国产与进口无血清培养基和重组胰蛋白酶规模化培养Vero细胞效果的比较

2023-03-03

疫苗临床研究临床结果

中文摘要目的比较国产物料与进口物料对Vero细胞的培养效果及消化效果，以判断国产物料VirusPro® VP无血清培养基（serum-free medium，SFM）（干粉）和Trpzyme重组胰蛋白酶是否适用于规模化Vero细胞培养。方法选取国产物料VirusPro® VP SFM（干粉）和Trpzyme作为实验组，选取进口物料粉剂VP SFM和TryPLe Select作为对照组，在T瓶、10层细胞工厂（10-layer cell factory，CF10）和CF40连续规模化生产中，对特定代次、特定传代规模分别进行独立样本t检验，比较总消化时长、细胞收获密度和细胞存活率。结果各代次中，国产物料组与进口物料组的细胞生长状态均相似且良好。T瓶、CF10和CF40传代的独立样本t检验结果显示，虽然国产物料组的T瓶、CF10、CF40总消化时长（17.33、19.17、19.17 min）均分别大于进口物料组（9.17、16.33、17.42 min），但仅T瓶总消化时长差异具有统计学意义（t=-5.58，P＜0.05）。两组间细胞收获密度及细胞存活率的差异均不具有统计学意义（P>0.05），T瓶传代阶段的细胞收获密度（进口物料组：3.03×106 ml-1；国产物料组：3.11×106 ml-1）均高于CF10（进口物料组：1.22×106 ml-1 ；国产物料组：1.13×106 ml-1）和CF40（进口物料组：9.90×105 ml-1；国产物料组：8.73×105 ml-1）。结论国产物料VirusPro® VP SFM（干粉）、Trpzyme均符合规模化Vero细胞培养所需。正文细胞体外培养是将来自生物机体内的细胞放置于一个模拟体内生长的体外环境中进行培养，达到使其生长、传代、扩增等目的，用于模拟生物机体内环境的各种物质和成分对细胞生长效果的影响极为重要[1]。规模化培养的Vero细胞常用于病毒性疫苗的生产，随着法规要求的日益提高，培养基及消化用胰蛋白酶（胰酶）逐渐向无动物来源的方向发展[2-4]。疫苗生产企业规模化培养Vero细胞大多仍使用进口物料，但国产物料供应商在逐渐增多，国产物料质量标准也在逐步提高。为了降低进口物料断供风险，本研究对部分进口物料开展了国产物料变更预试的规模化生产，对使用国产与进口无血清培养基（serum-free medium，SFM）和重组胰酶规模化培养不同批次Vero细胞生产中相关数据进行分析比较，探讨国产物料替代进口物料规模化培养Vero细胞的可行性。1材料与方法1.1细胞Vero细胞来源于美国典型培养物保藏中心，由武汉生物制品研究所有限责任公司保存。1.2试剂及仪器国产Trpzyme重组胰酶消化液（不含酚红）和VirusPro® VP SFM（干粉）购自上海源培生物科技股份有限公司，进口胰酶替代物TryPLe Select和粉剂VP SFM购自美国GIBCO公司。AE2000倒置显微镜购自麦克奥迪（厦门）电气股份有限公司，HERAcell vios 160i CO2培养箱、Protect-2FD-S超净工作台、ACFM GEN 10细胞工厂全自动操作器和CF Shaker GEN 3细胞工厂振荡器均购自美国赛默飞世尔科技公司，WAS-100细胞工厂显微镜购自日本四国计测工业株式会社，BioWelder Total Containment无菌管道焊接机购自德国赛多利斯公司，Watson-Marlow 630UN/L蠕动泵购自英国沃森马洛集团，细胞培养间定制于成都英德生物医药装备有限公司，细胞工厂专用小车购自北京一恒鑫旺通不锈钢制品有限公司。T瓶（T25、T75、T175）和 10 层细胞工厂（10-layer cell factory，CF10）购自美国 Corning 公司，CF40 购自丹麦NUNC公司。1.3实验方法1.3.1 实验分组对照组：将进口粉剂VP SFM、L-谷氨酰胺加注射用水配制至17.612 g/L，除菌过滤作为细胞培养液，将胰酶替代物TryPLe Select（10×）用含乙二胺四乙酸二钠的PBS稀释10倍，除菌过滤作为细胞消化溶液。实验组：将国产VirusPro® VP SFM（干粉）加注射用水配制至18.200 g/L，除菌过滤作为细胞培养液，将Trpzyme重组胰酶消化液（10×）用含乙二胺四乙酸二钠的PBS稀释10倍，除菌过滤作为细胞消化溶液。规模化培养Vero细胞过程中，待Vero细胞汇合度达到100%后消化，按照工艺流程先后在T瓶（T25、T75、T175）和细胞工厂（CF10、CF40）中连续传代培养。1.3.2 细胞消化及传代待Vero细胞长成致密单层，汇合度达到100%，弃去细胞培养液，加入细胞消化溶液消化，再加入细胞培养液重悬，记录消化时长。按照细胞传代比例稀释细胞悬液后，添加牛血清至体积百分浓度为0.5%~2.0%，再将细胞悬液分装至新的T瓶或细胞工厂中培养，同时取样进行细胞计数。1.3.3 细胞培养根据细胞传代比例，依次在T瓶（T25、T75、T175）和细胞工厂（CF10、CF40）中扩增Vero细胞，进行规模化培养。将T瓶及CF10中培养的Vero细胞置于37.0 °C CO2培养箱内静置培养3~4 d；将CF40中培养的Vero细胞置于37.0 ℃静置培养3~4 d。培养期间每日观察培养上清液及细胞状态，标准：上清液应为橘红色清亮液体，无浑浊，显微镜下观察细胞形态，应为梭状上皮样细胞，贴壁生长。1.4统计学分析应用SPSS 25.0软件，分析6批对照组和6批实验组中特定代次、特定传代规模的单个T瓶（T175）细胞传代、单个CF10细胞传代和单组CF40（装载于同一细胞工厂专用小车的4个CF40为同一组数据）细胞传代的关键参数，以总消化时长、细胞收获密度和细胞存活率作为指标，进行独立样本t检验，评价实验组与对照组间差异。P<0.05表明差异具有统计学意义。绘制6批对照组和6批实验组全部代次的关键参数散点图，分析实验组和对照组物料对规模化培养Vero细胞效果的整体趋势。2结果2.1细胞生长状态每批次Vero细胞在T175中连续培养4代，共计4次细胞传代操作；再在CF10中连续培养4代，共计5次细胞传代，其中最后一代次为两次细胞传代同时进行。培养上清均为橘红色清亮液体，无浑浊。使用相同的倒置显微镜观察T175和CF10，其中CF10观察最底层。显微镜下细胞形态均为梭状，贴壁生长。Vero细胞静置培养3~4 d后，均呈致密单层，细胞汇合度达到100%。图1中对照组与实验组的T175为相同代次，CF10为相同代次，对照组和实验组生长状态无明显差异。2.2细胞消化时长对照组T175培养的Vero细胞总消化时长（9.17±1.47） min 小于实验组（17.33±3.27） min，且差异有统计学意义（t=-5.58，P<0.05），见表1。但两组间细胞收获密度和细胞存活率的差异不具有统计学意义（t值分别为-0.17和0.85，P>0.05），见表1。对照组CF10培养的Vero细胞总消化时长（16.33±3.44） min小于实验组（19.17±2.23） min，细胞收获密度略高于实验组，但两组间总消化时长、细胞收获密度和细胞存活率的t值分别为-1.69、0.99和0.48，P值均>0.05，差异均不具有统计学意义，见表2。对照组CF40培养的Vero细胞总消化时长（17.42±2.61） min 小于实验组（19.17±1.80） min，细胞收获密度略高于实验组，但两组间总消化时长、细胞收获密度和细胞存活率的t值分别为-1.91、1.27和0.40，P值均>0.05，差异均不具有统计学意义，见表3。2.3连续细胞传代的关键参数规模化培养Vero细胞过程中全部代次的总消化时长、细胞收获密度、细胞存活率散点图，分别见图2、图3、图4。细胞制备阶段，两组的细胞收获密度及细胞存活率基本相当，T瓶传代阶段的细胞收获密度整体均高于细胞工厂传代阶段。实验组总消化时长均大于对照组，且T瓶传代阶段的消化时长增长辐度较细胞工厂更大。3讨论现有文献报道中关于国产与进口牛血清、SFM和重组胰酶对Vero细胞培养和消化效果的比较研究，大多为利用生物反应器规模化悬浮培养Vero细胞[5-7]，而贴壁培养Vero细胞的相关研究均为小规模培养，统计分析的批次和连续生产的代次较少[8-9]，本研究统计分析了多批次、连续、规模化培养Vero细胞的关键参数。结果显示，国产物料组总消化时长均大于进口物料组，且二者在T瓶阶段的总消化时长差异具有统计学意义，国产物料的细胞消化用时较长与相关文献报道相符合[8]。另外，T瓶的消化时长增长较细胞工厂更为显著，可能原因为T瓶培养的细胞收获密度整体均高于细胞工厂培养的细胞收获密度，细胞贴壁生长更为致密，使得实验组细胞达到与对照组相同的消化程度，所需用时更长。而细胞工厂培养的细胞收获密度相对较小，细胞消化作用的快慢影响相对较小，两组间的消化时长差异不大。细胞工厂工艺因具有工作效率高、生产成本低、操作安全可控的优势，已广泛地应用于水痘疫苗[10]、麻疹腮腺炎风疹系列联合疫苗[11]、甲型肝炎疫苗[12]、口服轮状病毒活疫苗[8]生产，本研究也使用了这一工艺。由结果可知，在规模化疫苗生产中，虽然应用国产物料上海源培生物科技股份有限公司的Trpzyme重组胰酶消化液（不含酚红）和VirusPro® VP SFM（干粉）相较于使用进口物料美国GIBCO公司的胰酶替代物TryPLe Select和粉剂VP SFM，在Vero细胞培养前期T瓶阶段的总消化时长差异有统计学意义，但相对整个规模化培养过程，这一时间差异是可以接受的，而且细胞收获密度及细胞存活率相当，故认为国产SFM和重组胰酶可替代进口物料，适用于规模化Vero细胞培养，降低生产成本。作者郑嘉唯1 贺韵遐1 皮道健1 程瑛辉1 周英1 熊静怡1 万宇洋1 王硕1 徐健1 朱超1 杨莹1 李菲1 张久威1 王英1 杨晓明21武汉生物制品研究所有限责任公司轮状病毒疫苗室，武汉 430207；2中国生物技术股份有限责任公司，北京 100029通信作者：杨晓明，Email：yangxiaoming@sinopharm.com引用本文：郑嘉唯，贺韵遐，皮道健，等. 国产与进口无血清培养基和重组胰蛋白酶规模化培养Vero细胞效果的比较 [J]. 国际生物制品学杂志，2022，45(6)：325-329. DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20220712-00039