Oxford Biomedica Plc

摘要：慢病毒载体（LVs）因其能在分裂和非分裂细胞中稳定整合基因组，已经成为基因和细胞治疗的重要工具。在过去几十年中，LV的生产和纯化过程已经发生了显著的演变。然而，随着对更大量和更严格纯度要求的不断增长的需求，正在刺激开发新的材料和策略，以成本效益的方式向市场供应LV。对每个下游过程单元操作进行了详细回顾，涵盖了限制、优势和潜在结果。目前，大多数大规模LV制造过程仍然基于贴壁细胞培养，尽管已知行业正在迅速转向悬浮培养。关于纯化策略，它由批处理层析和膜技术组成。尽管如此，正在创造新的解决方案来改进当前的生产方案并扩大其临床使用。 1.引言 慢病毒是逆转录病毒科的包膜病毒，由于它们能够在分裂和非分裂细胞中稳定整合待表达的转基因，因此对生物制药行业变得越来越重要。此外，它们的整合模式似乎比γ-逆转录病毒载体的风险更低，这证明了它们在功能基因组学、细胞工程研究、重组蛋白生产以及临床基因治疗中的广泛应用。在过去的几年中，基于慢病毒载体（LVs）的基因治疗临床试验数量已经增长，到2019年占到所有基因治疗试验的10.1%。它们在体外治疗多种疾病中的应用已被报道，通常涉及造血干细胞或T细胞的转导，以及在体内——向中枢神经系统和视网膜的基因传递。最近已经发表了对LV临床应用的全面回顾。2017年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了两种嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法用于治疗B细胞淋巴瘤和白血病，这证明了这些病毒载体的优势，并证明了它们在临床水平上的成功应用。对于其他类型的癌症，使用LV进行免疫仍然是一个有希望的应用。这些临床试验的成功需要改进LV的纯化方法，无论是定量上，增加过程能力，还是定性上，替代小规模使用的传统方法，这些方法在经济上和/或技术上对于更大规模是不可行的。当前的生产技术通常导致功能性滴度较低，范围在每毫升10^6到10^8转导单位（TU mL^-1），这取决于生产系统、LV假型、收获条件，甚至滴定技术。此外，杂质随着生产系统的不同而变化。例如，当LV由贴壁细胞系生产时，血清是存在的，并且质粒DNA用于瞬时LV生产。因此，在开发下游过程（DSP）时，追求LV的浓度和提高LV纯度，必须考虑到生产液的杂质轮廓。就像任何其他生物制品一样，所需的浓缩和纯化程度基本上与LV的用途密切相关。研究/小规模目的通常不需要非常纯净的产品。然而，当产品用于临床时，药物的安全性是一个问题。标准主要取决于给药类型。对于体外应用，药物产品的纯度水平更为灵活。此外，感染的多重性（MOI）必须尽可能保持低，以减少肿瘤潜力和细胞毒性。对于体内方法，每位患者至少需要10^11–10^12的剂量，这也将根据目标组织而变化。在这种情况下，需要更严格的控制纯度以减少患者的免疫反应。DSP还必须考虑到LV功能颗粒的低稳定性，这受到温度、离子强度、pH和剪切应力的影响。除了环境条件外，稳定性高度依赖于颗粒本身，主要取决于包膜蛋白（假型），但也取决于病毒核心。囊泡性口炎病毒G蛋白（VSV-G）是使用最多的LV假型，因为它具有广泛的嗜性并且在纯化过程中的稳健性。然而，由于它们对特定目标组织或细胞具有更高的嗜性，其他蛋白包膜（例如，狒狒内源性病毒（BaEV）、RD114-TR、长臂猿白血病病毒（GaLV））的DSP方案正在出现。本文旨在全面回顾LV纯化的最新技术发展，并追踪该领域的可能未来趋势。首先，确定了传统方法，然后回顾了更有希望且更容易扩展的技术。 2.传统LV纯化和浓缩方法  传统的纯化和浓缩技术通常用于小规模生产，例如科学研究，能够满足LV的需求。基于离心的方法可以作为浓缩和/或纯化技术使用。病毒沉淀和重悬程序通常用作浓缩方法。使用密度梯度离心或使用蔗糖或碘克沙醇进行超速离心，已有报道，可以在合理浓缩的同时实现一定程度的纯化。另一种用于小规模纯化方案的技术是聚乙二醇（PEG）。这种聚合物通过空间排斥作用使病毒颗粒从溶液中沉淀出来。通过离心可以回收病毒颗粒，并可实现高产量。传统方法的缺点包括对可扩展性的担忧以及产品中杂质浓度的集中。尽管可以获得高度纯化，但使用超速离心会减少感染力，因为LV受到的压力条件。因此，该领域正逐渐转向更多功能的技术。 3.可扩展的LV下游处理方法 在过去的几年中，已经描述了使用色谱步骤和基于膜的分离操作的DSP的开发和使用。这些过程可以分为三个主要阶段：i) 收获和澄清；ii) 中间纯化，包括一个或多个浓缩和纯化步骤；以及iii) 抛光、配方和灭菌。核酸消化通常是必需的，并且可以在过程的不同阶段进行（见图1）。目前，大规模DSP的总体回收率范围从20%到40%。 图1. 慢病毒载体纯化的下游处理工作流程。这张图示展示了用于慢病毒载体处理的三种不同的单元操作序列。[21,24,33] 在所代表的流程中使用的核酸酶是苯酰酶，它可以在流程的不同阶段引入。对于Valkama等人，核酸酶步骤是上游收获的一部分。NF，正常流。 3.1. 收获和澄清 LV是细胞生产者通过出芽释放的细胞外生物制品。大多数大规模LV生产过程使用人类胚胎肾（HEK）293或293T贴壁细胞的瞬时转染，批量模式，通常在转染后48–72小时收获一次或两次。尽管，最近，行业也在向悬浮培养过渡。收获质量高度依赖于细胞活性，这会影响宿主细胞（HC）衍生杂质的数量。因此，选择收获时间不仅要考虑生产力，还要考虑上清液的质量。 澄清的主要目标是从含有LV的介质中去除细胞和细胞碎片。这一步通常包括深层过滤，正常流微滤，低速离心，或这些操作的组合。使用离心后跟微滤是一种常见的策略，以减少过滤堵塞并最小化小体积的污染。具有类似目标，但针对更大规模的，通常使用膜级联，最终孔径为0.45微米。 这些早期步骤的回收率通常没有报告，尽管，在优化后，可以实现小的功能滴度损失。Valkama等人最近报告说，使用深层过滤器澄清含有VSV-G假型LV的大体积上清液，功能回收率接近100%。然而，这个操作的成功可能高度依赖于假型。使用GaLV-TR假型LV，Boudeffa等人在澄清步骤中获得了非常低的回收率，后来通过上清液稀释和稳定化得到了改善。 尽管如此，为了满足LV日益增长的需求，上游处理（USP）的最新发展正在出现，将DSP的早期步骤整合到USP中可能非常有利。最近，Oxford Biomedica报告了使用切向流深层过滤（TFDF）收获和澄清悬浮培养生产的LV，结果实现了高回收率，并促进了多次收获。此外，对于在灌注下运行的悬浮细胞培养，保留装置，如病毒收获单元（VHU），允许收获澄清的病毒库存。关于贴壁细胞培养，可以使用几种生物反应器配置进行连续LV生产。切向流微滤和连续流盘式堆叠离心也是连续技术，尽管从未报告用于LV澄清。 3.2. 核酸切割 为了提高最终产品的总体生物安全性并符合监管标准，必须进行核酸切割步骤。使用苯酰酶或去核酸酶可以减少DNA大小并降低整体粘度。这些酶需要镁离子作为辅因子，并在37°C下显示最佳活性；然而，关于核酸切割步骤的不同实验条件（例如，酶的量，温度，孵化时间，盐浓度，pH值，以及酶抑制剂的存在）已有报道。最近，Oxford Biomedica开发了一个系统（SecNuc），避免了添加与LV共生产的核酸酶。核酸酶步骤通常紧接在或澄清之后。在其他过程中，它被包括在USP或在某些体积减少后的后期DSP阶段。此步骤的早期位置导致更高的核酸酶消耗，增加了制造成本，这可以通过更容易的后续DNA清除和核酸酶去除来抵消，如果LV打算用于临床使用，则必须完成核酸酶去除。 3.3. 中间纯化 澄清后，LV的可扩展纯化步骤使用色谱和/或切向流过滤（TFF），这两种技术都实现了一定程度的体积产品的浓缩。色谱是主要生物治疗产品纯化协议中的关键技术，提供可扩展性，纯度，高回收率和可重复性。经典的树脂介质最初是为蛋白质纯化设计的；因此，LV的大流体动力学半径带来了一些技术限制。使用珠子通常限制了对结合位点的访问，导致动态结合容量较小。此外，高柱背压也导致流速有限。在这种固定相中的传质主要是由扩散限制的，而在膜吸附剂和单体中则主要是对流。这允许更快的处理和更大的吞吐量，使这些支持物非常适合病毒捕获。阴离子交换和亲和色谱已在LV的早期纯化步骤中使用（表1）。 表1. 用于LV纯化的阴离子交换和亲和色谱方法。 PT，假型化；BV，床层体积；解吸试剂，用于解吸的试剂；Rec.，功能性颗粒的回收；SW，逐步洗脱；LG，线性梯度洗脱。由作者根据文章数据计算得出。a) 在444 × 10^−3 m NaCl的峰值时的回收率。b) 包括色谱在内的一个以上单元操作的回收率。c) 澄清后的LV捕获/未澄清LV的捕获。d) Fractogel EMD肝素已停产。 3.3.1. 阴离子交换色谱 阴离子交换色谱（AEX）广泛用于大规模生物过程的捕获。简而言之，这些病毒的纯化是在结合-洗脱模式下进行的，其中LV颗粒在工作pH下具有负表面电荷，被带正电的基质吸附。洗脱是使用0.5-1m NaCl之间的缓冲液离子强度进行的。由于LV是不稳定的，高盐浓度可以导致病毒失活。有报道称，在1m NaCl暴露1小时后，LV生物活性损失了50%。为了减少AEX步骤期间的损失，通常需要在洗脱步骤后立即稀释病毒载体。 膜和单体固定相，与传统色谱树脂一样，可以用强或弱离子配体功能化。使用四级胺作为配体的强离子交换剂已用于生产高质量的病毒库存，特别是使用Sartobind Q和Mustang Q商业膜。相反，弱交换剂，例如带有DEAE（二乙氨基乙醇）配体的CIM单体，也已在LV纯化中报道，具有高回收率。总的来说，这种技术导致功能性颗粒回收率在30%到80%之间（表1）。 由于结合是由静电相互作用驱动的，AEX基质对LV并不选择性，负电荷的核酸和蛋白质也结合到色谱介质上。用于洗脱LV所需的高盐浓度也导致结合杂质的释放。Merten等人实现了大约99%和86%的蛋白质和DNA去除。然而，通常需要额外的纯化步骤以获得临床级病毒库存。 新型固定相不断发展中。Ruscic等人报道了使用再生纤维素纳米纤维衍生物进行LV纯化，该衍生物用四级胺功能化，并通过电纺生产。作者声称实现了100倍的体积浓缩因子，回收率为85%。 3.3.2. 亲和色谱 亲和色谱（AC）用于基于它们与选定的固定配体之间的高度特异性相互作用，从肉汤中分离颗粒。与AEX不同，AC表现出高选择性，这可能导致更高的纯度和浓度结果。因此，其在DSP中的整合可以减少所需的单元操作数量，从而获得更大的总体回收率。 最早报道的研究之一使用了固定金属亲和色谱（IMAC）。这种技术利用了固定金属离子与能够与其共享电子的分子之间的结合。对于LV纯化，这将涉及通过引入组氨酸标签来修饰包膜蛋白。这种插入可能导致表达降低或损害蛋白质的功能，从而失去颗粒感染力。此外，解吸步骤需要使用咪唑，导致LV失活。最后，IMAC用于LV纯化的另一个主要缺点是His标签在临床试验中可能产生的不良影响，因此目前被拒绝。 使用肝素亲和色谱在LV纯化中可以进行温和条件下的洗脱。然而，其低选择性可能导致宿主细胞蛋白质和DNA与LV的结合竞争，从而共同洗脱。鉴于肝素的动物来源，其在工业应用中的使用将被避免。 另一种策略涉及用去硫生物素或生物素模拟物标记LV，这些物质与链霉亲和素柱（或磁性珠）结合的亲和力较低。LV的解吸是使用生物素进行的。Chen等人改造了一个细胞系，以产生去硫生物素标记的LV，并在单体亲和素包被的色谱柱中进一步纯化。最近，Mekkaoui等人报道了使用cTag8标记的RDPro假型LV的纯化。这种生物素模拟物是遗传编码的，技术不依赖于包膜蛋白。尽管在实验室规模上使用亲和色谱进行LV纯化取得了令人鼓舞的结果，但要将这项技术转化为工业环境还需要改进。特别是，对LV包膜的修改可能会通过载体失活或改变嗜性来损害病毒的生物活性。 3.3.3. 切向流过滤 超滤/透析是病毒大规模浓缩和缓冲液交换的黄金标准，因为它是一种快速且稳健的技术，易于放大，并可转移到良好的生产实践（GMP）中。简单来说，TFF用于在保留液中浓缩病毒颗粒，而较小的杂质如蛋白质和DNA片段则通过孔隙进入渗透液中。膜污染可能是一个主要限制因素，导致浓缩过程中渗透流速降低和跨膜压力（TMP）增加。TFF可以应用于下游过程的不同阶段。首先，它可以用于浓缩流经病毒澄清后的料液，减少后续步骤的料液体积，如果进行透析，则将缓冲液交换为后续操作单元的适当组成。其次，它也通常用于下游抛光步骤中进行浓缩和缓冲液交换或配方（见下文）。 正如前所述，LV纯化的一个主要挑战是维持其生物活性。压力变化、高剪切力和泡沫可能导致感染力丧失甚至包膜破裂。通过实验筛选选择膜化学和孔径大小，然后优化关键过程参数，如流速、TMP、膜通量和过程时间，以确保平稳运行。平板盒式或中空纤维用于LV浓缩，提供不同材料——聚砜（PS）、聚醚砜（PES）、聚偏二氟乙烯（PVDF）或再生纤维素（RC）。选择的分子量截止值（MWCO）在100至750 kDa之间。对于具有较大孔径的设备，可以实现更高的杂质清除率和减少过程时间；然而，这可能导致病毒损失，如Valkama等人所观察到的。这些未回收的LV可以以渗透液的形式离开系统或被困在膜中。表2列出了不同团队使用VSV-G假型LV报道的高回收率。这项技术开始被用于更多包膜类型，正如不同研究团队所描述的。实现的最大浓缩因子和透析体积的数量应根据病毒的最终临床用途来确定。 表2. 切向流过滤在LV浓缩和/或透析中的应用。 PT，假型化；MWCO，分子量截止；VCF，体积浓缩因子，功能性颗粒的回收。a) 由作者根据文章数据计算得出。b) 作者一致报告，在保持压差恒定时，在更高的给料和保留压力下操作，回收率会增加。c) DF缓冲液的pH值对载体回收有相当大的影响。d) 优化前。e) 使用具有两个连续集成的HF过滤器的系统，FP1和FP2。 3.4. 抛光、配方和灭菌 LV制剂的抛光和配方可以通过使用色谱方法（基于尺寸排除）或TFF来实现。一些大规模流程探索LV与剩余杂质大小的差异，用于抛光步骤。在尺寸排除色谱（SEC）中，病毒载体被排除在填充材料的内部孔隙之外，而其他生物分子迁移较慢，因为它们更有可能被保留在孔隙中。通常使用最大MWCO为750 kDa（相当于50纳米）以防止滴度损失。这种方法能够高效地去除小尺寸颗粒，并且已有报道回收率从50%到80%。然而，低流速和小样品量限制使这种技术不理想于处理大量体积。此外，样品稀释两到四倍妨碍了高浓度病毒库存的生产。尽管如此，有报道称采用SEC进行抛光的GaLV-TR假型LV的规模化纯化过程。或者，可以使用多模式色谱，如Capto Core 700，进行抛光。这种流程色谱结合了SEC和AEX的特性。色谱介质由具有功能化核心的颗粒组成，大颗粒无法进入，以及一个非功能化的外层。Boudeffa等人报道了使用GaLV-TR假型LV时TU的回收率为86%。如上所述，TFF经常用于浓缩和配方LV。适当的病毒配方对于提供最大稳定性和保证治疗成功至关重要。LV在冷冻-解冻或冻干后以及在临床使用期间必须保持生物活性。对于体外应用，配方有一定灵活性，导致使用含蛋白质的介质，如Lonza的X-VIVO和CellGenix的CellGro介质。传统上，LV的稳定化是通过使用不同的缓冲系统——PIPES、HEPES、HIS-HCl、Tris-HCl或PBS——结合稳定剂辅助剂来完成的。更常见的辅料包括糖（蔗糖或海藻糖）或蛋白质，如重组人白蛋白和明胶。 最后，药物物质的灭菌是通过在灌装前通过0.22微米过滤器来实现的。这是标准监管要求，也是关于载体损失的关键步骤。Valkama等人报道了在他们大规模DSP的最后一步中损失了30%到50%。这一步的回收率取决于膜材料和LV滴度。Oxford BioMedica验证了最终浓缩步骤后的灭菌导致了LV功能回收率低。因此，在他们的DSP协议中，无菌过滤放置在最终TFF之前，这是在无菌条件下完成的。如果过程是在半封闭系统中无菌进行的，可以跳过灭菌。最终产品然后存储在-80°C以保护病毒免受热灭活或冻干。 4.分析方法和监管要求 从含有杂质的LV上清液到最终产品，预计载体滴度会增加，总杂质量会减少（图2）。这些杂质通常被区分为与流程相关的和与产品相关的，Segura等人对此进行了广泛回顾。分析方法在流程开发和运营以及生产批次的表征中起着关键作用。这种表征在GMP生产和进入临床试验中是必需的。然而，与其他先进治疗药物产品一样，目前还没有严格的LV生产指南。已经做出了标准化的努力，结果制定了LV分析标准和即将发布的LV参考材料。每个批次都必须经过身份、纯度、效力和安全性测试。一些用于LV释放的检测示例列在表3中。身份可以通过西方印迹法对gag蛋白、载体测序、限制性酶切图谱、反相高效液相色谱（HPLC）或十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行确认。关于纯度，流程相关和产品相关的杂质应在最终产品中得到很好的表征。可以使用比色法，如Bradford或BCA，获取总蛋白的定量。其他杂质，如HC蛋白、核酸酶和牛血清白蛋白，可以通过ELISA进行定量。DNA必须以每剂量低于10 ng的浓度存在，DNA大小在200个碱基对以下。它们的定量可以涉及光谱荧光测定和琼脂糖凝胶电泳。由于HEK293T具有肿瘤表型，使用这些细胞系生产的LV必须进行分析，以量化E1A和SV40 LTA DNA序列。如果生产过程涉及瞬时转染，还必须使用qPCR或Southern Blot评估质粒序列（vsv-g和gag-pol）的副本数。载体质量的良好指标是总颗粒和活性颗粒之间的比率，与其效力相关。如果这个参数太高，批次必须被拒绝。当前指南没有定义参考值，但报告了10^3数量级的比率值。总颗粒数通常通过使用ELISA试剂盒进行p24滴度测定来推断。其他用于定量总颗粒的分析方法可能包括评估逆转录酶活性和确定基因组RNA。物理方法可商业获得，并能够更快地定量总颗粒并表征尺寸分布。这些方法包括场流分离多角度激光光散射（FFF-MALLS）、纳米粒子跟踪分析（NTA）、流式细胞术和可调电阻脉冲传感（TRPS）。活性颗粒数通过在合适的细胞系中进行基因转移或基因表达测定来估计。出于研究目的，当使用GFP作为转基因时，功能性滴度通常通过流式细胞术估计荧光细胞。然而，对于临床目的，应该通过使用液滴数字PCR（ddPCR）或定量PCR（qPCR）通过经典的TaqMan基因组DNA或适合使用的转基因的另一种方法来量化逆转录病毒基因组整合到目标细胞的数量。此外，每个载体批次还必须根据几个安全参数进行评估，主要分析重组有能力的慢病毒（RCL）、内毒素、支原体、外来因子和无菌性。像pH值、渗透压和外观这样的物理化学参数补充了产品表征。 图2. 用于体外或体内治疗的慢病毒载体的通用纯化方案。每一步中消除的杂质和过程中添加的元素也在图中表示。 表3. 用于LV制剂质量评估的检测方法。 参考文献，引用；BCA，双缩脲酸；ELISA，酶联免疫吸附测定；PCR，聚合酶链反应；qPCR，定量聚合酶链反应；PERT，产品增强逆转录酶；RT qPCR，定量逆转录聚合酶链反应；ddPCR，液滴数字聚合酶链反应；LAL，鲎虫溶菌酶。 5.结论  在过去的十年中，慢病毒载体已成为基因和细胞治疗的基本工具，这解释了使用这些病毒的临床试验数量的增加。Kymriah[17]和Yescarta细胞治疗产品的批准加强了对简单、快速和稳健的病毒载体制造工艺的迫切需求。近年来，这个领域见证了巨大的努力，开发和优化大规模生产和纯化流程，能够满足临床使用所需的大量病毒剂量。 在本文中，对每个下游操作单元进行了详细回顾，并强调了显著的优势和局限性。对于色谱法，使用对流驱动的设备在LV纯化方案中是有效的，并且新的固定相正在出现，取得了非常有希望的结果。此外，使用定制配体的亲和色谱可能因其高选择性而证明是有价值的，这允许减少纯化步骤的数量并提高回收率。 LV纯化流程已显著发展，然而，回收率仍远未达到其最大潜力，并且使用当前技术无法有效获得所需的病毒量。转向新的生产系统可能克服这些障碍，但可能为LV的下游处理引入不同的挑战。生产滴度的增加当然有利于纯化流程，但转向悬浮系统将在澄清步骤中增加细胞质量。杂质轮廓也将改变，将观察到与流程相关的杂质增加（例如，基因组DNA，HC蛋白）。因此，DSP必须应对这些挑战，以实现相同高质量的病毒库存。 生物制药行业现在正在转向新的运营模式，试图实现完全连续和集成的生物工艺。这些改进非常吸引人，因为它们允许高纯度和生产力，降低总体成本。为了改进这些连续流程，已经做了很多工作，特别是在连续色谱方面，用于其他病毒颗粒，如腺病毒，流感病毒，和细胞外囊泡。然而，使用连续流程生产LV可能因LV细胞毒性而受到阻碍，特别是对于VSV-G假型载体。在建立稳健的LV制造流程之前，将连续生产和纯化转向更大规模将很困难，但实验室规模的研究已经致力于这些新的处理操作模式。 在这篇综述中，一些未来的发展方向被确定，并且描述了LV制造方面取得的进展。一些成功案例已经被报道，新的应用和技术发展正在蓬勃发展。趋势可能会继续，因为几个团体和公司致力于投入更多的资金和时间，将慢病毒载体推向更广泛的临床应用。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：慢病毒载体（LVs）是将感兴趣的基因传递到哺乳动物细胞的强大工具，目前常用于细胞和基因治疗领域，用于治疗单基因疾病和如嵌合抗原T细胞（CAR-T）疗法等的过继疗法。本文全面回顾了LV生产中采用的各个生物加工操作。我们强调了包膜蛋白在载体设计中的作用以及它们对慢病毒载体生物加工的影响。对这些操作现状的概述提供了生物加工发现和改进的机会，重点强调了在开发和临床生产期间对LV进行最佳和可扩展处理的考虑因素。描述了LV产生的上游培养，并对不同的转染方法以及悬浮和贴壁生产细胞培养的各种生物反应器进行了比较。检查了LV的纯化，评估了小规模和大规模生产要求的不同下游工艺操作序列。对于可扩展操作，重点是层析纯化的发展，以及对切向流过滤应用的深入检查。还介绍了载体定量和特性分析的摘要。最后，讨论了LV生产的整个生物加工评估，以从不同工艺选项的潜在相互作用的更广泛理解中受益。本文旨在帮助从健壮和可扩展的过程中实现高质量、高浓度的慢病毒载体。 1.引言 慢病毒载体（LV）通常用于细胞和基因疗法中，用于将感兴趣的转基因转移到受体细胞中以获得治疗效益。作为载体，它们能够转导分裂和非分裂细胞，如神经元、造血干细胞和免疫系统细胞，特别是T细胞，传递高达11千碱基（kb）大小的转基因。LV是治疗单基因疾病和需要基因传递的过继细胞疗法试验的主要载体兴趣点，占英国体外先进治疗药品（ATMP）的57%。在美国、中国、欧盟和加拿大有100多项正在进行的临床试验正在使用慢病毒载体，用于体外细胞修饰或体内疗法。总体而言，由于其在临床试验中的普及和最近CAR-T疗法Kymriah和Yescarta的市场批准，预计到2026年LV生产市场将增长至8亿美元。随着对慢病毒载体疗法的持续兴趣，对高效的LV生物加工的需求也在增长。在扩大规模和生产过程中的问题可能会推迟慢病毒载体在临床和商业用途中的采用。当今遇到的一些生物加工挑战包括在上游生产中无法产生足够的滴度，以及在下游处理过程中普遍的低回收率，导致许多公司无法提供足够的能力以满足大规模需求。尽管目前存在开发适量载体的问题，但病毒载体及其生物加工的应用是一项有价值的企业。考虑到只需要改变转基因就可以转向另一个产品，通用生产过程的兴起是可能的。这可以是包装细胞系的形式，其中细胞恒定地表达载体组分和所选的包膜蛋白，等待合适的转移卡带进行稳定或瞬时表达。对于已建立的平台，生产者细胞系可能是有价值的，其中细胞恒定地表达与载体生成相关的所有组分。从理论上讲，这些细胞系具有有利的商业属性，因为它们不需要所需的质粒DNA和转染步骤。一旦设计了优化的上游和下游，开发一个平台以快速交换和验证转基因的可行性很高。加强和连续的处理，如在重组蛋白生产中看到的那样，可能有助于成本效益高的载体生产。 2.慢病毒载体的生物加工 慢病毒载体因其生理和物理化学特性而独特。LV通常基于HIV-1，并共享其许多特性，如80-120纳米直径的球形形状，衣壳核心和功能性酶，以及来自宿主细胞膜的包膜。LV颗粒的固有复杂性和敏感性在加工过程中带来了挑战，例如颗粒热稳定性（例如，在37°C下半衰期在7-8小时范围内），对冻融周期的敏感性，需要快速处理，盐，pH，剪切和缓冲液渗透压。在这里，由于未包装的载体或酶功能丧失或包膜蛋白损坏/缺失导致转导能力的丧失，是有缺陷的颗粒可以与功能性载体共纯化，这在减少过程能力方面是有问题的。此外，生产细胞类型及其在生产期间的活性已涉及载体稳定性，因此必须保持细胞健康以获得高产量。从野生型病毒发展慢病毒载体需要评估病毒基因组并选择病毒组分以确保安全和有效的基因转移。HIV基因组组织成转元素，编码功能性、结构性和辅助性蛋白，如Gag多肽、包膜蛋白和功能性酶，而非编码顺式元素如长末端重复序列（LTR）协助将病毒RNA基因组转录和包装成病毒颗粒，并指示逆转录和整合到受体细胞的区域。因此，慢病毒载体的最初发展已经看到了HIV-1的顺式和反式作用元素的分离到单独的质粒上，除了HIV-1包膜，它被伪型化为替代包膜蛋白，如小鼠白血病病毒（MLV）的全嗜性包膜蛋白或VSV-G在第三个质粒上。随后的几代人通过去除不必要的病毒序列，如辅助蛋白vif、vpr、vpu和nef，以提高滴度和安全性。在现代第三代包装系统中，tat被移除，一个组成型启动子取代了转移质粒5' LTR中的U3，以允许在没有Tat的情况下进行转录，以提高生物安全性。为了进一步保持安全性并维持载体滴度，rev在另一个质粒上提供。因此，当前的做法特点是3-4个质粒，其中包含感兴趣转基因的自我灭活转移质粒，由HIV-1 LTRs和rev反应元件所环绕。这与包含基本转元素Gag-P的包装质粒共同转染，第三个包含包膜蛋白的包膜质粒，以及第四个如果不在其他地方包含的话，用于HIV-1 rev。LV处理的要求因应用而异，但高滴度和纯度是最重要的。大多数载体生产中的杂质将是残留DNA、转染试剂、宿主细胞蛋白和培养基成分（见表1）。对于细胞疗法，最终产品是转导的细胞，因此载体的纯度配置文件比体内疗法的纯度配置文件不那么严格，因为产品质量保证/质量控制（QA/QC）要求在细胞阶段。对于体内疗法，要求将与载体本身有关。因此，对于体内疗法过程，关键质量属性将侧重于质量和浓度，而体外则侧重于质量和产量。 2.1.伪型包膜蛋白 慢病毒（LV）通常进行伪型化，即将载体的包膜蛋白替换为另一种病毒的包膜蛋白（见表2），实际上是用来自其他病毒的蛋白质包裹病毒颗粒，这些蛋白质为载体提供了不同的特性，影响其嗜性以及预期的细胞靶标，也可能影响生物加工过程中的成功。当转导细胞时，包膜蛋白必须与受体细胞表面的受体接触并结合。包膜蛋白的选择、其在载体表面的频率以及受体的可用性对于有效转导至关重要，同时限制了非靶目标的相互作用。在LV生物加工中，包膜蛋白必须在生产细胞中适当表达并整合到载体中。由于这些蛋白质属于载体表面，它们直接与大量介质相互作用，因此受到加工过程中应用的物理化学条件的影响，如剪切力、盐浓度和pH值。因此，包膜蛋白的选择对于载体设计很重要，不仅影响载体的功能和预期靶标，还影响载体在加工过程中的初始表达、对生产细胞的影响以及在下游加工过程中的单元操作的影响。许多病毒包膜蛋白可以伪型到LV颗粒上。然而，最常用的伪型包膜蛋白，并且被广泛认为是黄金标准，是来自印第安纳囊泡性口炎病毒的VSV-G糖蛋白。这种蛋白质通常被使用，部分原因是其广泛的嗜性，与大多数细胞类型中普遍存在的低密度脂蛋白受体（LDL-R）相互作用。然而，从载体设计的角度来看，VSV-G的缺点是表现出细胞毒性，导致在高表达时LV生产细胞系中的细胞不稳定，并限制了其在瞬时转染方式中的应用。尽管已经展示了VSV-G的稳定表达，但可能是由于载体超感染或表达减少导致结果不佳。尽管如中所述，VSV-G的诱导性启动子可能避免由组成型表达引起的细胞毒性，但这在加工过程中可能会由于诱导剂的添加或去除而出现问题（见第3.2节）。VSV-G LV通常应用于体外疗法，因为它们会被人血清中的补体灭活。在体内，对VSV-G的额外免疫反应是显而易见的，这可以通过适应性免疫反应抑制随后的LV给药。此外，尽管LDL-R普遍存在，但临床上有价值的静止淋巴细胞对CAR-T疗法的受体表达特别低，因此转导效率低下，除非事先激活。然而，由于VSV-G提供的高功能性滴度，其应用广泛，是常用的包膜蛋白。 包膜蛋白受到需要在下游加工中考虑的物理化学条件的影响。带有VSV-G包膜的LV已观察到在pH偏离pH 7时灭活，并且在用1M NaCl处理时，1小时内失去50%的功能滴度。对载体加工的影响在超速离心中尤为明显，其中带有包膜蛋白VSV-G的LV在超速离心中的表现优于带有流感包膜蛋白的LV或HIV-1包膜蛋白超过VSV-G，并且似乎对剪切有抵抗力。在加工过程中需要考虑包膜蛋白的稳健性，并解释载体包膜稳定性的差异。 已经研究并应用了其他包膜蛋白进行LV伪型化。来自与VSV相同的囊泡病毒科的糖蛋白Cocal-G与VSV-G共享71.5%的氨基酸序列，因此具有类似的特性。通过Cocal-G包膜的LV的转导已被可溶性LDL-R抑制，类似于VSV-G，因此可能通过相同的LDL-R或类似受体感染。与VSV-G不同，Cocal-G不会被人血清灭活，并且可以恒定表达，允许在载体生产细胞系中稳定表达的潜力，尽管这会导致超感染和细胞不稳定。已经检查了其他囊泡病毒科糖蛋白用于稳定生产细胞系的生成，如来自PIRY、Chandipura和VSV-New Jersey的那些，它们显示出105到106 TU/mL的滴度，在浓缩和冻融过程中稳健。此外，已经应用了病毒包膜蛋白RD114进行载体生产。来自猫内源性逆转录病毒的RD114包膜显示出较少的细胞毒性，不会被补体灭活，并允许在稳定生产细胞系中使用。这些包膜蛋白能够转导CD34+细胞，并在超速离心中显示出稳健性，50-70%的产量与100-200倍的浓缩。RD114已经进一步修改，通过在HIV基质/衣壳蛋白裂解位点的R肽裂解位点插入HIV基质/衣壳裂解序列，从而产生了RDPro包膜蛋白，与RD114相比，在瞬时生产中显示出更高数量级的滴度。这些RD114衍生的包膜蛋白进一步防止了超感染的作用，即产生的载体被阻止转导它起源的细胞系，并已在CAR-T疗法的淋巴细胞转导和CD34+前体细胞中找到应用。其他包膜，如仙台，需要胰蛋白酶处理来通过蛋白裂解激活包膜，尽管需要考虑在加工过程中补充额外的单元操作。此外，激活的仙台包膜在超速离心中表现较差，与未裂解包膜的50%恢复率相比，恢复率降至20%。 随着病毒载体的伪型化，理论上，任何在细胞表面表达的病毒组分都可以使用。然而，这些方法依赖于病毒蛋白，这可能会引起安全方面的担忧，并在筛选上增加开发成本。已经应用的一种方法是“即插即用”包膜蛋白，通过二硫键将细胞靶向蛋白共价键合到它们的表面，或者通过生物素化的靶向配体。这样的工作可能会改善载体的可能靶向机制，尽管这可能需要在加工过程中增加额外的单元操作以完全结合靶向组分。 3.慢病毒载体的上游生物加工 上游加工的重点是在批量生产LV的同时，允许有效的下游纯化。有几个重要因素需要管理，这些因素取决于生产模式，无论是通过质粒对细胞进行瞬时转染，还是使用稳定或可诱导的生产细胞系。一个基本因素是细胞的可扩展性扩展、它们的活性以及达到最佳LV生成的合适细胞密度。因此，细胞系的类型，无论是贴壁还是悬浮，用于扩展的生物反应器、具有适当补充的细胞培养基类型以及适用的瞬时转染方法，都是需要考虑的重要因素。 3.1.LV生产的细胞系 需要一个合适的细胞系来以高滴度生产LV颗粒。通常，选择的细胞系是人胚肾细胞293（HEK-293），特别是衍生的293T系。HEK-293T具有SV40 T抗原，这与抑制p53和阻止细胞内先天免疫反应的激活有关，已被证明可以提高LV的滴度。这种后继细胞系比其前身显示出几个优点，特别是更短的倍增时间、更高的转染效率和更高的载体滴度以及适应悬浮培养。培养密集的细胞群体对于高载体滴度非常有益，因为从理论上讲，每个细胞都是LV的产生单元。然而，这需要在整体流程上进行一定程度的优化，因为高细胞密度与较低的细胞活性相关，这将在加工过程中需要去除更多的污染物。这个缺点可能会抵消更多细胞数量带来的滴度优势。 3.2.瞬时、稳定和诱导生产 LV生产的主导模式是瞬时转染细胞，使用各种质粒表达和包装LV。最初开发这种方法是为了最小化复制能力载体的风险，这种方法已经经历了代际发展，以提高产量和安全性。质粒与化学转染剂共转染，通常给出的滴度在非纯化的范围内为10^6到10^7 TU/mL，尽管更大的转基因会给出较低的滴度。尽管如此，用残留的质粒DNA和转染试剂污染饲料是一个问题，需要去除这些。由于转染剂的细胞毒性问题，通常需要在转染后进行培养基交换，这需要额外的设备用于泵和罐混合质粒DNA、转染试剂和培养基，此外还增加了整体培养基消耗。此外，许多因素可以影响转染效率，包括质粒浓度、试剂：DNA比例、细胞密度、孵化时间、混合方案、温度和pH，其中一些在扩大规模时具有挑战性。因此，载体滴度的批次间变异性明显。临床级质粒和转染试剂的成本为生产运行增加了大量费用，通常至少使用每百万细胞1µg质粒DNA。有多种转染试剂可用于LV生产，选择哪一种将极大地影响生产运行的处理步骤和货物成本。磷酸钙（CaPi）是一种经济的转染试剂，通常在实验室或小规模使用，涉及在混合氯化钙和DNA与HEPES缓冲盐水时形成细小的磷酸钙和DNA沉淀物。沉淀物沉降并被细胞内吞。然而，这种方法由于混合两个缓冲液以产生一致的沉淀物而难以扩大规模；需要优化的变量，如组分浓度、温度和聚集时间。由于pH的微小变化，该过程进一步复杂化，这会对转染效率产生负面影响。此外，CaPi转染可能会在没有血清或白蛋白保护作用的细胞培养中引起细胞毒性。阳离子脂质体，如脂质体，也已被使用。它们形成包裹DNA的脂质体，通过与DNA的负电荷复合。脂质体与细胞膜融合，释放其内容物进行表达。尽管能够转染许多细胞类型，但脂质体具有细胞毒性，可以降低活性，因此在应用后需要进行培养基交换，因此通常只在开发规模使用。聚乙烯亚胺（PEI）更适合可扩展的转染，通过形成细胞内吞的与DNA的多聚体，提供了一个高效且成本效益的选择。多聚体的形成和降解是时间的函数，因此有一个最佳的使用窗口。尽管如此，PEI被认为比CaPi更简单，不需要严格控制以获得最佳的转染效果，同时使用的质粒DNA也更少。重组杆状病毒也被用作转染试剂来转移病毒组分，尽管这可能会导致在下游加工（DSP）中分离杆状病毒和慢病毒载体的更大成本。无论采用何种方法，载体生产通常在转染后48小时内达到峰值，从72小时开始下降，为收获提供了有限的时间窗口。理想情况下，载体群体的质量应该是相似的，尽管由于每个细胞规模上的转染效率不同及其对活性的影响，载体群体通常是异质的。瞬时转染的替代方案可以在稳定生产或包装细胞系中找到（见表3）。在这些细胞系中，病毒组分在细胞内恒定表达，不需要额外的质粒和转染试剂，除了包装外，只需要转移质粒。这简化了上游培养，并避免了来自残留质粒的额外成本和污染物负荷。此外，稳定细胞系生产者可能会产生更高质量的颗粒，由于生产的克隆来源，允许产生近乎同源的颗粒。此外，这种收获往往更清洁，可能由于存在的基于包膜的囊泡较少，以及缺乏质粒和转染试剂负荷。这样的稳定细胞系有潜力提供成本效益、可扩展和可复制的载体运行，每批之间的变异性较小，因为每个细胞将保持一致的生产能力。 高性能的稳定生产者通过基因组标记、筛选活性位点并用慢病毒组分替换而创建。例如WinPac和LentiPro26这样的细胞系已经被开发出来，它们提供了每天每毫升10^6 TU的滴度范围，前者利用逆转录病毒标记和重组酶介导的盒交换来高表达Gag-Pol，后者应用了活性较低的突变病毒蛋白酶来维持细胞活性并提高滴度。这些稳定的生产细胞系可能很难开发，需要分离和评估单个克隆的组分表达，这些需要在筛选抗生素中培养以维持滴度。 为了简化这一过程，已经开发了努力，例如使用细菌人工染色体，它将所有载体组分结合在一个单一的构建上，或者开发高通量筛选方法，例如将编码部分GFP片段的单个分离生产细胞与表达互补GFP片段的细胞共同培养，并监测GFP的重组以识别高产者。然而，关键地，稳定生产细胞提供的滴度低于瞬时引导方法，因此它们的采用是个问题。这特别是由于病毒蛋白表达可能对细胞产生的细胞毒性效应，例如蛋白酶，它与裂解促凋亡蛋白有关，以及包膜蛋白选择的限制。例如，VSV-G，一种高效的包膜蛋白，很难恒定表达。潜在的细胞毒性转基因也对长期在稳定生产者中表达是个问题。这个问题已经通过一种细菌色氨酸RNA结合衰减蛋白得到了解决，它通过结合在核糖体启动位点的上游来阻断转基因表达，限制了它在生产细胞系中的表达。 通常，生产或包装细胞的最大挑战是在维持高滴度的同时管理细胞毒性或细胞静止效应。虽然这可以通过可诱导系统来减轻，并且已经用LV实现了，但这些方法目前并不完全实用。Tet-on诱导将需要添加四环素，这必须在稍后去除，而tet-off诱导可能需要延长培养时间以达到表达高峰，并且还需要完全更换培养基，这可能是不经济的。在所有可诱导的情况下，也存在“泄漏”表达的风险，即LV的非控制生产是可能的。 尽管如此，随着进一步的开发，稳定生产者的应用将在LV生产中大有裨益。这些改进可以以高通量自动化克隆分离和评估的形式，以及改进的盒设计、包膜选择和细胞系开发。优化LV生产的可能策略是上调抗凋亡基因，下调细胞内感知，并优化蛋白质和脂质生成途径，以有效生产载体。 3.3.用于生产慢病毒载体的上游培养 为了生产高滴度的LV，需要大量的细胞。有各种解决方案来扩展生产细胞的数量（见表4），追求不同规模的贴壁或悬浮细胞。在开发过程中，需要小批量大小的灵活性，通常由贴壁培养主导，主要是因为HEK-293T天生是贴壁的，提供的高细胞密度和易于接触。这通常由培养瓶、培养皿和瓶子来满足。随着规模扩大，需要更大和更一致的批量大小，生产转移到搅拌罐、摇摆波和固定床生物反应器中，多层培养瓶跨越中间规模。就有效的货物成本生产而言，最近的一项研究表明，一次性搅拌罐在悬浮培养可用时最具成本效益，否则固定床比贴壁培养瓶提供更大的节省。许多上游培养容器也已经过渡到一次性使用。这些不仅有助于减少变更时间，还有助于通过减少设备的清洁和灭菌阶段来帮助验证。 3.3.1.贴壁培养 在开发阶段，贴壁培养是理想的，但在规模上受到限制。这里，要么用多个培养瓶进行扩展，要么垂直扩展到多层培养瓶。这些培养瓶提供了一系列的表面积供细胞附着和生长，1-40层CellSTACKS（Corning，636-25,440平方厘米）和1-40层细胞工厂（Nunc，632-25,280平方厘米）通常被使用。此外，HYPERflasks（1720平方厘米）和HYPERStacks（6000-18,000平方厘米）（两者都是Corning）提供了气体透过的塑料用于O2和CO2的大规模转移，因此不需要像生产载体那样大的头空间。这些系统的扩展或扩展在高表面积时变得越来越笨重和难以处理，需要更大的培养箱空间和运输考虑，通常需要额外的设备来协助。随着扩展，手动处理增加，开放操作的污染风险增加，特别是当批次经常汇集进行下游处理时。此外，转染阶段倍增，增加了变量载体生产的机会，并增加了技术人员的工作复杂性。培养瓶和滚瓶中的贴壁培养不允许培养管理，本质上是批量模式，没有内联能力来监测和控制溶解氧、pH值、废物产品和营养补充。 对于贴壁细胞的另一种培养方法是微载体，已经应用于HEK-293和HEK-293T的逆转录病毒载体和LV。这些微载体可以是多孔的或固体的，允许细胞在内部或表面生长。然而，微载体已经与结块和细胞脱落有关。此外，微载体内部可能会发生微环境，其中外表面细胞限制了营养物质和氧气的大规模转移，同时限制了有毒代谢产物、CO2和病毒颗粒的释放，导致LV滴度低。 为了扩展目的，来自贴壁细胞的LV生产通常转移到固定床生物反应器中。作为基于培养瓶或瓶子培养的替代方案，细胞在由高度多孔微纤维载体组成的3D基质上扩展，提供了经济体积下的大量表面积。这种反应器已经应用于逆转录病毒和腺病毒载体。商业化的固定床生物反应器的例子是Pall的iCELLis或Univercells的Scale-X生物反应器，分别提供0.53-500和2.4-600平方米的表面积。这样的生物反应器允许对生产载体的培养参数进行内联监测和控制。内联监测提供了对生物加工环境的更深入了解，并提高了离线的应用程序在硅模型的未来优化中。 此外，Scale-X流程可以作为Univercells的Nevaline的一部分进行加强，提供切向流过滤（TFF）的内联浓缩和模块化下游处理选项，如澄清和色谱。iCELLis已用于在固定灌注速率或针对特定葡萄糖目标的灌注系统中生产瞬时LV，最终在灌注模式下（总体积5.5升）的4平方米填充床上实现超过10^10 TU的滴度。尽管这项工作表明仍需要优化，因为固定床反应器受到细胞分布不良的影响，可能不会最佳地扩展，也不会在更大的压缩下允许有效的转染，最终每平方厘米的生产力低于贴壁培养瓶。在细胞分布更均匀的Scale-X生物反应器中也产生了类似的滴度。iCellis Nano中LV的LV与在cGMP条件下使用10层细胞工厂生产的LV的并排比较也证明了类似的转导效率。尽管如此，这项研究中的iCellis Nano的单一运行相当于30个三重培养瓶，展示了上游规模选项的影响。 3.3.2 悬浮培养 悬浮培养通常应用于各种重组蛋白的生产，因为它们易于规模化、对培养参数的控制以及工业上的广泛熟悉。对于LV生产，HEK-293T培养可以适应悬浮培养，并用于传统的搅拌罐生物反应器和摇袋。悬浮培养为规模化提供了解决方案，最小化了手工处理，允许灌注培养、自动化、内联监测和控制，以及转染试剂的简化应用。然而，必须使细胞适应悬浮培养才能在这些生物反应器中使用。这可能很难完成，而不损失生产力，滴度在10^6 TU/mL范围内及以下。直到最近才有滴度通过在悬浮介质中逐渐适应达到10^8 TU/mL。通常，细胞密度远低于贴壁培养，因此在这些方法中载体自然会被稀释。此外，还需要额外考虑初始澄清，以去除悬浮的细胞。 搅拌罐生物反应器为LV生产提供了最简单的规模化方法。这些单元可以结合开发规模的生产，如在Ambr生物反应器中用于HEK-293T生长优化，到10L Biostat的更大规模，后者的生物反应器据报道可以扩展到10,000 L。此外，Pall Allegro报告了1.1×10^10 TU/L的滴度。搅拌罐生物反应器的规模化遵循典型的规模化参数，如跟随kLa体积传质系数、功率体积（P/V）比率和叶尖速度。由于哺乳动物细胞通常比细菌细胞需要更少的kLa，因此规模化参数倾向于P/V和叶尖速度，以防止对生产者细胞造成剪切损伤。尽管在规模化方面，瞬时转染生产策略的限制是明显的，其中可能需要更换培养基，这在悬浮细胞中更加困难。 摇动生物反应器为生产者细胞的扩展提供了一种方法，使用一次性充气的可处置袋，在平台上轻轻摇动细胞和培养基以促进混合，规模为10-200 L。该方法提供了高气体传质，同时由于缺乏搅拌器，为细胞提供了低剪切环境。这种生物反应器已被用于在临床规模上从稳定生产细胞系生产载体，尽管这次运行在这个例子中使用了Fibra-Cel盘作为生长基质，尽管悬浮细胞在专利文件中有所记录。 3.3.3 灌注培养 灌注培养的选择可以去除细胞废物，因为它们在发展过程中产生，并维持生产细胞的营养水平。载体在培养容器内的停留时间也减少了，这意味着由于时间敏感的损失，存在的非功能性载体较少，从而提高了产量。这种灌注方法在批量运行中允许高达15倍的改进，每升高达10^11累积TU，在固定床反应器中取得了更好的成功。此外，由于载体对温度敏感，灌注可以将载体带到一个较凉爽的环境中，远离对细胞不稳定的较温暖的培养温度。尽管灌注培养需要根据设定的灌注速率消耗大量的培养基，这可能会增加成本，但一些单克隆抗体（mAb）过程表明与补料批次方法相比，有潜在的成本节省。灌注培养理论上可以集成到任何下游流程中，如色谱，用于连续纯化和加强流程。 3.3.4 细胞培养基和补充剂 培养基的选择直接关系到生产者细胞的扩展和活性，以及下游加工的成功，因为培养基负责载体的稳定性，并形成了要处理的初始载体含料。 有一种趋势是去除LV生产的血清。许多LV生产策略使用血清来协助最佳细胞生长和载体本身的稳定性，这似乎从高蛋白溶液中受益，很可能是由于与白蛋白和脂质相关的稳定。补充白蛋白显示了在DSP加工中载体的稳定。然而，大多数使用的血清都是牛源性的，因此牛相关疾病传播和全球短缺的威胁是令人担忧的。虽然重组人白蛋白可能作为替代品，但这将增加生产成本。此外，高蛋白质负荷给下游流程增加了压力，必须去除大部分血清污染物。这样的压力导致了无血清培养基在细胞培养中的使用，并且现在在LV生产中已经很好地建立，产生的滴度与含血清培养基相当；HyCell TransFX、FreeStyle 293和SFM4TransFx-293只是一些商业上可用的培养基的例子。这种无血清表达载体通常涉及在培养中顺序减少血清，直到细胞适应低或零血清浓度。否则，一个常见的上游策略是在含血清的培养基中扩展细胞，然后在载体收获前换成无血清的替代品。 细胞培养的补充与LV滴度的提高有关。添加丁酸钠与提高重组蛋白生产有关，通过抑制组蛋白去乙酰化酶，导致转录因子功能改善，从而增加来自病毒LTRs的RNA副本并提高LV滴度。额外补充胆固醇和脂质与提高滴度有关，很可能是由于稳定了病毒出芽的细胞表面脂质筏。然而，一项使用仙台F/HN包膜蛋白和不同培养基类型的研究发现，额外的补充并没有显著提高产量，但仍然建议较小的累积效应可能是有益的。由于细胞培养基中咖啡因的存在，在转染后产量有所提高，尽管这样的结果尚未复制。此外，有报道称，在收获前将pH降至6可将滴度增加三倍。在这个实验中，使用了VSV-G包膜蛋白，而在pH 6下其感染力可能降低，因此可能减少了超感染的影响。研究还表明，高细胞培养基渗透压与提高逆转录病毒稳定性有关，因为病毒膜中胆固醇与磷脂比率降低，导致稳定性提高。 4.慢病毒载体的下游处理  慢病毒载体（LV）的下游生物加工关注于最大化载体的回收并最小化可能对产品功效或安全性产生负面影响的成分，同时保持经济可行性。虽然最终产品概况取决于载体是体内还是体外应用，以及最终的转导单位数量取决于验证的治疗剂量，但总的来说，生物加工操作必须减少杂质的数量，同时保持病毒效力以确保最终用户的安全。这些杂质可能包括残留DNA（来自宿主细胞和质粒）、宿主细胞蛋白、血清、蛋白多糖以及与过程相关的杂质，如核酸酶和可浸出物。 LVs的完整下游处理由许多单独的单元操作组成，旨在实现载体材料的纯化、浓缩和稳定性。简而言之，一个典型的过程包括连续的纯化步骤，包括去除细胞及其碎片，然后是载体的富集以及去除宿主细胞或血清蛋白、核酸和脂质。载体产品可能在交换到适合稳定性的配方缓冲液之前进一步浓缩，然后最终在储存或应用之前进行无菌过滤（请见第6节对整个生物加工评估）。 4.1. 载体过滤：初始澄清 澄清和无菌过滤过程旨在去除细胞和细胞碎片等大颗粒杂质。澄清通常在过程的早期进行，因此在处理高负载的细胞和细胞碎片以及稀释的LV浓度时，而无菌过滤发生在生物加工的后期阶段，处理较低浓度的细胞或细胞碎片和较高浓度的LV颗粒。用于澄清的初始下游阶段通常是微滤和/或离心。细胞和大部分颗粒可以通过低速离心沉淀并去除。或者，可以使用声波过滤器在收获期间使用声波捕获悬浮细胞并返回到生物反应器。两者都随后通过膜或深度过滤器进行微滤。初始的离心作用是作为预过滤步骤，以防止过滤器过早堵塞。在大规模生产运行中，需要考虑离心机的容量，因为容量考虑。连续离心机的应用，如在单克隆抗体和重组蛋白加工中普遍的盘式堆叠离心机，在LV生产中尚未看到，因为低容量处理（升到几百升）和这些过程的典型批次模式需要与离心机的高资本成本与过滤选项相平衡。 过滤技术在初始澄清中占主导地位，一次性系统提供了简化的清洁和验证。使用级联过滤器，即用逐渐精细的过滤器过滤料液，可以防止最终过滤器过早堵塞，这可能导致由于载体排除和通量减少而导致滴度损失和处理时间延长。过滤器的选择影响澄清步骤的效率。对于膜过滤器，料液通过具有特定孔径的平坦或褶皱的惰性聚合物片，根据膜的绝对保留等级进行穿孔。深度过滤器是一类具有海绵状质地的过滤器，其中颗粒在通常由聚合物、粘合剂和过滤助剂（如硅藻土）组成的整个过滤器床上被保留。对于一些深度过滤器，介质带有电荷，用于电静力保留宿主细胞蛋白和DNA，硅藻土显示出改善的料液容量，尽管在高浓度下它可以降低LV滴度。在一些小规模研究中，使用包括基于纤维素和合成介质（如聚丙烯酸纤维与硅过滤器助剂）的多个深度过滤器介质，已经显示出90%的浑浊度降低，同时保持高恢复非包膜载体，如基于猴腺病毒的载体。在LV应用中，没有过滤器助剂如硅藻土的深度过滤器恢复了>95%的滴度，同时在50 L规模上减少了>85%的HCP。通常，大多数保留等级在微滤范围内从10到0.2 µm以级联方式应用，要么只应用膜，要么应用深度过滤器和膜的序列进行更细的过滤。在直径80-120 nm的LV可以通过小保留等级的过滤器，尽管典型的终点0.22 µm确实看到滴度损失。表5中列出了一些用于澄清的可用过滤器的例子。 载体的性能取决于过滤器的保留等级、料液的质量和该规模预期的负载挑战。在高度污染的过滤器中，高跨膜压力可能导致杂质潜在地转移到滤液中，可能是由于过滤器表面细胞或片段的破裂。澄清受到上游生产的影响，悬浮培养需要去除整个细胞，而贴壁培养可能由细胞片段组成。此外，用于LV生产的瞬时转染产生与稳定生产细胞系不同的宿主细胞蛋白谱，并且可以根据使用的包膜蛋白而不同。在所有情况下，由于吸附到过滤器或被过滤器排除的组分，以及过滤系统保持体积中的损失，预计会有一定程度的LV损失。对于许多澄清过程，冲洗过滤器与缓冲液后处理是理想的，以摆脱任何吸附的载体，以改善恢复并清除死体积。 虽然通常应用于浓缩和透析（见第4.6节），切向流膜微滤也可以应用于澄清。由于切向料液流动，膜表面积累的任何蛋糕层都被去除，维持通量，与传统的死端过滤模式相反。最近，一种新的过滤器介质，Repligen的2-5 µm深度过滤器在切向流过滤中使用，以在收获时分离悬浮细胞和LV，报告的LV产量为90%。这种方法可以将悬浮细胞与LV收获物分离，允许回收生产细胞以进行持续培养和顺序收获的机会。 4.2 载体过滤：无菌过滤 无菌过滤通常是下游过程的最后一步，在这一步骤中，经过纯化、浓缩和配方的病毒载体通过一个精细的过滤器，以去除任何偶然的微生物，如细菌或真菌，同时保持LV滴度。在使用0.22 µm注射器膜过滤器进行无菌过滤期间，报告了30-50%的滴度损失。这部分是由于配方不足或纯化不良导致过度聚集和载体损失。由于载体回收率低和偶然微生物存在的风险，无菌过滤可以早期在封闭系统中进行，或者完全可以取消，尽管这将受到监管机构的密切审查。 4.3 非色谱纯化 LV的纯化寻求利用载体和其他介质组分之间的差异，即大小、密度、电荷或对固定相的特异性。这可以通过多种方法实现，常见的单元操作是超速离心和色谱（见第4.5节）。超速离心是一种纯化和浓缩载体的单元操作，通常在载体生产的研究和开发阶段应用。这种技术也广泛用于通过在大g力下沉淀病毒颗粒来纯化逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。由于载体的体积比溶液中的游离蛋白大，载体最初被沉淀，蛋白质留在上清液中。或者，使用梯度（通常使用蔗糖、菲可尔或碘克沙醇分层逐渐更密集的层），载体可能出现在特定的带或沉淀物中，而介质污染物在前面的层中，尽管与载体密度相似的囊泡或杂质可能会与载体共同沉淀，除了抑制蛋白多糖。然而，通过蔗糖梯度生产的载体在小鼠中显示出较少的免疫原性效应，可能是由于血清污染较少。载体颗粒可以重新悬浮，并重新旋转以获得更大的纯化，多达四轮提供相对清洁的材料。此外，一些包膜蛋白可能在操作期间受到剪切力的负面影响，VSV-G特别耐剪切。此外，颗粒本身可能受到梯度渗透压的损害。此外，任何梯度成分可能需要在顺序过程中去除。高速离心机（10,000×g）也可以用于纯化，尽管这可能需要延长旋转时间，有报道称使用蔗糖旋转时间长达4小时。然而，用于载体纯化的离心可能耗时、规模受限（与超速离心机的容量相关，除非追求规模扩展）和劳动密集型。因此，它的应用通常限于研究、开发或早期临床试验阶段。 LV可以通过向含有载体的介质中添加辅料来沉淀，这可以用于浓缩目的。已经使用了聚乙二醇（PEG）、聚-L-赖氨酸、软骨素C硫酸盐和鱼精蛋白硫酸盐的混合物和磷酸钙等沉淀剂。在大多数情况下，载体与材料一起孵化，然后通过离心沉淀，重新悬浮和解聚沉淀物，然后进行进一步的处理，如TFF或透析。作用模式是由于溶剂可用性降低导致溶解度降低，从而引起载体沉淀或由于电荷导致聚集。然而，使用沉淀剂可能需要额外的处理来去除它们，以及延长时间来完全沉淀载体颗粒，并与多达16小时的孵化常见的沉淀物一起沉淀。此外，重新悬浮和解聚沉淀物可能是有问题的，当使用磷酸钙时需要EDTA处理。尽管如此，在这个单元操作中报告了50%到100%的功能恢复。 4.4 核酸减少 核酸杂质来自转染的质粒DNA或生产细胞系的宿主细胞DNA。在处理过程中需要减少核酸，以提高纯度并防止对受体细胞或患者的任何有害影响，残留DNA的限制被设定为长度<200 bp，每剂<10 ng。这可以通过在过程中的某个时候添加核酸酶，如苯酰核酸酶来完成。通常，核酸酶直接添加到生物反应器中的LV培养物中，在收获前或收获后不久，或在澄清后。然而，由于这些阶段的体积较大，需要更多的酶单位才能有效，这会产生成本。另一种选择是生产者或辅助细胞分泌核酸酶，如Oxford Biomedica开发的SecNuc，其中与载体组分共转染编码核酸酶的质粒，或生产细胞与表达核酸酶的细胞共培养。否则，核酸酶可以在浓缩步骤后添加，以降低酶的需求。无论何时添加酶，它们必须在下游进一步去除，并且必须考虑高核酸负担的影响，如在色谱中的共洗脱和/或降低的结合能力，以及核酸复合物的形成。此外，必须考虑载体所在的缓冲液的组成，以实现最佳消化，因为一些核酸酶需要镁离子、升高的温度和特定的pH范围才能有效，以及所需的孵化时间，这可能会导致载体灭活。核酸也可以通过仔细选择离子交换或混合模式流穿色谱（见第4.5节），或使用稳定生产细胞（第3.2节）和全介质替代在上游（第3.3节）的TFF来减少。 4.5 色谱纯化 色谱是一种单元操作，通过其与固定相和流动相的相互作用来分离混合物的组分。它是一种可扩展的解决方案，用于纯化和浓缩颗粒，并且与离心相比相对较快，并且易于自动化，以实现一致和可靠的结果。它在纯化许多生物来源的材料方面有广泛的应用，如单克隆抗体、重组蛋白、工业酶和核酸。通常，用于解决饲料的相互作用是尺寸排除色谱（SEC）中的组分大小，离子交换（IEX）中的电荷，以及疏水性和对固定相或流动相的亲和力。这可以以捕获和洗脱模式运行，或以流穿模式进行抛光和改进。对于LV的纯化，可以应用多种类型的色谱，观察到不同的恢复率（见表6）。 色谱的固定相开发主要集中在小分子的纯化上。这导致了多孔珠基固定相的广泛应用，以最大化表面积，实现高动态结合能力。由于组分的尺寸较小，质量传递以扩散为主。这对于病毒颗粒来说是有问题的；由于它们的尺寸，珠孔太小，因此它们的内部表面积无法接触，从而降低了结合能力和载体捕获的性能。此外，由于基于扩散的质量传递，固定相的流速往往较慢，降低了产量，这可能导致由于过程时间增加而导致滴度损失更大。鉴于这些限制，已经开发了依赖于对较大颗粒的对流质量传递的新固定相（见图1）。这样的相允许更大的流速和产量，同时保持可用的表面积以结合能力。最简单的是大孔固定相，如单体，其中许多通道形成一个海绵状结构供料液流过。单体的特点是它们的大表面积与体积比，并且已经成功地纯化了多种类型的病毒，包括具有不同包膜的LV。或者，膜固定相也提供对流质量传递。这些遵循典型的平坦或编织片，可能堆叠在一起以增加容量，具有供料液流过的孔，并允许捕获载体。最近开发的是纳米纤维旋转固定相，它提供阴离子交换色谱（AEX），并实现了约90%的LV恢复，由Puridify开发，现在由Cytiva（前身为GE Healthcare Life Sciences）拥有。这些相由薄的电纺线定义，移动相可以流过，保留在纤维本身上。这种纳米纤维在LV和腺病毒的结合和洗脱中已经显示出实用性，尽管商业容量目前集中在mAb市场上。一些混合模式色谱应用也已经开发出来。虽然AEX已被证明是纯化载体的有用工具，但最终洗脱中仍存在一些杂质，特别是DNA和蛋白多糖。因此，已经开发了一些混合模式固定相，如CaptoCore。这些结合了尺寸排除和AEX色谱，在负模式容量下纯化载体。在这种方法中，载体被排除在带有AEX配体的内部核心之外。因此，载体流过柱子，而带负电的DNA或其他较小的蛋白质被捕获和去除。这可以作为载体和病毒的抛光步骤或污染物减少步骤。 图1. 用于慢病毒载体纯化的色谱树脂的说明性示例，从左到右展示了对流质量传递的增加。 4.5.1 阴离子交换色谱 LV在中性pH下表面具有净负电荷，由于外部包膜的组成和它们的整体等电点，因此使用季铵盐（QA）或二乙氨基乙基（DEAE）配体的AEX色谱是捕获和洗脱它们的可行选择。对于逆转录或慢病毒载体，洗脱往往是分步进行的，首先通过顺序增加盐浓度洗脱松散结合的组分以提高纯度，然后最终高盐缓冲液洗脱载体。McNally使用0.3 M NaCl的初始洗脱，然后上升到1.3 M进行载体洗脱，整个过程中保持pH为8的Mustang Q AEX。对于像DEAE这样的弱配体，这个配置文件可以类似于pH 8和NaCl浓度为0.1和0.65 M。分步洗脱对载体特别有效，因为它们的大小大和表面成分可变，允许在固定相上的多个位点进行相互作用，并且因此与单个料液组分相比保留得更多。然而，这确实需要更大的盐浓度或pH变化来洗脱，这需要立即稀释以保持稳定性，由于渗透效应或包膜降解。因此，色谱的浓缩方面被减弱，必须考虑增加的缓冲液消耗用于稀释。此外，LV的瞬时生产可能导致载体的异质种群，导致不同的洗脱种群，这可能归因于外部包膜的不同组成。无包膜蛋白载体显示比包膜阳性载体更低的等电点，具有不同的zeta电位，这可能会影响色谱纯化的效率，可能是由于与色谱固定相配体的多种相互作用。此外，已经证明，用NaCl预处理载体装载材料可以令人满意地抑制大量蛋白质与AEX材料结合，提高纯度。 4.5.2 亲和色谱 亲和色谱通过其对固定相配体的特异性来解决混合物的组分。这是一种可行的技术，可以允许在不使用高盐浓度洗脱的情况下实现载体的高纯度和浓缩，例如在离子交换中，从而在下游处理过程中保持载体滴度。由于捕获基于亲和力，理想情况下只有载体被保留和洗脱，残留的DNA和蛋白质在柱内保持未结合状态。以前，LV包膜上表达过组氨酸标签以帮助其纯化，但产量很低，为46.7%，大多数可能仍然附着在柱子上。同样，可以在载体表面表达生物素，允许其通过固定化的链霉亲和素捕获，并在添加生物素后洗脱，允许载体浓度提高4500倍以上。这已经通过在CD8α茎上添加生物素模拟物进一步开发，尽管在小规模上产量高（60%），但在扩大规模时下降到20%。此外，已经应用了一种类似的方法，将低亲和力神经生长因子受体（LNGFR）被动地结合到载体表面，因此可以通过固定在磁珠上的抗LNGFR抗体捕获，回收率超过85%，尽管没有从抗体珠上释放，并且只有通过将细胞与载体结合珠混合才能实现转导恢复。在载体包膜的外表面应用亲和标签也可能会引起一些监管方面的担忧，如果来自非哺乳动物来源，尽管这可能对于体外疗法来说可以最小化，因为在载体阶段的要求不那么严格。此外，观察到逆转录病毒载体与可溶性肝素混合时受到抑制，从而导致肝素亲和色谱在LV纯化中的应用，肝素和相关的肝素硫酸盐捕获LV，产量高达53-61%的载体。 4.5.3 尺寸排除色谱 尺寸排除色谱（SEC）是一种基于尺寸通过填充多孔珠的流动材料来解决饲料组分的方法。由于它们与较小颗粒相比的较大尺寸，LV可以被高度纯化，感染性恢复超过70%，纯度超过90%，尽管高分子量污染物和DNA可能仍然存在。此外，SEC的应用是将载体缓冲液交换到配方缓冲液中，或者在离子交换后去除盐分。然而，由于线性流速降低，该步骤的整体产量较低。此外，SEC在进料体积较低时最有效，大约是床层柱的15%，以保持有效的分离，因此需要事先浓缩。由于感兴趣的产品在洗脱过程中被稀释，可能需要额外的浓缩轮次。最终，SEC可以作为抛光步骤，在先前阶段大部分污染物被去除后使用。 4.5.4 立体排阻色谱 与聚乙二醇的结合导致了立体排阻色谱的使用。该方法基于粒径大小选择性，可以作为病毒的一种快速替代SEC的方法。这种方法遵循与PEG沉淀类似的机制，不同之处在于存在一个亲水的固定相，供大颗粒凝聚。在洗涤柱子时，洗脱缓冲液中PEG浓度的降低会基于尺寸选择释放结合的载体。虽然该方法已应用于流感病毒，但LV的恢复率报告为60%。 4.6 切向流过滤的浓缩和缓冲液交换 切向流过滤（TFF）是一种单元操作，通常以超滤/透析（UF/DF）模式运行，允许在LV处理过程中体积减少和缓冲液交换，同时去除低分子量杂质，同时保留载体颗粒。它以不同的格式（表7）使用不同的参数（表8）。在这里，切向超滤允许体积减少以将载体浓缩至适当的滴度，并简化下游处理，减少体积进料。缓冲液交换（透析）通常跟在浓缩步骤之后，以优化更换缓冲液的消耗效率。载体可以交换到的缓冲液的选择对于维持载体的稳定性至关重要，无论是在冷冻-解冻过程中（见第4.7节），还是在交换到最佳的色谱结合缓冲液中，或者有效地转导受体细胞。除了TFF之外，这可以通过多轮离心和在所选缓冲液中重新悬浮或SEC方法来实现。然而，TFF提供了更大的自主性和减少的手工处理，同时保持高载体浓度。一些TFF系统使用中空纤维单元，而其他系统使用卡带，由不同的膜组成，如基于纤维素的（例如，混合纤维素酯）和聚醚砜（PES）。两种格式都是可扩展的，适用于载体浓缩和缓冲液交换的解决方案。两者都提供高表面积与体积比，尽管平板卡带可以比中空纤维提供更高的通量，尽管由于它们的迂回流路和湍流促进的屏幕，对载体颗粒的剪切率更高。使用TFF的膜允许盐、缓冲液和小分子物种根据它们的保留等级（通常以kDa表示）跨膜传递。TFF中澄清的效率与料液和每个单独组分的保留系数有关。一些研究小组已经将TFF作为色谱的替代品，作为澄清和纯化步骤，达到高达97%的恢复率，或者与超速离心结合使用，允许高达1800倍的浓缩。因此，TFF可以应用于多个实例，例如在色谱之后去除洗脱缓冲液中过量的盐，将缓冲液交换到配方缓冲液中，到色谱捕获的优化结合缓冲液中，或者在SEC之前的浓缩。此外，如果载体的生产要强化，可以使用串联过滤，使用中空纤维膜在连续减小表面积的中空纤维中浓缩产品，或者应用单次通过切向流过滤，其中没有循环回路，料液沿着长的迂回膜路径流动。尽管，截至撰写本文时，尚未发表LV的应用，单次通过TFF已在mAbs和重组蛋白生产中得到采用。随着过程的成熟，这些单元操作的实施是可能的，特别是与基于灌注的生物反应器和稳定生产细胞系相结合，允许最佳的连续生产。尽管如此，TFF的参数需要根据料液进行优化，因为流速和膜类型可能导致剪切损伤和载体损失。此外，跨膜压力、料液流速和料液组成对通量的影响由于污染可能导致处理时间延长，并需要更大的膜，这涉及到更大的保持体积。载体也可能吸附或被困在膜的表面，特别是如果孔径与载体大小相近，尽管更大的孔径提供更好的杂质去除和通量性能。因此，通常使用100-750 kDa范围内的膜，其中更大的孔径有利于通量，以牺牲载体吸附为代价，而较低的截止速度减慢通量以保持载体。运行后冲洗可以帮助释放吸附的载体，优化取决于该阶段的料液。此外，向料液中添加添加剂，如蔗糖或类似的粘度增强剂，可能保护载体免受剪切。 4.7 配方 LV的缓冲液配方对于在整个处理过程中以及最终应用中维持载体的转导能力是必要的。最终的配方将根据其应用而变化。例如，体内疗法可能需要更严格的配方，如使用注射用水以确保安全，与体外应用或在处理过程中临时冷冻的载体相比。对于许多体外疗法，通常将载体配方到细胞培养的细胞培养基中；这简化了过程，不需要考虑LV配方对细胞生长的影响。然而，这并不意味着LV的最佳配方，因为培养基组分可能无法充分稳定载体，或者可能允许载体聚集或吸附到容器上。这在冷冻过程中特别成问题，如果载体需要长途运输或存放一段时间，尽管细胞培养基中的蛋白质和糖的存在在这里可能有益。通常，缓冲液辅料作为载体配方的防腐剂。这些可以包括重组蛋白，如人血清白蛋白，因为一些蛋白质已被证明可以稳定载体，以及如蔗糖或海藻糖等糖，它们可以作为冷冻保护剂和渗透压调节剂。应该使用缓冲液种类来在各种温度下维持稳定的pH值（理想情况下是生理的），因此基于它们有效的缓冲范围和对温度的pH漂移抵抗力，已经使用了像HEPES和组氨酸这样的种类，与常见的缓冲液如TRIS不同，TRIS会看到pH漂移。尽管如此，已经在TRIS或磷酸盐缓冲液（PBS）中使用蔗糖或海藻糖进行冻干的LV长期储存中取得了成功。后者证明了载体在37°C下冻干至少四周的稳定性。一些NaCl可能有助于稳定性，添加氯化镁也可以防止聚集。另一个考虑因素是缓冲液对处理单元操作的影响，例如，常见缓冲系统中的负磷酸根离子与AEX色谱树脂中的带正电荷的配体发生相互作用。Kumru等人研究了多种辅料对LV物理稳定性的影响，通过观察粒径、形态和zeta电位，他们指出，当在37°C的玻璃中过夜孵化时，氨基酸脯氨酸和赖氨酸以及糖的甘露糖和乳糖可以最小化载体损失。导致吸附损失到玻璃上的辅料是盐（例如，氯化钙）、还原剂、螯合剂和阳离子肽。这些在冷冻-解冻周期中也被发现对LV有负面影响，而糖、多元醇和环糊精以及某些氨基酸如亮氨酸则有所帮助。然而，在这个实验中，只检查了物理稳定性，没有检查转导能力。 5.载体特性和质量控制  对于人体试验的应用，LV批次在放行前应进行广泛的表征和QC测试。为了保持安全性，产品必须保持在预先确定的规格范围内，这些规格由适当验证的、精确且可重复的检测协议支持。一个典型的LV批次将需要纯度、身份、安全性和效力的规格，并且这些必须在批次之间保持合理的一致性，如监管机构所要求的，随着潜在治疗从动物研究到商业发布的过程，严格性不断发展。所需的检测可以是大多数重组过程所典型的和预期的，但也可以扩展到载体和转基因特定的检测。例如，残留DNA可以通过Picogreen或定量聚合酶链反应（qPCR）进行检测，而宿主细胞蛋白可以通过酶联免疫吸附测定（ELISA）、SDS-PAGE或任何形式的总蛋白定量，如Bradford、Lowry或双缩脲酸比色法，以及标准的支原体和内毒素检测进行分析。过程中的添加剂，如核酸酶，可以通过ELISA进行滴定，也可以通过qPCR检测HEK-293T细胞中的SV40 T抗原（抗原的qPCR可以作为宿主细胞DNA杂质的信号）。由于载体颗粒本身的性质，包含核酸、脂质和蛋白质，以及区分功能性滴度和总颗粒数，载体特定的检测更为复杂。验证定量方法是LV开发过程和商业供应QA/QC的关键。由于各种工业或学术团体中可用的转基因、包膜蛋白和受体细胞的多样性，以及不同团体之间的滴度差异很大，这取决于操作者，因此达成方法学的共识是有问题的。尽管如此，在表征生产运行的有效性时，载体定量是必不可少的，并且作为监管批准的关键质量属性的要求。LV的定量可以广泛地分为定量载体的各个部分，这些部分在一定程度上有交叉，这些分组可以列为功能性、载体RNA定量、载体蛋白、载体酶活性和物理计数颗粒。对于功能性，选择的定量方法是转导已知数量的细胞并检查转基因表达。这种方法通常需要在各种稀释度下对感兴趣的载体进行滴定，并将载体溶液与已知数量的细胞混合。可以添加聚布雷恩以增强转导，通过最小化包膜蛋白和受体之间的静电排斥。在允许细胞扩张并稀释出任何短暂的转基因表达一段时间后，通常通过染色抗体或亲和染料检查细胞表达，除非使用标记基因（通常是GFP），并用流式细胞术进行分析。通过知道转导细胞的百分比、添加的载体溶液体积和细胞数量，可以确定转导单位。然而，这并不考虑可能在高感染度下出现的多重整合，因此必须进行滴定。此外，由于短暂转基因表达导致滴度过高的风险是显而易见的，因此建议在转导和细胞读取之间有适当的时间长度，以稀释出非整合的转基因，更好地反映长期细胞培养治疗。此外，总体积、细胞密度、细胞受体的可用性和搅动可能会影响结果，因此不同团体之间的滴度很难直接比较。理想情况下，转导的细胞应该是与目标受体细胞相同的类型，尽管通常使用HEK-293T。此外，在FACS分析期间的门控策略、染色的转基因数量和染色的质量需要考虑。此外，转导抑制物的存在，如非功能性载体、游离漂浮的包膜蛋白和蛋白多糖，可能会导致滴度被低报，以及载体从未接触到细胞或可用受体的机会。 可以通过整合测定非染色方案的功能滴度，其中提取转导细胞基因组DNA（gDNA），并通过qPCR定量前病毒，并与管家基因进行比较。这个测定可以是感兴趣的转基因特有的，尽管如果载体转基因和标准之间的序列共享，世界卫生组织（WHO）已经制定了一个标准，用于跨团体比较。qPCR可以定量多个整合，尽管这不是转基因功能性的指标。此外，质量取决于gDNA的分离和缺乏来自质粒、宿主细胞和短暂形式的DNA污染，因此需要扩增时间或/和核酸酶以最小化假阳性。考虑到测定仍基于转导效率，实际应用是在转导的细胞中，转基因难以染色或用于转导细胞gDNA的遗留采样。 核酸定量涉及载体RNA的定量。这种方法需要破坏载体，分离载体RNA，其逆转录为互补DNA，然后进行定量。值得注意的是，这种方法不定量载体功能，因此其应用在一定程度上是有限的。存在质粒DNA夸大结果的风险，这需要通过非逆转录对照或DNase处理进行校正。此外，非功能性但包装的载体可能会导致过度报告。它依赖于RNA提取的效率及其稳定性，尽管这可以通过添加RNA标准来控制。然而，其有效性对于过程开发目的可能是有问题的，因为样品中qPCR或逆转录酶的不同抑制剂可能会影响结果，例如色谱洗脱中的高盐。qPCR可以进一步扩展为数字滴液qPCR（ddqPCR），其中通过水-油乳液滴在高稀释下分离单个qPCR反应。通过计算阳性滴液的数量，可以按照泊松分布计算模板浓度，而无需标准曲线。这种技术已经与LV一起使用，即使模板非常稀少也可以提供结果，并可用于计算受体细胞中的载体副本数。 p24 ELISA测定是一种定量样品中p24 HIV衣壳蛋白质量的方法，可以作为常规商业试剂盒购买。基于抗体的测定可以在一天内提供蛋白质的定量，而功能性感染性需要2-3天。在测定中，载体通过洗涤剂破坏，然后在板上孵化，蛋白质通过电荷结合到塑料上或p24被预先固定的抗体捕获。另外孵化一次抗体并洗去，然后添加酶联二抗体。洗去后，结合的酶允许通过吸光度或荧光测量底物的变化，这直接对应于p24的数量。这种方法已被广泛采用，结果通常报告为p24质量与转导单位（P:I比率）的比率。这将颗粒质量与功能联系起来，因此作为载体质量的衡量，甚至允许团体通过估计每pg p24的1x10^4个LV颗粒来假设LV数量。然而，p24试剂盒依赖于它们抗体的特异性，在某些情况下会过度报告，因为包括未处理的p24形式，如GAG、载体片段和灭活或未成熟的病毒。 测量载体酶活性可以提供病毒蛋白的替代定量测定。在基于qPCR的产品增强逆转录测定（PERT）中，载体进行滴定并用洗涤剂裂解，然后与标准RNA模板混合。设置热循环器，进行逆转录的初始孵化时间，然后温度升高导致酶失活。然后运行qPCR以定量RNA模板转换为DNA的数量，与已知的HIV-1重组逆转录酶对照进行比较。由于它依赖于逆转录酶的活性，测定将对逆转录酶的抑制剂敏感，可能需要通过通常在qPCR主混合物中提供的惰性蛋白进行稳定。这可能在处理样品中看起来有问题，这些样品可能具有不同范围的稳定剂或抑制剂。然而，该方法是快速的，提供结果在2小时内，因此可以提供高吞吐量定量，一天内多个样品。与p24测定相比，该测定也可以更具成本效益，因为缺乏特定的抗体和使用常见的qPCR混合物。 另一种技术是物理颗粒计数。动态光散射（DLS）是一种方法，通过量化光束被颗粒中断时散射的光量，并使用样品的已知粘度，通过斯托克斯-爱因斯坦方程计算颗粒的水动力直径。结果可以在30分钟内获得，并估计平均粒径、多分散性和粒径分布的计算。尽管这也只确定物理颗粒数量而不是功能性，但DLS数据的质量随着多分散性的增加而逐渐不可靠，增加的颗粒数量导致散射错误，这会影响感兴趣的颗粒。这对于可能具有相当高多分散性的工艺混合物来说是有问题的，此外还有必须为DLS准确性表征的不同粘度。除非提供干净的样品，否则该方法主要用于混合物中的平均粒径和确定样品是否聚集。 尽管DLS技术已经通过多角度动态光散射得到改进，这增加了光散射的检测角度数量，并在高多分散性下提供了更稳健的结果，但颗粒浓度的准确性可能在名义值的50%以内变化。 基于与DLS相似原理的替代方法可以在纳米颗粒跟踪分析方法中找到。在这里，通过显微镜录制视频片段，并通过跟踪算法量化小颗粒的布朗运动。尽管无法区分LV与其他类似大小的颗粒，但一些新型号允许染色和跟踪特定荧光的颗粒，因此允许量化特定物种。同样，可调电阻脉冲传感检测通过小孔的颗粒大小和数量，并已与LV一起使用。 其他基于物理颗粒的定量可以通过在电子显微镜中计数颗粒来完成，使用负染色，现代系统，例如Vironova的台式MiniTem，提供自动化的电子显微镜和分析。此外，标记的LV的荧光可以与共焦显微镜中的荧光珠进行比较。这两种方法完成都非常耗时，并且不适用于大量样品。最近增加的一种方法，利用高性能液相色谱（HPLC）与AEX树脂，可以洗脱载体带，基于它们的荧光，估计每毫升范围内10^8到10^10个载体颗粒的数量。 这种方法已用于区分DNA和载体，并且与ELISA和ddPCR相当，允许在6.5分钟内应用来自过程不同方面的各种样品。尽管这种方法只量化载体颗粒，并不显示功能单位，但这种快速和高通量分析考虑对于过程开发具有很大的价值。 6.LV生产的整个生物过程评估  图2展示了生产慢病毒载体的不同过程选项。有些过程选项仅适用于小规模或需要少量剂量的应用程序（超速离心、SEC和篮式离心），而大多数是可扩展的（例如，过滤选项、色谱等）。操作的最终顺序取决于LV产品的规模、用于LV生成的技术、LV滴度以及所需的产品和杂质概况。在这方面，需要应用某些操作的实际点（例如，浓缩、透析、DNA消化等）将取决于这些因素。例如，应用苯酰核酸酶或类似产品进行DNA消化可能在LV生成步骤的任何地方进行，作为澄清步骤的一部分，或在色谱之前或之后。 图2. 慢病毒载体生产的生物过程选项。(1) 一些研究表明，在之前使用不同孔径大小的膜过滤或包含低速离心的序列。过滤过程的序列将根据规模、细胞密度以及产品和杂质概况来决定是否采用。(2) 这些是在临床前和临床研究中使用的操作策略的例子。(3) Benzonase 可以在下游过程中的多个步骤中添加。 在他们的综述论文中，McCarron等人提供了扩大慢病毒载体生产的挑战概述。这些在表9中简要总结。在LV生产中，生物过程理解在解决低恢复率和载体功能性丧失方面最相关。这始于对最终产品应用的理解，这定义了操作的最终规模，以及产品和过程规格。此外，确定影响过程选项性能的相关参数将对这些选项及其操作的最佳选择很重要。筛选研究可以提供关键的生物过程信息，例如TFF操作中的跨膜压力水平或横流速率，AEX色谱中的柱流速率，或TFF操作中正确的分子量截止（MWCO）或膜材料。确定在未配方LV产品的过程开发中使用冷冻-解冻材料的影响也很重要（例如），而不是使用新鲜材料，因为这一步可能对过程性能有巨大的影响，而不是作为生物过程操作本身的结果。 定义LV生产生物过程序列中的步骤需要进行整体生物过程分析，因为不同操作之间存在相互作用。例如，浓缩和缓冲液交换（TFF）后跟阴离子交换（AEX）色谱产生了一种LV产品，当用于转导时，与仅使用TFF步骤相比，尽管总体产量较低，但对细胞没有毒性。另一个例子是，TFF操作，无论是单独使用还是与超速离心结合使用，都产生了一个功能滴度更高的LV产品，当这个步骤被移除时，这种产品是看不到的。最后，DNA消化在过程序列中的位置或TFF步骤的位置可以用来改善随后的AEX色谱。 对病毒载体细胞和基因疗法的日益关注推动了生物加工的界限。对于更大规模的LV生产，需要研究过程剪切的作用，因为大规模生产意味着使用更大的泵或以更高的流速运行泵，因此，可能产生更高的剪切率。此外，更高的生产力要求也意味着增加通量要求以缩短TFF操作时间。这对LV生产有几种影响：较短的时间可能对LV稳定性有利，而增加的通量可能意味着需要以更高的横流速率或更高的跨膜压力运行；这两者都可能导致暴露于高过程剪切。病毒载体通常被认为是脆弱的，因此对剪切敏感。例如，Valkama等人提到，增加的循环流速，绕过柱子，导致感染性LV损失20%。然而，我们实验室的早期分析发现，一些伪型LV即使在暴露于非常高的过程剪切后也能有很高的恢复率，使用超规模缩小（USD）（未发表数据）。这表明过程剪切可能对不同的慢病毒载体有不同的影响，生物过程操作的设计（例如，TFF）应该考虑到这些，以提高生产力并满足大规模制造的要求。我们之前展示了使用超规模缩小设备预测大规模TFF操作生产单克隆抗体。这种大规模设备与用于LV TFF加工的设备类型相似。超规模缩小方法也已用于评估其他单元操作。USD由于进行分析所需的材料量少，因此能够进行整体生物过程评估。最后，作为LV生产的整体生物过程分析的一部分，结合过程经济分析将是有益的，因为它可以证明生物过程选择的经济可行性。 7.结论  我们回顾了慢病毒载体生物加工的基本单元操作、整体生物过程选择和当前发展的其他方面。由于细胞和基因治疗的治疗益处被认识到并转化为临床应用，对LV的需求在可预见的未来将保持高涨，新应用正在被探索（例如，作为病毒疫苗载体）。尽管目前全球LV的制造能力很低，LV生物加工需要优化，但显然正在努力提高产量和恢复率。这些发展将导致更广泛地实施基因转移剂以改善治疗结果。对慢病毒载体的生物过程要求的基本理解是确保LV产品从临床开发转化为患者使用的关键。TFF和AEX色谱是可扩展LV生物加工的首选单元操作的领跑者，微滤也是如此。根据我们对这些操作的了解，溶液环境（即，缓冲液、添加剂、辅料等）以及固相材料（例如，膜、树脂或纤维）将在不同伪型LV的处理过程中有重要贡献。确定关键操作参数和过程条件将是过程开发中必不可少的活动，以及整体生物过程评估。这应该能够获得高LV浓度和产量，同时在LV产品中最小化杂质。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

声明：因水平有限，错误不可避免，或有些信息非最及时，欢迎留言指出。本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及）;本文不构成任何投资建议。 抗体-药物偶联物(ADC)领域见证了偶联技术、连接子化学和使用的有效载荷的多样化，超越了传统的微管蛋白抑制剂，包括新的作用机制。随着大量融资和收购，对ADC研究的投资继续增长。 此外，市场的地域扩张，特别是在中国，反映了全球对创新癌症疗法的推动，这从旨在将新型ADC带到临床的多次合作和许可协议中可以看出。以下是ADC领域的一些主要生物技术公司介绍。 艾伯维/ImmunoGen 艾伯维以101亿美元收购ImmunoGen的战略举措加强了公司在ADC癌症领域，特别是实体肿瘤领域的影响力。此次收购包括ImmunoGen用于铂类耐药卵巢癌的旗舰癌症疗法ELAHERE (mirvetuximab soravtansine-gynx)，表明艾伯维雄心勃勃，希望通过各种实体瘤和血液系统恶性肿瘤的潜在变革项目，扩大其肿瘤学产品线。ImmunoGen的产品组合，包括下一代adc，如用于卵巢癌的IMGN-151和用于罕见血癌的pivekimab sunirine，增强了艾伯维在肿瘤学领域的研究能力和产品供应。 此次收购不仅加速了艾伯维进入ADC市场的步伐，也是其在实体肿瘤治疗领域取得重大进展战略的关键一步。ELAHERE是首个在铂类耐药卵巢癌中显示出总生存获益的药物，其成功为艾伯维提供了一个在ADC领域领先的独特机会，并进一步开发创新的癌症治疗方法。 除了收购ImmunoGen，艾伯维的ADC管线还包括早期开发项目，如ABBV-400，一种用于实体瘤的c-Met(间充质上皮转化因子)ADC，以及两种抗sez6(癫痫相关的6同源)ADC, ABBV-011和ABBV-706，旨在解决各种癌症适应症。 Adcendo Adcendo成立于2017年，是哥本哈根大学和Rigshospitalet的分拆公司。这家位于哥本哈根的生物技术公司利用其科学创始人发现的新靶点uPARAP受体，开发旨在改善癌症治疗结果的ADC。 uPARAP受体，也被称为Endo180，在人体细胞外基质的管理中起着关键作用，特别是在胶原重塑中。它对组织修复和维持至关重要，但在癌症进展中也起着重要作用，因为它在几种癌症类型中过度表达。 Adcendo已与澳大利亚免疫肿瘤公司GlyTherix合作，推进靶向GPC-1(一种与多种实体瘤类型相关的蛋白)的ADC的开发。此次合作旨在利用GlyTherix的Miltuximab(一种领先的抗GPC -1单克隆抗体)，进一步推进Adcendo将创新治疗方案推向市场的使命。 最近，Adcendo与Duality Biologics达成了一项期权许可协议。该协议是Adcendo进一步发展其ADC产品线战略的一部分，该产品线专注于为各种类型的癌症创建疗法。此次合作旨在利用Duality Biologics的能力，潜在地增强Adcendo现有的ADC技术。这一合作关系反映了Adcendo正在努力探索ADC开发的新途径，旨在扩大其癌症治疗的范围和有效性。 Adcendo在2021年获得了5500万美元(5100万欧元)的A轮融资，并在2023年获得了3300万美元(3100万欧元)的额外融资，Adcendo处于有利地位，可以继续其在ADC领域的开创性工作。 AdcentrX Therapeutics AdcentrX正在建立一个创新ADC的内部管线，以解决当前该领域的限制和挑战。Adcentrx最近在A +轮融资中获得了3800万美元，后来又追加了1300万美元。此次融资继2021年的5000万美元A轮融资之后，标志着其ADC肿瘤学产品线的临床开发迈出了重要一步。 Adcentrx的主要候选产品ADRX-0706是一种针对Nectin-4的ADC, Nectin-4是一种在多种人类癌症中过度表达的细胞表面粘附蛋白。这种靶向策略是Adcentrx利用更稳定的连接器技术和利用“旁观者效应”更精确地向肿瘤输送有效载荷的方法的一部分，从而提高疗效，同时最大限度地减少副作用。该公司计划每年至少推进一个其他管线项目进入临床测试，这表明该项目正在开发中。ADRX-0706于2023年7月获得FDA新药研究申请批准。 除了ADRX-0706, Adcentrx正在研究肿瘤学适应证的第二种候选药物，以及另一种旨在治疗免疫学疾病的候选药物。该公司还于2022年2月与AvantGen达成了为期三年的合作伙伴关系，共同开发用于新型ADC的抗体，以扩大其产品线，并解决癌症和其他严重疾病患者的需求。 Alentis Therapeutics Alentis Therapeutics是一家临床阶段的生物技术公司，专门开发ADC治疗Claudin-1阳性的器官纤维化和癌症。该公司的研发管线专注于抗claudin -1抗体作为治疗CLDN1阳性肿瘤和器官纤维化的一种新型治疗方法。Alentis正在通过临床开发推进两种领先的单克隆抗体，并且也在研究下一代抗CLDN1疗法，包括ADC、双特异性抗体和T细胞衔接器。 Alentis因其创新工作而备受关注，其在2023年4月完成了1.05亿美元的C轮融资。这笔资金用于支持其主要研究产品ALE的2期和1期项目F02和ALE，分别开发了C04及其CLDN1平台。 Alentis在其ALE的首次人体1期临床研究中报告了多次递增剂量(MAD)部分的阳性背线结果。F02证实该药物具有良好的安全性、暴露性和靶向生物活性。此外，该公司已经启动了第一例ALE患者的2期试验。F02用于ANCA相关性血管炎伴急进性肾小球肾炎(RPGN)。本试验具有重要意义，因为它研究了该药物的安全性、耐受性，以及在已知导致快速肾衰竭的情况下，保留肾功能的可能性。Lixudebart靶向Claudin-1 (CLDN1)有可能阻止和逆转纤维化，标志着治疗严重肾脏疾病的新方法。 Araris Biotech Araris Biotech AG 在 ADC 领域取得了显著进展，最近来自 Samsung Ventures 的投资就是其中的亮点。这笔资金支持 Araris 的 ADC 管线的发展，该管线专注于癌症治疗，采用创新的连接技术，旨在简化开发和提高药物疗效。 该公司还成功筹集了 2400 万美元，以推进其 ADC 连接子技术，并将其 ADC候选药物（例如前景广阔的抗 CD79b）推向临床阶段。抗CD79b ADC 在临床前研究中显示出积极结果，显示出优于现有疗法的潜在优势。 在 2023 年 AACR 年会上，Araris 展示了使用其专有连接子技术创建的两种 ADC 的临床前数据。这些靶向抗 Nectin-4 和抗 HER2 的 ADC 与已批准的 ADC 相比，显示出优异的抗肿瘤活性和稳定性，这表明 Araris 的技术具有开发更有效、更安全、药物载量更低的 ADC 的潜力。 阿斯利康/第一三共 阿斯利康和第一三共在 ADC 领域开展了重要合作，专注于 DS-1062 的开发和商业化，DS-1062 是一种靶向 TROP2（滋养层细胞表面抗原 2）的 ADC。这项合作凸显了 DS-1062 利用第一三共专有的 DXd ADC 技术治疗多种肿瘤类型的潜力，包括非小细胞肺癌 （NSCLC） 和三阴性乳腺癌 （TNBC）。该合作伙伴关系使阿斯利康和第一三共能够分摊开发、商业化成本和利润，但日本除外，第一三共保留日本的独家权利。 此外，肺癌研究基金会 （LCRF） 宣布与第一三共和阿斯利康开展一项新的研究合作，旨在资助多达三项专注于 ADC 的研究资助，以改善肺癌患者的预后。该计划旨在探索 ADC 在肺癌治疗中的潜力，特别关注 HER2 导向和 TROP2 导向的 ADC，包括 DS-1062，以研究其作用机制、生物标志物和耐药机制。 此次战略合作是在他们在 HER2 定向 DXd ADC Enhertu 上的初步合作之后建立的。Enhertu 于 2022 年获得 FDA 批准，用于治疗携带特异性 HER2 突变的非小细胞肺癌 （NSCLC） 成人患者。该批准基于 DESTINY-Lung02 研究的结果，该研究表明 Enhertu 显着缩小了大多数患者的肿瘤，为特定肺癌患者提供了新的治疗选择。 第一三共的 ADC 产品线广泛，包括针对不同抗原和癌症的各种候选药物。最前沿的是治疗 EGFR 突变（表皮生长因子受体）NSCLC 的 patritumab deruxtecan （HER3-DXd） 和用于治疗 NSCLC 的 datopotamab deruxtecan （Dato-DXd）。 第一三共在 ESMO Asia 和 SABCS 等重要会议上展示了其 DXd ADC 产品组合的数据，展示了其肿瘤学产品组合的深度。这包括对 NSCLC 中具有可操作基因组改变的 datopotamab deruxtecan 和 HER2 突变 NSCLC 中的 ENHERTU 的研究，展示了第一三共正在进行的研究，以通过 ADC 推进癌症治疗。 两家公司都是 ADC 领域的关键参与者，阿斯利康利用合作来增强其肿瘤学产品线，而第一三共则专注于其专有的 DXd 技术，以开发有可能在癌症治疗中产生重大影响的 ADC。 BioNTech/DualityBio  BioNTech 与 Duality Biologics 合作，一直专注于开发针对癌症和自身免疫性疾病的 ADC 疗法。他们著名的 ADC 候选药物 BNT323/DB-1303 目前正在进行针对转移性乳腺癌患者的关键 3 期试验。该试验是基于早期 1/2 期研究的积极安全性和有效性数据启动的，这些数据表明具有有希望的抗肿瘤活性，尤其是在既往接受过大量治疗的 HER2 低乳腺癌患者中。观察到的客观缓解率和疾病控制率令人鼓舞，突出了 BNT323/DB-1303 改善晚期实体瘤患者预后的潜力。 此外，BNT323/DB-1303 已获得FDA的突破性疗法认定，用于治疗晚期子宫内膜癌。 此次合作有望加快这些创新疗法向全球患者提供，BioNTech 拥有除中国大陆、香港和澳门以外的全球商业权利，而 DualityBio 保留这些地区的权利。 百时美施贵宝 百时美施贵宝 （BMS） 通过旨在增强其肿瘤产品组合的战略合作，显著加强了其在 ADC 市场的地位。其中一个值得注意的合作伙伴关系是与 SystImmune，涉及 EGFRxHER3 双特异性ADC BL-B01D1 的联合开发和商业化，交易价值 84 亿美元。 在另一项战略举措中，BMS 与 Tubulis 达成了一项价值 10 亿美元的协议，利用 Tubulis 专有的 P5 偶联平台、一种用于半胱氨酸选择性偶联的新型化学试剂和“Tubutecan”有效载荷来开发针对实体瘤的 ADC。此次合作不仅涉及向 Tubulis 支付 2275 万美元的预付款，还包括潜在的开发、监管和商业里程碑付款，以及上市产品的特许权使用费。该联盟旨在为每个抗体靶点生成唯一匹配的 ADC，BMS 全权负责其后续开发、制造和商业化。 BMS 还以 1 亿美元的价格从 Orum Therapeutics 收购了一种 1 期血癌药物，从而扩大了其在 ADC 领域的影响力。有问题的药物 ORM-6151 是一种一流的抗 CD33（唾液酸结合 Ig 样凝集素 3）抗体驱动的 GSPT1 降解剂，针对急性髓性白血病 （AML） 和高危骨髓增生异常综合征，如果该计划成功，有可能获得 8000 万美元的里程碑付款。 这些合作代表了公司扩大其 ADC 产品线的方法，利用创新技术开发癌症治疗疗法。 葛兰素史克 葛兰素史克（GSK） 还通过战略收购和合作伙伴关系积极扩展其肿瘤产品组合，尤其是在 ADC 领域。最近一个值得注意的进展是 GSK 向 Hansoh Pharma 支付了 1.85 亿美元的预付款，以获得 HS-20093 的权利，HS-20093 是一种靶向 B7-H3 的 ADC，B7-H3 是一种在包括肺癌在内的许多不同癌症中表达的蛋白质。ADC 已在实体瘤（尤其是小细胞肺癌和肉瘤）中显示出临床活性的早期迹象，并将于 2024 年在中国以外的地区开始 1 期临床试验。 此外，该公司还达成了另一笔涉及靶向 B7-H4 的 ADC 的重大交易，称为 HS-20089，这表明 GSK 对靶向各种癌症（包括卵巢癌和子宫内膜癌）中丰富蛋白质的 ADC 具有战略兴趣。此举使 GSK 与辉瑞等主要参与者在开发针对这些癌症的有效治疗方法的竞争中处于竞争状态。 最近，DREAMM-7 III 期试验表明，GSK 的 Blenrep （belantamab mafodotin） 联合硼替佐米和地塞米松治疗复发/难治性多发性骨髓瘤方面有显著改善。与标准护理组合相比，这种组合几乎使中位无进展生存期增加了两倍，显示疾病进展或死亡风险降低了 59%。该试验还表明，总生存期获益呈强劲趋势，死亡风险降低了 43%。这些发现突出了 Blenrep 在首次复发时或之后重新定义多发性骨髓瘤治疗策略的潜力。 MBrace  这家生物技术公司正在积极致力于 ADC 领域，专注于 MBRC-101，该药物针对 EphA5（肝配蛋白 A 型受体 5）受体酪氨酸激酶。靶向 EphA5 的意义在于其在多种实体瘤中普遍存在，例如三阴性乳腺癌 （TNBC） 和非小细胞肺癌 （NSCLC），使其成为 ADC 开发的重要靶点。 MBRC-101 的基础在于其特异性靶向 EphA5（一种膜相关酪氨酸激酶受体）的能力。这种特异性对于癌症的治疗至关重要，因为与正常细胞相比，EphA5 在肿瘤细胞中的表达差异，为选择性癌细胞靶向和治疗提供了途径。MBRC-101 采用与单甲基 auristatin E （MMAE） 偶联的人源化抗 EphA5 IgG1 抗体，MMAE 是一种有效的细胞毒剂。在与癌细胞上的 EphA5 结合后，MBRC-101 被内化，将 MMAE 直接递送到癌细胞中以诱导细胞死亡。 MBRC-101 的临床前数据令人信服，在乳腺癌模型中显示出显着的疗效。它已显示出与 EphA5 的独家结合、快速内化和对表达 EphA5 的细胞的细胞毒性。在患者来源的 TNBC 异种移植小鼠模型中，MBRC-101 表现出剂量依赖性、稳健且可重复的抗肿瘤活性，为其临床开发提供了强有力的依据。值得注意的是，MBRC-101 在临床前模型中在不同剂量下的耐受性良好，毒理学结果归因于 MMAE 有效载荷，而不是靶点本身。 MBrace Therapeutics 目前正在通过 1/1b 期临床试验推进 MBRC-101，旨在确定最佳生物学相关剂量并评估 MBRC-101 在 TNBC、NSCLC 和其他实体瘤中的安全性和初步活性。 在财务方面，MBrace Therapeutics 最近在 B 轮融资中筹集了 8500 万美元，以进一步开发其肿瘤学产品线。 牛津生物 Oxford Biotherapeutic （OBT） 领先的 ADC 之一 OBT076 靶向 CD205 受体，该受体在一系列实体瘤和液体瘤中过表达。这种创新方法旨在治疗头颈部腺样囊性癌 （ACC），这是一种罕见的侵袭性癌症类型。OBT 与 GORTEC 合作，正在进行一项 1b 期试验，以研究 OBT076 作为单一疗法和与 PD-1（程序性细胞死亡蛋白 1）阻断抗体 balstilimab 联合使用。这项试验因其专注于治疗选择有限的癌症而引人注目。 此外，OBT 与 Boehringer Ingelheim 的合作促成了 BI 764532 的开发，这是一种靶向 DLL3（Delta 样配体 3）的研究性 T 细胞接合器，DLL3 是使用 OBT 专有的 OGAP 平台发现的一种蛋白质。这种合作伙伴关系已经取得了重要的里程碑，包括获得美国 FDA 的快速通道资格，用于治疗晚期或转移性肺神经内分泌癌 （LCNEC-Lung）。 OBT 的 ADC 开发工作以 OGAP 平台（癌症特异性膜蛋白库）为基础，有助于识别癌症靶标的新型、高特异性抗原。这个广泛的数据库支持 OBT 开发基于 ADC 的疗法的战略。 辉瑞/Seagen 辉瑞于 2023 年 12 月 14 日完成对 Seagen 的收购，价值约 430 亿美元，标志着辉瑞肿瘤学能力的重大扩展。这一战略举措进一步确立了辉瑞作为肿瘤学领域领先公司的地位，加速下一代癌症治疗方法的开发。此次收购将 Seagen 的开创性 ADC 技术与辉瑞的广泛能力和专业知识相结合。 Seagen 在收购时的投资组合包括四种已获批准的癌症疗法，2022 年的总销售额接近 20 亿美元。此次收购不仅为辉瑞的肿瘤产品组合增加了重要价值，其中包括超过 25 种已批准的药物和生物仿制药，涵盖 40 多个适应症，而且还使辉瑞的肿瘤产品线翻了一番，达到 60 个项目。这些项目涵盖多种模式，包括 ADC、小分子、双特异性和其他免疫疗法，有望对多种癌症类型产生广泛影响。 Seagen 最先进和最著名的 ADC 之一是 Tivdak （tisotumab vedotin-tftv），它已获得 FDA 批准，用于治疗化疗后进展的复发性或转移性宫颈癌。Tivdak 代表了宫颈癌治疗的重大进步，标志着第一个获批用于该适应症的 ADC。这是 Seagen 第三款获得监管部门批准的 ADC，展示了该公司在 ADC 领域的领导地位和创新能力。 除了 Tivdak，Seagen 还参与了其他新型 ADC 的开发，包括 SGN-B7H4V，它针对在各种实体恶性肿瘤中过表达的 T 细胞检查点配体 B7-H4。 罗氏 罗氏著名的 ADC 之一是 Kadcyla（曲妥珠单抗 emtansine），旨在直接向 HER2 阳性癌细胞提供有效的化疗。Kadcyla 已在包括美国和欧盟在内的 100 多个国家/地区获得批准，用于治疗既往接受过赫赛汀和紫杉烷类化疗的 HER2 阳性晚期乳腺癌患者。它还被批准用于新辅助治疗（包括基于赫赛汀和紫杉烷类药物的化疗）后有残留浸润性疾病的 HER2 阳性早期乳腺癌的辅助治疗。 罗氏开发的另一种重要 ADC 是 Polivy （polatuzumab vedotin），这是一种获批与苯达莫司汀加利妥昔单抗联合使用的抗 CD79b 抗体-药物偶联物。它用于治疗不适合造血干细胞移植的复发或难治性弥漫性大 B 细胞淋巴瘤成人患者。 罗氏还通过战略合作伙伴关系和投资推进 ADC 技术和癌症治疗。例如，罗氏已与 Moma Therapeutics 达成重要合作，投入超过 20 亿美元用于开发精准癌症药物。这笔交易突显了罗氏的战略，即利用外部专业知识和平台来确定与癌细胞生长和存活有关的新药靶点，以开发下一代精准药物。 另一项合作是与 MediLink Therapeutics 公司合作开发 YL211，这是一种针对实体瘤的下一代 ADC。MediLink 将其专有的肿瘤微环境可激活 LINker-payload （TMALIN） ADC 技术平台引入合作伙伴关系，专注于 c-间充质上皮转化因子 （c-Met） 作为该疗法的靶点。 罗氏将拥有开发、生产和营销 YL211 的独家国际权利，进一步巩固其在 ADC 和肿瘤学领域的地位。该协议包括向 MediLink 支付总计 5000 万美元的预付和近期里程碑付款，潜在的开发、监管和商业里程碑高达 10 亿美元，以及未来产品净销售额的特许权使用费。 武田制药 武田制药一直积极参与 ADC 的开发和商业化。 其中一项值得注意的合作是与 ImmunoGen 的合作，武田获得了将 ImmunoGen 的新型 ADC 技术（包括新型 DNA 作用 IGN 有效载荷剂）用于最多两个未公开靶点的独家权利。ImmunoGen 收到了武田的预付款，有可能获得总额高达 2.1 亿美元的里程碑付款，外加任何 ADC 产品的商业净销售额的特许权使用费。 该公司还扩大了与 Mersana Therapeutics 的合作伙伴关系，旨在推进 Fleximer ADC 的开发，包括靶向 HER2 表达肿瘤的 XMT-1522。此次合作不仅授予武田在美国和加拿大以外对 Mersana 主要候选产品的权利，而且还为其他靶点提供了对 Mersana 的 Fleximer ADC 平台的访问权限。 此外，武田和Seagen强调了ADCETRIS （brentuximab vedotin）治疗晚期霍奇金淋巴瘤的重要性。ADCETRIS已在70多个国家获批用于治疗复发或难治性霍奇金淋巴瘤和全身性间变性大细胞淋巴瘤（sALCL）。它正在 70 多项临床试验中进行评估，表明它在治疗 CD30 阳性恶性肿瘤方面具有广泛的潜力。 最近，武田还与 Innate Pharma 签订了独家许可协议，以开发针对乳糜泻的ADC。武田已同意向Innate Pharma支付500万美元的预付款，在开发、监管和商业里程碑方面可能达到高达4.1亿美元的费用，外加通过此次合作开发的任何商业产品的净销售额的特许权使用费。 这笔交易是武田解决乳糜泻问题的更广泛战略的一部分，这是其自 2019 年以来的第四项举措，旨在开发该病的候选药物。该协议授予武田使用Innate抗体研究、开发、制造和商业化ADC的全球独家权利，这标志着武田将ADC技术从传统肿瘤学应用扩展到乳糜泻等自身免疫性疾病的重大举措。 参考资料： 各公司官网 www.labiotech.eu -END- 2025CMC-CHINA药博会 • 展位火热预定中！