研究优化免疫原性特征、生物分布和治疗功效，以充分实现 EVs 在体内 CAR-T 细胞工程中的临床效用。 非病毒载体平台的临床转化考量 非病毒递送系统已成为体内 CAR-T 细胞工程的病毒载体的有前途的替代品，解决了免疫原性、有效载荷限制和复杂制造等关键局限性 [112]。一个主要的转化挑战仍然是循环 T 淋巴细胞的高效和选择性靶向。纳米载体表面工程的最新进展——尤其是 T 细胞特异性配体的使用 [69] 以及优化的理化参数（例如电荷、大小、形态）[113]——改善了细胞摄取和组织特异性。诸如 pH 响应性释放、增强内体逃逸和对肿瘤微环境线索的响应性等策略进一步提高了细胞内递送的精度 [112]。piggyBac 转座子系统是非病毒平台的范例，具有高载荷能力和低免疫原性，能够实现稳定的基因组整合 [114]。在临床前研究中，它已用于生成趋向中枢神经系统 (CNS) 的 CAR-T 细胞 [115] 和同种异体 CAR-NK 细胞 [116]，早期的临床试验 (ACTRN12617001579381) 强调了其转化活力 [117]。此外，器官选择性递送正获得关注。涂有特定血清蛋白的纳米颗粒可以避免肝脏滞留，转而靶向脾脏和肺等免疫相关组织 [118]。这种蛋白质冠介导的重定向为体内非病毒载体编程提供了一个新的维度。虽然该领域继续发展，但这些平台共同代表了一个模块化和临床上可扩展的基础，用于推进体内 CAR-T 疗法。靶向精确度、货物保留和系统耐受性方面的进一步完善将是广泛临床应用所必需的。 为体内应用改进 CAR 架构 CAR-T 疗法的疗效不仅受递送平台的影响，在很大程度上也受嵌合抗原受体分子结构配置的影响。实际上，优化 CAR 设计不仅是对体外工程原理的完善，也是克服与体内基因递送和细胞重编程相关的独特挑战的基本前提。典型的 CAR 构建体包括胞外抗原结合域（通常是 scFv）、铰链区、跨膜域和一个或多个胞内信号传导基序（图 3）[26]。根据其细胞质设计，CAR 分为五代——每一代都结合了诸如双共刺激信号、细胞因子释放模块或诱导型转录控制等增强功能 [119]。中等亲和力、人源化的 scFvs 可以最小化紧张型信号传导（tonic signaling）并降低脱靶激活的风险，而优化的铰链和跨膜结构域提高了循环 T 细胞中的受体稳定性和表达效率 [120]。值得注意的是，在体外环境中开发的几项合成生物学创新——包括响应多种抗原的逻辑门控 CAR、诱导型安全开关和药物依赖型 ON 开关 CAR——为外部控制 CAR-T 活性提供了基础策略 [121-123]。更重要的是，这些进展为下一代 CAR 架构的设计提供了信息，这些架构包含多重信号传导组件、可调表达系统和生物标志物响应促动机制 [124, 125]，为工程化能够在动态体内环境中发挥作用的 CAR-T 细胞提供了概念蓝图。总的来说，这些工程完善实例说明了结构创新如何将体内 CAR-T 细胞疗法从实验概念转化为可编程、临床可扩展和生物安全的免疫治疗平台。 图 3 体内 CAR-T 细胞疗法的设计策略和转化进展。 a. 病毒和非病毒 CAR 递送载体的制造。病毒载体通过基于细胞的系统（如 HEK293 细胞）生产，将 CAR 转基因包装到受衣壳包裹的基因组中。相比之下，非病毒平台——包括脂质纳米颗粒和聚合纳米载体——是通过化学或物理方法合成进行核酸封装的。(b) CAR 构建体的演变。CAR 设计已经发展了五代。第一代 CAR 仅包含 CD3ζ 信号传导；后来的迭代结合了一个或多个共刺激模块（例如，CD28，4-1BB）、细胞因子诱导剂（例如，IL-12）或合成结构域（例如，具有 JAK-STAT 链接的 IL-2Rβ）以改善持久性、功能性和免疫调节能力。(c) 免疫效应细胞的体内基因递送。病毒和非病毒载体能够在原位重编程包括 T 细胞、NK 细胞、树突状细胞和巨噬细胞在内的多种免疫细胞谱系，以表达功能性 CARs，支持靶向肿瘤细胞毒性。(d) 转化里程碑。体内 CAR 递送已在小鼠和非人灵长类动物模型中展示了治疗功效，并正进入针对血液系统恶性肿瘤、实体瘤和自身免疫性疾病的早期临床试验。缩写：CAR，嵌合抗原受体；CM，共刺激模块；DC，树突状细胞；IL，白细胞介素；JAK，Janus 激酶；LNP，脂质纳米颗粒；LV，慢病毒载体；NK，自然杀伤细胞；scFv，单链可变片段；STAT，信号转导和转录激活因子。 临床开发概况和临床前验证 将体内 CAR-T 细胞疗法从概念验证模型转化为临床应用，需要在小动物和大动物系统中进行验证（图 3）。临床前研究表明，CD3 靶向的慢病毒载体可以在体内重编程 T 细胞而无需体外操作。这种载体在人源化小鼠中的单次静脉注射成功生成了 CD19 特异性 CAR-T 细胞，导致持续的 B 细胞耗竭和肿瘤消退 [126]。基于这些发现，Umoja Biopharma 的 UB-VV100 平台——共同递送 CAR 转基因和雷帕霉素诱导的细胞因子受体——已在 PBMC 人源化小鼠模型中展示了增强的 T 细胞扩增和持久性 [29]。AAV 载体同样实现了人类 T 细胞的体内重编程，生成了能够在异种移植模型中介导肿瘤清除的功能性 CAR-T 细胞 [55]。修饰有抗 CD3 或抗 CD7 抗体的 LNP 制剂也实现了将 CAR mRNA 选择性递送至 T 细胞，从而实现了高效的 B 细胞耗竭和强大的体内转染 [127]。此外，基于 EV 的系统——如 Cas9 包膜递送载体 (EDVs)——允许使用 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物在体内对 T 细胞进行精确的基因组编辑 [84]。这些技术进步使病毒和非病毒平台——特别是 LNPs——不仅成为 T 细胞工程的有前途的递送系统，而且还具有更广泛免疫干预的潜力。越来越多的证据基础支持了体内生成 CAR-T 的临床可行性，并突出了能够克服体外制造现有障碍的递送模式的出现。 扩大体内细胞工程的转化格局 普遍的体内细胞工程技术的进步，已从最初的血液恶性肿瘤 T 细胞疗法扩展开来，现在正在提供基本策略和支持技术，这些策略和技术直接支撑体内 CAR-T 平台的持续演进 [25, 128]。超越血液恶性肿瘤，体内 CAR-T 技术正在迅速扩展到更广泛的疾病适应症中，正如各种动物模型中令人信服的临床前证据所证实的那样（表 3）。至关重要的是，病毒和非病毒递送系统都已针对免疫细胞（包括 T 细胞、巨噬细胞和 NK 细胞）的原位高效编程进行了优化，从而为体内 CAR-T 的实施提供了多功能的技术基础（表 4）。 转化策略和临床考量 体内 CAR-T 疗法的临床转化 多个体内 CAR-T 平台已进入早期临床评估阶段，标志着向转化的重要一步。Umoja Biopharma 的 UB-VV100（一种编码 CD19 特异性 CAR 的 CD3 靶向慢病毒载体）获得 FDA 批准，针对复发/难治性大 B 细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病患者启动 I 期试验 (NCT06528301)。同时，Interius BioTherapeutics 启动了一项 INT2104 的首次人体试验 (NCT06539338)，这是一种用于 B 细胞恶性肿瘤，利用慢病毒递送的 CD20 导向的体内 CAR-T 候选药物。这些试验的理论依据建立在体内基因治疗的成功先例之上。值得注意的是，NTLA-2001（一种用于转甲状腺素蛋白淀粉样变性的全身给药的 CRISPR-Cas9 LNP 平台）在人类研究中证明了具有良好安全状况的持久体内基因编辑 [146]。这些例子为将体内基因组工程技术适应 CAR-T 疗法奠定了转化基础，并有潜力将其应用扩展到肿瘤学之外。尽管在递送技术和构建体设计方面取得了进展，但体内 CAR-T 细胞疗法仍然面临着关键的转化挑战，包括载体嗜性限制、免疫识别、监管障碍和制造重现性。解决这些障碍对于开发更安全、更有效和可扩展的平台至关重要（图 4）。 表 3 血液系统和非血液系统疾病中体内 CAR T 细胞疗法的代表性临床前证据（注：保留原文结构）疾病适应症CAR 靶点递送平台临床前发现参考文献B细胞淋巴瘤CD19融合性NVs通过融合性NVs在体内生成的抗CD19 CAR-T细胞对CD19+淋巴瘤表现出强效的细胞毒性，且无CRS；抗OX40联合进一步增强了T细胞活化和抗肿瘤作用。[70]B细胞白血病CD19LVs体内 CAR-T 细胞抑制了 CD19+ 肿瘤生长并显著延长了生存期，即使在侵袭性疾病模型中也是如此。[129]B细胞白血病CD19LVs在人源化 B 细胞肿瘤小鼠中给药可诱导强大的 CAR-T 细胞扩增和完全的系统性肿瘤根除。[29]B细胞白血病CD19LVs在使用人类 PBMC 的 Raji 淋巴瘤异种移植物中，限于 CD8+ T 细胞表达的 CAR 驱动了高效的 CD19+ B 细胞清除；在 CD34+ 小鼠模型中观察到类似疗效（70% 耗竭）。[130]B细胞白血病CD19LNPs抗CD3-LNP/CAR19加shIL6实现了长达90天的稳定T细胞转染和持久的CAR-T功能，具有强效抗肿瘤活性。[69]T细胞白血病194-1BBz CAR纳米颗粒纳米颗粒共同递送194-1BBz CAR和IPB7转座酶导致70%的肿瘤完全消退，并延长生存期58天。[67]T细胞白血病1928z CAR纳米颗粒编码1928z CAR的纳米载体有效地抑制了白血病进展并在3周后减轻了肿瘤负荷。[131]T细胞白血病CD4AAVs单次 AAV 输注在体内生成了功能性 CAR-T 细胞，在人源化模型中诱导白血病消退。[55]血管免疫母细胞性 T 细胞淋巴瘤CD4LVs在临床前 AITL 模型中，CAR+ CD8-LVs 显著延长了生存期并减少了肿瘤性 T 细胞的浸润。[132]心脏纤维化CD5LNPs将 mRNA CAR 递送至 T 细胞生成了短暂的功能性抗纤维化 CAR-T 细胞，从而在体内减轻了纤维化并恢复了心脏功能。[85]肝纤维化 & RAuPARLNPsCAMP脂质介导的CAR-uPAR T细胞消除了衰老的成纤维细胞和单核细胞，显著改善了RA和肝纤维化模型中的疾病病理。[133]前列腺癌ROR1纳米颗粒基于颗粒的 CAR 编程将生存期延长了 40 天，其疗效与传统的过继转移方案相当。[131]B细胞介导的病理CD5LNPs从健康或自身免疫供体体内生成的 CAR-CD8+ T 细胞在小鼠体内赋予了强大的肿瘤控制能力，并在灵长类动物中实现了选择性的 B 细胞耗竭。[76] 表 4 超越 T 细胞：NK 细胞、巨噬细胞和髓系谱系的体内 CAR 工程（注：保留原文结构）靶细胞类型CAR 靶点功能与特性递送平台适应症临床前结果参考文献巨噬细胞GPC3Hedgehog通路调节因子：通过GPI锚定诱导hedgehog复合体的溶酶体降解。LNPsHCC增强吞噬作用，减轻肿瘤负荷，延长存活期[134]巨噬细胞ErbB2调节微管稳定性的受体酪氨酸激酶共受体。纳米载体ErbB2+ 实体瘤重编程巨噬细胞表型，诱导全身抗肿瘤免疫[132]巨噬细胞FAP-α癌间质中的明胶酶；在发育、修复和癌症中调节成纤维细胞的生长。LNPsPDAC减少了CAF标志物，增强了对化疗/免疫疗法的敏感性[135]巨噬细胞/小胶质细胞CD133胆固醇结合膜组织者；维持上皮极性，控制形态发生。纳米载体GBM触发适应性免疫；防止术后复发[136]巨噬细胞/小胶质细胞CD133胆固醇结合膜组织者；维持上皮极性，控制形态发生。去核MSCsGBM原位生成CAR-M；CD47阻断达到了83%的90天存活率[137]巨噬细胞/DCsIFNγII型干扰素；通过二聚体受体结合介导抗病毒/抗微生物防御纳米载体ALK+ 神经母细胞瘤增强抗肿瘤和促炎反应[138]单核细胞CD19B细胞标志物；形成信号复合物以降低激活阈值，促进PI3K-Ca2+信号传导。LNPsSKOV3原位生成功能性CAR单核细胞；在健康小鼠中有效耗竭B细胞[139]单核细胞TROP2钙流入调节因子；作为钙池操纵通道对淋巴细胞的发育/活化至关重要。LNPsCD19+ 恶性肿瘤在小鼠异种移植模型中抑制肿瘤生长[4]NK/NKT/T细胞CD19B细胞标志物，启动活化信号。LVsB细胞恶性肿瘤体内生成的CAR-T细胞在人源化NSG小鼠中证明了疗效[140]NK/NKT/T细胞CD20钙通道，用于B细胞活化、发育和分化。LVs(未详列)单剂量生成CAR-T/NK细胞，高效耗竭CD20+ B细胞[141]巨噬细胞/T/NK细胞HER2受体酪氨酸激酶；促进细胞增殖、存活和分化。LNPs乳腺癌原位生成PanCAR细胞，引发强大的抗肿瘤免疫，并与HER2疫苗协同抑制肿瘤生长。[142]巨噬细胞FAP间充质细胞活化标志物；促进组织重塑和纤维化。LNPs心肌纤维化原位工程化FAP CAR巨噬细胞；在心肌I/R损伤小鼠中显著减少心脏纤维化并改善功能。[143]巨噬细胞GP75酪氨酸酶家族的黑素体酶；黑色素生物合成的关键调节因子LNPs黑色素瘤TAMs中强大的CAR表达，将TME向促炎表型重编程；诱导抗肿瘤作用。[144]巨噬细胞PD-L1免疫检查点配体；T细胞抑制和肿瘤免疫逃逸的关键介质。纳米载体三阴性乳腺癌通过多聚复合物原位生成 CAR-M；浸润肿瘤并吞噬 PD-L1+ 细胞；STING 激动剂促进了 CD8+ T 细胞的募集并减轻了肿瘤负荷。[145] 靶向特异性和脱靶安全性 体内 CAR-T 开发的一个主要转化瓶颈在于在全身给药后实现精确的 T 细胞靶向。与在回输前接受严格质量控制的体外工程细胞不同，体内递送必须确保在复杂的生理环境中具有高特异性 [67, 147]。尽管脱靶毒性的风险是两种方法根本的安全关注点，但控制脱靶递送的挑战——以及随之而来的靶向/脱瘤（off-tumor/on-target）毒性——却大得多，并且构成了体内策略特有的决定性障碍。对于病毒系统，可以通过血清型选择和包膜糖蛋白工程 [148, 149] 来提高靶向精度，并辅以高亲和力、细胞特异性配体，以改善嗜性并最大程度减少旁观者摄取 [150]。非病毒平台，特别是脂质和聚合纳米颗粒，通过先进的生物材料设计进行了优化，包括表面功能化、拓扑结构和电荷调节，以提高递送保真度 [68, 151]。为了减轻脱靶风险，正在积极探索针对 CAR 的特定创新。抗原结合结构域的结构优化、组合抗原识别回路以及动态自调节元件——如合成的 Notch 受体和抑制性 CARs——提供了对 T 细胞活化和功能的可编程控制 [152, 153]。高分辨率单细胞转录组学通过对疾病限制性表面标志物进行无偏倚的发现，进一步改进了目标抗原的选择 [154]。CRISPR-Cas9 基因组编辑为免疫细胞的可编程、持久的重编程提供了一个变革性的机会 [155, 156]。在体外环境中，靶向双抗原（例如 CD19/CD22）或设计用于同种异体用途的 CRISPR 编辑的 CAR-T 细胞已进入复发性白血病 (NCT04227015) 和自身免疫疾病 (NCT05859997) 的临床试验，显示出令人鼓舞的安全性和疗效。CRISPR 的体内应用仍处于早期阶段，但进展迅速 [157, 158]。正在调查的策略包括通过系统递送的 CAR 构建体和 CRISPR 组件进行瞬时或组织限制性基因编辑。例如，与 CRISPR-Cas9 共包装的 CAR 工程化细胞外囊泡已被用于以细胞特异性方式编辑血液恶性肿瘤中的 MYC 癌基因 [159]。这些技术体现了原位 CAR 重编程的未来，结合了基因编辑的精确性和体内方法的递送可扩展性。 炎症毒性和免疫反应 对基因递送平台和转基因产品的免疫反应代表了体内 CAR-T 疗法取得持久疗效的关键障碍 [160]。需要注意的是，无论制造方法（体外或体内）如何，如 CRS 和 ICANS 等毒性是强效 CAR-T 细胞激活的固有问题。然而，体内递送引入了额外的免疫原性成分——包括病毒衣壳、脂质纳米颗粒或聚合物结构——这些成分可能会加剧炎症反应并诱发预存的免疫 [161-163]。这些特定于平台的挑战需要进行仔细的免疫原性分析，并针对每种载体类型制定量身定制的缓解策略。在治疗上，在持久性和免疫原性之间取得正确的平衡是一项核心挑战。整合载体，如 Umoja Biopharma 的 VivoVec™ 慢病毒，被设计为从单次给药后提供持续的 CAR 表达。这些构建体包含模拟完整 T 细胞激活的多结构域融合蛋白，生成长寿的 CAR-T 细胞，特别适合需要延长监测的肿瘤环境 [36]。相比之下，非整合策略——以 Capstan Therapeutics 靶向 CD5+ T 细胞的 LNP-mRNA 平台为代表——提供了具有可编程开启/关闭动力学的短暂 CAR 表达。这种模式模仿了可滴定的生物药物，并结合了内置的安全性可逆性，有利于自身免疫性疾病等非恶性疾病应用，在这些应用中，永久性免疫细胞消融（如 B 细胞发育不良）带来了不可接受的风险 [76]。虽然瞬时表达将长期毒性降至最低，但对于需要持续抗原清除的适应症可能还不够。正在开发的方法包括共同施用靶向关键炎症途径的小分子免疫调节剂，以及进一步微调 CAR 共刺激结构域的组成以减少紧张型信号传导和耗竭 [164, 165]。例如，基于纳米抗体的靶向 CD72 的人源化 CAR（使用羊驼衍生的框架开发）在体外表现出降低的免疫原性同时保留了细胞溶解功能，这表明 CAR 组分的人源化可以增强体内的耐受性和持久性 [166]。为了进一步减轻免疫相关障碍，递送载体设计和给药途径的进步正在与免疫调节辅助剂相结合。这些包括通过重组载体来逃避中和抗体，通过修改途径来避开抗原丰富的区室，在脱靶组织中通过 miRNA 引导来沉默转基因，以及通过血浆置换方案来减少循环抑制剂 [167-170]。总的来说，这些努力主要是为了减轻与载体和转基因相关的免疫原性，这是在体内生成的 CAR-T 细胞实现持久安全临床活性的先决条件。 CAR-T 细胞持久性和肿瘤控制 体内生成的 CAR-T 细胞要实现持久的治疗效果，取决于它们在抗原引发后扩增、持久存在和维持细胞毒性功能的能力。与体外工程的对应细胞相比，由于体内递送过程中转导事件不完全或具有随机性，这些细胞在代谢适应性、分化潜能和转运行为方面经常表现出异质性 [171]。这些局限性会损害持续的抗肿瘤活性并增加复发风险。除了对 CAR 转基因进行结构优化（包括增强抗原识别、共刺激结构域和细胞内信号传导）之外，辅助策略也正在积极探索中。这些包括免疫检查点阻断、支持记忆 T 细胞形成的表观遗传或代谢调节剂，以及保留肿瘤抗原表达以最大程度减少免疫逃逸的联合疗法 [172]。免疫抑制性肿瘤微环境 (TME)，特别是在实体瘤中，对 CAR-T 细胞浸润和存活构成了进一步的障碍 [173, 174]。体外 CAR-T 研究表明，在过继转移后，人类 CAR-T 细胞表现出共抑制受体（包括程序性细胞死亡蛋白 1 (PD-1)、细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4 (CTLA-4) 和其他免疫检查点分子）的上调，这可能会减弱抗肿瘤免疫反应 [175, 176]。这一观察结果促使人们对旨在减轻由持续抗原暴露引起的 T 细胞耗竭并进一步阐明免疫耐受潜在机制的补充性共刺激策略进行严格调查。除了采用检查点抑制剂的传统组合方法外，近期体外 CAR-T 研究的进展集中于通过内源性工程策略来增强 CAR-T 细胞的疗效和持久性。这些包括共表达 PD-L1 特异性嵌合开关受体 (CSRs) 以增强抗肿瘤功能，以及开发掺入 OX-40 共刺激结构域和抗 PD-1 shRNA 的 BCMA 靶向 CAR-T 细胞以实现持续的抗肿瘤反应 [177, 178]。此外，可以通过基于 CRISPR/Cas9 的方法在 T 细胞中基因破坏免疫检查点信号传导，如靶向敲除 CTLA-4 所证明的那样，该方法通过持续的 CD28 共刺激信号传导并在高抗原暴露条件下维持表面 CAR 表达，从而增强了 CAR-T 细胞的增殖能力和抗肿瘤效力 [179]。这些发现可能为开发更有效的体内 CAR-T 疗法提供有价值的见解。除了对 CAR-T 细胞的工程修饰外，目前正在开发新兴治疗策略来克服由免疫抑制性 TME 施加的物理和代谢障碍 [180, 181]。使用血管生成抑制疗法等药剂进行血管重塑可以增强 T 细胞的渗出 [182]。并行的工作包括局部递送 CAR-T 以刺激全身免疫，改造 CAR-T 细胞分泌细胞外基质 (ECM) 降解酶，以及控制趋化因子轴以改善肿瘤归巢。代谢重编程，包括过度表达氧化磷酸化调节剂或糖酵解促进剂，可以进一步增强在恶劣 TME 中的功能持久性 [168, 183]。 图 4 体内 CAR-T 细胞疗法中的转化障碍和缓解策略。 该图概括了体内 CAR-T 细胞疗法开发中的主要挑战及相应的缓解策略。尽管这些挑战中的许多方面——例如炎症毒性、CAR-T 细胞持久性和制造复杂性——也与体外 CAR-T 方法相关，但由于全身载体递送和原位细胞工程的独特性，克服这些挑战的策略有很大的不同。提出的解决方案涵盖了定制载体设计、优化的 CAR 构建体、免疫调节和新的监管框架，反映了体内范式的独特生物学和技术障碍。缩写：AAV，腺相关病毒；CAR，嵌合抗原受体。 建立可扩展的制造标准 体内 CAR-T 疗法的一个决定性优势在于其有可能绕过劳动密集型的体外操作。然而，这一前景取决于能否以临床级标准可靠、可复制且可扩展地生产基因递送载体。同时，这一前景也建立在克服与生产临床级病毒或非病毒基因递送载体相关的明显且重大的制造挑战之上 [32, 184, 185]。一个关键且尚未得到充分解决的空白在于分析标准化。体内工程化疗法对用于确定的细胞产品的传统效力检测提出了挑战。新兴的解决方案包括关键质量属性的实时监控、开发可适应不同 CAR 构建体的模块化递送载体，以及支持快速迭代的无细胞生产平台 [186]。这些工具的整合，加上 CAR 信号传导逻辑、合成调控回路和靶向递送系统的进步，对于将体内 CAR-T 技术转化为临床主流实践至关重要 [2]。 应对监管复杂性并确保合规 体内 CAR-T 技术模糊了基因治疗、生物制剂和细胞产品之间的传统监管界限。这种复杂性由于缺乏确定的细胞产品来进行输注前的质量评估而进一步加剧，使得传统的批次放行测试不再适用。相反，监管框架必须演变，以强调严格的工艺验证、载体批次放行标准，以及输注后对患者安全和疗效的强健监控 [187, 188]。随着载体平台的多样化，跨递送模式的监管协调变得越来越重要。安全的临床实施需要分子生物学、免疫学、药理学和生物材料工程学的协调投入。监管指南必须涵盖载体设计、转导效率、组织特异性和长期生物安全性——特别是在脱靶转基因表达和插入突变风险方面 [185]。随着人工智能日益简化载体设计并加速转化研究，监管框架必须同步发展以确保负责任的实施。这些框架应建立清晰的原则，以保护数据完整性、提高算法过程的透明度，并要求对模型的泛化能力和安全性进行严格的验证 [189, 190]。由于 AI 继续塑造基因和细胞治疗发展的未来，此类指导对于维持科学责任和公众信任将是至关重要的。非病毒载体提出了独特的质量挑战。由于物理化学异质性和纳米颗粒合成过程中过程控制有限，通过设计确保质量的框架难以执行 [191]。由于直接在人类身上评估载体生物分布不可行，必须使用预测替代模型和下一代分子追踪系统作为转化代理 [54]。另一个重大挑战是自体产品和体内工程化产品的内在变异性，这限制了不同方案之间的可比性 [192]。与体外 CAR-T 疗法在输注前具有标准化剂量和细胞表型分析不同，体内方法依赖基于载体的宿主 T 细胞转导。该过程受宿主免疫状态、T 细胞丰度和激活状态，以及全身生物分布模式的影响 [129, 193]。全面的免疫原性评估——包括抗载体和抗转基因反应——是至关重要的，同时还需要对延迟毒性、插入事件或恶性转化进行长期监测 [194-196]。为了建立健全的放行标准，未来的监管范式必须将载体效力和药效学特性与临床结果联系起来。诸如实时成像、单细胞转录组分析和系统级免疫监测等先进工具，可能实现体内 CAR-T 行为的精确映射 [197]。最终，体内 CAR-T 细胞疗法的安全有效部署，不仅取决于科学创新，还取决于监管科学、质量保证体系，以及针对这一新治疗范式量身定制的灵活临床试验设计的同步进展。 结论与展望 体内 CAR-T 疗法代表了基于细胞的免疫疗法的一种范式转变，使得内源性 T 细胞的直接重编程成为可能，而无需劳动密集型的体外操作。通过简化制造并扩大患者的可及性，这种方法有可能极大地扩大细胞疗法的可扩展性和负担能力。病毒和非病毒载体平台现已在临床前模型中展示了概念验证的成功，早期临床试验正在进行中，以在患者体内验证这些策略。然而，关键挑战依然存在。这些包括在对非肿瘤毒性最小的情况下实现细胞特异性靶向，维持体内 CAR-T 的持久性和效应功能，以及减轻系统性炎症反应。重要的是，绝大多数可用证据仍然局限于临床前模型和小型早期临床研究。诸如长期安全性、治疗效果的持久性以及标准化递送协议的建立等关键参数，尚未得到全面的阐明。此外，患者异质性、疾病特异性的微环境以及载体系统复杂的生物分布等因素，继续对广泛临床转化构成实质性障碍。临床级的、合规的、可扩展的递送载体制造，以及对体内 CAR 表达进行实时监控的先进技术，是成功临床转化的必要前提。该领域目前正在经历一次战略过渡，从传统的 T 细胞工程转向多谱系细胞重编程，涵盖 CAR 修饰的 NK 细胞和巨噬细胞。这一多样化的框架利用互补的免疫效应功能来抵消免疫抑制性的肿瘤微环境，并协调针对异质性恶性肿瘤的细胞毒性反应。这种多细胞协同作用解决了单谱系疗法的固有局限性，并为治疗难治性癌症和复杂的免疫介导疾病开辟了新途径。总的来说，体内 CAR 工程代表了细胞和基因治疗的融合，为可编程的免疫疗法奠定了概念基础。虽然人工智能正开始加速载体优化和理性设计，但一些转化挑战依然存在。克服长期存在的障碍——例如实现精确定向、确保安全性控制并界定协调的监管标准——需要持续的多学科合作。尽管如此，核酸货物工程、载体优化和合成生物学回路设计方面的迅速进展，为产生具有临床可行性的体内 CAR 平台提供了强大的动力，这可能最终拓宽细胞免疫疗法的可及性和治疗范围。展望未来，体内 CAR-T 策略可能会重新定义细胞免疫疗法的治疗边界，将其影响范围从肿瘤学延伸到自身免疫和传染性疾病领域。体内 CAR-T 策略的另一个决定性优势在于其通过跳过劳动密集型的体外扩增过程从而大幅降低成本的潜力，借此提高了全球患者群体的可及性和可扩展性。