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从384孔高通量到PDO模型：NCI肿瘤药筛平台为何持续选择CellTiter-Glo®？ 美国国家癌症研究所（NCI）的NCI-60药物筛选面板（NCI-60 drug screening panel），由60种不同的人类癌症细胞系组成，被广泛用于体外筛选大量小分子（合成或纯化天然产物），以鉴定潜在的抗癌药物。 这一药物筛选面板代表了人类癌症的多样化横截面，涵盖了白血病、黑色素瘤以及肺癌、结肠癌、脑癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和肾癌等。NCI-60面板的开发与应用在癌症研究和药物发现中发挥了举足轻重的作用，为揭示癌症的分子基础及治疗剂作用机制提供了宝贵见解。 然而，随着药物研发进入精准医疗时代，研究人员面临的新问题也越来越明显： 一方面，希望能够以更高效率筛选越来越庞大的化合物库； 另一方面，也希望体外实验模型能够更真实地反映患者体内的肿瘤状态。 围绕这两个目标，NCI近年来对药物筛选体系进行了两次重要升级。 升级高通量筛选：从96孔到384孔 NCI过去30多年一直在升级肿瘤药筛体系，其药物筛选的方法经过了一系列的优化演变： NCI-60建立初期，NCI采用MTT类检测方法； 1990年代初，NCI长期采用磺酰罗丹明B（SRB）的蛋白质结合染料的方法； 2022年，NCI完成了现代化升级的NCI-60 S384平台。该平台由经典96孔SRB读数升级为384孔格式，并采用CellTiter-Glo® ATP发光法作为检测终点。 对于药物筛选而言，这不仅意味着筛选速度的提升，更意味着研究人员能够以更低成本处理更大规模的候选药物库。 升级更真实的肿瘤模型：从二维细胞走向PDO 然而，仅仅提升检测效率还不足以解决药物研发中的所有挑战。要提高体外筛选结果向临床转化的成功率，实验模型本身也需要不断升级。 高通量筛选（High-Throughput Screening，HTS）能够快速评估抗癌单药及联合用药在多种细胞肿瘤模型中的活性。然而，要使筛选结果成功转化至临床患者，所采用的肿瘤模型必须具有较高的生物学相关性。与传统二维细胞系相比，患者来源类器官（PDO）直接来源于患者肿瘤组织，能够在体外保留更多肿瘤的遗传特征、组织结构和药物反应特征，因此被认为更接近临床真实情况。 PART 01 自动化类器官HTS平台  2023-2024年间， NCI建立了基于患者来源模型库（PDMR）的患者来源类器官（PDO）的高通量药物筛选平台。研究团队评估了超过230个患者来源类器官模型，包括检测其： 冻存复苏后的恢复能力 生长与扩增的可重复性 在384孔板筛选格式中，以CellTiter-Glo® 3D细胞活力检测作为终点读数时的检测性能指标。 未来，该数据库预计将扩展至所有已获批准以及绝大部分在研肿瘤药物，覆盖约1000种小分子化合物。 PART 02 结直肠癌类器官高通量联合用药筛选 2025年，NCI采用32个PDMR结直肠癌类器官开展高通量联合用药筛选，并以CellTiter-Glo® 3D终点法评价细胞活力。研究识别出若干涉及RAS/MAPK及PI3K等信号轴的候选协同组合，显示了PDO平台用于抗肿瘤联合用药发现的可行性。 PART 03 罕见癌症患者来源类器官模型药物筛选 2026年，NCI利用25个罕见癌症患者来源类器官模型，使用包含166种FDA批准肿瘤药物的化合物库，经7天处理后，以CellTiter-Glo® 3D检测细胞活力。结果显示，该筛选体系具有良好的检测性能，并观察到不同模型间具有差异性的药物反应，为罕见癌症的药物再定位和候选治疗策略研究提供了实验依据。 为何两次升级都选择CellTiter-Glo®？ Promega的CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay（简称CTG）是基于ATP的细胞活力检测，在国内外科研及制药企业中被广泛应用，是公认的细胞活力检测“金标准”。3D版的CellTiter-Glo®进行了优化，试剂裂解能力更强，可以更高效的渗透至打的3D培养物或细胞球内。 CellTiter-Glo®有以下优势： CellTiter-Glo® 简单、更快、更灵敏 新实施的CellTiter-Glo®工作流程也克服了SRB测定的局限性。例如，CellTiter-Glo® Assay中测量的细胞内ATP提供了有活力细胞的直接度量，其发光输出在高密度和低密度细胞培养中都具有更高的稳定性和灵敏度。CellTiter-Glo® Assay还通过使用户能够测量非贴壁细胞的细胞存活和细胞毒性，扩展了样本选择，这是SRB测定无法实现的。 CellTiter-Glo® 更适合高通量筛选 CellTiter-Glo® Assay的某些特性使其更适合高通量筛选（HTS）工作流程。与需要固定和洗涤等多个步骤的SRB测定不同，CellTiter-Glo® Assay只需将试剂直接添加到细胞中，然后在测量发光结果之前进行短暂的孵育。 CellTiter-Glo® Assay的高灵敏度和信号背景比还允许使用更少的细胞和更低的样品体积，使得NCI能够为HTS筛选操作方案采用更高孔数的平板格式。此外，CellTiter-Glo® Assay产生的稳定发光信号半衰期超过五小时。这种延长的半衰期通过消除对试剂注入器的需求并提供批量处理多个平板的灵活性，进一步改善了HTS过程，减少了在多步方法（如SRB测定）中可能引入的移液错误。 总结 从NCI-60 HTS384平台采用CellTiter-Glo®，到PDO高通量筛选使用CellTiter-Glo® 3D，我们看到的不仅是一种检测方法的应用，更是现代药物筛选对于数据质量、实验效率和临床相关性不断提升的要求。 未来，随着患者来源类器官、罕见癌症模型以及标准化类器官平台的发展，药物筛选关注的将不仅是“筛得更快”，更是“筛得更准”。而可靠的细胞活力检测，也将持续成为连接高通量筛选与临床转化的重要基础。 参 参考文献（点击显示全部） Alley, M.C. et al. (1988) Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Research, 48(3), 589-601. Boyd, M.R. (1997) The NCI In Vitro Anticancer Drug Discovery Screen. In Teicher, B.A. (Eds.) Anticancer Drug Development Guide. Cancer Drug Discovery and Development. (pp. 23-42). Humana Press, Totowa, NJ. Chabner, B.A., and Roberts, T.G., Jr. (2005) Chemotherapy and the war on cancer. Nature Reviews Cancer, 5(1), 65-72. Keepers, Y.P. et al. (1991) Comparison of the sulforhodamine B protein and tetrazolium (MTT) assays for in vitro chemosensitivity testing. European Journal of Cancer, 27(7), 897-900. Skehan, P. et al. (1990) New Colorimetric Cytotoxicity Assay for Anticancer-Drug Screening. Journal of the National Cancer Institute, 82(13), 1107-1112. Suggitt, M., and Bibby, M.C. (2005) 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clinical Cancer Research, 11(3), 971-981. Vistica, D.T. et al. (1991) Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Cancer Research, 51(10), 2515-2520. https://dctd.cancer.gov/drug-discovery-development/assays/high-throughput-screening-services/nci60#about-the-nci-60-hts384-screen https://aacrjournals.org/cancerres/article/83/7_Supplement/5776/722008/Abstract-5776-Advancing-a-screening-platform-with https://aacrjournals.org/cancerres/article/86/7_Supplement/4857/779391/Abstract-4857-A-panel-of-patient-derived-organoid https://aacrjournals.org/cancerres/article/85/8_Supplement_1/1674/756554/Abstract-1674-Combinatorial-screen-with-standard 产品信息  如需要了解更多产品信息或技术，请拨打下方电话与我们联系。 400 810 8133 >关于Promega公司< 普洛麦格公司（Promega Corporation）是为生命科学行业提供创新解决方案和技术支持的领先者。公司拥有超过4,000种产品的产品组合，服务于细胞生物学、DNA、RNA及蛋白质分析、药物研发、人类身份鉴定、分子诊断等生命科学领域。过去45年间，这些工具与技术的应用范围持续扩展，目前被全球科研机构、法医部门、制药企业、临床诊断实验室，以及兽医、农业和环境检测领域的专业人员使用。普洛麦格总部位于美国威斯康星州麦迪逊市，在16个国家设有分支机构，并通过50余家全球经销商提供服务。更多信息请访问：www.promega.com。 Promega媒体中心 生命科学官方微信公众号 生命科学小红书官方号 生命科学B站官方号 抖音官方号 生命科学知乎官方号 生命科学官方视频号 技术咨询:400-810-8133 / 服务:010-58256268 www.promega.com SEARCH

日前，2026中国细胞与基因治疗(CSGCT)大会在北京中关村国家自主创新示范区展示交易中心举行。 大会以“释放中国临床与监管新势能，助力全球CGT加速转化”为主题，由中关村科学城管理委员会指导，北京中关村科学城创新发展有限公司、北京海淀中关村科学城竞科细胞与基因治疗创新发展中心、CSGCT中国细胞与基因治疗联盟主办。 北京市海淀区人民政府副区长林航在主论坛致辞环节指出，海淀精准地锚定CGT产业的赛道，提前布局了TIL、Treg、In Vivo CAR-T等功能性细胞药物研发平台，推出全链条的政策保障体系，来推动CGT产业的创新突破。“在海淀，国际创新资源加速聚集，本土创新企业快速成长，已形成优质的临床资源吸引药企深度合作，产业生态完善，加速创新实体落地的良性循环发展。面向未来，海淀将继续把CGT产业作为重点发力的前沿方向，我们将持续优化创新生态，以最优的服务、最完备的生态，与大家共同推动CGT产业实现更新的突破和发展。” 北京医药健康科技发展中心主任刘慧在致辞中表示，对比国内外CGT产业的发展现状，北京具有创新动能强、临床资源丰富、细分赛道优势突出的特点。同时，为了进一步做好818号令的落地，北京市相关部门也在一起研究落实，服务好新政落地与产业高质量发展的衔接工作。 2026年3月，CSGCT联盟正式落地海淀。CSGCT发起人、主席，嘉因生物创始人吴振华表示，CSGCT联盟让全球资源看见真实的中国临床与产业能力，为中国CGT全产业链带来商机与合作。截至目前，CSGCT已链接9家国际CGT组织，大会吸引超300位海外参会者，全年触达国际CGT资源10000项。 据了解，本次大会邀请了巴西、加拿大、澳大利亚、亚洲、韩国等多个国家和地区的细胞与基因治疗相关学会代表到场。在与会代表见证下，《北京倡议：共建全球基因与细胞治疗共同体》正式发布，这份倡议以共筑开放包容的国际合作网络，共享前沿科学与临床转化的智慧成果，共促全球基因药、细胞药的普惠及可及，共守伦理底线与行业发展的信任基石，共绘科技与科学努力的未来韧性为五大核心原则，承载着全球CGT同行共同愿景。 当天，参会者共同见证了诺思兰德塞多明基注射液商业化上市启动的里程碑进展。该品种获批用于治疗不适合血运重建手术或手术效果不佳的严重下肢缺血(下肢动脉硬化闭塞症、血栓闭塞性脉管炎和糖尿病下肢缺血等)导致的肢体溃疡。 会上，北京药品监管科学创新中心主任王涛系统梳理了CGT产品监管的四大核心变化，即分类边界明确、审批加速、监管灵活性释放以及全生命周期管理的强化，并透露2026年将出台药学变更、分类与风险控制指南，强调监管体系须匹配CGT高风险、高定制化特征形成闭环。 圆桌讨论环节则汇聚了监管、产业与资本等多方力量，中国药品监督管理研究会CGT专委会主任委员王越从监管新政端把脉方向；科济药业创始人、董事会主席、首席执行官、首席科学官、CSGCT联席主席李宗海，信念医药联合创始人、董事长兼首席科学家肖啸，瑞宏迪医药创始人、董事长廖成，以及艺妙生物CEO何霆等，带来一线临床与商业转化的实战洞察；君联资本联席首席投资官王俊峰则从资本视角出发，共同探讨如何以临床资源与监管创新为双轮驱动，构筑全球CGT管线落地的“中国支点”。 在国药中国生物研究院、复星凯瑞、威斯津生物、舒桐科技、Promega、聚茵生物、唯可生物等代表的见证下，《全球In Vivo细胞治疗行业白皮书》全文于大会期间发布。该白皮书经由前后访谈数十位行业专家，结合走访调研、已披露数据完成内容撰写，围绕载体递送、成药路径及产业化前景等展开深入讨论。 图片由活动主办方授权使用

In vitro anticancer effect of venom from Cuban scorpion Rhopalurus junceus against a panel of human cancer cell lines古巴蝎子Rhopalurus junceus毒液对人类癌细胞系的体外抗癌效果作者：亚历克西斯·迪亚斯-加西亚 ，路易斯·莫里耶-迪亚斯 ，雅希玛·弗里翁-埃雷拉 ，赫米斯·罗德里格斯-桑切斯 ，亚米拉·卡瓦列罗-洛伦佐 ，迪内娅·门多萨-利亚内斯 ，雅内利斯·里克内斯-加洛博 ，何塞·A·弗拉加-卡斯特罗  生物制药与化学生产实验室（LABIOFAM） 古巴哈瓦那古巴哈瓦那“佩德罗·库里”热带医学研究所细胞培养实验室微生物学系 古巴哈瓦那大学食品与药学研究所 PMC版权声明 PMCID：PMC3717326 PMID：23946884 摘要 在古巴，特有的蝎子Rhopalurus junceus被用于传统医学中的癌症治疗。然而，关于其在癌症治疗中的潜力，科学证据很少。通过MTT测定，对来自上皮细胞系（Hela、SiHa、Hep-2、NCI-H292、A549、MDA-MB-231、MDA-MB-468、HT-29）、造血细胞系（U937、K562、Raji）及正常细胞（MRC-5、MDCK、Vero）的人类肿瘤细胞系，使用不同蝎子毒液浓度（0.1、0.25、0.5、0.75和1mg/ml）效果。此外，还通过荧光显微镜、RT-PCR和西方墨迹检测了毒液对肿瘤细胞死亡的影响。仅上皮癌细胞表现出显著的细胞存活率下降，中质细胞毒性浓度（IC50）范围为0.6-1mg/ml，且与浓度相关。正常和造血肿瘤细胞均无影响。蝎子毒液被证明能诱导较不敏感的肿瘤细胞（Hela）细胞凋亡，表现为染色质缩合、p53和bax mRNA的过度表达、bcl-2 mRNA的下表达以及激活的半胱天冬酶增加3、8、9。在大多数敏感肿瘤细胞（A549）中，蝎子毒液诱导坏死，证据包括橙酸酐/溴化乙酰荧光染料以及凋亡相关基因的下表达。我们得出结论，来自R. junceus的蝎子毒液对上皮癌细胞具有选择性和差异性毒性。这是首个关于红朱氏毒液对肿瘤细胞系生物效应相关的报告。所有这些结果使R. junceus毒液成为癌症治疗的有望天然产品。 关键词：Rhopalurus junceus、蝎子毒液、癌细胞、凋亡、坏死 引言 癌症是全球主要的死因之一。癌症是一种复杂的多因素疾病，依赖于各种遗传和表观遗传事件的细胞积累（Blagosklonny，2005）。具体来说，实体肿瘤是全球最常见的，死亡率更高。放疗、化疗和手术是癌症治疗的关键工具（Fritz 等，2013）。然而，这些治疗也会导致严重的全身性副作用。因此，已有多种治疗方法被开发出来以克服不同癌症的复杂性（Meiyanto 等，2012）。其中，全球范围内对抗癌新药物的探索和发现，尤其是源自天然产品的药物正在不断增加。其中一种，蝎子毒液，如今被认为是癌症治疗的有趣天然来源（Gomes 等，2010）。 此前已有研究表明，Leiurus quinquestriatus和Buthus martensii Karsh（BMK）中的蝎子毒液作为癌症治疗的潜在天然产物（Xiao， 1990;Debin 等，1993）。BMK蝎及其毒液被用作传统和民间疗法，用于癌症及其他病理生理状况的治疗（Goudet等，2002）。此外，Das Gupta及其同事还建立了印度黑蝎（Heterometrus bengalensis）毒液对人类白血病U937和K562细胞的细胞毒性活性（Das Gupta等，2007）。 蝎子（Rhopalurus junceus，简称R. junceus）是古巴特有的一种，属于鹃科。这种蝎子分布广泛，国内没有该物种或其他物种的蝎子活动报告。因此，它们不被视为对人类危险。长期以来，来自R. junceus的毒液一直被古巴传统医学用于治疗某些疾病，包括癌症，并对部分人群显示出有益效果。然而，关于这种蝎子毒液对癌细胞的生物活性和作用范围，科学证据仍然很少。因此，我们评估了R. junceus蝎毒液对来自不同组织学来源的癌细胞系（包括正常细胞）的抗癌效果。 材料与方法 试剂 RPMI-1640和Dulbecco改良的Eagle's介质是从GIBCO/BRL（马里兰州凯瑟舒尔格）购买的。胎儿牛血清（FBS）是从Hyclone购买的。TRIzol试剂来自Invitrogen（Invitrogen，美国）。dNTP、GoTaq DNA聚合酶和M-MLV逆转录酶系统均购自Promega（美国Promega公司）。3-[4,5-二甲基-亚唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）试剂购自西格玛。所有其他化学品和试剂均来自Sigma（密苏里州圣路易斯）。 毒液来源 成年Rhopalurus junceus蝎子被安置在生物制药与化学生产创业集团（LABIOFAM）实验室的单个塑料笼中。实验室中活体蝎子的毒液通过电刺激提取。毒液溶解于蒸馏水中，并在15000xg离心15分钟。上清液通过0.2微米注射器滤网过滤，并在-20摄氏度储存，直到使用。蛋白质浓度通过Lowry修正法计算（Herrera等，1999）。 细胞系与培养 实验中使用的人类癌细胞系来自ATCC培养样本。所用细胞系包括上皮细胞系Hela（宫颈腺癌，ATCC CCL-2™）、SiHa（宫颈鳞状细胞癌，二级;ATCC HTB-35™）、NCI-H292（黏膜样肺癌;ATCC，CRL-1848™）、A549（肺癌;ATCC;CCL-185™;;肝炎2型;™™™造血癌U937（组织细胞淋巴瘤ATCC CRL-1593.2™）、K562（慢性骨髓性白血病ATCC CCL-243™）和Raji（伯基特淋巴瘤ATCC CCL-86™）细胞系。此外，还使用了MRC-5（正常人类肺成纤维细胞ATCC CCL-171™）;MDCK（正常犬肾 ATCC CCL-34™）和 Vero（正常非洲绿猴肾 ATCC CRL-1586™）细胞系。Hela细胞、SiHa和Hep-2细胞在Earle's BSS中保持在Eagle's最小必需培养基中，配合非必需氨基酸90%（w/v）和热处理的胎儿牛血清（FBS）10%（v/v）、青霉素（100U/ml）和链霉素（100μg/ml）。细胞NCI-H292、A549、MDA-MB-231、MDA-MB-468、HT-29、Vero和MDCK在Dulbecco改良的Eagle's培养基中保持，90%（w/v）配热灭活胎牛血清（FBS）、10%（v/v）、青霉素（100U/ml）和链霉素（100μg/ml）。MRC-5细胞系在RPMI-1640中维持，辅以10%（v/v）FBS、青霉素（100U/ml）和链霉素（100μg/ml）。 体外细胞存活能力测定（MTT测定） 蝎子毒液对细胞存活能力的影响由MTT测定法确定（Mosmann，1983）。SiHa细胞（5个 × 103 个/孔）及剩余细胞系（1 × 10个 4 个/孔）在 96 孔培养板（纽约罗切斯特 Costar Corning）中 50μl 培养基/孔中进行培养，并在 5% （v/v） CO2 湿度、37°C 的加湿环境中隔夜培养，以实现细胞的恢复和细胞粘附。孵育后，在每个孔中加入50μl不同量的蝎子毒液，溶解于培养基中，毒液浓度分别为0.1、0.25、0.5、0.75和1 mg/ml。使用了带有培养基且无蝎子毒液的细胞作为未处理的生长控制。每个浓缩区共包含五口井。经过72小时处理后，每孔加入10微升5mg/ml无菌MTT（pH值4.7），并再培养3小时。上清液被小心去除，每孔加入150μl DMSO，并在37摄氏度摇晃15分钟。吸收度通过微板读取器测量（ELISA MRX Revelation Dynex Technologies 560nm，630nm为参考）。未处理细胞的吸收被视为生长的100%，用于存活率计算。蝎毒对人类细胞系存活率的影响以存活率百分比表示，公式为：%存活率=处理细胞560株/对照株560株 × 100%。从癌细胞中测定了IC50值（导致细胞减少50%的毒液浓度）。这些实验共进行了五次。 分离总RNA及T-PCR分析，在Hela和A549细胞中p53、bax和bcl-2基因表达 Hela和A549细胞（2×10个5孔/孔）在24孔板上播种，培养24小时。与新鲜培养基一起使用的蝎毒浓度为0.75mg/ml，三倍细胞培养井暴露在包括载体（对照细胞）中。处理和对照细胞培养后又孵育8小时、24小时和48小时。在潜伏期结束时，细胞被采集并用于全RNA提取和逆转录PCR（RT-PCR）。 根据制造商的规范（Invitrogen，美国）使用TRIzol试剂从细胞中分离出总RNA。最终洗脱中的总RNA浓度通过使用生物光度计加（德国埃彭多夫）测定。每个分离的RNA（1μg）样本都通过M-MLV逆转录酶系统（Promega公司，美国）在50μl体积反应中进行逆转录。每次PCR均在包含1个Green Go Taq Flexi Buffer、2mM MgCl2、10mM dNTPs和1.25U GoTaq DNA聚合酶（Promega Inc. 美国）的主混合中进行，并配有0.2mM的正向和反向引物和5μl的DNAC，采用25μl反应混合物。PCR扩增在热循环仪（西班牙AUXILAB）中进行。GAPDH（甘油醛3-磷酸脱氢酶）扩增作为家务基因进行。RT-PCR的引物序列为5'-ACACCCACTCCTCCACCTT-3'和5'-TAGCCAAATTCGTTCATACC-3'用于GAPDH;5'-GGGTTAGTTTACAATCAGCCACATT-3' 和 5'-GGCCTTGAAGTTAGAGAAAATTCA-3'for p53;βax的5′-GGACGAACTGGAGAGATAACATGG-3′和5′-GCAAAGTAGAAAGGGGACAC-3′;以及bcl-2的5'-CAGGTCCTCTCAGAGGCAGATAC-3′和5'-CCTCTCCCCAGGACCTTAACG-3′。GAPDH的PCR条件为：94摄氏度30次30秒，54摄氏度30秒，72摄氏度1分钟。Bcl-2的PCR条件为94摄氏度30圈1.5分钟，56摄氏度30秒72摄氏度1分钟。Bax的PCR条件为94摄氏度35周期1.5分钟。 在55摄氏度下30秒，在72摄氏度下1分钟。p53的PCR条件为30个周期，94摄氏度，1.5分钟，56摄氏度30秒，72摄氏度，持续1分钟。扩增后的PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中以70伏电泳进行1.5小时。使用了一个50碱基对的DNA梯形标记作为分子标记。凝胶在1xTBE（三硼酸盐-EDTA）缓冲液中用溴化乙键观察。凝胶被检查，并使用Gel Doc成像系统UVIsave D-55/20M版本15.08（英国UVItec）测量了每条波段的强度。扩增后的PCR产物大小为GAPDH为120碱基对，Bcl-2为220碱基对，Bax为150碱基对，p53为130碱基对。 凋亡和坏死细胞的形态评估与测量 为研究细胞死亡事件，Hela和A549细胞（每孔2×105孔）在24个培养板中过夜生长，并用0.75mg/ml蝎毒液处理48小时。在此期间，细胞与橙酸酐和溴化乙蓌混合物在PBS中孵育（100μg/ml橙酸酐/100μg/ml溴化乙莓）。活细胞的细胞核被膜永久染料阿里定橙染色，坏死细胞则用高荧光的溴化乙键染色。添加荧光染料后，利用IX-71（日本奥林巴斯）荧光显微镜在480nm和520nm滤光片的三个独立实验中分析并计数了200个细胞。此外，蝎子毒液处理和未处理细胞被4′，6-二酰胺-2-苯吲哚二盐酸物（DAPI）（1μg/ml）染色5分钟，以识别凋亡体。 通过西部印迹法确定Caspase 3、8和9活性 Hela细胞（2×10个5个/孔）被置于24孔培养板中，并用0.75mg/ml蝎毒处理。未处理对照细胞和毒液处理细胞随后孵育24小时和48小时。此后，细胞被培养在含有50mM三盐酸、150mM氯化钠、1mM乙二醇四醋酸（EGTA）、1mM EDTA、20mM NaF、100mM Na3VO4、1% （v/v） NP-40、1% （v/v） Triton X-100、1mM 苯甲基硫酰氟化物（PMSF）、10μg/ml Aprotinin和10μg/ml Leupeptin的冰敷中孵育，30分钟后将细胞裂解。离心后，采用Herrera等人修改的Lowry方法测定总蛋白（Herrera等，1999）。蛋白质被12%（w/v）SDS-PAGE分离（50μg），并转移到聚二氟乙烯（PVDF）膜上。这些膜在室温下，用含0.05%（v/v）tween（pH7.5）磷缓冲盐水（PBS）溶解的5%脱脂牛奶（PBS-Tween）封闭，浸泡1小时。清洗步骤后，在室温下用适当的主抗体探测半胱天冬酶3、8和9，在阻断缓冲液中探针2小时。最后，膜与相应的二级抗体一起孵育1小时，并使用增强型化学发光印迹检测系统检测。 统计分析 IC50值通过从线性回归曲线插值趋势线确定，并采用Mann-Whitney U检验进行比较。如果无法获得该参数，则表示无效果，并声明“无效”（无效）。主要细胞死亡事件采用曼-惠特尼U检验分析。使用Mann-Whitney U检验比较了蝎子毒液处理和未处理细胞中各基因的带强度。所有分析中，我们使用了Windows版GraphPad Prism 5.01（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）。研究中考虑了p<0.05的显著差异。 选举结果 MTT测定与IC50值 为了探讨蝎子毒液对细胞存活能力的影响，研究人员对一组人类细胞系施加了更高浓度。结果显示，与对照细胞相比，72小时治疗后，对上皮癌细胞系（癌细胞瘤和腺癌）的细胞存活率显著下降（p<0.05）（见图1A和1B）。图1。 在新标签页中打开 蝎子毒液对不同细胞系的细胞毒性图示。细胞在蝎子毒液浓度0.1-1mg/ml下孵育72小时。通过MTT细胞毒性分析测量了细胞增殖百分比。答。最敏感的人类上皮肿瘤细胞系。B. 敏感度较低的人类上皮肿瘤细胞系。C. 人类造血肿瘤细胞系。D. 细胞系正常。 研究中连续使用毒液浓度后，癌细胞存活率显著降低（p<0.05），显示生长抑制呈浓度依赖性。相反，在所用浓度下，R. junceus scorpion毒液不影响正常造血细胞系的存活率（见图1C和1D）。 IC50参数用于测量蝎子毒液对人类细胞系细胞存活能力的影响。表I显示了IC50值，允许对每个细胞系进行比较。IC50显示，毒液对上皮癌细胞具有选择性生存能力降低，而正常和造血细胞则无显著效果（见表1）。A549和NCI-H292肺癌对应的细胞IC50最低分别为0.63±0.04mg/ml和0.68±0.01mg/ml（见表1）。而Hela和Siha分别是IC50值最高的细胞，分别为1.05±0.02mg/ml和0.91±0.01mg/ml（见表1）。 表1。 在所有面板细胞系中，使用R. junceus蝎毒处理72小时后获得的IC50值。“NE”意为“材料与方法中描述的”无效应“。这些数值代表五个独立实验中获得的平均±标准差。 细胞系 IC50（mg/ml） 组织学起源 A549 0.63 ± 0.04 肺癌 NCI-H292 0.68 ± 0.01 黏膜表皮样肺癌 肝炎-2型 0.79 ± 0.03 喉癌 赫拉 1.05 ± 0.02 宫颈腺癌 西哈 0.91 ± 0.01 子宫颈鳞状细胞癌 MDA-MB 231 0.7 ± 0.02 乳腺腺癌 MDA-MB 468 0.64 ± 0.01 乳腺腺癌 HT-29 0.89 ± 0.02 结直肠腺癌 拉吉 NE 伯基特淋巴瘤 K562 NE 慢性骨髓性白血病 U937 NE 组织细胞性淋巴瘤 MRC-5 NE 正常人类肺纤维细胞 维罗 NE 正常的非洲绿猴肾 MDCK NE 正常犬肾 在新标签页中打开 蝎子毒液对Hela和A549细胞中凋亡相关基因的影响 细胞凋亡分析中选取IC50值最低和最高的细胞，分别对应A549和Hela。本研究考察了蝎子毒液浓度（0.75mg/ml）在Hela和A549细胞中对凋亡相关基因表达率的影响。所用蝎毒液的浓度低于Hela细胞的IC50，高于A549的IC50（见表1）。内对照组中，p53、bax、bcl-2 mRNA和GAPDH在毒液施用8小时、24小时和48小时时的表达水平如图2所示。图2。 在新标签页中打开 蝎子毒液处理对Hella和A549细胞中p53、bax和bcl-2基因表达的影响。A. p53、bax 和 bcl-2 mRNA 的表达通过 RT-PCR 在 8 小时、24 小时和 48 小时后检测到。B.p53、Bax、Bcl-2 和 Bax/Bcl-2 比值 mRNA 表达水平与 GAPDH 的相对信号强度比较。这些数值代表至少三个独立实验中获得的平均值+标准差。通过比较对照组与所有处理组，采用Mann-Whitney U检验获得p值。显著差异 *p<0.05， ** p<0.01， ***p<0.001。 在Hela细胞中，我们发现p53基因在8小时内显著过度表达，且在48小时（p<0.001）毒液处理后，p<53基因以时间依赖性的方式增加（p0.05），与未处理对照组相比（见图2A）。蝎子毒液处理24小时（p<0.05）和48小时（p<0.01）时，bax基因表达显著增加。相反，bcl-2基因表达较未处理对照组显著下调，从8小时（p<0.05）降至24小时（p<0.01）（见图2A）。其他时间点未显示bcl-2基因表达显著下降（图2A）。未处理对照组与蝎子毒液处理的Hela细胞在24小时（p<0.01）和48小时（p<0.001）间，Bax/Bcl-2比值显著增加（见图2A）。Bax/Bcl-2比值的增加是由于bax mRNA的增加和bcl-2 mRNA表达的减少。 在A549细胞中，24小时和48小时毒液处理后p53 mRNA的表达显著下调（p<0.01）（见图2B）。此外，bcl-2 mRNA表达也从8小时（p<0.05）显著下调至48小时（p<0.001），与未处理对照组相比（见图2B）。蝎子毒液未改变bax mRNA表达水平（见图2B）。在A549细胞中，蝎子毒液处理组在24小时和48小时内Bax/Bcl-2比值显著增加，较对照组相比（p<0.05）。Bax/Bcl-2比值的增加完全是由于bcl-2 mRNA的降低（见图2B）。 通过荧光染色染料在Hela和A549细胞中进行细胞凋亡/坏死分析 为确定蝎子毒液的生长抑制活性是否与细胞凋亡或坏死诱导相关，研究了利用AO/EB和DAPI染色的细胞死亡形态学测定。在Hela和A549细胞暴露于蝎子毒液48小时后，观察到了不同的形态特征。对照细胞的核形态均匀呈绿色，形态正常（见图3A和3B）。图3。 在新标签页中打开 海拉和A549癌细胞在48小时蝎毒处理后发生凋亡/坏死的形态学证据。答：Hela未处理对照细胞中的AO/EB染色。B. A549未处理对照细胞中的AO/EB染色。C. AO/EB染色体在蝎子毒液处理后的Hela细胞中，“A”旁边的箭头表示凋亡细胞。D. 蝎子毒液处理后的A549细胞中的AO/EB染色，“N”旁边的箭头表示坏死细胞;“L”旁边的箭头表示晚期凋亡;E. 箭头表示蝎子毒液处理后的Hela细胞出现膜出血。F. DAPI 染色体在蝎子毒液处理的Hela细胞核中，箭头表示凋亡体。G. 直方图显示，细胞凋亡和坏死的发生率显著增加于对照细胞。细胞凋亡和坏死细胞数与未处理对照组进行比较，*显著差异（p<0.05）。 在蝎子毒液处理的Hela细胞中，观察到如明亮绿色的早期凋亡细胞，伴有核边缘和染色质缩合（见图3C）。Hela诱导凋亡的证据包括膜侵蚀（图3E）和凋亡体（图3F）。在该细胞中，蝎子毒液导致了显著的凋亡而非坏死（p<0.05;凋亡指数17%）（见图3G）。相比之下，最敏感的肿瘤细胞系A549在用蝎子毒液潜伏时显示出大量坏死细胞（见图3D）。橙色/红色染色细胞在明亮的绿色细胞核上非常明显，表明坏死细胞死亡率较高（p<0.05;坏死指数32%）（见图3G）。结果表明，蝎子毒液能够根据癌细胞类型诱导细胞凋亡或坏死。 Hela细胞中半天冬酶活性的测定 我们研究了与Hela细胞中外源性和内源凋亡途径相关的主半胱天冬酶表达。在处理后24小时和48小时检测到活性形式的Capase-3、8、9，而未处理的对照细胞中未观察到活性半胱天冬酶3、8和9的增加（见图4）。图4。 在新标签页中打开 代表性的西部印迹显示Caspase 3、8和9在未处理对照组及蝎子毒液处理的Hela细胞（sv处理细胞）中表达。Hela细胞（2×105/ml）被0.75mg/ml蝎毒处理24小时和48小时，然后采集以西方墨迹估计细胞凋亡相关蛋白表达，详见材料与方法。 讨论 蝎子毒液是癌症治疗的一种有趣的天然来源（Gao等，2008;Gomes 等，2010）。本研究旨在评估R. junceus蝎毒液对一组人类癌细胞的影响。蝎子毒液暴露显示对上皮癌细胞具有显著的细胞毒性和选择性，而对上皮正常对应细胞则无显著影响。在所有上皮癌细胞中，肺癌（A549，NCI-H292）和乳腺癌细胞系（MDA-MB-213，MDA-MB-468）的敏感性略高。我们观察到，在0.1-0.75mg/ml之间进行蝎子毒液治疗时，该组细胞存活率低于50%。而在其余的上皮癌细胞中，只有在毒液浓度高于0.75mg/ml时，存活率降低超过50%。这种敏感性差异可能与通常由蝎子毒液识别的细胞靶点表达差异有关（Jehle等，2011）。此外，虽然上皮癌细胞对蝎子毒液治疗均敏感，造血癌细胞则不敏感。这一特征表明癌细胞对蝎子毒液治疗的易感性在组织学上依赖于起源。这可能解释了正常细胞中无毒性的原因（Cherubini 等，2000;Brevet 等，2008）。进一步的实验以识别这些细胞中潜在的药理靶点，将有助于结合组织学来源来描述作用谱。 一些报告已证明不同蝎子毒液具有抗癌效果。BMK毒液对肿瘤脑细胞系U251-MG表现出显著细胞毒性，而在正常细胞上则未观察到（Wang 和 Ji，2005）。来自Tytius discrepans的毒液和肽对乳腺癌细胞系SKBR3表现出抗癌效果，但对正常猴肾细胞系MA104（D'suze等，2010）无效果，这两种组织学类型均为本研究所纳入。此外，Odontobuthus doriae的毒液以浓度依赖性方式诱导人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的细胞毒性效应（Zargan等，2011）。这些证据与本研究中获得的类似，支持蝎子毒液对上皮癌的潜在作用。 在我们的研究中，R. junceus scorpion毒液诱导了细胞对Hela和A549细胞的存活能力的显著影响，但细胞死亡的方式有所不同。蝎子毒液诱导的Hela细胞凋亡涉及bax的上调和bcl-2基因的下调，这很可能是p53上调的结果，包括半胱天冬酶活化、染色质缩合和凋亡细胞核的形成。 多种信号通路参与细胞凋亡的调控。p53介导的细胞死亡机制与其作为转录调节因子的功能相关，这可能影响促凋亡基因如bax的激活以及抑制抗凋亡基因如bcl-2基因（Mirzayans 等，2012;欧阳等，2012）。BCL-2基因家族在半胱天冬酶激活中起核心作用，并主导细胞凋亡的内在通路（Wu 等，2001）。 (Mirzayans 等，2012）。我们的结果显示Bax/Bcl-2比率上升，表明线粒体介导的细胞凋亡参与了Hela中蝎子毒液诱导的细胞死亡。Bax/Bcl-2比值可被视为凋亡过程的关键因素，通过调控细胞色素c从线粒体释放到细胞质（Adams 和 Cory，2007）。在线粒体依赖性细胞凋亡中，bax和bcl-2下表达的增加会诱导Bax在外线粒体膜的重新定位。同源二聚体Bax-Bax的形成在线粒体膜中形成孔隙，允许释放细胞色素c等凋亡因子（Renault等，2013）。这一步骤激活起始因子半胱天冬酶-9和效应子半胱天冬酶-3，后者在内在和外在通路中都起关键作用（Mirzayans 等，2012;欧阳等，2012）。半胱天后酶家族，已知是凋亡途径的重要组成部分。效应半胱天冬酶，如半胱天冬酶3，通常由上游半天冬酶8和9进行蛋白水解激活（Cohen，1997）。活化的半胱天冬酶-3切割DNA并启动DNA碎片化，这正是凋亡的标志（Cohen，1997）。活化半胱天冬酶8和9的增加表明，R. junceus毒液可以通过Hela细胞中的外源和内源凋亡途径发挥作用。 我们的结果表明，R. junceus scorpion毒液优先诱导A549细胞中的坏死细胞死亡。在蝎子毒液治疗后，AO/EB荧光可检测到坏死。在蝎子毒液处理下，p53和bcl-2 mRNA均被下调。与Hela细胞相反，蝎子毒液对bcl-2表达的影响主要并非由p53引起。此外，bax表达水平在所有评估时间内无变化，而该细胞系的Bax/Bcl-2比值因bcl-2下表达而上升，表明该水平存在坏死细胞死亡。Sasi等人指出，Bcl-2过度表达是许多耐药或凋亡耐性癌症的致病，如B细胞淋巴瘤和小细胞肺癌（Sasi等，2009）。在某些临床环境中，Bcl-2的减毒可能有助于增强细胞死亡的替代模式和药物疗效。 不同报告显示，Bcl-2不仅是细胞凋亡的介导者，还包括程序性坏死（Poliseno等，2004;Sasi 等，2009）。红根石根根中天然存在的四子仁已被证明能直接诱发坏死。该化合物还被发现能降低Bcl-2和Bcl-xL水平。作者推测这些发现可能具有真正的临床影响，因为shikonin可能能够抑制Bcl-2/xL水平，同时在Bcl-2/xL过度表达时诱导坏死，并且是抑制抗凋亡癌细胞的有力候选药物（Han等，2007）。 在A549中，所用毒液浓度（高于IC50值）诱导坏死性细胞死亡，而在Hela中，同样浓度（低于IC50值）则诱导细胞凋亡。根据毒液浓度，毒液很可能会诱导坏死或凋亡细胞死亡。还需在不同毒液浓度下进行额外研究以证实该假说。 在不同蝎类物种中，已观察到诱导凋亡和/或坏死的能力。BMK毒液已被证明通过细胞凋亡诱导抑制胶质瘤细胞生长。这一点通过DAPI荧光染色和FACS分析得到了证据（Wang 和 Ji，2005）。Heterometrus bengalensis蝎子的毒液通过细胞凋亡抑制U937和K562细胞的生长。该事件表现为膜出血、染色质缩合和DNA断片，均通过共焦点、荧光、扫描电子显微镜和流式细胞术检测（Gupta等，2007）为证。此外，Omran观察到，高浓度的Leiurus quinquestriatus蝎毒液可诱导细胞系C2C12，而293T细胞中浓度较低可诱导细胞凋亡（Omran，2003）。Odontobuthus doriae 蝎毒液会诱导神经母细胞细胞线粒体膜电位的变化;这会在低浓度下引发内在性细胞凋亡和癌细胞死亡的激活，而在高浓度下则有坏死细胞死亡的建议（Zargan等，2011）。 目前，越来越多的癌症对化疗产生难治性或内在耐药性，但未能通过细胞凋亡死亡（Plati 等，2008;刘，2009）。R. junceus蝎毒的细胞死亡双重机制可能成为克服耐药性的一个有趣替代方案。 结论 来自R. junceus的毒液对上皮癌细胞具有选择性和差异性的抗癌作用。该研究表明，毒液的凋亡和坏死效应很可能源于癌细胞的敏感性;然而，需要进一步研究更多细胞系和不同剂量的天然产物，以确定这些观察结果。据我们所知，这是首次科学证据证明这种蝎子毒液对人类癌细胞系细胞系细胞存活率和细胞死亡事件的影响。这使得R. junceus毒液成为未来体内抗肿瘤实验研究的有利候选物种 致谢 作者感谢热带医学研究所“Pedro Kourí”技术与科学支持部门的细胞培养维护团队。此外，作者感谢来自“佩德罗·库里”热带医学研究所的菲德尔·努涅斯·费尔南德斯对该手稿的批评性评审。 参考文献 Adams JM， Cory S. 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