Zhejiang Normal University

近日，浙江师范大学蔡倩研究员团队联合暨南大学张章副研究员等在药物化学TOP期刊JMC杂志发表了题为“Design, Synthesis and Evaluation of 4‑Methoxy‑1H‑[1,2,3] triazolo [4,5‑c] quinolines as Highly Potent and Oral Available RIOK2 Inhibitors”的研究性论文， 报道了一类全新结构的口有效、高选择性、高活性RIOK2抑制剂，其中最优分子CQ3196具有良好的细胞活性和药代动力学性质。本研究为RIOK2的生物学功能、靶标确证、药物开发等研究提供强了有力的工具分子，对靶向RIOK2的药物开发具有重要意义。 RIOK2是一种假激酶，在白血病、胃癌、结肠癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤和非小细胞肺癌等多种肿瘤中高表达，与肿瘤的恶化程度直接相关。早期研究发现，RIOK2缺失或者失活与蛋白质合成密切相关；近期研究报道了RIOK2的转录调控功能。因此，RIOK2是一个新的潜在癌症等疾病的治疗靶点。 目前，不同研究的报道了少数几个小分子RIOK2抑制剂，但这些抑制剂要么与RIOK2的结合强度低，要么激酶的选择性比较差，利用其开展针对RIOK2的功能研究及药物开发还有很大限制。2022年，蔡倩研究员、张志民研究员和张章副研究员等通过分子库筛选、系统构效关系研究、激酶谱筛选、晶体结构解析、体内外活性和机制研究等，设计、合成并鉴定了一个全新结构的小分子RIOK2抑制剂CQ211 (J Med Chem. 2022,65(11):7833-7842)，该分子是目前可见报道的活性最强、选择性最佳的RIOK2激酶抑制剂（Kd =6.1 nM），但是其口服生物利用度低，对肿瘤细胞的增殖抑制活性有待提高。 瞄准上述科学问题，作者以CQ211为基础，通过“骨架跃迁”策略设计合成了一种强效且口服生物利用度高的RIOK2抑制剂CQ3196，其对胃癌细胞HGC-27、AGS的抑制活性分别为0.46 ± 0.02 μM 和0.73 ± 0.03 μM，相比于CQ211有2-3倍提高。与此同时，CQ3196的口服生物利用度有了明显改善，F = 23.4%。 首先，作者从hRIOK2-CQ211的复合物共晶结构出发，针对影响化合物PK的三氮唑并喹啉酮母核结构进行结构改造，设计合成了多类含不同并杂环结构的RIOK2小分子抑制剂。其中，化合物8a和8b对RIOK2具有强大的亲和力，分别为12 nM和22 nM（Table 1）。  作者在获得具有良好亲和力的化合物8a和8b后，进一步对多个细胞的活性评估显示，8a和8b在胃癌细胞系中表现出显著增强的抗增殖活性（Table 4）。具体来说，8a和8b在HGC-27细胞中的IC50值分别为0.27 μM和0.69 μM，在AGS细胞中的IC50值分别为0.23 μM和0.57 μM。这与化合物CQ211相比，其效力提高了2至6倍。 由于8a(CQ359)和8b(CQ388)具有良好的细胞活性，作者进一步评估了它们在1µM浓度下对468种激酶的选择性。激酶选择性分析显示，8b对RIOK2具有优异的选择性，其选择性评分（S(35)）为0.02。相比之下，8a的选择性降低，显示出对mTOR、VPS34和PIK3亚家族成员的明显非靶向活性。作者认为8a对肿瘤细胞增强的活性可能部分归因于其与这些非靶标的相互作用 (Figure 2)。 之后，作者获得了8b (CQ388)与RIOK2的复合物共晶结构，其与CQ211的结合模式类似。具体来说，8b中的三环骨架与Gln198形成两个氢键，一个通过甲氧基，另外一个通过三氮唑上的氮原子。甲氧基吡啶中甲氧基与Ile-191形成氢键，位于亲水链中哌嗪与Asn-192形成氢键作用 (Figure 3)。  8b (CQ388)与RIOK2的共晶结构显示，哌嗪部分延伸到溶剂暴露区域，这是一个有望改善溶解性、代谢稳定性和生物利用度的修饰位点。为了在不影响与Asn192的相互作用的情况下增强药代动力学特性，作者通过引入一系列含氮杂环来探索构效关系 (Table3)。作者首先在哌嗪2号位引入不同的取代基，比如甲基、乙基、异丙基、环丙基等，发现其亲和力相比于8b均有所下降。同时，作者引入一些桥环和螺环取代，只有8q的亲和力与8b相当，有29 nM，其余均有所下降。之后，作者将氮原子移出环位，得到8t，其Kd为11 nM，效力提高两倍。作者在氮原子上再加一个甲基，发现其Kd为14 nM，其可能在生理条件下，质子化的氮原子与Asn-192形成氢键。与此同时，作者将哌嗪环打开或者扩环，得到8v和8w，其相比于8b的亲和力有所提高，但是其对HGC-27和AGS细胞的抑制活性相比于8u (CQ3196)来说要差一些（Table 4）。 接着，作者进一步研究8u (CQ3196)和8t在SD大鼠中的药代动力学性质，8u (CQ3196)的最大血药浓度和AUC都比8t要好，相比于CQ211来说有了明显的提高。作者进一步评估其ATP酶活性，结果表明CQ3196有效地抑制了RIOK2的ATP酶活性，其IC50值为72 nM，与CQ211相当。 CQ3196在多种细胞中的抗肿瘤活性都要优于CQ211，对胃癌细胞具有更强的抑制作用，而且对正常细胞保持了可接受的选择性，突显了其作为有前途的治疗候选药物的潜力。 与此同时，作者发现在 HGC-27 和AGS 细胞系中观察到CQ3196可以明显抑制细胞的增殖，结果表明CQ3196在300 nM和1000 nM 时，可完全抑制HGC-27和AGS 细胞中的集落形成（Figure 5）。之后，作者进一步去探究CQ3196对细胞凋亡的影响，结果表明CQ3196呈剂量依赖性地诱导HGC-27和AGS细胞的凋亡 (Figure 6)。  Western blot显示，CQ3196处理后显著降低了HGC-27细胞中AKT的磷酸化水平，浓度为300 nM，这个剂量与HGC-27细胞中的IC50浓度相同。  之后，作者研究CQ3196在调节核糖体功能和蛋白质合成中的作用。作者首先在HGC-27细胞中进行了关于CQ3196对全局蛋白组影响的研究，发现HGC-27细胞中有872种蛋白质下调。在HGC-27细胞中，使用CQ3196抑制RIOK2后，核糖体蛋白RPSs和RPLs下调。此外，Western blot表明在HGC-27细胞用CQ3196处理48小时后，核糖体小亚基RPS2的表达降低 (Figure 8)。这些结果表明CQ3196可能通过阻碍核糖体成熟发挥其抗肿瘤作用。 CQ3196在HGC-27小鼠移植瘤模型中通过灌胃给药能够显著抑制肿瘤生长（62.3 %抑制率），且未引起明显体重下降，表现出良好的抗肿瘤活性和安全性 (Figure 9)。这些结果表明，CQ3196是一种有前途的口服治疗候选药物，用于针对RIOK2的胃癌治疗。  综上所述，作者在CQ211的基础上开发了一种强效且口服生物利用度高的RIOK2抑制剂CQ3196，使之成为RIOK2靶向癌症治疗的有前途的候选药物。 本文通讯作者为浙江师范大学蔡倩研究员和暨南大学张章副研究员等，共同第一作者分别为博士后马浩文、博士生黄朝明。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

当地时间7月23日，Nature最新一期刊发浙江师范大学生命科学学院张可伟教授团队的最新研究成果“Complete biosynthesis of salicylic acid from phenylalanine in plants”。该成果首次完整阐述了水稻苯丙氨酸解氨酶（PAL）依赖的水杨酸（SA）生物合成途径，关键酶的亚细胞定位和分子进化。为利用分子育种技术培育作物抗病新品种提供了重要基因靶标。 该成果由浙江师范大学联合美国布鲁克海文国家实验室、中国科学院深圳先进技术研究院等单位共同完成，其中，浙江师范大学为论文第一作者、通讯作者单位。此次研究是浙江师范大学首次以第一完成单位在顶尖期刊Nature发表科研成果，展现了学校在生命科学领域的科研实力和国际影响力。 数千年前，柳树皮中的水杨酸（SA）类物质，就已经开始在帮助人类对抗疼痛、发热、风湿等疾病。18世纪末德国科学家通过改造SA的结构发明了传奇“神药”阿司匹林。SA也是植物应对生物胁迫和非生物胁迫的关键激素。植物合成SA有两条主要路径：异分支酸合酶（ICS）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）依赖的SA合成途径。ICS参与SA合成途径最早在2001年被报道，并在2019年率先在拟南芥中被完整解析，但是其在非十字花科植物中的保守功能存在质疑。PAL依赖途径参与SA合成的证据早在上个世纪60年代被报道，尽管发现其在许多植物抗病中发挥作用，但是代谢路径尚不清楚。其核心反应——苯甲酸（BA）转化为SA，一直被认为由烟草P450蛋白酶（苯甲酸-2羟基化酶，BA2H）催化，但相关编码基因却始终未被克隆，成为植物SA合成领域的核心科学难题。 水稻是我国半数以上人口的主粮作物和单子叶模式植物，具有独特的SA代谢特性：基础SA水平非常高，是模式植物拟南芥的数十倍之多，含量相对稳定，受病原侵染后SA水平无明显升高。前期研究表明，水稻SA合成主要依赖PAL途径而非ICS途径。因此，水稻是一种研究植物PAL依赖SA合成途径的理想遗传学材料。 本研究基于一种对SA敏感的生物化学发光系统建立水稻低SA突变体筛选体系，通过EMS诱变获得了SA降低至野生型10%以下的水稻突变体osd1，利用图位克隆和重测序技术相结合的方法克隆到OSD1（Oryza sativaSA Deficientmutant 1）基因，其编码肉桂酸辅酶A连接酶，通过对OSD1的共表达基因的筛选和突变体验证，鉴定到参与PAL依赖SA生物合成过程中的关键成员OSD2、OSD3和OSD4，其突变体的内源SA含量极端下降，且表现对白叶枯病原菌敏感的表型。 在获得以上遗传学材料基础上，将PAL依赖SA生物合成过程分解为由肉桂酸（CA）合成BA-CoA的β-氧化过程以及由BA-CoA合成SA的两个生化过程，进一步通过分子生物学、生物化学等方法阐明SA 代谢路径。结果表明：在过氧化物酶体中，肉桂酸经（CA）β-氧化途径，由肉桂酰辅酶A连接酶OSD1、肉桂酰辅酶A氢化酶/脱氢酶AIM1、3-酮脂酰辅酶A硫解酶OsKAT1/KAT2酶的依次催化下生成BA-CoA；随后，BA-CoA在苯甲酰转移酶OSD2的作用下生成苯甲酸苄酯（BB），BB从过氧化物酶体转运到细胞质中，经在内质网定位的BB 2-羟化酶（BB2H）OSD3催化生成水杨酸苄酯(BS)，最后在胞质中由BS水解酶(BSH) OSD4催化生成SA（图1）。值得注意的是，本研究揭示了BA不能直接转化生成SA，而是由β-氧化产物BA-CoA 与苯甲醇反应生成苯甲酸苄酯（BB），再通过BB 2-羟基化酶(BB2H OSD3)催化生成水杨酸苄酯(BS)，最后通过BS水解酶（BSH）水解生成SA。以上发现颠覆了1962年在nature提出SA由BA催化合成以及1995年在PNAS提出的BA2H催化BA合成SA的传统认知。 PAL依赖的SA生物合成的完整路径 为了解该代谢路径在不同物种的保守性，该研究从低等水生植物红藻到高等陆生植物单双子叶植物选取25种代表不同进化阶段植物的基因组数据，对PAL依赖的SA生物合成的关键酶进行分子进化分析，结果表明：参与合成BA-CoA的β-氧化途径成员OSD1-AIM1-OsKAT1/KAT2中的AIM1最早出现在红藻门植物中，而完整的β-氧化途径则在绿藻门植物中首次完成组装。值得注意的是，在陆生植物分化后，OSD1在一些早期陆生植物中丢失。OSD3最早出现在石松门植物卷柏中，且在大多数维管植物中保守。相比之下，OSD2和OSD4同源基因则首次出现在裸子植物银杏中，并在大多数种子植物中保守。有意思的是，十字花科植物拟南芥中缺少OSD3和OSD4的同源基因，暗示十字花科植物不存在完整的PAL依赖的SA合成途径。进一步利用13C6-Phe饲喂不同进化程度的代表物种，结果显示：在绿藻、苔藓和卷柏等植物中没有检测到13C6-SA和/或13C6-SAG，从裸子植物银杏和松树开始到高等植物，除了拟南芥和油菜外均检测到13C6-SA和/或13C6-SAG。进一步在双子叶植物烟草和单子叶植物玉米中敲除相关基因，均发现SA含量显著下降。以上结果说明PAL依赖的SA合成途径的关键酶成员在植物中是逐步进化的，在裸子植物中率先组装完整的合成通路，这一代谢途径在大多数种子植物中保守，是一种古老的SA合成途径。然而，PAL依赖的SA合成途径可能在拟南芥和油菜等十字花科植物中并不存在，推测十字花科植物在进化过程中丢失了PAL依赖的SA合成途径，但是上帝为它关上一扇门却又为它打开了一扇门，十字花科植物同时获得了一个ICS依赖的SA合成途径。这一假设有待进一步证实。 PAL依赖SA合成途径的关键酶在种子植物中高度保守 综上所述，本研究首次完整绘制了PAL依赖的SA生物合成途径，攻克了一个存在长达60多年的科学难题。分子进化分析表明PAL依赖的SA合成途径在种子植物中高度保守，对于解析其他作物SA合成途径和抗病分子育种中具有重要价值。 浙师张可伟团队 浙江师范大学生命科学学院张可伟教授、张艳军副教授和美国布鲁克海文国家实验室刘长军教授为通讯作者。浙师大生科院在读博士朱宝、张艳军副教授和已毕业硕士高蓉为共同第一作者；浙师大生科院吴智华副教授、章薇博士、在读博士张超、张鹏鸿博士、化材学院毛会实验员等为共同作者。中国科学院深圳先进技术研究院赵乔研究员为本研究提供了重要指导和支持。该研究得到国家自然科学基金面上项目、国家重点研发项目、浙江省自然科学基金重点项目、浙江师范大学首届高水平创新团队建设项目等课题的资助。据悉，本论文为浙江师范大学首次以第一完成单位在顶尖期刊nature发表科研成果，说明浙江师范大学重视科研平台、团队建设和人才培养的举措取得了显著成效。 来源：浙江师范大学

植物科学领域的重大谜题，被中国团队解开了！7月23日，学术顶刊《Nature》同时发表了来自中国三个不同研究团队，关于水杨酸（Salicylic Acid, SA）的研究论文。其中四川大学张跃林团队首次完整解析植物中全新的水杨酸合成通路“PAL/BSH途径”；浙江大学潘荣辉团队首次打通水稻水杨酸合成途径；浙江师范大学张可伟团队首次完整阐述了水稻苯丙氨酸解氨酶（PAL）依赖的水杨酸生物合成途径。三项研究组合在一起，成功揭示并完整描绘了植物中水杨酸的长期缺失的最后三个酶促步骤，破解了这种关键防御激素的生物合成途径的百年未解之谜。这一发现不仅颠覆了长期以来苯甲酸直接羟基化生成水杨酸主流假说，有望改写教科书，还被业内人士预测要入选今年全球十大植物科学进展。这一传奇成分究竟有哪些应用方向，在生物制造领域又有哪些产业尝试与进展？诺奖级植物成分水杨酸是一种脂溶性的有机酸，存在于自然界的柳树皮、白珠树叶及甜桦树中。早在2000多年前，中国人、古埃及人和古希腊人都发现了服食柳树的叶子和树皮可以止痛。 然而直到18世纪，化学家们才制备出了水杨酸，但因其对咽喉和胃肠刺激剧烈而无法用于临床治疗。1897年，德国拜耳制备出了乙酰水杨酸，发现其独特的镇痛退烧功效并申请专利，将其命名为阿司匹林（aspirin）推向市场。1982年，英国医学家John Vane凭借对阿司匹林的研究获得诺贝尔生理学或医学奖，此后阿司匹林的其他药用价值被医学界源源不断地发掘出来。从一片小小的柳树皮上，诞生了世界上应用最广泛的解热、镇痛和抗炎药物，还开创了人类将天然产物类似物作为药物的先河。目前，水杨酸主流的生产方法是通过科尔贝－施密特反应（Kolbe-Schmitt Reaction）化学合成，会产出高盐、含酚且难以生物降解的强酸性有毒有机工业废水，对环境产生极大破坏。通过合成生物学技术生产水杨酸则是一种绿色环保、可持续的解决方案：江南大学吴静教授团队就发表过相关论文，工程化大肠杆菌在摇瓶中实现了3.72g/L的水杨酸产量。相关综述中也提到，在酿酒酵母中合成水杨酸产量可达46.2mg/L，且酵母独特细胞结构可转化分离水杨酸，有效规避细胞毒性。相信随着水杨酸在植物体内的合成渠道的逐渐完善，未来将有在微生物体内高表达量合成水杨酸的可能。药妆界双栖明星产业应用上，水杨酸市场已经相当成熟，其中又以医药和美妆最受关注，作为原料长久以来被用于制备阿司匹林、拉米夫定等药物。也因为具有清除老废角质的皮肤清洁能力，广泛运用在棉片、精华、涂抹面膜、爽肤水、面霜、身体乳等护理产品中。医美领域还有“刷酸”美白护肤项目，就利用到水杨酸，实现软化角质、剥落老化角质层，并促进真皮层胶原蛋白生成的效果。参考论文：Three-step biosynthesis of salicylic acid from benzoyl-CoA in plantsDeciphering phenylalanine-derived salicylic acid biosynthesis in plantsComplete biosynthesis of salicylic acid from phenylalanine in plants从化学合成到生物合成 —— 天然产物全合成新趋势Rational and Semirational Approaches for Engineering Salicylate Production in Escherichia coli推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。©2021 医药速览 保留所有权利往期链接“小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点 人人学懂免疫学| 人人学懂免疫学（语音版）综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普|医药前沿笔记PROTAC技术| 抗体药物| 抗体药物偶联-ADC核酸疫苗 | CAR技术| 化学生物学温馨提示医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群加作者微信（yiyaoxueshu666）或者扫描公众号二维码添加作者，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送①点击标题下方“医药速览”  ②至右上角“...”  ③点击“设为星标