Malathion

TUESDAY, Aug. 13, 2024 -- Pesticide exposures during preconception and the first trimester may be associated with stillbirth, according to a study published online July 16 in the American Journal of Epidemiology . Melissa A. Furlong, Ph.D., from the University of Arizona College of Public Health in Tucson, and colleagues linked Arizona pesticide use records (27 types) with birth certificates (2006 to 2020) to estimate associations between living within 500 m of any application site and stillbirth. The researchers found that during 90 days preconception, any exposures to pesticides were associated with stillbirth, including cyfluthrin (relative risk [RR], 1.97), zeta-cypermethrin (RR, 1.81), organophosphates as a class (RR, 1.60), malathion (RR, 2.02), carbaryl (RR, 6.39), and propamocarb hydrochloride (RR, 7.72). During the first trimester, fenpropathrin (RR, 4.36), permethrin (RR, 1.57), organophosphates as a class (RR, 1.50), acephate (RR, 2.31), and formetanate hydrochloride (RR, 7.22) were associated with stillbirth. "These findings underscore the importance of considering individual pesticides rather than just the overall pesticide class, as specific chemical compounds may pose unique risks," Furlong said in a statement. "It also highlights the potential for prepregnancy exposures to affect reproductive outcomes." One author disclosed ties to pesticide registrants unrelated to the research.

摘要：登革热是由登革病毒（DENV）引起的，每年都会影响全球数百万人。这种病毒在人类和蚊子中有两个不同的生命周期，控制这两个周期对控制疾病至关重要。为了控制DENV的传播媒介——埃及伊蚊（Aedes aegypti），科学家们尝试了许多技术，但后来这些技术被证明在很多方面都是无效甚至有害的。因此，研究的重点转向了疫苗的开发；研究人员已经将目标对准了病毒的表面蛋白E蛋白和细胞外蛋白NS1蛋白。到目前为止，已经开发了几种类型的疫苗，如减毒活疫苗、重组亚单位疫苗、灭活病毒疫苗、病毒载体疫苗、DNA疫苗和mRNA疫苗。除了这些，科学家们还在探索开发改进版疫苗的新策略，例如利用针对NS1的重组DNA质粒，以及通过阻断蚊子体内DENV的生命周期来预防感染。 在这里，我们讨论了迄今为止疫苗研究领域的各个方面，并确定了未来疫苗开发的一些前景。 1.登革热的历史、流行病学和病因学 登革热是热带和亚热带地区最普遍的蚊媒传播疾病，每年影响全球1亿到4亿人，并威胁着世界近一半人口的登革感染。作为全球最常见的虫媒病毒疾病，它已经感染了大约128个国家的人口，这个数字在发病率和地理扩散方面还在不断增加，无疑给国际旅行者带来了压力。 东南亚、东地中海、非洲、西太平洋和美国是DENV感染的原生热点地区，然而，这种流行病正在全球范围内爆发。世界卫生组织（WHO）已经宣布登革热是继COVID-19之后第二严重的病毒疾病，因为2020年感染病例数量激增。报告的DENV感染病例最多的国家是菲律宾、越南、印度、哥伦比亚和巴西。未规划的快速城市化以及不适当的病媒控制管理是传播蚊媒疾病的主要原因。商业或个人旅行也加速了传播。 DENV起源于黄病毒科，是登革热（DF）的主要原因。正链RNA构成的DENV基因组编码七个非结构蛋白（NS）以及三个结构蛋白，即衣壳蛋白（C）、前膜蛋白（prM）和包膜蛋白（E）。这些被组织为5′-UTR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR-3′，其中UTR表示非翻译区。成熟的病毒颗粒呈圆形，直径为50纳米。DENV E蛋白，位于病毒颗粒表面，包含生成中和抗体所需的主要表位。因此，它是疫苗开发的理想目标。此外，感染患者的血清中含有高浓度的被称为DENV NS1的蛋白，由受影响的细胞释放。由于NS1是细胞外病毒成分，它可以作为DENV感染疫苗的另一个选择。 埃及伊蚊是传播四种血清型（DENV 1-4）给人类的真正罪魁祸首。2013年在马来西亚沙捞越发现的第五种也是最新的一种血清型是DENV-5。在这种情况下，DENV-4在非人类灵长类动物（NHP）和蚊子（A. nivalis）之间传播，并被认为是森林登革热感染。经过彻底的基因验证过程，导致在东南亚森林中流行的新的DENV-5血清型。从森林菌株到人类菌株的基因转换、更高的突变率和大规模的森林砍伐是导致传播激增的潜在因素。 大多数情况下，登革感染是无症状的或亚临床的。初次感染任何血清型的主要症状表现为急性发热疾病，无法与其他发热疾病区分。发热、头痛、眼睑持续疼痛、严重的肌肉和关节疼痛、腹痛、潮红和厌食是一些典型症状。任何登革血清型都可以引起登革出血热（DHF）和有时的登革休克综合征（DSS）。最严重的影响，DHF和DSS，更常见于15岁以下的儿童和青少年感染。 DENV感染发展出高浓度的中和抗体滴度，包含保护性免疫反应的潜在元素。它可以提供长期的有效性，就同型保护而言，但在异型保护的情况下，效果仅持续两年。此外，交叉抗体滴度浓度下降，随后的异型登革感染比初次感染更为严重。非中和抗体是导致抗体依赖性增强（ADE）的危险现象的原因。ADE通常发生在非中和抗体导致病毒进入宿主细胞并导致感染增加时。它们与DENV颗粒结合形成复合物，通过Fc受体促进吞噬细胞的感染。这在以前的感染与一种血清型导致其他不同血清型的进入增强时特别常见。这种增强的感染导致DHF和DSS。 1.1.人类和蚊子之间的登革热生命周期 在讨论控制登革热的方法之前，我们将深入了解登革热的生命周期（图1），以了解如何控制传播媒介。DENV在蚊子、灵长类动物和人类之间的传播有两种不同的生命周期 - 森林周期和城市周期。低等灵长类动物和人类是登革热传播的唯一哺乳动物目标。DENV-1到DENV-4，所有四种血清型都会导致城市周期的感染。当蚊子叮咬感染病毒的人时，蚊子的中肠上皮细胞就会受到感染。病毒迅速在蚊子体内传播，从其血腔传播到其唾液腺和其他组织。一旦发生这种情况，蚊子就能够通过叮咬将病毒传播给未感染的人类。 因为埃及伊蚊通常在人类住所附近繁殖，并且容易受到DENV的影响，所以它被认为是热带和亚热带地区的主要传播媒介。被称为亚洲虎蚊的A. albopictus可以作为次要传播媒介。由于能够在温带地区生存，它已经在所有大陆迅速传播，并引起包括DENV在内的虫媒疾病。A. albopictus在欧洲和中国的登革热传播中扮演着关键角色。 图1 埃及伊蚊的生命周期。 1.2.病媒控制方法 登革疫苗的开发和DHF和DSS的治疗比预期的要长。因此，病媒控制对于预防和管理登革热仍然至关重要。 控制登革热最受欢迎和最简单的方法是使用驱蚊剂，这是由合成或天然化合物混合而成的。主要成分是N,N-二乙基-3-甲基苯甲酰胺（DEET），它对蚊子非常有效。但是持续暴露可能会对人体产生毒性反应。 早期用于针对登革热病媒成蚊阶段的化学控制方法之一是二氯二苯三氯乙烷（DDT）。尽管在减少病媒种群方面取得了显著的下降，但DDT抗性在20世纪60年代及其后的年代的出现，是登革热从休眠阶段重新爆发的主要原因之一。第二和第三代杀虫剂（如马拉硫磷和拟除虫菊酯）也在这个时候变得可获得。 除了这些，还有各种基于化学的技术可用于控制成蚊和登革病媒的幼虫和蛹的水产阶段。然而，基于化学的登革病媒控制有缺点，例如环境污染、毒素生物积累以及与人类毒性的可能性，这些特别与在饮用水容器中使用杀虫剂有关。 一种提出的病媒控制策略是生物控制。这包括引入食蚊幼虫的捕食者，如桡足类，和昆虫幼虫进入水容器，传播转基因载体例如沃尔巴克菌株（旨在减少或取代具有有限传播和繁殖能力的野生型病媒种群），以及生态管理（例如限制潜在的幼虫发育场所、识别和清除废弃的容器、遮盖功能性水容器、减少水污染、确保安全水的可用性、通过使用杀虫剂处理的网减少人-病媒接触，以及筛选门窗）。然而，这些替代病媒控制技术的有效性证据很少。 因此，对抗登革热爆发的主要策略一直是病媒控制。简单来说，通过将昆虫浓度降低到昆虫学阈值以下，可以减缓疾病传播。然而，随着预防措施的兴趣增加，对登革疫苗的研究也在进行中。由于公众意识的提高和新型分子技术的发展，过去十年中登革疫苗开发工作大大加快。一些候选疫苗正在从临床前到第三阶段进行评估，如灭活、减毒活、DNA、重组亚单位和病毒载体。 2.登革疫苗研究和开发 1929年进行了最早的登革疫苗评估。然而，疫苗配方受到几个问题的困扰。首先，由四种抗原不同的复杂血清型组成的DENV，使得疫苗开发成为一个巨大的挑战。其次，由第二次异型感染引起的DHF和DSS，其未知的免疫反应和发病机制阻碍了DENV疫苗的开发。第三，对病毒的适应性免疫反应尚未完全理解，以及免疫反应（保护性或病理性）对病毒的确切特征，使疫苗开发变得复杂。此外，我们没有方便、经济、准确反映人类感染后免疫反应的动物模型。NHP可以维持病毒复制并发展出强大的免疫反应，但不能发展出明显的疾病。另一方面，某些免疫缺陷的小鼠模型感染小鼠适应的DENV菌株，表现出严重疾病的迹象，如在人类严重登革热中看到的“血管渗漏”综合症。人源化小鼠模型可以维持DENV复制并表现出一些疾病迹象，但为了验证免疫反应，需要进一步发展。在免疫能力的小鼠感染DENV的情况下，它们不表现出疾病。尽管血清中存在含有DENV的免疫复合物，暗示了ADE样现象的可能性，但DENV的猪模型仍然有一些无症状的限制。 尽管存在这些障碍，疫苗开发在过去几年中已经取得了显著进展，目前登革疫苗的开发和测试阵容是先进的、多样化的和令人鼓舞的。目前，多种登革疫苗候选正在进行第三阶段临床研究，其他一些已经在人类试验中进行了评估。本文讨论了开发登革疫苗的各种策略。 2.1.减毒活疫苗 夏威夷大学首次尝试创建减毒活疫苗，采用了长期建立的在NHP中连续传代的策略。后来，该项目转移到泰国的马希多大学，进行了更多的病毒传代、疫苗配方和评估。尽管提出的疫苗没有成功，但该研究为后来的减毒四价登革疫苗的开发提供了推动。 沃尔特·里德陆军研究所（WRAIR）开发了第二种组织培养传代登革疫苗。WRAIR制造的四价登革疫苗的原始配方也存在不均匀的反应原性和免疫原性的问题。在第二阶段研究中，改变的配方看起来是无害和免疫原性的；然而，需要进一步的研究来完全评估它们的保护效果。 美国国立卫生研究院利用突变技术，启动了登革疫苗研究的新阶段。登革基因组的遗传修饰很简单，产生了已经在美国未接触过黄病毒属的成人中评估的减毒菌株。此外，美国FDA还开发了一种分子减毒的四价登革疫苗，并在除人类以外的灵长类动物上进行了测试。为了开发减毒四价登革疫苗，这两种方法都提供了替代策略。 正在开发几种使用重组DNA技术减毒活登革疫苗，包括四活减毒病毒登革疫苗（DENVax）、携带30核苷酸缺失的重组DENV-4突变疫苗（rDEN4D30）和带有嵌合黄热病17D病毒的四价登革疫苗（CYD-TDV）。 2.1.1.减毒活体嵌合黄热病-登革热疫苗 美国疾病控制与预防中心（CDC）设计了一种四价嵌合登革热疫苗，通过将DENV-1、DENV-3和DENV-4的E基因和prM整合到来自马希多大学-赛诺菲巴斯德减毒活DENV疫苗（DEN-2, 16681 PDK-53）的有效减毒cDNA中。显着的黄热病疫苗病毒株17D的感染cDNA组分被修改以整合登革热结构基因。这方面的起源可以在华盛顿大学和圣路易斯大学的医学院找到。赛诺菲巴斯德已获得Acambis公司的制造许可，以继续这些黄热病嵌合体的商业开发。因此，赛诺菲巴斯德（法国里昂）开发了最先进的授权登革热疫苗，名为Dengvaxia。这种登革热疫苗是四价嵌合体，使用Vero细胞作为基质，已获得在墨西哥和菲律宾进行临床研究的授权。四个登革热血清型的匹配序列被替换为YF17D黄热病病毒prM/E RNA，以开发相应的疫苗（图2）。这种潜在的疫苗对所有DENV血清型都具有免疫调节作用，并且可能为1、3和4型提供保护。在泰国进行的这种特定疫苗的第二阶段研究报告显示，对DENV-3和DENV-4血清型的效力高，对DENV-1的活性适中，没有对抗DENV-2感染的潜力。此外，在亚太地区和拉丁美洲五个国家进行了两个第三阶段试验。结果清楚地表明，疫苗对DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的效力分别为50.3%、42.3%、74.0%和77.7%，并且其对登革热相关临床指标和住院的平均效力为56.5%。这些数据需要进一步评估Dengvaxia疫苗的效力和保护。疫苗刺激的免疫持续时间长达四年，但效力受到诸如病毒血清型、年龄和个体登革血清状态等多种因素的影响。据报道，超过九岁的血清阳性受试者通过CYD-TDV获得了决定性的保护。根据世界卫生组织战略咨询小组的建议，血清阴性患者不应接种疫苗，因为通过CYD-TDV疫苗接种增加了严重登革热的风险。对于血清状况的评估，作为金标准的空斑减少中和试验需要不同的技术和实验室设施。 图2 构建减毒活体嵌合黄热病-登革热疫苗。将黄热病疫苗病毒株17D的cDNA骨架中的prM和E蛋白基因替换为异源DENV血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4）的基因，以创建这些嵌合黄病毒疫苗。 与细胞培养中的常规减毒相比，分子克隆支持的四价登革热疫苗方法具有显著优势。这些包括减毒的分子解释和减少意外因素的威胁，这两者都将降低与产品质量保证相关的成本。 2.1.2.减毒活体rDEND30疫苗 基于将减毒活体四价疫苗（LATV）与DENV单价疫苗结合的杰出研究已经进行。由于黄病毒基因组的3'-UTR对RNA复制至关重要，因此被选为焦点。 根据Durbin的说法，在接种疫苗后的第28天，血清中和抗体滴度增加到七倍或更多（平均滴度=1:580），这被认为是可接受的耐受性。通过化学突变从rDEN4D30获得rDEN-4D30 NS3-S158R是一个巨大的成功。 相反，TV003疫苗结合了四种减毒重组登革热疫苗（rDEN1D30, rDEN2/4D30, rDEN3D30/31, 和 rDEN4D30），显示出比CYD-TDV更高的对DENV-2的抵抗力。据报道，TV003在试验对象中91.7%的人中产生了针对每种DENV血清型的抗体，并且保护DENV-2的能力高于CYD-TDV疫苗，仅表现为轻微的皮疹作为不良反应。一个比较性的第一阶段临床试验显示，TV005与TV003相比，结合了更多的DENV-2减毒病毒组分。通过TV005的单次疫苗接种，在90%的疫苗中产生了相对平衡的免疫反应，而TV003疫苗接种仅在76%的受试者中产生了免疫反应。TV003和TV005与其他LATVs（TV001–TV005）相比，刺激了与中和抗体成比例的生产，因为这些疫苗具有不同的病毒颗粒结构、感染力和免疫原性。 然而，产生一种同时对每个血清型产生免疫反应并减毒每个单价组分的LATV可能具有挑战性。 2.1.3.减毒活体嵌合四登革疫苗 为了生产减毒活体嵌合四登革疫苗，首先改变了DENV-2, PDK-53的遗传代码，并包含了DENV-1、DENV-3和DENV-4的编码序列。最后，通过将重组RNA转移到Vero细胞中，产生了潜在的候选疫苗DENVax。目前，这些疫苗正在进行临床试验。然而，在AG129小鼠中的研究表明，由PDK53免疫母亲所生的后代的免疫效果可能会受到母体抗体的干扰。减毒活体疫苗对9岁以上的后代具有明确的保护性。由于DENVax具有高度的免疫遗传耐受性，很难从它那里引发系统反应。 2.2.灭活病毒疫苗 另一种保护措施可能是灭活疫苗，它包含来自病毒或细菌的灭活物质（图3）。S16803是DENV-2灭活疫苗的一个例子，它是通过甲醛灭活和蔗糖离心工艺生产的。在Macaca mulatta中使用三种不同类型的疫苗评估了免疫原性：一种重组亚单位蛋白疫苗（R80E）、一种减毒活疫苗（DENV-2 PDK-50）和一种灭活疫苗（S16803）。结果显示，只有DENV-2 PDK-50产生了稳定的抗体滴度。使用四价纯化甲醛灭活疫苗（TPIV）或四价DNA疫苗（TVDV）初次免疫恒河猴，然后使用四价减毒活疫苗（TLAV）显示了与单独使用疫苗相比，对DENV的体液免疫反应的刺激。其潜在机制是：最初TPIV帮助所有四种血清型的抗体滴度达到一定高度，然后TLAV增强了免疫。 图3 灭活病毒疫苗。野生DENV通过在实验室中应用热或化学方法使其无法在体内复制或引起疾病。身体对由这些灭活病毒制成的疫苗产生抗体。 应用灭活病毒疫苗相当具有挑战性。这是因为这些疫苗只表达病毒基因组负责结构蛋白的部分，使它们无法刺激对NS蛋白的免疫。为了在血清阴性受试者中获得最佳免疫原性，可能需要添加佐剂，这反过来可能会增加疫苗的成本和反应原性。另一个缺点是，为了确保长期免疫，需要多次加强剂量。 相比之下，由于它们不能变成更具病原性的表型，并且在结合时不太可能相互作用，灭活全病毒疫苗具有优势。此外，已经证明灭活黄病毒疫苗可以诱导细胞介导和体液免疫反应。 2.3.重组亚单位疫苗 为了制造登革热抗原，尤其是E蛋白，以创建亚单位疫苗的候选物，使用了多种表达技术。真核或原核细胞经常表达这些抗原蛋白，以引发持久的防御或治疗性免疫反应（图4）。 图4 重组亚单位疫苗。由作为抗原诱导宿主免疫的纯化病毒蛋白组成的亚单位疫苗的构建。亚单位疫苗的修改形式是病毒样颗粒（VLP）疫苗。VLP是由一个或多个蛋白质组成的实体，类似于真正的病毒，但没有病毒基因组。观察到在这些疫苗接种后，T细胞和B细胞产生了有效的免疫反应。 已经证明，来自大肠杆菌的重组包膜蛋白域III（EDIII）在小鼠中有效地诱导产生针对所有登革热血清型的抗体。此外，也报道了这些抗体保护哺乳小鼠免受感染。一种与重组登革热蛋白结合的脂蛋白消除了使用佐剂，并显著激发了对所有血清型的免疫反应。在这里，脂蛋白是完整细菌的主要元素，通过螺旋体中的CD14依赖途径激活单核细胞，并在决定螺旋体的促炎潜力中发挥重要作用。一种名为EDIII-P64K的四价登革热疫苗含有表达来自不同DENV血清型的EDIII和来自脑膜炎奈瑟菌的P64K的佐剂。接受疫苗三次的小鼠，产生了高水平的DENV1-3和低水平的DENV-4抗体。此外，使用大肠杆菌表达DENV1-2 EDIII与DENV3-4 EDIII通过Gly-Ser连接体结合，接受这种疫苗组合的小鼠成功地发展了对所有DENV血清型的防御。通过使用来自大肠杆菌的热不稳定肠毒素B亚基（LTB）和合成的共识登革热包膜域III（scEDIII），生产了融合蛋白LTB-scEDIII。通过口服途径免疫细胞自由提取物（CFE）和重组酵母细胞（rYC），观察到粘膜和系统性体液免疫反应。与rYC相比，CFE的中和抗体浓度更高。V180被认为是另一种由昆虫细胞衍生的截短蛋白DEN-80E制成的潜在亚单位疫苗。用这种疫苗免疫小鼠和恒河猴，显示出显著的免疫保护作用，且剂量很低。此外，V180免疫可以保护恒河猴免受病毒血症。一项研究表明，转基因植物和中国仓鼠的卵巢细胞被用来生产含有聚合免疫球蛋白G支架和DENV共识域III（cEDIII）的蛋白。该蛋白在小鼠中诱导大量产生IgG抗体，具有DENV-2中和能力。重组亚单位疫苗的优点是它们可以诱导针对所有DENV血清型的平衡免疫反应，并与减毒活疫苗相比减少ADE效应的发生率。然而，缺乏翻译后蛋白质处理可能会引发与抗体和其他蛋白质固有反应不同的蛋白质生成。 2.4.病毒载体疫苗 腺病毒、阿尔法病毒和牛痘病毒是用于以疫苗配方形式传递登革病毒抗原的一些常见载体（图5）。由于DENV-4蛋白（prM、E、NS1和NS2A）在抗西多福韦的牛痘（WR）菌株中的效率不够，为了增加保护性，整个牛痘病毒或C末端截短的病毒被重组以产生DENV E蛋白。基于无害的、改变的牛痘安卡拉（MVA）病毒，创建了MVA-DENV2-80%E和MVA-DENV4-80%E。尽管早期病毒在恒河猴中仅轻微诱导DENV-2抗体，但这些病毒可以在小鼠模型中产生大量的抗E抗体。 图5 病毒载体疫苗。由病毒遗传物质的一小段组成，包含目标蛋白的指令。另一种经过基因改造而无法在人体中复制自身的病毒，将基因安全地传递给宿主细胞，以产生对入侵者的免疫力。 在开发重组复制缺陷腺病毒（rAd）时，一些因素如基因操作简便、蛋白表达水平高和方便识别基因复制缺陷是必不可少的。疫苗通过腹腔内途径给小鼠注射，并成功刺激了通过DENV-2的E蛋白产生的DENV-2抗体和特定的T细胞免疫。此外，最初注射了rAd的小鼠随后接受了表达EDIII的DNA疫苗的加强，显示出对DENV-2和DENV-4感染的防御。另一个潜在的药剂是双价复合腺病毒（cAd）载体疫苗，例如cAdVaxD（1–2）和cAdVaxD（3–4）。恒河猴在接受DENVs的prM和E后，发展出针对所有DENV血清型的抗体以及T细胞免疫反应。委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）复制子颗粒（VRP）是针对DENV的阿尔法病毒载体疫苗，它们在单剂量疫苗中表达大量抗原。表达DENV-1蛋白如M和E的VRP在猕猴中诱导防御性抗体。另一方面，DENV-2 VRP产生了IgG和针对DENV-2的中和抗体。尽管prM-E-VRP和E85-VRP都能在恒河猴中产生针对特定血清型的抗体，但E85-VRP针对EDIII产生的抗体更快且浓度更高。鉴于它为猴子提供了平衡的免疫反应并使它们对DENV1-4安全，四价E85-VRP登革疫苗可能是克服血清型干扰的重要工具。即使在单次新生儿剂量后，VRP疫苗也发展出强大的免疫力，尽管其强度并不像成年小鼠那样均匀。病毒载体疫苗被认为对细胞免疫有最大的影响，并可能引发更大的体液反应。与不同的病毒载体疫苗相比，腺病毒载体更适合简单的基因改变、识别复制过程中的异常，以及提高抗原表达。 2.5.DNA疫苗 DNA疫苗可以定义为编码特定抗原的质粒，这些抗原被注射到生物体内后表达出来，从而触发免疫反应。在接受TVDV（四价DNA疫苗）后，小鼠和猴子体内成功产生了中和抗体。将包含结构蛋白prM和92%的DENV-2 E蛋白的皮内DNA疫苗注射到BALB/c小鼠体内，产生了预期的抗体（图6）。表达prM和100% E蛋白（ME100）的DNA疫苗比只表达80% E蛋白（E80）的疫苗更有效地诱导抗体。在人体试验的第一阶段中，D1ME100的安全性和良好的耐受性得到了证实，仅有轻微的不适或注射部位的疼痛作为副作用。高剂量组中只有41.6%的疫苗产生了中和抗体，而低剂量组中没有反应。 图6 DNA疫苗。使用PCR或合成方法获得所需的基因序列。为了促进宿主体内的T细胞和B细胞介导的免疫，将这个序列酶法引入质粒骨架的多克隆区域，提纯后在接种点进行接种。 根据Porter等人的研究，DENV-2 prM/E联合CpG基序在防御上优于单独的DENV-2 prM/E。还有报道称，由DENV-2 DNA疫苗表达的重组DENV-2 EDIII和大肠杆菌麦芽糖结合蛋白（MBP）负责触发产生中和抗体。在恒河猴上使用DENV-2 prM/E DNA疫苗（D）、DENV-2 EDIII和MBP重组融合蛋白（R）以及纯化的灭活病毒颗粒（P）进行的比较研究表明，联合使用而不是单独使用时，抗体水平更高，中和作用更强。在DR/DR/DR、DP/DP/DP和R/R/R疫苗接种中观察到最高的抗体滴度，而D/D/D疫苗接种显示最少。然而，仅用P接种的动物显示出对病毒血症的显著免疫保护。使用众多导向蛋白靶向免疫系统，增强了疫苗的保护作用。开发针对DENV-2 prM/E DNA疫苗的免疫原性反应的一种方式是通过将抗原序列整合到溶酶体膜蛋白中，并与抗CD4抗原一起，从而增加T细胞的合成，这导致MHC II类抗原的增强产生。另一种诱导对目标抗原的强免疫的方法是通过将抗原与选择性针对树突细胞内吞受体（DEC205）的单链Fv抗体（scFv）融合。为了评估TVDV、TPIV和TLAV免疫的有效性，使用了恒河猴。只有接受TVDV/TVDV/TLAV处理的猴子勉强受到保护，而接种TRIV/TLAV的猴子则完全没有病毒血症。一项I期临床研究证实，TVDV与一种名为Vaxfectin®（Vical, Boulder, CO, USA）的佐剂同时使用，可以安全地诱导抗登革热T细胞IFN反应。尽管DNA疫苗具有稳定性、易于准备、成本效益高以及适合大规模生产等优点，但它们需要增强免疫原性。幸运的是，可以通过采取诸如使用替代传递策略、有希望的启动子、多剂量系统以及与佐剂联合免疫等措施来解决这个问题。 3.针对登革热的新免疫策略 尽管已有多种DENV疫苗获得批准或正在进行临床试验，这些疫苗针对的是病毒结构蛋白或DENV病毒体，但仍有许多安全问题需要解决。传统开发无误登革热疫苗的方法受到与登革热发病机制相关的几个问题的挑战，包括ADE效应的危险以及跨反应性T细胞在疾病进展中引发的致病性。鉴于此，除了用于登革热疫苗开发的常规方法外，DENV增殖和生命周期的几个独特方面可能成为尖端疫苗配方的焦点。 为了预防登革热疾病，应该考虑采用基于DENV NS1的疫苗和基于蚊子的免疫方法等新概念。除了这些，考虑到mRNA COVID-19疫苗在大流行期间的成功，mRNA疫苗可能是一个有希望的选择。 3.1.基于NS1蛋白的策略 NS1糖蛋白由一个六聚体和一个二聚体组成，是糖基磷脂酰肌醇（GPI）的膜锚定型。感染者血清中NS1蛋白的释放量通常在70到15,000 ng/mL之间，而在特殊情况下，可达到50,000 ng/mL。作为细胞外成分，我们可以利用NS1作为潜在的疫苗候选物。根据Henchal的研究，通过抗NS1抗体在小鼠中实现了对DENV的被动免疫。另一方面，有报道称，通过主动腹腔内或皮下途径免疫重组NS1蛋白，部分保护了小鼠。两项研究报告称，NS1完全阻止了登革热介导的血管渗漏，同时作为增强血管通透性的关键因素。此外，缺乏干扰素受体的小鼠，免受DENV-2致命影响。NS1免疫的一个有希望的替代方案是使用由DENV-2蛋白E、NS1的N端以及金黄色葡萄球菌蛋白A组成的蛋白组合进行免疫，这可能通过产生抗DENV-2抗体来保护小鼠。 可以使用重组DNA质粒开发基于NS1的疫苗。这些DNA质粒通过产生细胞因子、DENV prM、NS1、E和大鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，据报道可以保护小鼠免受致命的脑内DENV-2挑战。Costa等人还报告说，用包含DENV-2 NS1的重组质粒pcTRANS1进行脑内接种的小鼠显示出有希望的结果。另一项在小鼠中进行的研究表明，NS1特异性体液和细胞免疫反应，导致麻痹发展迟缓以及在致命DENV-2静脉挑战后生存时间显著延长。 尽管编码DENV-2或DENV-4 NS1的重组疫苗病毒为BALB/c小鼠提供了部分保护，但一些研究表明NS1抗体可能加剧登革热发病机制。这是因为它们与宿主蛋白的交叉反应，导致内皮细胞的凋亡受阻并触发血小板聚集。鉴于这些问题，需要进一步对NS1疫苗进行安全性和有效性测试。 3.2.基于阻断感染传播的策略 为了解决登革热的传播问题，我们必须紧急实施所有必要的措施。为此，需要通过宿主特异性疫苗减少感染媒介的数量。疫苗的设计应针对环境中病原体的生命周期，以控制疾病。通过关注病原体用来侵入脊椎动物和无脊椎动物宿主的机制，我们可以阻断它们的途径。例如，针对疟原虫物种的配子体，可以减少在蚊子肠道中持续存在的病原体数量，从而降低微生物传播效率。 免疫接种针对特定的蚊子C型凝集素（mosGCTLs），这些凝集素与DENV-2病毒相遇并感染埃及伊蚊，有可能停止DENV的生命周期。研究还表明，针对几种mosGCTLs的抗血清组合可以显著降低餐后登革热感染。另一项研究发现，通过特定抗血清或RNAi阻断富含半胱氨酸的毒液蛋白（CRVP379），延缓了埃及伊蚊中的DENV污染，这可以被视为控制登革热疾病的有希望的预防和治疗作用。将免疫接种与DENV相关的蚊子易感变量结合起来，可能是开发预防登革热传播疫苗的一个合理概念。 3.3.登革热mRNA疫苗开发进展 为了开发mRNA疫苗，科学家们通常对mRNA的自然结构进行修改。Wollner Clayton团队也采用了同样的方法来开发登革热疫苗（图7）。他们首先使用假尿苷将DENV-1膜和包膜结构蛋白（prM/E）转录成修饰的mRNA，然后将其包装成脂质纳米颗粒（LNP）。然后，mRNA-LNP复合物被肌肉内注射，肌肉细胞通过内吞作用摄取后，LNP被降解，留下mRNA用于进一步翻译病毒prM/E蛋白。在研究的小鼠中，病毒多聚蛋白随后引发了针对特定血清型的免疫反应。另一组使用相同的mRNA疫苗技术，针对DENV-2的prME、E80和NS1。在这种情况下，他们将mRNA核苷修饰为1-甲基假尿苷-50-三磷酸（1 my）。这种候选疫苗在小鼠中诱导产生了针对DENV-2的中和抗体，并触发了T细胞免疫反应。 图7 mRNA疫苗作用机制的示意图；mRNA进入细胞，载体留在细胞外，并被翻译成病毒抗原。然后这些抗原被分泌到细胞外，触发抗体的产生。 上述两种疫苗目前都处于初期阶段，但有望在未来的临床试验中获得批准。下表（表1）总结了登革热疫苗开发阶段。 4.总结和未来展望 目前，登革热是影响全球热带和亚热带地区国家的最紧迫的虫媒病毒疾病。传统的疫苗方法，如减毒活疫苗、重组亚单位疫苗、灭活病毒疫苗、病毒载体疫苗、DNA和mRNA疫苗，已经开发出来，以防止所有登革热血清型在人类中的传播。这些策略主要通过培养对DENV病毒体或致病病毒表面展示的包膜蛋白的防御来工作。四价减毒活疫苗在人体中有效诱导了中和抗体，但它们缺乏中和DENV-2病毒的能力。此外，接种了减毒活疫苗DENVax的雌性小鼠会影响其后代的疫苗接种结果。重组亚单位疫苗虽然针对所有血清型引发了平衡的免疫反应，但存在内毒素污染和不正确的蛋白质折叠问题。腺病毒载体疫苗提供了许多好处，例如基因修饰的便利性、检测基因复制错误的效率以及高水平的蛋白表达。此外，阿尔法病毒载体登革疫苗在小鼠中仅需一剂新生儿免疫接种即可引发强大的免疫反应。另一方面，DNA疫苗极其稳定、经济且方便生产；然而，低免疫原性限制了它们的使用。在疫苗接种策略方面，成功的动物保护涉及使用各种疫苗组合进行初次免疫和加强免疫接种。 计算进步，包括免疫信息学的进步，可以促进改进的登革热疫苗设计策略。这些方法可能包括在识别抗原位点、病毒蛋白的结构建模、分子对接实验和分子拟态方面的改进。通过检查不同的血清型并预测登革热基因组的不同部分随时间演变的可能性，可以实现针对更多登革热病毒血清型的改进效力的疫苗。 除了NS1，其他NS蛋白包括NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。有可能通过生化测定评估NS3和NS5的活性来开发抑制剂，但还没有化合物进入临床研究。另一方面，NS2A、NS2B、NS3、NS4A和NS4B不保留任何酶活性。此外，这些蛋白的结晶挑战和动态特性也阻碍了它们的结构研究。 鉴于当前疫苗对登革热的零碎效力，我们强烈主张未来的疫苗开发将mRNA、基于NS1的和基于蚊子的免疫接种等尖端疫苗概念与传统疫苗结合起来，以提高其对人类登革热感染的安全性和效率，同时最小化蚊子传播并有效减少环境中DENV的存在。 目前疫苗研发仍然面临着一些挑战，如多种重要的病原体尚无有效疫苗、病原体的变异不断出现需要通用型疫苗等。为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 转发分享福利：疫苗研发企业、科研院校和监管机构人员，前30位报名人员转发分享会议信息可免费参会（不含餐饮）报名后，扫描下方二维码加工作人员微信后，发送截图即可。 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 大会日程 已经确定的报告人 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。