增强ADCC/ADCP效应的三种技术策略

2023-06-25

抗体药物偶联物细胞疗法

从抗体作用机制来讲，抗体由抗原结合部位(Fab)和可结晶部位(Fc)构成。Fab段可以与特定的抗原结合，由此决定抗体的特异性和亲和力；Fc段可以与免疫细胞表面表达的Fc受体(FcγRI，FcγRII，FcγRIII)、血液中的补体(C1q)和FcRn结合，从而激活免疫效应细胞清除外来物。抗体的结构决定其作用机制，Fab段可以识别游离分子和细胞表面的受体，决定抗体识别的特异性和亲和力；而Fc段决定抗体的效应功能，包括抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)，抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）和补体依赖的细胞毒性作用(CDC)。Fc受体具有影响抗癌抗体功效的潜力，当其与抗体Fc段结合后，可以激活抗体依赖的细胞毒性（ADCC）和抗体依赖的细胞吞噬作用（ADCP）。不同的免疫细胞表达特定的Fc受体，如中性粒细胞通常表达FcγRI、FcγRII、FcγRIIIb，而NK细胞只表达FcγRIIIa。FcγRIIIa通常认为是引起ADCC的关键受体，所以虽然NK细胞、单核巨噬细胞和中性粒细胞都可以产生ADCC作用，但是NK细胞被认为是最重要的细胞种群。ADCP是由吞噬细胞，如巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞介导的，该效应是由抗体与相应的激活性FcγRs相互作用诱发的。通过工程化改造提高抗体Fc段与具有激活效应的FcγRs的亲和力能够增强ADCC/ADCP的效应功能。改造策略主要包括：Fc糖基化改造，定点突变和Fc段多聚化。策略一：Fc糖基化改造抗体重链的N297位的糖基化在Fc效应功能方面具有重要的作用，此位点的糖基化可以影响Fc受体和C1q对Fc的结合，从而影响相应的细胞效应。在IgG型的抗体中，N297的糖基化核心主要是由N-GlcNAc和其它糖共同组成，其中岩藻糖化的GlcNAc最为常见，而岩藻糖的存在会通过空间位阻阻碍Fc与受体FcγRIIIa的结合，从而减弱ADCC效应，因此，去除岩藻糖可以增强FcγRIIIa与Fc的结合并增强ADCC效应。早期研究发现，当用过表达GnTIII酶CHO细胞表达IgG抗体时，能得到低岩藻糖化的抗体，从而导致ADCC效应的增强。后续瑞士的生物公司Glycart以此方法开发了GlycoMab®平台，随后此平台几经辗转到了罗氏手中。另外一种通过工程化降低抗体岩藻糖水平的方法是利用基因工程的手段敲除宿主细胞的FUT8基因。在哺乳动物细胞内岩藻糖与抗体Fc端上的氨基葡萄糖通过一个α-1,6糖苷键结合，这个糖苷键由FUT8基因编码的α-1,6-岩藻糖基转移酶催化形成。敲除FUT8基因可以完全消除抗体Fc端的岩藻糖，从而提高单抗药物的ADCC作用。日本BioWa公司的POTELLIGENT®技术平台就是通过敲除FUT8基因构建的ADCC增强型宿主细胞平台。后续通过对岩藻糖修饰的进一步细化研究，发现多种酶参与此过程，通过对这些酶的敲除诞生了一系列抗体表达工程细胞株（表1）。目前，通过上述岩藻糖技术提高ADCC功能的抗体有两个已经获批上市，为靶向CCR4的Mogamulizumab和靶向CD20的Obinutuzumab。表1、通过糖工程化细胞生产低岩藻糖化的抗体策略二：定点突变基于Shields等人的研究，多个研究团队通过在Fc的相关区域引入氨基酸突变以增加ADCC和ADCP效应。Shields等人设计了包含S298A/E333A/K334A三个位点的组合突变，在IgG和IgE中，这些突变显示增强了Fc与FcγRIIIa的结合力，同时对FcγRIIb结合力减弱。一些团队还采用了基于结构的计算模型并结合高通量筛选，以确定能够增强Fc效应的氨基酸突变。例如，抗CD52抗体Alemtuzumab，当其进行S239D/I332E 或S239D/A330L/I332E突变时，发现其与FcγRIIIa和 FcγRIIb的结合亲和力都有所提高。研究发现这两种突变很大程度的提高了ADCC效应，而且ADCP效应也有微弱的提升。G236A/S239D/A330L/I332E或者是G236A/A330L/I332E突变也可以显著的增强Fc与FcγRIIa和FcγRIIIa的亲和力，而两者相比，后者对抑制性受体FcγRIIb的结合力相对较弱。体内研究表明，带有G236A/A330L/I332E突变的CD20抗体显著增强对CD20+B细胞的清除能力。但是在稳定性方面，该突变与野生型抗体相比具有较低的溶解温度（~55℃ vs ~68℃），并且其半衰期也相对较短，这可能是因为G236A/A330L/I332E突变导致抗体稳定性降低。S239D/A330L/I332E也存在稳定性降低的问题，该突变与野生型抗体相比Tm值下降了21℃。F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L突变是一种通过酵母展示技术筛选获得的氨基酸突变，其在增强Fc对FcγRIIIa亲和力的同时降低了对FcγRIIb的结合力，进而到达增强Fc效应功能的目的。随后的研究做了进一步的改进，用L235V替换了V305I，从而降低与FcγRIIb的亲和力。目前已经有含有L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L突变的抗体Margetuximab获批上市。与S239D/A330L/I332E和G236A/A330L/I332E相比，L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L突变抗体的热稳定性更接近于野生型Fc。临床前猴子体内的PK实验显示，与含野生型Fc的Her2抗体相比，Margetuximab的半数期缩短20%，1/3的实验动物出现ADA，不过在随后的临床研究中，未见明显ADA，抗体的PK也未受影响。FcγRIII与Fc复合物的共晶结构表明，Fc与Fcγ RIII不对称结合，两条Fc链通过利用不同的残基接触FcγRIII的不同区域，为了充分探索Fc-FcγR相互作用的这种不对称性质，来自安进的研究人员以Fc异二聚体的形式筛选了9000多个克隆，这些克隆在两条Fc链的同一位置引入了不同的突变，最终，确定了一组与FcγRIIIa结合显著改善的新型Fc变体，这些突变体能够显著增强抗体与FcγRIIIa的亲和力（表2）。与早期发现的一些对称突变相比，这些突变没有显著降低抗体的热稳定性（表3）。表2、不同Fc段组合突变体与人FcγRIIIa的结合活性比较表3、对称突变和非对称突变Fc与FcγRIIIaF158的亲和力以及Fc段的Tm值去岩藻糖化和定点突变这两种方法均能有效提高抗体的ADCC和ADCP功能，那么这两种方法能否进行组合从而进一步提高ADCC和ADCP效应呢？日本BioWa公司的研究显示在去岩藻糖化的基础上进一步突变S239D/A330L/I332E能够明显增强抗体与FcγRIIIa的亲和力，但是没有看到ADCC效应的明显增强。随后，安进公司的研究显示非对称的Fc突变（A330M+K334V/L234Y+Y296W）与去岩藻糖化具有协同作用，能够进一步增强Her2抗体的ADCC效应，从而产生更好的抗肿瘤效果（图1）。南开大学张宏恺团队也做了类似的研究，不过他们采用的是对称结构的Fc突变（H268E/K326S/I332E），也显示与去岩藻糖化具有协同作用。但是目前含有这些组合的抗体还未进入临床研究阶段，在人体内的疗效还未知，是否会导致抗药抗体的产生也需要进一步的研究证实。目前通过氨基酸突变提高ADCC功能而获批上市的抗体有Morphosys公司靶向CD19的抗体Tafasitamab和MacroGenicsg公司的靶向Her2的抗体Margetuximab。图1、非对称FC突变与去岩藻糖化修饰能够协同增强抗体的ADCC功能下表汇总了一些可增强Fc效应的氨基酸突变组合。表4、增强Fc效应功能的氨基酸突变组合策略三：Fc段多聚体和糖基化改造，定点突变相比，增加IgG1的Fc段数量，使一个IgG1带有多个Fc段，结合多个FcγRIIIa，增强ADCC作用，显得更加的直接。此技术目前有两家公司在进行尝试，momenta公司的SIFbody和Roche的DuoMab，这两种抗体的设计思路如下图（图2）：图2、通过Fc段多聚化的结构示意图总结 ADCC和ADCP是抗体药物杀伤抗原阳性细胞非常重要的手段，这两种方式均需要抗体与效应细胞上的Fc受体结合，从而介导效应细胞对靶细胞进行杀伤。通过糖基化改造和定点突变均能明显提高抗体Fc段与Fc受体结合的亲和力，从而提高ADCC和ADCP效应。目前，通过去岩藻糖技术和定点突变技术提高ADCC功能的抗体分别有两个已经获批上市（表5），Fc多聚化技术目前还处于早期研发阶段，未有进入临床的品种。表5、通过Fc工程化进入临床后期开发阶段的抗体参考文献：1.Rena Liu, Robert J Oldham, Emma Teal, et al. 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