Denka Co., Ltd.

摘要：植物作为生产药物蛋白的平台已经被探索了20多年。生产成本效益高、易于扩大到生产能力、无需冷链要求以及能够生产与哺乳动物同类产品在生物学和功能上完全相同的复杂治疗蛋白等重要特性，使植物成为疫苗生产的强有力替代品。这篇综述文章集中讨论了植物制造疫苗的表达以及下游纯化过程。概述了包括转基因、瞬时和悬浮细胞培养在内的表达策略，并描述了针对如叶片和种子等不同植物组织的目标。审查了用于植物制造疫苗下游处理的主要组成部分。综述以对植物生产平台对未来疫苗生产的潜在益处的反思结束。 1.引言 传染病是全球人类死亡的主要原因。最近的COVID-19大流行生动地展示了全球对新型病毒疾病的准备不足。除了新出现的疾病外，许多众所周知的传染病毒，例如严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）和流感，不断经历基因变化，从而引发频繁的爆发，与严重的疾病和死亡有关。SARS-CoV-2的迅速和广泛传播导致了前所未有的全球危机，导致数百万人死亡。因此，迫切需要以成本效益高和快速的生物制造方式大规模生产重组疫苗抗原，以应对众多传染病。分子农业，也称为生物制药，是一种尖端技术，利用植物的细胞、器官或组织作为生物工厂，生产有价值的生物制药和其他高价值蛋白，包括疫苗抗原。这项技术为使用原核和真核宿主的传统蛋白质生产方法提供了一个有希望的替代方案，例如酿酒酵母、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、大肠杆菌（E. coli）、人类胚胎肾（HEK）细胞、毕赤酵母，以及昆虫系统，如草地贪夜蛾（Sf9）。这些生产宿主因其明确的监管途径、更高的表达能力和生产便利性而被广泛接受用于大规模生产；然而，每个生产平台都有其自身的优缺点。植物是多样化和复杂蛋白质的生物工厂，并提供了几个优势。植物由于其能够大规模种植，允许可扩展且成本效益高的生产。植物细胞具有显著的转录后蛋白质处理能力，以制造定制的糖链结构（翻译后修饰）和正确的折叠，为生产具有特定糖基化模式的重组蛋白提供了优势。例如，与CHO细胞相比，植物提供了成本效益高且高度可扩展的生产能力。另一方面，瞬时表达系统允许快速可扩展性，超越了传统的发酵罐基础平台。此外，在安全性方面，植物携带人类或动物病原体的风险较低，使它们成为蛋白质生产的有利选择。因此，将植物作为重组疫苗的生产宿主具有巨大的潜力，并继续是生物技术领域积极研究和发展的领域。选择表达宿主涉及考虑宿主属性的混合，包括食品或饲料作物、遗传操作的便利性、特定内源代谢途径的存在、表达能力和知识产权限制。此外，产品特性，如预期用途、结构复杂性和所需的纯化水平，也是选择生产宿主的关键因素。 疫苗在预防和控制传染病方面发挥着至关重要的作用，其可用性和可及性对全球公共卫生至关重要。然而，传统疫苗生产过程通常面临可扩展性、成本效益和冷链存储要求方面的挑战。基于植物的系统为疫苗生产提供了几个优势。此外，植物可以被设计生产复杂和多组分的疫苗，允许生产组合疫苗或针对病原体多种菌株的疫苗。使用植物系统生产疫苗还提供了物流优势。与传统疫苗不同，基于植物的疫苗在更高温度下稳定，不需要冷链存储和分发，使它们特别适合资源有限地区或基础设施不足的地区。近几十年来，在植物基础平台上生产疫苗方面取得了显著进展。包括烟草、玉米、土豆和其他在内的各种植物种类已成功设计生产针对病毒、细菌和寄生虫疾病的广泛疫苗。这些植物生产的疫苗在临床前和临床研究中显示出有希望的结果，证明了安全性、有效性以及诱导强烈免疫反应的能力。在这种情况下，我们提供了分子农业领域内植物系统疫苗生产的当前状态的概述。它讨论了使用植物作为生物工厂生产疫苗的进步、挑战和前景，强调了这种创新方法的潜力，以彻底改变疫苗制造格局并改善全球获取救命免疫的途径。重要的是，在植物中表达重组蛋白/疫苗的不足之处被强调，综述以独特的视角和洞察力结束，探讨了使用最先进的基因组编辑技术来规避基于植物的表达系统的缺陷。 2.疫苗表达策略 2.1.转基因植物用于可食用疫苗 转基因植物作为生产可食用疫苗的潜在平台正在被探索。可食用种子或营养组织可以被设计生产重组疫苗，这些疫苗可以通过口服途径进行管理，从而最小化痛苦的注射针头，并不需要冷链要求，能够在疫苗分发期间实现快速和有效的全球规模部署。口服途径可以彻底改变当前的疫苗输送方法。在植物细胞中生产疫苗抗原具有巨大的潜力，可以消除成本高昂且复杂的发酵，简化其运输和分发，消除无菌注射，并在室温下延长保质期数年。有几个植物种类已经表达了重组疫苗以实现口服输送，如土豆、水稻、香蕉、番茄、生菜、烟草、紫花苜蓿、小麦、菠菜和胡萝卜。 植物制造的疫苗被细胞壁和细胞器生物封装，使疫苗蛋白能够抵抗降解并通过消化系统，以便它们可以被免疫监视系统识别。由于其巨大的粘膜表面积，人类肠道为口服植物衍生疫苗提供了最佳入口点。肠道相关淋巴组织（GALT），构成人体最大的免疫系统组织（超过70%），是一个关键的调节性T细胞（Tregs）的水库，并拥有约300平方米的广泛表面积。植物制造的疫苗抗原的独特优势在于它们被生物封装到植物细胞壁中；这使它们能够承受肠道腔内的酶促和酸性条件。由于人类消化酶无法分解细胞壁中存在的碳水化合物的糖苷键，植物制造的疫苗抗原能够成功通过消化道。存在于厌氧纤维素分解细菌中的纤维素体，作为一个细胞外酶复合物，包含结合、结构和催化域，使直接与植物细胞壁相互作用和糖苷键的裂解成为可能。一旦疫苗到达肠道粘膜层，居民细菌帮助分解植物细胞壁，从而促进疫苗抗原的释放。脆弱拟杆菌通过降解粘蛋白糖蛋白帮助穿透粘液层。进入肠道上皮细胞并将疫苗抗原呈现给免疫系统至关重要，这是通过附着在疫苗上的不同标签（受体结合蛋白）实现的，如CTB。 2.2.瞬时表达系统 植物瞬时表达系统因其快速高效生产、易于扩大规模、低成本、易于纯化，以及最重要的是一些植物已有的成熟协议而被作为首选表达系统使用。瞬时系统在生产高价值和复杂蛋白的能力和可靠性方面已成功展示。本氏烟（Nicotiana benthamiana）是研究和商业目的的主要生产宿主，它具有在DNA构建物传递后几天内制造蛋白的潜力，因此被多家公司用于商业生物制造，如激素、抗体、酶、治疗剂和疫苗等（Medicago Inc.、Forte Protein Inc.、Kentucky BioProcessing 和 Icon Genetics）。实现尽可能高的产量是表达高价值蛋白的首要问题，因为当蛋白从更稀释的混合物中提取时，下游处理成本会显著增加。转基因植物开发可能是一个耗时的项目，通常需要大约2-3年才能获得宿主植物的纯合系。相比之下，瞬时表达能够迅速生产大量重组蛋白。例如，Medicago Inc.，一家利用植物基础瞬时表达系统的公司，可以在收到序列后仅三周内生产出流感疫苗的纯化最终产品。最近，Medicago Inc.展示了使用瞬时系统生产针对SARS-CoV-2和流感疫苗的能力。数据显示在人类临床试验中具有一致的免疫原性。在最近的COVID-19大流行期间，几个研究小组使用不同的宿主系统生产了RBD作为疫苗抗原。例如，SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域（RBD）在动物模型以及非人灵长类动物中诱导了体液免疫，使用本氏烟作为生产宿主。 瞬时表达系统通常可以在每公斤鲜重生物量中产生克级的重组蛋白，并且随着创新的进一步发展，产量还有提高的潜力。几种重组蛋白，即疫苗、生长因子、治疗剂、激素和抗体已使用瞬时表达系统生产。除了在竞争系统上具有几个优势外，瞬时表达系统还需要进一步创新，包括新的载体、表达策略、澄清，特别是下游处理，以实现大规模生产的目标，以更低的成本使替代蛋白更加负担得起和可获得。 2.3.植物悬浮培养系统 体外培养的植物细胞，也称为植物细胞悬浮培养，已被证明是替代蛋白生物生产平台的极有前景的选择。悬浮培养可能包括转基因植物、毛状根、原生质体或细胞培养，结合了整株植物培养系统的优势和微生物及哺乳动物细胞培养的好处，使它们成为生产治疗蛋白的高度有前途和多功能的选择。可扩展性、安全性、蛋白质折叠、翻译后修饰、生产成本、稳定性和灵活性是使用植物细胞悬浮培养的关键考虑点。与其他真核系统（如CHO或HEK细胞）不同，植物培养物可以在简单且廉价的生长介质中生长，易于快速扩大生产规模；这两个特点降低了生产总成本。高价值重组蛋白可以通过添加信号肽来分泌，以简化下游处理。来自不同来源的N端信号肽可以将重组蛋白输送到内质网（ER）腔。运输以信号识别颗粒（SRP）依赖的方式发生，由SRP受体促进。随后，在ER中，信号肽从前体蛋白中被切除，然后蛋白质被包裹成小囊泡，这些囊泡向高尔基体膨胀并最终释放到细胞外隔室。将重组蛋白靶向到ER和高尔基体有助于重组蛋白的正确折叠，这是其功能所必需的。分泌蛋白在内质网（ER）和高尔基体中经历额外的修饰，包括N-糖基化。在过去的几十年中，已经表达了几种重组蛋白并验证了它们的功能性。最重要的是，第一个获得FDA批准的植物制造的重组蛋白taliglucerase alfa是在胡萝卜悬浮培养中表达的。植物细胞悬浮培养已被用作疫苗生产的宿主。最近，烟草细胞（BY-2）和蒺藜苜蓿A17细胞中报告了RBD和刺突蛋白的生产。考虑到植物悬浮培养的优势，通过体内外分析已成功表达并验证了多种疫苗抗原的功能性。已经开发了使用胡萝卜、大豆、烟草、水稻、蒺藜苜蓿和土豆的细胞技术，并生产了针对多种疾病的疫苗。然而，未来研究和发展（R&D）在优化培养环境方面有很大的潜力，目的是提高生产水平和蛋白质回收效率。生物反应器的主要好处是受控的生长环境具有完全的封闭性，蛋白质质量、产量和均质性的一致性，以及从基因到蛋白质的快速生产速度在短短的时间内4-5周内。尽管如此，由于类似于哺乳动物细胞培养的扩大限制，生物反应器并不受欢迎，如相对较低的浓度、分泌蛋白产品的不稳定性以及与温室或露天种植相比更高的资本支出。从下游处理的角度来看，分泌蛋白产品的主要优点包括更简单、低成本的纯化，以及分泌效率可能受到蛋白质疏水性、大小和/或电荷的限制。对于非分泌型重组蛋白，植物细胞匀浆与叶状植物遇到相同的复杂性。因此，它们可能不像其他蛋白质表达系统那样经济上吸引人，因为与分泌蛋白相比，生产细胞内蛋白质的潜在节省可能会被抵消。 2.4.植物中疫苗及相关重组蛋白的表达 生物技术表达治疗蛋白需要有效的表达和纯化方案，以便以原生构象生成重组蛋白。植物中稳定或瞬时表达此类重组治疗或疫苗蛋白是实现规模扩大和降低生产成本潜力的有力工具。第一个概念验证是在植物中表达乙型肝炎表面抗原（HBsAg），此后，已成功生成几种亚单位疫苗和病毒样颗粒。最近，Medicago采用了这种方法来生成COVID-19疫苗和季节性流感疫苗，这些疫苗现在已经幸运地完成了临床试验。 使用植物生物合成重组药物蛋白的瞬时表达系统与其他系统相比具有优势。瞬时表达比任何其他发酵平台更快地扩大规模。此外，诸如源自完整或拆解植物病毒的瞬时表达载体促进了重组生物药物的高水平表达。然而，要将植物开发为重组治疗剂的表达载体，必须克服两个主要挑战：表达水平不足和不可扩展/低效的纯化方法。 2.5.基于种子的表达系统 种子已成功用于表达几种重组蛋白，如疫苗抗原、治疗剂、抗体、激素、工业酶和细胞培养蛋白。美国农业部已批准田间释放转基因植物种子，表达如乳铁蛋白、血清白蛋白和人溶菌酶的蛋白质，以及红花中的载脂蛋白和玉米中的巴西蛋白和乙型肝炎表面抗原（http://www.isb.vt.edu/searchreleasedata.aspx）。与哺乳动物细胞培养、转基因动物和小发酵微生物作为宿主平台相比，种子作物提供了几个优势，因为它们有关种植、收获、加工和储存的广泛知识基础。 Shi等人，2023年报告了在小麦种子组织中稳定表达编码Mycoplasma gallisepticum（MG）氨基酸序列的TM-1基因，被认为是针对影响鸡的慢性呼吸道疾病（CRD）的疫苗抗原候选物。在这项研究中，重组41.8 kDa蛋白在胚乳组织中普遍表达，并达到了1.03 mg/g干重的表达水平。在鸡口服给药后，这种植物制造的可食用疫苗在没有可识别的体重减轻的情况下有效诱导了抗体反应。口服给药的TM-1疫苗候选物的两剂触发了免疫反应，并在与商业生产的CRD灭活疫苗相当水平上对MG的挑战提供了保护。这项研究证明了植物制造的可食用疫苗是安全、可扩展、在室温下稳定且成本效益高的。 Shahid等人，2020年报告了一项研究，其中新城疫病毒（NDV）的保护性抗原，血凝素-神经氨酸酶（HN）和融合（F）蛋白分别使用组成性种子特异性Zein启动子和35S启动子在转基因玉米中表达。在这种情况下，观察到F基因mRNA在叶片中的表达几乎是2-7.1倍，而HN基因mRNA在种子中的表达约为8-28倍。对于F蛋白，观察到1.66 µg/ml，占叶片总可溶性蛋白的0.5%，而对于HN蛋白，发现2.4µg/ml，占总种子蛋白的0.8%。当小鸡口服转基因玉米的种子和叶片时，产生了针对两种NDV抗原的免疫反应。 通过农杆菌渗透生成了表达新城疫（ND）病毒F蛋白的稳定转基因水稻种子。当这种疫苗接种到无特定病原体的鸡时，显著触发了对异源和同源ND病毒株的中和抗体反应。两剂4.5 µg抗原完全保护鸡免受致死剂量NDV的挑战。此外，F蛋白免疫的鸡在挑战后15天内展示了更高的平均体重增加，与传统的全病毒疫苗免疫的鸡相比，从而产生了更高的成本效益。这项研究强调了植物基础疫苗作为NDV根除平台的成功。 在营养保健品、工业酶和口服疫苗的情况下，通过使用种子作物，最小化了加工和纯化的要求。与叶作物相比，种子作物每单位表面积的生物量产量较低。然而，如果作物在露天田地种植，蛋白质的稳定性和规模经济远远超过了与低生物量产量相关的劣势。 2.6.基于叶片和果实的表达平台 烟草和紫花苜蓿等叶菜作物由于其高生物量产量、每年可能有几个生长周期的可能性，以及与其种子对应物相似的农业基础设施，具有高度优势；然而，它们通过防止开花来降低花粉传播的风险。烟草是商业表达重组蛋白的领先叶基平台，自从表达单克隆抗体的烟草出现以来。此外，在叶片用于瞬时表达疫苗、单克隆抗体和其他治疗剂方面取得了重要进展，使用烟草（Nicotiana benthamiana）作为表达系统。瞬时表达规避了与转基因植物相关的监管问题，目前是低容量蛋白合成的重组蛋白表达的首选方法。使用叶组织进行瞬时表达对于在温室中生长的烟草具有独特优势，特别是在需要快速表达大流行疫苗的情况下。与从种子中提取相比，基于叶片的蛋白提取的简单性有时被视为一种优势，因为从种子中提取可能需要额外的操作，例如浸泡和研磨。 生菜和番茄是首选的蔬菜系统，可以生吃。生菜（Lactuca sativa）品种已被用于生产针对猪瘟、I期肝炎和大肠杆菌的可食用疫苗。同样，胡萝卜（Daucus carota）已被用于获得针对幽门螺杆菌和大肠杆菌的可食用疫苗。香蕉（Musa acuminata）已成为提高乙型肝炎疫苗的首选植物。香蕉生吃，广泛种植在发展中国家，香蕉的主要优势是在果实中表达足够的抗原蛋白水平。然而，叶组织涉及主要缺点，如高水分含量、收获的叶生物量存储不稳定，导致重组蛋白的稳定性问题，以及难以分离下游和上游处理。因此，叶表达的明显优势被表达蛋白在组织中的不稳定性（及其提取物）抵消了，这些组织是代谢活跃的。此外，叶提取物含有酚类物质、叶绿素衍生的色素和固有的蛋白水解活性，这些物质干扰了下游处理，导致繁重的多阶段纯化过程，影响了纯化蛋白的数量和质量。此外，尽管与叶菜和种子作物的生产相关的成本低于露天田地，但基于植物的制药生物合成已经转向在生物反应器和温室等封闭环境中表达。 2.7.植物制造的重组蛋白的下游处理 植物制造的疫苗利用植物作为生物反应器来生产疫苗抗原。这种创新方法相比传统疫苗生产方法提供了若干优势，例如更低的生产成本、可扩展性，以及对冷链存储的依赖性降低。蛋白纯化作为生物工业领域的一项基本下游技术，依赖于确定有效的纯化方法和建立连续的最优策略，以改进纯化步骤。目标是使用尽可能少的步骤获得期望的浓度、纯度和产量的目标蛋白。这个过程对于后续的研究工作至关重要，为研究人员提供高质量的蛋白，这些蛋白适合于多种应用。 此外，植物制造的疫苗的纯化策略对于确保创新疫苗的安全性、有效性和遵守监管规定至关重要。下游处理过程涉及一系列步骤（见图1、2）。每个步骤都应仔细设计，以去除杂质，实现高产品纯度，并保持目标抗原的完整性。在纯化之前，通过生物信息学分析软件收集有关目标蛋白的基本信息是有益的。这些分析提供了包括：等电点（pI）、半胱氨酸含量、蛋白稳定性、蛋白溶解度、分子量（MW）、二级结构、对氧化和高盐离子或pH敏感性的易感性等在内的各种属性的见解。选择适当的标签以便于在载体构建期间过度表达和纯化也很重要。应考虑细胞破裂方法及其对蛋白变性和结构变化的潜在影响。应综合评估这些因素，以确保最佳纯化结果。 图 1 植物系统中重组蛋白的生产过程、下游加工和应用。 植物衍生蛋白的纯化方法主要涉及利用所需蛋白的独特物理和化学特性。这些特性包括特定氨基酸序列及其组成、电荷分布、极性以及多肽链的亲水性或疏水性，以及蛋白表面存在的氨基酸残基的整体形状和排列。通过仔细考虑和理解这些特性，可以制定有效的纯化策略，以在植物系统中分离和纯化所需的蛋白。 选择合适的纯化方法是至关重要的，不仅应仔细考虑目标蛋白的特性，还应考虑杂质。以下是在选择合理时需要考虑的一些因素： 1.在考虑基于植物的蛋白的纯化系统时，了解特定于植物的杂质概况非常重要。在植物蛋白纯化过程中可能遇到的一些常见杂质包括植物细胞碎片、可溶性蛋白、色素和酚类化合物、脂质和蜡质、糖类和多糖以及核酸。这些化合物可能导致样品变色、样品浑浊，并影响蛋白的稳定性和纯度。了解特定于植物系统的杂质概况允许选择适当的纯化策略和优化纯化条件，以有效分离目标蛋白和不需要的成分。 2.澄清，作为纯化基于植物的疫苗的初始步骤，是上游和下游过程之间的重要环节。它对确定最终产品的产量、一致性和可重复性有至关重要的影响。一个执行良好的澄清过程应该产生一个低浑浊度的溶液，同时最大限度地减少对产品回收率的影响。它的设计目的是消除过程和产品相关的杂质。澄清过程应该针对去除与过程或产品相关的较大颗粒、不溶性和可溶性杂质，包括大聚集体。在植物基础疫苗的纯化中，有几种常用的澄清技术。 3.沉降：沉降是一种基于重力的澄清方法，其中植物提取物可以静置不动，允许较大的颗粒和杂质由于其更高的密度沉积在底部，或者涉及高速旋转提取物以分离较重的颗粒，如植物细胞、碎片和较大的杂质，从液相中分离出来。然后可以收集澄清的上清液，留下沉淀的固体。 4.过滤：过滤方法，包括深层过滤和微滤，被用于植物提取物的初级和次级澄清，用于生产人类乳头瘤病毒（HPV）和乙型肝炎病毒（HBV）。这些植物衍生疫苗的纯化通常涉及过滤步骤，以去除颗粒物质、杂质和宿主细胞蛋白，同时保留所需的疫苗抗原。深层过滤器由纤维或颗粒介质组成，可以有效地捕获较大的颗粒和杂质。孔径通常在0.1到10微米范围内的微滤膜用于去除较小的颗粒和胶体物质，从而获得澄清的溶液。 5.絮凝可以用于增强植物提取物的澄清。絮凝是一个涉及悬浮液中细颗粒和胶体物质的聚集，使它们形成更大的团块或絮凝物的过程。然后，这些絮凝物可以更容易地沉降或通过过滤轻易分离，从而提高提取物的清晰度。植物提取物澄清中的絮凝剂可以包括天然和合成聚合物，如聚乙烯亚胺（PEI）、聚丙烯酸或聚二甲基二烯丙基氯化铵（PDADMAC）、壳聚糖和硫酸铝。在Park等人，2015年进行的一项研究中。开发并评估了一种通过结合PEI沉淀和蛋白样品分级来提高TSP中Rubisco去除率的方法。通过应用50和100 mg/g的聚乙烯亚胺（PEI），实现了高效率的rubisco去除。此外，硫酸铵被用于纯化基于植物的结直肠癌疫苗候选物GA733-FcK，研究人员在纯化过程中使用了50%的硫酸铵浓度。结果显示，蛋白浓度显著增加了1.8倍。这些聚合物具有通过桥接、电荷中和或吸附机制促进絮凝形成的属性。通过选择合适的絮凝剂和优化絮凝条件（例如，pH、温度、絮凝剂用量），可以显著提高澄清过程的效率。 6.技术组合：通常，为了达到最佳效果，会采用多种澄清技术的组合。例如，可以使用离心和过滤的序列来去除不同大小的颗粒和杂质。特定澄清技术的选择取决于植物材料的性质、所需的纯度水平、过程的规模以及目标疫苗抗原的属性等因素。这些澄清方法有助于从植物提取物中去除不需要的颗粒、碎片和杂质，从而获得可以进一步用于下游纯化和植物基础疫苗配方的澄清溶液。 各种色谱技术，如亲和色谱（AC）、离子交换色谱（IEX）、疏水相互作用色谱（HIC）和凝胶过滤色谱（SEC）通常用于纯化重组生物药物。这些技术的主要目标是获得高纯度的产品，同时确保其生物活性得到保留。人们普遍认识到，在过程的初始阶段需要目标蛋白的高浓度，这需要更多的色谱树脂和增加的缓冲液需求。 亲和色谱是一种广泛认可且高选择性的技术，用于纯化包括带标签蛋白、双特异性抗体和疫苗在内的各种植物基生物分子。六组氨酸（His）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和麦芽糖结合蛋白（MBP）是常用的亲和标签。与蛋白A色谱相关的一个重要挑战是蛋白A的浸出，导致DNA、宿主细胞蛋白和其他源自细胞培养的杂质的结合。这些挑战涉及增加的树脂费用、限制的树脂寿命、对蛋白A配体的修改，需要探索替代品，包括微球和单体膜。这些努力旨在克服传统蛋白A色谱相关的限制，旨在提高纯化过程的效率和成本效益。 离子交换色谱是一种高度使用且成本效益高的纯化植物基重组蛋白的技术。它涉及阳离子CEX和阴离子AEX，有效地去除各种杂质，包括浸出的蛋白A、培养基成分、产品变体、宿主细胞蛋白（HCPs）和DNA。疏水相互作用色谱利用蛋白质分子的多样性疏水性质，是蛋白质精炼的关键部分。通过HIC，蛋白质在高离子强度条件下粘附到色谱配体上，而在低离子强度条件下释放。这种技术根据其疏水性质有效地分离和纯化蛋白质，从而增强整个纯化过程。 在SEC中，蛋白质分子根据其分子量进行分离。这种方法已广泛用于纯化不同的蛋白质，包括SARS-CoV-2刺突三聚体疫苗、人类白细胞介素-6（hIL6）、重组过敏原和低过敏性变体。 除了SEC，基于膜的色谱技术用于实现高纯度的重组蛋白。这种方法涉及将高特异性配体附着到微滤膜上。在这种方法中，可以在中性至碱性pH以及低电导率下从溶液中去除杂质。然而，在这种方法中，需要优化流分布以及膜的大小和厚度，以实现蛋白纯化。基于膜的色谱的进步提供了增强的纯化能力，并扩大了有效蛋白纯化过程的选项。 2.8.使用亲和标签纯化植物制造疫苗的例子 亲和标签对于台式纯化以及重组蛋白的表征至关重要。然而，并非每个纯化标签在生产规模上都具有经济可行性，因为通过化学或酶裂解去除标签（对于生物制药是必要的）会降低目标蛋白的产量，因此效率不高。 蛋白融合在基于叶绿体的表达中是有利的，因为融合伙伴稳定并保护叶绿体表达的重组蛋白免受蛋白水解降解，并使融合蛋白纯化。尽管如此，融合蛋白的表达水平> 10%的总可溶性蛋白形式包含体，需要溶解后经过复性才能纯化。因此，尽管在叶绿体转化和重组蛋白表达方面取得了很大进展，但很少有报告使用基于叶绿体的平台进行纯化开发。 融合蛋白中的融合伙伴可以有利于蛋白积累和简便的纯化。GUS干扰素（INF）融合蛋白通过弱阴离子交换色谱和随后的IMAC-Ni色谱纯化，产率为TSP的6%。包含His标记的GUS作为融合提高了表达60倍，同时简化了纯化。作为融合蛋白的INF使用因子Xa以58%的效率裂解，然后通过阳离子交换色谱纯化。使用硫酸铵的两次沉淀步骤和IgG亲和柱用于纯化与金黄色葡萄球菌Z域融合的胰岛素样生长因子（IGF）。在这种情况下，融合蛋白（~10% TSP）经过化学裂解，使用羟胺去除Z域。作为融合体在烟草植物叶片中积累的霍乱毒素B-前胰岛素融合体（高达TSP的47%），在通过IMAC-Ni柱金属亲和色谱纯化之前，经过溶解和复性，因为霍乱毒素B域具有三个相邻的His残基，允许Ni-琼脂糖树脂和融合蛋白之间强烈的相互作用。 桑托尼等人，2022年提出了使用瞬时表达含有6个组氨酸标签（His-tag）的重组蛋白，这些标签可以融合到重组疫苗候选物的N-或C-末端，其中标签使得可以轻松地初步评估植物衍生的候选疫苗。然而，在将其推广到临床试验阶段之前，必须从最终疫苗产品中去除His标签。同时，也需要评估His标签的适当位置，因为标签的位置可能会影响蛋白的积累和表达。 在稳定和瞬时表达系统中，弹性蛋白样多肽（ELP）衍生物（ELPylation）已被证明可以增强蛋白表达。ELP标签可以用于纯化融合蛋白，这对于需要低成本生产的兽医应用尤其有利。这对于生产确保动物健康的疫苗非常有利，对于受动物护理法规和防止因公共卫生问题导致的食品污染的需要驱动的生产者来说，这是一个关键目标。 近年来，猪流感和禽流感等动物传染病的爆发强调了开发有效、可扩展的疫苗接种程序的必要性。流感主要抗原血凝素（HA）的三聚体化是一个重要的工具，可以实现足够的抗原性。ELPylation已被证明可以增强表达，同时实现HA三聚体的可扩展和低成本纯化。 金等人，2021年克隆了肿瘤相关抗原GA733糖蛋白（在结直肠癌中特异性表达）和免疫球蛋白Fc片段（GA733-Fc）的融合基因，以及GA733-Fc与内质网保留基序（GA733-FcK）的融合到瞬时、拆解的植物表达载体pEAQ-HT中，该载体源自豇豆花叶病毒。两种融合克隆都转化到农杆菌中，然后渗透到本氏烟植物的叶片中。在确定了顶部叶片中它们的最大表达水平后，两种融合蛋白都是使用蛋白A亲和色谱纯化。沈等人，2023年选择了针对SARS-CoV-2刺突蛋白的人重链可变域（VHH）抗体片段，使用植物细胞悬浮液和转基因烟草植物进行快速表达。这种抗体的纯化是通过6x His标签和C-Myc标签实现的。这种植物衍生的VHH抗体证明能够像在哺乳动物和细菌细胞培养中表达的抗体一样有效地识别SARS-CoV-2刺突蛋白。 2.9.植物中的糖基工程 大多数具有治疗应用的重要生物蛋白都经历了N-糖基化，其中的糖分子显著影响它们的折叠、组装、溶解度和功能。因此，糖基工程，一种改变蛋白质的碳水化合物组分以实现特定蛋白质特性的过程，是提高药物蛋白的有效性、安全性和韧性的方法。困难在于创建能够可靠地按需生成均质糖蛋白的生物结构。这些结构的可用性将在两个层面上促进进步：（i）理解糖基团在各种生物过程中的作用；（ii）设计具有精确定制糖基化的创新生物物质，以满足其功能要求。 大多数真核细胞的N-糖基化模式都相似，直到形成中间体GnGn。然而，这一点之后的加工差异很大，导致合成几种复杂的N-糖基形态。糖基工程是植物基系统对生物制药开发最引人注目的特征。表1列出了各种表达宿主系统的优缺点。与哺乳动物的Golgi定位糖酶的大量减少相比，植物细胞只产生两种主要的糖链结构，GnGnXF和MMXF。因此，植物蛋白通常具有独特的主要N-糖链结构，与CHO细胞衍生蛋白中发现的多种N-糖链不同。GnGnXF和MMXF中发现的核心1,3-岩藻糖和木糖，不在人类糖蛋白中发现。人们担心植物基蛋白可能引发免疫反应，最终可能导致诱导植物糖链特异性抗体，这可能产生负面影响。与哺乳动物细胞不同，它们具有大量的糖组，导致糖链变异性，使得难以特异性地操纵N-糖基化途径，植物提供了一小系列N-糖基化的糖酶，这使得植物系统成为生产具有均质糖链的蛋白质的理想系统。此外，植物对不同的糖链修饰具有巨大的抵抗力，这不能显著影响它们的生长或发育表型。 在这一发展之后，已经在植物中有效地制造了各种明确定义的人类N-糖链结构，如具有1,6-岩藻糖基化、双分支模式、四天线结构和大乳糖基化的糖链。因此，CHO细胞不再无法生成多分支N-糖链，这都归功于糖基工程植物的创新。这些植物可以生产具有相同N-糖链轮廓的单克隆抗体（mAbs），仅在它们的核心1,6-岩藻糖上有所不同。这些研究还表明，实现人类糖基形态的针对性生产需要精确定位引入的糖酶在特定的亚细胞器中。随机引入哺乳动物酶将破坏自然的糖基化途径，导致次优或不寻常的混合N-糖链。通过使用瞬时表达方法，这些知识促进了通过同时表达和精确指导六种不同的哺乳动物糖酶到各种亚细胞位置，成功生产双天线唾液酸化N-糖链。 植物系统的另一个生物合成能力是生产末端多唾液酸（polySia）糖蛋白，这可以解决与现有的polySia偶联过程相关的挑战，如需要大量的发酵、产品纯化和体外化学相互作用。PolySia在各种生物过程中发挥多种作用，如细胞再生、各种免疫过程和大脑发育。通过将六种人类糖酶共转化到XF植物中，已成功地产生了能够生产具有功能活性的特定唾液酸化N-糖链结构的t植物。COVID-19疫苗和taliglucerase-alpha是使用植物系统生产糖基化生物制药的巨大潜力的显著例子。关于在中低收入国家有效生产疫苗候选物的最新研究突出了植物基糖基化生物制药的未来进步。这项研究，表明在植物系统中制造这些分子可以提供解决当前挑战的解决方案，如不平等的疫苗分配、每剂高成本和对冷链基础设施的需求。 尽管植物糖基工程在过去15年中取得了显著进步，但仍需设计一些目标，以最小化N-糖链和O-糖链的变异性，并防止潜在的免疫原性糖链表位。 表 1 不同表达宿主系统的优缺点 图 2 用于澄清、浓缩和纯化植物系统中表达的重组蛋白的下游工艺的示意图。 3.植物系统中重组蛋白表达和纯化的缺陷 3.1.植物中表达的重组蛋白受蛋白酶影响 植物细胞含有大量属于不同类别的蛋白水解酶，在溶酶体和小液泡中高度表达。N-糖基化和蛋白酶处理直接影响在植物中表达的许多异源蛋白的翻译后命运，除了影响相应重组蛋白的质量。蛋白酶在控制蛋白质的周转中起主要作用，并参与调节几种发育和细胞过程。然而，这些酶在植物组织中无处不在，同时高度多样化，并构成了一个重大障碍，损害了几种重组蛋白的成功表达。 蛋白酶与植物中的多种生物过程有关，包括植物发育、营养物的再动员、病原体防御和衰老。蛋白酶可以通过多种方式影响表达的重组蛋白的完整性，无论是在植物内生物合成后还是在细胞外的提取过程中。根据易受内源性蛋白酶水解肽键的位点数量和可访问性，重组蛋白可能在植物细胞内保持稳定，或者可能遭受完全水解或部分切割，这可能对它们的活性、结构完整性或均质性产生负面影响，从而影响它们的治疗价值。 除了对目标蛋白产量产生负面影响外，蛋白水解处理还可能导致生成具有与完整重组目标蛋白相同物理化学特性的降解产物，因此在下游提取过程中难以去除。 许多针对小液泡的重组蛋白已在植物中成功表达，但是小液泡内蛋白酶的丰富性和特异性不足经常构成一个主要障碍，与有效的重组蛋白表达方案不兼容。蛋白酶抑制剂已被用于增加植物中的重组蛋白表达。 3.2.提高重组蛋白积累的其他方法 提高重组蛋白表达的其他重要参数包括最大化或协调密码子偏好以及修改tRNA库以实现密码子协调，这需要事先了解源生物和宿主中的密码子使用情况和tRNA库的大小。此外，可以与重组蛋白共表达病毒沉默抑制剂，以阻止系统性和局部RNA沉默，通过阻止siRNAs的积累，破坏siRNA-AGO相互作用或引发AGO1降解。表2列出了使用各种植物系统产生的一些重组疫苗。建立ER应激抗性和改变降解途径的方法可以增加重组蛋白表达的途径。此外，通过促进膜合成来增加ER的蛋白质储存能力，可以增加ER的生产力和容量，从而克服ER应激。可以通过遗传工程改造细胞来合成更多的磷脂，特别是磷脂酰胆碱（PC），以促进ER容量的增加。 植物贮藏泡是种子中表达的重组蛋白的首选细胞内目的地。相比之下，叶细胞和未分化悬浮细胞中的液泡通常被视为蛋白表达的不理想部位，因为它们不提供稳定的环境。尽管如此，已经证明几种重组蛋白，如内溶菌素、纤维素酶和亲和素在叶中央液泡中高度积累。使用液泡定位信号在胡萝卜细胞中表达了人葡萄糖脑苷脂酶，实现了所需的N-糖链结构的整合，该结构具有末端甘露糖残基，由液泡中的糖链修饰酶催化。有趣的是，植物生产的taliglucerase alfa，一种用于治疗高雪氏病的酸性β-葡萄糖脑苷脂酶，能够承受溶酶体中普遍存在的高水解条件。通过调节内源性分子伴侣水平，通过过度表达选定的分子伴侣以及感兴趣的重组蛋白，也可以增加重组蛋白的表达。 3.3.监管和安全问题涉及植物中疫苗/重组蛋白的表达和纯化 在生产基于植物的疫苗过程中，监管考虑是批准重组产品的关键组成部分，因此必须遵循监管机构规定的良好实验室规范(GLPs)和良好生产规范(GMPs)的具体指南。一些健康组织，如国际协调理事会(ICH)和世界卫生组织(WHO)，在美国、日本和欧洲等地区在开发、实施、监管和执行监管策略方面发挥重要作用，以生产和使用高质量、有效和安全的生物制药，以实现有利的公共卫生结果。 根据2017年FDA的规定，烟草衍生的重组产品只有在满足改良风险烟草产品批准的要求，提供有关新植物基产品的治疗信息的证据后，才能获得使用批准(食品药品监督管理局，HHS(2017))。加拿大环境气候变化部(ECCC)和美国农业部动植物卫生检验局(USDAAPHIS)等特定国家的监管机构也执行严格的分子农业规则和法规，主要关注防止与生产重组疫苗的植物种植相关的环境风险。由于其生物相容性、低成本、大规模表达和低传播动物疾病风险，烟草已被证明是表达植物基疫苗的有利系统。然而，由于监管和安全限制的强大阻碍，长期的临床试验受到了阻碍。 FDA已经对植物基产品的安全应用提出了严格的指令。此外，欧洲药品管理局(EMA)已规定，只有在至少使用了30年，包括在欧盟至少使用了15年，并且不是通过肠外给药的情况下，草药治疗化合物才能被使用。此外，只有在有足够的科学信息证实植物基产品的纯化成分或活性成分具有可识别的效力时，才允许使用和销售这些植物衍生产品。考虑到植物中存在几种有毒物质，必须排除由于非规范管理的植物衍生产品的管理而产生的任何副作用。只有这样，针对疾病的植物基疫苗候选物才能被考虑有效使用。此外，监管操作的快速协调将有助于减少植物基产品从实验台到市场的适应时间。此外，基于植物的疫苗必须符合所有生物制品的严格GMP法规指南所指定的最佳质量标准。尽管植物基可食用疫苗具有优点，但它们的使用存在几个挑战。这些包括不适当的基因转移方法、低表达水平、密码子偏差和监管位点的障碍、不当的聚腺苷酸化、mRNA不稳定、表观遗传沉默、位置效应、管理后不充分的免疫反应、剂量一致性变化以及疫苗抗原和宿主植物组合的不当选择。Medicago Inc.最近完成了SAR-Cov-2候选疫苗的2期临床试验，并获得了加拿大卫生部的监管批准，这将为植物制造的产品铺平道路。 4.结论 随着植物表达平台的发展，研发的重点将从上游转移到下游处理，以提高整体生产力。下游处理占操作和产品制造总成本的大部分。因此，为了经济可行，越来越需要选择性和高效的产品提取和纯化过程。下游处理的效率取决于重组蛋白的浓度、无细胞培养基和植物提取物的复杂性以及最终产品所需纯度水平。本综述试图定义从植物中表达和发展疫苗和其他药物蛋白所需的阶段。随着对疫苗的环保和经济有效的表达平台的需求增加，这些步骤将进一步完善。 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The strategic investment will help the company tackle dehydration and heat stress in Japan and broader Asia with its portfolio of sweat-sensing biowearables CAMBRIDGE, Mass., Jan. 17, 2024 /PRNewswire/ -- Epicore Biosystems ('Epicore'), a digital health solutions company developing advanced sweat-sensing wearables to provide real-time personalized hydration insights for performance and safety, today announced that it has received investment from Pegasus Tech Ventures ('Pegasus'), a global venture capital firm based in Silicon Valley, and Denka Company Limited ('Denka'), a Japan-based multinational technology and materials company. The new investment is the first of a larger series and will be used to support the scale and distribution of Epicore's wearable solutions within Japan and in the broader Asia market. Asia continues to experience unprecedented heat waves, breaking all-time temperature records throughout the continent. Despite the introduction of wearable technologies and the dangerous rise in extreme heat waves, digital solutions that monitor and manage hydration have yet to reach broad-scale adoption in Asia. As a result, many enterprises and athletes alike have had to rely on qualitative tracking of weather conditions to determine the hydration needs of industrial workers. Using the new investment from Pegasus and Denka, Epicore will improve access to personalized hydration insights by scaling its Connected Hydration solution across Japan and Asia. Connected Hydration is a breakthrough biosensor and enterprise cloud that measures sweat loss, sodium loss, skin temperature and movement to provide actionable rehydration strategies in real-time. "Exposure to heat has proven to be quite challenging to pin down, as every individual has different hydration needs that could vary depending on diet, sleep, stress and physical exertion," said Dr. Roozbeh Ghaffari, CEO and co-founder of Epicore Biosystems. "Alongside Denka and Pegasus, we are bringing our scientifically validated biowearable products to Asia to tackle the dehydration and extreme heat crisis with a single, unified biosensor and enterprise cloud for the first time." This strategic investment comes on the heels of recent deployments by Epicore and Denka across several industrial sectors in Japan. Denka trialed the solution with multiple Japanese corporations, including chemical factories, construction, engineering services, oil and gas, warehouses and manufacturing plants, and found that extreme heat conditions across both indoor (factory work) and outdoor (construction and oil gas field work) caused significant sweat losses and a broad range of electrolyte losses. These sweat loss results indicate that heat exposure and dehydration risks are not limited to outdoor field workers. In fact, indoor workers experienced significant alerts/alarms and were at times working nearby radiating heat sources, thus representing even higher risk. "Health risks and injuries associated with extreme heat are pervasive in Japan and across the broader Asia population," said Nobuyuki Yoshino, managing executive officer at Denka. "Epicore's wearable technology is positioned to improve our understanding of hydration and health needs for people at home and in industrial work settings. We are excited to collaborate with Epicore to help scale Connected Hydration and its portfolio of innovations and products." Epicore's Connected Hydration consists of a flexible wearable patch, a mobile application and a cloud engine. Unlike most wearables in the market, Connected Hydration has an extended battery life that works over 1,000 hours and never requires charging. Epicore Biosystems offers a complimentary battery swap service, creating an eco-friendly and seamless user experience. Connected Hydration's advanced features include: Multiple biosensors for real-time sweat and electrolyte loss, skin temperature, and motion tracking Real-time dehydration alerts and alarms via vibration cues Real-time hydration feedback and fluid/electrolyte intake tracking via the mobile app Data dashboard for tracking daily and longitudinal changes across all biometrics Enterprise cloud engine with predictive analytics for dehydration events The record-setting heat waves of 2023 have led to increasing global demand for hydration management solutions from enterprise sports and industrial companies, particularly in Asia, Australia and the Middle East regions. Over the past few years, Epicore has lined up several key partners in the United States and abroad, including notable companies such as Chevron, PepsiCo, Gatorade, 3M, the U.S. Army and more. The company will launch the patented Connected Hydration patch, mobile application and cloud engine for commercial use in early 2024. To learn more about the company and its solutions, visit . About Epicore Biosystems Founded in 2017, Epicore Biosystems is a digital health company developing advanced sweat-sensing wearables that provide real-time personalized health insights for hydration, stress and wellness. Their clinically validated biowearable products and cloud analytics are deployed globally and licensed by leading Fortune 500 companies, the Department of Defense and the National Institute of Health. To learn more, visit . About Denka Company Limited Denka is a chemical company that continues to contribute to the advancement of society by developing and providing unique technologies and products for more than 100 years since its establishment in 1915. In our management plan "Mission 2030" covering the 8-year period from 2023 to 2030, we identified three domains "ICT & Energy", "Healthcare", "Sustainable Living" as focus areas. Denka continues to contribute to people's lives and the society through the chemistry we can be proud of to the world for the purpose of "Make the world a better place as specialists in chemistry." To learn more, visit About Pegasus Tech Ventures Pegasus Tech Ventures is a global venture capital firm based in Silicon Valley, offering intellectual and financial capital to exceptional emerging technology companies around the world. In addition to a more traditional investment approach, Pegasus offers a unique Venture Capital-as-a-Service (VCaaS) model for large, global corporations that wish to partner with cutting-edge technology startups. To learn more, visit

Recently, the Department of Justice (DOJ), on behalf of the Environmental Protection Agency (EPA) , filed a motion for the preliminary injunction of Denka Performance Elastomer, requesting that the court order the company to significantly reduce chloroprene emissions through pollution controls. The preliminary injunction is filed under the Clean Air act section 303 and is currently pending in the United States District Court of the Eastern District of Louisiana. Denka’s facility is located in St. John the Baptist Parish, LA. The lawsuit posits that the company facility — specifically its manufacturing operations — remains an imminent and substantial danger to the surrounding communities due to the level of chloroprene emissions, an pollutant that EPA has determined to be a likely carcinogen. “Today’s motion asks the court to require Denka to take strong action to protect neighboring communities from the urgent dangers caused by its harmful emissions,” said Assistant Attorney General Todd Kim of the Justice Department’s Environment and Natural Resources Division. “This action shows our determination to address environmental justice concerns of overburdened communities and to protect children living and studying today near this facility.” Chloroprene is a liquid raw material used to produce neoprene, a flexible, synthetic rubber used in many industries. In medtech, neoprene is used in orthopedic braces and other medical equipment like gloves. When manufactured, chloroprene is emitted into the air, and can spread from the facility to neighboring communities. According to the original US complaint, which was filed on Feb. 28 , air monitoring conducted by the EPA and Denka over the past several years has consistently shown long-term chloroprene concentrations in the air near its facility as high as 14 times the levels recommended for a 70-year lifetime of exposure. Located 450 feet from Denka’s facility is the 5th Ward Elementary school, housing more than 300 children. Approximately 1200 children who attend East St. John High School, located roughly a mile-and-a-half north of Denka, are also exposed. Additionally, approximately 20% of the total population living with two-and-a-half miles of the facility are children under the age of 18, and about 800 to 1000 children are under the age of five. Children are particularly vulnerable to carcinogens like chloroprene because they change DNA and harm cells, meaning they are mutagenic. The motion for preliminary injunction asks the court to require the company to take strong action to reduce exposure to chloroprene in the area. The original complaint also names DuPont Specialty Products — the owner of the land beneath the facility and Denka’s landlord — reasoning that DuPont is a necessary party to ensure there are no delays in any actions Denka is ordered to do to reduce emissions as a result of the rights DuPont holds under its lease agreement with the company. “All communities deserve to breathe fresh, clean air; it is one of EPA’s top priorities as we work to protect human health and the environment,” said EPA Administrator Michael S. Regan. “This is another action that sends a clear message that the Biden-Harris Administration is committed to the health and safety of St. John the Baptist Parish, and I will continue to pledge that EPA will use all legal remedies available to reduce harmful air pollution in this community.”