Lanzhou Institute of Biological Products Co. Ltd.

继血制品行业整合大潮后，疫苗公司开始步入整合浪潮。 7月20日，康华生物公告了一纸决定命运的文书。公司控股股东、实际控制人王振滔及其一致行动人奥康集团、股东康悦齐明，拟以65.03元的价格，向上海万可欣生物（简称万可欣）转让合计21.91%的公司股份，总价高达18.51亿元。 同时，王振滔还将剩余持有的8.08%股份对应的表决权独家委托给这家新生企业行使。成立仅12天的万可欣生物由此掌控了康华生物29.99%的表决权，恰好低于30%的要约收购红线。 这意味着，温商“鞋王”王振滔即将正式告别了他一手创办的疫苗公司。一家成立仅12天的企业，也即将接过了康华生物的控制权。这座曾被资本市场热捧的“金矿”，在创始人王振滔手中经营二十年后，即将转入了上海国资的版图。 不过，交易尚需完成对赌条款才能一锤定音。未来两年的业绩，将直接决定康华生物的未来。 01 “皮鞋大王”的疫苗梦 疫苗龙头康华生物的创立，源自“皮鞋大王”王振滔的一次无意邂逅。 2002年，已经依靠奥康皮鞋闯出“温州鞋王”名头的王振滔在一次偶然的机会下，与一个疫苗初创团队进行会面。虽然是生物医药的门外汉，但在听过这个团队的介绍后，商业嗅觉极其敏锐的王振韬立刻察觉：疫苗可能是未来人们健康生活的一个重要保障，具备很大的商机。在得知生物研究团队仅需8000万元就能维持五年研发后，他当即决定投资。 于是，康华生物在2004年诞生了。 但王振滔还是低估了生物医药行业的困难程度。接下来的十年中，康华生物一直默默无闻。转机出现在2014年，康华生物自主研发的冻干人用狂犬病疫苗（人二倍体细胞）正式投产销售，开创了“二倍体狂苗”的先河。 这款疫苗迅速成为康华生物的核心产品，2017年度、2018年度及2019年度，其批签发量为99.51万剂、223.21万剂及237.77万剂，销售收入分别为2.41亿元、5.51亿元、5.38亿元，占康华生物同时期的营收比重均在90%左右。 “二倍体狂苗”的巨大成功，助推康华生物在2020年登陆创业板。上市后公司股价一口气收获20个涨停，不到两个月飙升至每股999元，差一点就成为A股第五只千元股。自此，王振滔的跨界投资被奉为商业传奇。他也真正体会到了生物医药行业“十年不开张，开张吃十年”的神奇之处。 可疫苗资本盛宴背后，王振滔的皮鞋主业却在持续失血。自2013年起，奥康国际业绩逐渐下滑，2019年首次出现扣非净利润亏损，此后一直未能转正。2022年至2024年，奥康国际连续三年亏损。好在疫苗的业绩爆发，也让王振滔以第二曲线及时补充了自己商业帝国的财富。 康华生物在短暂辉煌后也显露疲态，自从2021年到达8.29亿元的顶点之后，康华生物的净利润就呈现持续下滑的趋势。2024年，康华生物营收14.32亿元，同比下降9.23%；净利润3.99亿元，同比下滑21.71%。2025年一季度业绩加速下滑，营收仅1.38亿元，同比下降55.70%；净利润仅0.21亿元，同比暴跌86.15%。 图：康华生物业绩一览，来源：锦缎研究院 两大业务均开始萎靡，王振滔的资金链问题成为市场关注的焦点。截至2025年7月3日，王振滔累计质押所持康华生物股份比例高达89.20%，奥康集团质押比例也达71.91%。资金链的紧张程度可见一斑。 双重压力之下，王振韬选择弃车保帅，实则也符合情理。只不过令人意外的是，挣钱的康华生物成了“车”，亏损的鞋业反被保留。 02 上海国资入局 出售方颇为无奈，而接盘方则踌躇满志。 接盘者万可欣虽为新设企业，但背景却大有来头。股权穿透显示，上海国资委通过嵌套股权关系实现间接持股。具体而言，上海医药集团持有万可欣生物19.79%合伙份额，上海生物医药并购私募基金持有80.21%合伙份额。 图：万可欣股权一览，来源：锦缎研究院 对于此次收购，万可欣生物表示是“基于对上市公司主营业务及内在价值的认可”。但背后更深层的原因，是上海国资企业对疫苗产业觊觎已久。尤其是上海医药作为中国第三大医药商业公司，有覆盖全国31省、2200+区县疾控和20000+接种点的分销网络，在进口疫苗保税仓储、冷链物流等环节具备独特优势。 以往，上海医药只是代理其他企业的疫苗产品。如今，也已经开始频频出手，要介入上游生产和研发环节。2021年2月2日，康希诺与上海三维生物技术有限公司、产业投资基金签订合资合同，建立了上药康希诺。产业投资基金背后的部分股东是上海医药以及其控股股东上海上实（集团）。 如今，将康华生物收入囊中，是上海国资对原有资源序列的补充和加强，也顺应了上海市打造全球生物医药高地的战略规划2024年12月，上海市印发《上海市支持上市公司并购重组行动方案（2025—2027年）》，明确提出设立100亿元生物医药产业并购基金。本次针对康华生物的收购，是该基金设立不到四个月的首单交易，标志着上海国资正式进军疫苗领域。 但国资也并不是甘当冤大头的“接盘侠”。此次收购价格虽然不菲，但却有明确的对赌条款。王振滔及奥康集团承诺：2025至2026年康华生物扣非净利润合计不低于7.28亿元；若未达标，承诺方需现金补偿差额。 此外，这笔收购的资金安排颇为精巧：万可欣生物以自有资金出资7.01亿元，另通过银行并购贷款融资11.50亿元，并以本次收购的部分上市公司股份（不超过本次受让股份的 80%）向银行等金融机构质押取得融资。这显然是做了风险兜底设计——无论净利润是否达标，7.01亿元自有资金不会白白打了水漂，贷款部分也是已获得的相应股权作为抵押物。 当然，国资也不是要空手套白狼，在收购协议中也明确要求，康华生物未来“两年研发费用合计不低于2.6亿元”。可见，国资还是十分在意康华生物能否带来长期价值的。 03 悬在对赌上的未来 康华生物能够完成对赌吗？这还是要看康华生物未来的研发进展，只期待现有产品是肯定不够的。 首先，康华生物“二倍体狂苗”的独家优势不在。2023年12月，康泰生物的人二倍体狂犬疫苗获得批签发，终结了康华的垄断地位。2024年，康泰产品批签发量达337.26万剂，同比暴增3262.51%；同期康华生物同类产品批签发量仅389.76万支，同比下滑43.83%。仅用一年时间，两者就几乎达到了同一水平线的位置，康华生物先发优势荡然无存。 其次，疫苗行业整体承压，面临传统疫苗降价、竞争加剧、新生儿出生率下降等多重考验。上海国资入局后，虽然可以利用自身资源对康华生物的现有产品进行赋能，可从长远来看，康华生物疫苗产品矩阵并不丰富，增长或将十分有限。 所以，康华生物的未来系于研发管线之中。在其目前披露的七个在研产品中，重组六价诺如病毒疫苗无疑是最有价值的一个。不仅仅是因为它已经进入临床阶段，更重要的是它堪称疫苗中的“皇冠明珠”。 图：康华生物在研管线一览，来源：公司财报 诺如病毒属人类杯状病毒科，是一种主要通过粪口途径传播、具有高度传染性的病毒。该病毒在免疫缺陷病人、老人和小孩中可引起严重疾病并可持续较长时间，其感染发病的主要表现为腹泻、呕吐和发热等，是全球引起急性肠胃炎的主要病原体，目前全球尚无预防性疫苗上市。康华生物公告称，公司研发的重组六价诺如病毒疫苗理论上可预防90%以上的相关感染。 据Frost & Sullivan的数据，2026至2031年，中国诺如病毒疫苗市场规模可由15.3 亿元增长至229.3亿元，年复合增长率达71.85%。可见市场的预期还是十分乐观的。 巨大的商业前景的诱惑下，2024年1月，康华生物与美国上市公司HilleVax签署独家许可协议，授权后者在除中国外的全球市场开发商业化该产品。根据协议，康华获得1500万美元首付款，并有望获得最高2.705亿美元的开发及销售里程碑付款，以及个位数百分比的销售分成。2024年12月，该疫苗获得中国国家药监局的临床试验批准。 不过，这款明星产品也面临严峻挑战。全球诺如病毒疫苗研发竞争激烈，美国公司Vaxart的重组腺病毒载体口服疫苗、Moderna的mRNA疫苗等均已进入临床。国内方面，中国生物/兰州生物制品研究所的重组诺如病毒双价疫苗和智飞龙科马的四价疫苗均已进入临床3期。康华生物的六价疫苗虽然价更高，但临床进度却较为滞后。 除重组六价诺如病毒疫苗外，康华生物的管线名单上还有其余六个名字——包括四价鼻喷流感疫苗、带状疱疹mRNA疫苗等，但这些产品的共性困境在于均处于临床前研究阶段，短期内难见成效，可能在未来十年内都难有产出。 因此，自康华生物复牌以来，市场并未呈现出狂热的冲动，迄今为止20%左右的涨幅，既体现了投资者对康华生物未来的乐观预计，也同时也保持谨慎观望的态度。 康华生物如果想打动投资者，除加速推进现有管线外，上海国资和“鞋王”还要向康华生物注入更多新的研发“故事”，才能撑得起市场的期盼。毕竟，要兑现2025至2026年合计7.28亿元净利润的对赌承诺，单靠下滑中的狂犬疫苗是远远不够的。  喜欢我们文章的朋友点个“在看”和“赞”吧，不然微信推送规则改变，有可能每天都会错过我们哦~ 免责声明 “汇聚南药”公众号所转载文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请在留言栏及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。 信息来源：医曜 往期推荐 本平台不对转载文章的观点负责，文章所包含内容的准确性、可靠性或完整性提供任何明示暗示的保证。

中文摘要目的   建立快速、简便和准确地检测表达绿色荧光蛋白的重组呼吸道合胞病毒（recombinant respiratory syncytial virus expressing the enhanced green fluorescent protein，RSV-EGFP）感染滴度的方法。方法   以反向遗传学构建的RSV-EGFP为研究对象、流式细胞术为检测方法，建立以泊松分布为基础的数学模型并做曲线拟合，以数学模型中的预设参数进行病毒感染滴度计算。结果   成功建立了基于泊松分布的病毒感染数学模型和流式细胞术检测RSV-EGFP感染滴度的新方法。与传统的荧光显微镜计数法比较，检测结果差异无统计学意义（t=0.16，P=0.879）；6次测定结果的变异系数为10.42%（荧光显微镜计数法为60.44%），重复性好。结论   建立了适用于RSV-EGFP感染滴度测定的新方法，可为其他病毒感染滴度的测定方法研究提供参考。正文呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）感染是婴幼儿与老年人下呼吸道感染的主要病因之一。目前已有3种RSV疫苗获批上市。RSV疫苗和预防性药物旨在诱导强大的RSV中和免疫应答，研究表明抗RSV中和抗体可针对RSV引起的严重下呼吸道疾病提供被动保护，验证了抗RSV中和抗体与预防保护的相关性。WHO也支持使用抗RSV中和抗体检测作为评估RSV疫苗免疫原性的初步方法，即作为RSV预防保护性的主要血清学标志。目前，表达绿色荧光蛋白的重组RSV（recombinant RSV expressing the enhanced green fluorescent protein， RSV-EGFP）已被广泛用于RSV疫苗中和抗体的测定。据文献报道，在基于RSV-EGFP建立的中和实验方法中，荧光病毒输入量会显著影响检测结果，准确测定病毒感染滴度对于中和实验的结果至关重要。由于噬斑法、荧光显微镜计数法等传统检测方法操作比较复杂，实验周期长，客观性差，因此有必要建立更科学的RSV-EGFP感染滴度检测方法。本研究拟基于泊松分布模拟RSV-EGFP感染细胞的数学模型，建立可靠、准确、简便的应用流式细胞术检测RSV-EGFP感染滴度的方法。1材料与方法1.1细胞Vero细胞购自美国典型培养物保藏中心，由兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室保存并提供。1.2病毒RSV-EGFP购自美国ViraTree公司，由兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室保存并提供。1.3主要试剂及仪器胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自南京诺唯赞股份有限公司；L-谷氨酰胺、DMEM培养基、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；96孔细胞培养板和细胞培养瓶均购自美国Thermo Fisher公司；青霉素-链霉素-两性霉素B添加剂购自武汉赛维尔生物科技有限公司。12道移液器（15～300 μL）购自德国Brand公司；CO2培养箱购自德国Memmert公司；IX71荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司；BD Accuri™ C6流式细胞仪购自美国BD公司。1.4荧光显微镜计数法用胰蛋白酶消化培养瓶中的Vero细胞，用病毒培养基（DMEM+体积分数5% FBS+2 mmol/L L-谷氨酰胺+体积分数1%链霉素-青霉素-两性霉素B添加剂）稀释细胞浓度至5×105 mL-1，接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL细胞悬液。将RSV-EGFP在37 ℃水浴中快速融化，低温下在离心管中进行梯度稀释（从1∶10开始10倍稀释至1∶1010），将不同稀释度的病毒液加至96孔细胞培养板与细胞悬液混合，总体积200 μL。每个稀释度重复3个孔，同时设置阴性对照孔（只加病毒培养基不加病毒液），37 ℃、5% CO2 条件下培养24 h。将96孔细胞板置于荧光显微镜下观察，若阴性对照成立，则用最后出现阳性细胞孔及相邻稀释度孔的阳性细胞数量结合稀释倍数计算感染滴度，病毒感染滴度〔荧光灶单位（fluorescence focus unit，FFU） /mL〕=阳性细胞数×稀释倍数×10，并将2个相邻稀释度得到的病毒滴度结果取均值，即为病毒原液的最终感染滴度。1.5泊松分布法1.5.1　数学模型建立　本数学模型的建立基于泊松分布。泊松分布主要用于描述单位时间（空间）中稀有事件的发生数。随机变量X服从泊松分布，是指X取值范围为0、1……，其相应取值概率为P（λ为常数，其数学意义为分布平均数）：泊松分布是模拟病毒感染单细胞层面最适合的数学模型之一。由于病毒的体积相对于细胞极小，因此当一定量的病毒感染单细胞层面时，可看作一定区域内某种微生物的计数分布。将病毒培养的时间控制在20~24 h，此时病毒还未完成出芽生殖释放，子一代病毒不会感染其他细胞，即使感染也不会马上表达EGFP，故在某一确定的感染复数（multiplicity of infection，MOI）下，1个细胞被k个病毒感染的概率为：每个细胞被感染的概率P，即细胞至少被1个病毒感染的概率P（X≥1）为1-P（X=0）：此时病毒感染的个体概率P可以用于二项分布法则中，以预测在给定MOI下被感染的细胞比例。由于事件的总数相对较高（细胞接种数为5×104），可以认为独立事件符合正态分布，则从宏观角度来看，在此MOI下，细胞的感染率（%）即为：假设样品中实际的病毒感染滴度为m，实验前m未知，假定其滴度为n，此处引入1个参数B，且m=B×n。根据假定值n将样品稀释成不同滴度，结合细胞计数得到不同的MOIn，则MOI=B×MOIn（MOI为对应于m的实际值，MOIn为根据假定值n得到的表观值），将其代入上式。同时被感染的细胞中可能有一定比例状态不好，病毒感染后不能表达出报告基因编码的蛋白，从而呈现假阴性，故引入参数A来反映EGFP生成效率，即感染率为：此即为所建立的数学模型，通过曲线拟合得到B值，即可计算样品的感染滴度。1.5.2　实验方法建立　取对数生长期的Vero细胞，用病毒培养基稀释细胞浓度至5×105 mL-1，取100 μL/孔细胞悬液接种于96孔细胞培养板。将待检测的RSV-EGFP（假定滴度为n）用病毒培养基按MOIn=50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.000、0.500、0.250稀释。将100 μL不同稀释度的病毒液加至96孔细胞培养板，与细胞悬液混合，每个MOI重复3个孔。37 ℃、5% CO2培养24 h。弃去旧培养基，PBS洗涤1遍，加入胰蛋白酶消化细胞（50 μL/孔），37 ℃放置30 s，显微镜下观察细胞，消化完全（变成单个圆形细胞）后加入含有体积分数5% FBS的PBS中和胰蛋白酶（50 μL/孔），将细胞吹散，加入质量分数4%的多聚甲醛（100 μL/孔），室温固定15 min。固定完成后，再次吹打细胞，镜下观察细胞已经吹散均匀后进行流式细胞上机检测。流式细胞术上样速度为中速，每个孔收集10 000个细胞。调整前向散射光与侧向散射光的电压，使目标细胞群独立处于适当位置，将所需要分析的目标细胞群圈门，与细胞碎片分开。用阴性对照设门，使得阴性对照接近100%处于门内，则阴性对照门外为阳性。计算出每孔阳性细胞的百分比，将3个平行孔的结果求均值，即为该MOIn下的感染率。1.6数据分析数据分析采用Curve expert 1.4软件，将所建立的数学模型进行Python语言转换导入Curve expert 1.4软件的自定义用户模型进行曲线拟合，以MOIn为横坐标、感染率为纵坐标，做曲线拟合，得到参数A和B，计算病毒实际滴度。2结果2.1荧光显微镜计数法检测结果荧光显微镜下每1个阳性细胞代表1个有感染能力的病毒（图1）。该实验共进行6次，取其中1次的结果为例作详细描述，如表1所示。对同一样品连续测定6次，结果分别为3.8×106、1.8×106、3.1×106、5.9×106、7.4×106、1.4×106 FFU/mL。6次测定结果的x̅±s为（3.9±2.4）×106 FFU/mL，变异系数（coefficient of variation，CV）为60.44%。2.2泊松分布法结果该实验共进行6次，取其中1次的结果为例详细描述。接种的细胞数为5×104个/孔，假定病毒的感染滴度n=5×107 FFU/mL（假定值n可根据预估值任意设定，为了稀释方便，本实验设置为细胞的整数倍）。各MOIn对应的流式直方荧光图如图2所示（未展示复孔），阳性细胞（FL1-A+）百分比见表2。使用建立的数学模型进行曲线拟合，见图3。病毒较少时，MOIn与细胞感染率呈正线性关系，随着病毒增多，细胞感染率逐渐达到平台，说明本实验建立的数学模型符合病毒感染细胞的一般特点。本次实验中，所得拟合曲线决定系数＞0.999，拟合参数A=0.736 6，B=0.079 6。根据m=B×n，感染滴度为4.0×106 FFU/mL。针对同一样品连续测定6次，结果分别为4.0×106、4.6×106、3.7×106、4.2×106、4.3×106、3.4×106 FFU/mL。6次测定结果的x̅±s为（4.1±0.5）×106 FFU/mL，CV=12.93%。2种检测方法的检测结果差异无统计学意义（t=0.16，P=0.879）。3讨论本研究建立了1种RSV-EGFP感染滴度测定的新方法，该法与传统的荧光显微镜计数法相比，具有结果客观和精密度高等优点。荧光显微镜观察法通过最后1个有荧光细胞出现的孔的细胞数得出结果，此时的细胞孔往往稀释度很高，难以避免由此导致的稀释误差；而新建立的泊松分布模型法通过采用多个稀释度的感染率进行曲线拟合，弥补了高倍稀释导致误差大的缺点。荧光显微镜计数法需要实验者在荧光显微镜下对细胞孔进行全视野计数，容易产生视觉疲劳且需要主观判断阳性细胞，造成不同实验操作者结果差异很大。本研究建立的泊松分布模型法采用流式细胞仪进行计数，客观性更强，且更加简便。其次，由于细胞需培养24 h，在此过程细胞（包括感染细胞和非感染细胞）会分裂，镜下观察常见多个荧光细胞连接的现象，难以区别是单个阳性细胞分裂还是2个独立的阳性细胞，给结果造成很大的误差；而流式细胞术测定的是阳性细胞的百分比（细胞分裂前后，阳性比不会改变），避免了细胞分裂带来的误差。病毒感染细胞后，细胞状态不良可能会造成无法产生或者产生很少的EGFP，从而无法指示阳性结果，造成一定比例假阴性，采用荧光显微镜计数法无法避免这种误差，会造成结果偏离；而本研究的数学模型中引入参数A，可将此误差校正，而结果判定由B决定，避免了对结果的影响。同时，A的值在理论上应该接近于实验的平台期感染率，例如本研究结果中，感染率为70%左右出现平台，而A约为0.74，说明了感染率不能在100%左右出现平台是因为存在假阴性。此外，如果A的值大于1，可能是因为消化细胞时间过长，导致大细胞碎片过多或者是因为培养时间过长，病毒的子代已经感染其他细胞而产生EGFP，此时样品应重新进行检测。综上，本项研究以RSV-EGFP为研究对象，通过建立以泊松分布为基础的数学模型，研究建立了流式细胞术检测其感染滴度的方法，结果表明该方法操作简便、客观性强、精密度高。该研究不仅适用于RSV-EGFP，同样可以拓展应用于其他RSV毒株（A2株、B株、LONG株以及临床分离株）感染滴度的测定。如果病毒自身不具备指示基因，则可以通过引入荧光抗体染色指示阳性结果。其次，对于腺病毒、流感病毒等其他病毒，可以尝试采用相同的模式进行感染滴度检测法的建立。若能通过分子生物学技术方法优化阻断子一代病毒感染其他细胞，则该数学模型会更加适用。作者杨欣宇1,4  唐悦1,4  彭诗浛1,4  李铎2,4  王栋3,4  卢亚奇1,4  王宇1,4  陈玥如1,4  王婉1,4  李雄雄1,41兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室，甘肃省疫苗技术创新中心，兰州 730046；2兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室，甘肃省疫苗技术创新中心，兰州 730046；3兰州生物制品研究所有限责任公司菌苗三室，甘肃省疫苗技术创新中心，兰州 730046；4中国生物技术股份有限公司，新发传染病新型疫苗研发全国重点实验室，北京，100024通信作者：李雄雄，Email：lixx985@163.com引用本文：杨欣宇, 唐悦, 彭诗浛, 等. 基于泊松分布模型的荧光重组呼吸道合胞病毒感染滴度测定 [J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(3): 180-185.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20241120-00081识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。

中文摘要目的   考察经免疫亲和层析纯化的马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2的等电点分布与比活性的关系，为工艺优化建立更好的质量表征。方法   采用毛细管等电聚焦电泳测定免疫亲和层析纯化前后马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2的等电点，并进行统计分析。结果   免疫亲和层析纯化前后样品的等电点分布范围均在4.97~9.88之间；纯化后样品等电点的分布更为集中；样品纯化后在等电点区间6.01—7.00和8.01—9.00的峰面积占比较纯化前的有所增加，平均增加幅度分别为70%、37%；在等电点区间7.01—8.00和9.01—10.00的峰面积占比降低，平均降低幅度分别为25%、26%。结论   根据研究结果推测，马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2中针对破伤风毒素的中和活性较强的抗体等电点可能主要分布在6.01—7.00和8.01—9.00。正文马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2是由破伤风类毒素免疫马所得的血浆经系列纯化制得的液体免疫球蛋白制剂，可用于预防和治疗由破伤风梭菌引起的感染。马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2是天然多克隆抗体，各组分对破伤风毒素的结合能力不同。文献报道，马免疫球蛋白的IgG按血清学可分为5个亚型，即IgGa、IgGb、IgGc、IgG（T）和IgG（B），其中IgG（T）是最主要的中和抗体，相对分子质量最大，约180 000，其他亚型的相对分子质量为160 000~170 000。比活性是反映该类产品质量优劣的最主要指标，中和抗体占总抗体的比例越高，其比活性就越好。本研究所用马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2是采用免疫亲和层析工艺纯化制备的高比活性制剂，与采用传统硫酸铵盐析法制备的破伤风抗毒素相比，其比活性提高2~3倍，采用SDS-PAGE法或高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定亲和层析纯化前后样品的F（ab'）2含量及保留时间，二者均无明显差别，这说明中和抗体及各种亚型的IgG的分子大小非常接近，采用传统电泳法及HPLC法无法对其差异进行表征。理论上，抗体Fab片段氨基酸序列的差异是导致抗体亲和活性不同的最主要因素，不同的氨基酸序列可能会造成F（ab'）2表面电荷差异。基于此，本研究尝试探索马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2各种亚型抗体的表面电荷分布，进而分析其等电点分布与比活性的关联性。毛细管电泳自20世纪80年代后发展迅速，具有分析速度快、分离模式多、样品和试剂消耗少等优点，已在医学、化学和生物医药领域广泛应用。本研究采用毛细管等电聚焦（capillary isoelectric focusing，CIEF）电泳对马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2的等电点分布进行对比测定，探寻具有较高中和活性F（ab'）2的等电点分布特点，从而为该品的工艺改进提供理论依据和技术支持。1材料与方法1.1马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2样品层析纯化前样品：采用经破伤风类毒素免疫后的混合马血浆作为原料，经胃蛋白酶消化、硫酸铵盐析、超滤后制得。层析纯化后样品：以破伤风类毒素作为亲和配基，对上述样品进行免疫亲和层析纯化后制得。2种样品的编号及关键质量指标见表1。1.2主要试剂和仪器中性毛细管、等电点聚合凝胶、Marker（CIEF peptide marker kit）均购自美国贝克曼库尔特公司，硫酸铵、磷酸、氢氧化钠、乙酸均购自国药集团化学试剂有限公司，胃蛋白酶购自重庆奥力生物制药有限公司，精氨酸购自美国Sigma公司，亚氨基二乙酸购自北京索莱宝科技有限公司，尿素购自美国Bio-Rad公司，两性电解质（Pharmalyte 3-10）购自美国GE Healthcare公司。PA800 plus毛细管电泳仪购自美国贝克曼库尔特公司。1.3马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2含量测定方法1.3.1　SDS-PAGE法测定F（ab'）2含量　参照中国药典2020年版三部（药典三部）通则0541电泳法中的第五法，采用质量分数7.5%丙烯酰胺分离胶分析样品纯度。1.3.2　HPLC法测定F（ab'）2含量　参照药典三部通则3128抗毒素/抗血清制品分子大小分布测定法测定。1.4等电点分布测定与分析1.4.1　等电点分布测定　采用毛细管电泳仪测定马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2免疫亲和层析纯化前后样品的等电点分布，详细测定方法如下。毛细管预处理：运行“CIEF conditioning method”，即在345 kPa压力下依次用去离子水冲洗5 min，乙酸冲洗2 min，等电点聚合凝胶冲洗5 min，程序运行结束后即可进样检测。样品要求及处理：将样品用纯化水稀释至工作浓度（5~10 mg/mL）。CIEF电泳样品缓冲系统配制方法： 3 mol/L尿素液体凝胶溶液200 μL、两性电解质12 μL、阴极稳定液20 μL、阳极稳定液2 μL、等电点 marker A（10.0）2 μL、等电点 marker B （7.0）2 μL、等电点marker C（4.1） 2 μL、稀释后的样品10 μL（盐离子浓度低于50 mmol/L），混合后加入分析池。电泳条件：检测器 UV、检测波长 280 nm、毛细管切割长度 30.2 cm、毛细管有效长度 20 cm、毛细管温度 20 ℃、样品室温度 20 ℃、聚焦电压 25 kV、聚焦时间 15 min、分离电压 30 kV、运行时间 30 min。结果分析：用等电聚焦marker理论值及相应的迁移时间建立标准曲线，其中拟合优度值＞0.99，表明marker拟合性好，可用作定量。按毛细管电泳仪操作说明测定等电点。1.4.2　等电点分布结果分析　对层析纯化前后马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2样品的等电点分布结果进行分析：（1）统计纯化前后样品等电点峰的数量和等电点分布范围；（2）分别统计纯化前后样品不同等电点区间的峰面积占比并进行比较。2结果2.1马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2含量测定结果HPLC结果显示，层析纯化前后马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2的含量均在96%以上，二者无明显差异，见图1和图2。SDS-PAGE结果显示，层析纯化前后F（ab'）2含量均在90%~93%之间，无明显差异，见图3。2.2马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2的等电点分布范围和分布峰数量测定结果亲和层析纯化前后马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2样品的毛细管电泳等电点分布范围和分布峰数量结果如下：第1批样品纯化前后等电点分布峰数分别为38和31，等电点分布范围均为4.97~9.88（图4）。第2、3批样品纯化前后结果类似：纯化前等电点分布峰的总数分别为41、37，纯化后的峰数分别为35、34，纯化后峰数量略少；峰的分布范围方面，纯化前后样品的等电点分布范围均在4.97~9.88之间，等电点分布峰呈现范围相同且分布较广的趋势。2.3马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2不同等电点区间峰面积占比分析将图4中的峰按照等电点分布不同分为6个区间：1—6区间分别对应等电点4.10—5.00、5.01—6.00、6.01—7.00、7.01—8.00、8.01—9.00和9.01—10.00。剔除marker峰后，层析纯化后样品峰面积占比增加的2个区间为6.01—7.00和8.01—9.00，对应峰面积占比平均值分别提高70%和37%。层析纯化后样品峰面积占比减小的2个区间是7.01—8.00和9.01—10.00，峰面积占比平均值分别降低25%和26%。而在等电点区间4.10—5.00和5.01—6.00，层析纯化前后样品峰面积占比虽然分别增加和减小，但总占比均较低。结果见表2。3讨论马免疫血清类制品的发展先后历经原制血清、浓制血清、精制抗毒素等阶段，每一次技术升级及改进均聚焦于如何提高产品的质量及比活性、降低产品杂蛋白含量和过敏反应发生率。马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2是破伤风抗毒素的升级换代产品，从2020年版中国药典质量标准来看，其比活性明显高于破伤风抗毒素。在临床应用中，大量文献报道也印证了马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2具有更好的安全性，进一步说明马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2比活性越高安全性越好。本研究对免疫亲和层析纯化前后马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2样品中F（ab'）2含量进行测定，采用SDS-PAGE法检测F（ab'）2含量均在90%以上，用HPLC法检测F（ab'）2含量均在96%以上，二者结果无明显差异。分析CIEF电泳结果发现，层析纯化前后马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2样品的等电点分布既有一致性又存在差异：相同点是二者等电点分布范围均为4.97~9.88，分布峰的总数也无明显差异。这是由于马免疫血清类制品是天然的多克隆抗体，免疫亲和层析过程可富集中和活性较强的抗体从而提高比活性，但层析过程中的非特异性吸附又导致不具中和活性的抗体无法被完全去除；同时多克隆抗体本身成分复杂，从而在等电点分布中呈现范围分布较广、数量较多的趋势。不同点在于，层析纯化前后样品在不同等电点区间的峰面积占比不同。在等电点区间6.01—7.00和8.01—9.00，层析纯化后样品的峰面积占比有所增高，增高幅度分别为70%和37%。而在等电点区间7.01—8.00和9.01—10.00，层析纯化后样品的峰面积占比有所降低，平均降幅分别为25%和26%。因此推测，中和活性较强的抗体可能主要分布在等电点6.01—7.00和8.01—9.00区间内。本研究从F（ab'）2含量及等电点分布角度对马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2层析纯化前后样品的比活性差异进行探讨，发现免疫层析纯化前后样品中F（ab'）2含量无明显差异，说明F（ab'）2含量不是影响比活性的主要原因；纯化前后等电点分布峰总数和分布范围虽无明显差异，但不同区间峰面积占比差异较大，说明比活性差异可从等电点分布角度体现。尽管对等电点区间的划分是人为划分，具有一定局限性，但在其他检测方法无法解释样品比活性差异的情况下，保证层析纯化前后划分方法一致即可确保本研究分析的准确性和科学性。从本研究等电点分布研究结果来看，免疫层析纯化前后样品等电点分布差异较大区间对应的蛋白应该是影响产品比活性的中和活性最强的F（ab'）2。后续研究将探究提高6.01—7.00和8.01—9.00区间对应蛋白的含量，分别纯化后进行比活性检测，以明确比活性和等电点分布的关系，从而进一步提高产品的比活性。本研究为马血清制品生产工艺改进和质量提高提供了新的研究思路和方法。作者包正琦  梁凌宇  秦芝蕾  段丽娟  马江  张锐  高建军  兰州生物制品研究所有限责任公司血清室，甘肃省疫苗技术创新中心， 兰州 730046通信作者：高建军，Email：gao5369@163.com引用本文：包正琦, 梁凌宇, 秦芝蕾 , 等. 马破伤风免疫球蛋白F（ab'）2比活性与等电点分布的关联性 [J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(3): 170-174.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20241129-00083识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。