从细胞株筛选到细胞培养：构建高效高产细胞株

2024-05-25

近年来生物医药产业发展热度急剧上升，生物创新药也在不断迭代、发展、突破。目前各大药企仍在致力研发新一代生物创新药产品如细胞与基因治疗、抗体药物等，但无论是抗体药物的生产还是基于病毒载体的基因治疗药物的制备，都离不开稳定高效的细胞株。细胞株构建是生物药研发-生产-上市的征途之始，同一个细胞株将伴随产品的整个生命周期，细胞株的优劣直接决定生产成本和产品质量，有效地加速开发过程对于推动全球生物医药创新极为关键。因此，开发流程中每个步骤都涉及复杂而精细的分析和质控工作，以确保后续的工艺开发及放大、质量控制等环节一片通途，能够成功进行商业生产。优良细胞株标准优良细胞株不仅能显著增加单位体积产量，降低产品的生产成本，并且还可以降低下游纯化过程的复杂度，确保获得安全，高品质的生物制品。产量高，开发周期短，可以直接降低固定投资和单次生产成本；产品质量符合要求，这将直接影响药效和安全性；稳定性，产量和质量在生产传代过程中不应有大的改变；与生产过程的相容性，细胞株需要适合大规模生产放大；合规，细胞株的构建过程应避免接触或使用动物来源成分或其它可能影响安全性的成分；可追溯性，保证整个过程的实验记录完整。细胞株开发流程开发稳定细胞株的过程通常始于将所需的质粒转染至选定的宿主细胞，一般是CHO或HEK 293细胞。转染后，研究人员筛选和定量分析高表达的细胞克隆。一旦检测到这些高产细胞株，便进一步对这些细胞和其产生的蛋白质进行验证。细胞株开发一般流程如下：细胞株开发关键考量因素细胞株开发周期长、难度大，每一步都很关键，在质量和产量方面有诸多挑战，在早期流程开发过程中提高对关键考量因素的认识，有助于降低失败风险，减少重复流程的相关费用，加速项目进度。（一）细胞培养。细胞培养是细胞株开发的基础，无论是细胞转染、高通量克隆筛选、培养基优化、还是抗体表达，都需要在细胞培养的基础上完成细胞生长状态的检测，其中包括活细胞密度（VCD）和活率（Viability）检测。通过检测结果将细胞密度和活率达不到要求的细胞排除掉。最终，从数以千计的克隆细胞中筛选到稳定高产的单克隆细胞株。细胞培养是一个长流程，精细的工作，面临着难以避免的细胞污染使得实验结果不稳定、细胞营养不足或过载难以保证细胞健康生长等难题，这就要求操作人员需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活，确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度。因此，细胞计数是一项基本功，高效准确的细胞计数可以提高实验的精准度和可重复性。（二）在大量的克隆中快速筛选得到理想的基因敲除单克隆细胞株一直是一个难题，传统的检测的方法是采用抽样检测法进行检测，首先挑选一些克隆进行Sanger测序，根据测序结果进行次级筛选，然后挑克隆测序，根据结果再次筛选，最终得到基因敲除单克隆细胞株。传统的挑斑筛选的统计方法，因人为取样的随机性而影响编辑效率数据的准确；同时存在漏挑的可能性，影响整体实验时间，费时费力。而且对于数据追踪要求很高，需保证得到的数据结果高效且稳定避免人为导致的记录错误。（三）合规性。不论是FDA还是NMPA，在IND阶段对宿主细胞的来源证明都有明确要求，通常需要提供从商业机构购买的宿主细胞CoA、合同、发票，在机构内的细胞的培养、改造、筛选建库历史及使用试剂等文件。如果是非商业机构来源，需要提供相关研究机构的声明、报关单、物流单据等证明来源真实合法。细胞的单克隆源性验证在确保生物制药产品的纯度和均一性上至关重要，FDA的政策和法规都强制要求生物制药企业提供清晰图片证据以证明单克隆抗体研发过程中的单克隆源性。（四）双抗更为复杂的表达体系和结构导致大量新型杂质的形成：包括与双抗结果类似的错配产物、抗体片段、大分子聚合物等。分子设计（序列设计、成药性评估）、细胞株开发及上游工艺开发、下游纯化工艺开发以及分析方法开发都缺一不可。为解决细胞株开发过程中的各种难点，5月29日19:00-20:45，药融圈邀请到皓阳生物细胞株开发负责人唐慧娴和贝克曼库尔特生命科学高级应用专员姚金龙做客药融云端直播间，针对大批量克隆筛选、无法预测的基因表达、早期表征分析和优化以及可扩展性、细胞株稳定性等问题“对症下药”，就细胞株开发常规流程及关注点进行交流分享，从细胞样品的制备、检测方法的验证、仪器的状态和性能检测等多个方面排查可能导致测试结果出现偏差的原因，助力细胞株开发技术实现更大的突破。