CD3 x CD30

摘要：化学免疫疗法和细胞疗法是复发/难治性（R/R）淋巴瘤治疗的主要手段。这些治疗中出现的耐药性和常见毒性限制了它们在实现期望的响应率和持久缓解方面的作用。抗体-药物偶联物（ADC）是一种新型靶向疗法，已证明在治疗包括淋巴瘤在内的各种癌症中具有显著的疗效。迄今为止，已有三种ADC药物被批准用于不同类型的淋巴瘤，这标志着该领域取得了重大进展。在本文中，我们旨在回顾ADC的概念及其在淋巴瘤治疗中的应用，分析目前批准的药物，并讨论ADC开发正在进行的进展。 1.引言 淋巴瘤是一组来自不同类型淋巴细胞（B细胞、T细胞或自然杀伤（NK）细胞）在不同成熟阶段的克隆性增殖的恶性肿瘤。过去几十年来，不同类型淋巴瘤的发病率一直在增加。化学免疫疗法和细胞疗法仍然是不同亚型淋巴瘤常用的治疗手段。大多数化疗方案的治疗效果指数较窄，导致广泛的毒性。此外，耐药性的出现是最常见的原因之一，阻碍了它在复发和难治性（R/R）情况下的使用。针对表面抗原的单克隆抗体，如利妥昔单抗和奥比妥珠单抗，已经彻底改变了淋巴瘤的治疗。抗体-药物偶联物（ADCs）是一种高度靶向的药物，将针对特定表面抗原的单克隆抗体（mAb）与细胞毒素分子连接起来。毒素只传递给表达表面抗原的细胞，具有高度的肿瘤特异性和有限的系统暴露。美国食品药品监督管理局（FDA）已经批准了三种用于治疗淋巴瘤的ADC药物，分别是本妥昔单抗、波拉图单抗和洛卡图单抗。 在本文中，我们将回顾ADC的概念，重点关注它们的结构、工程和在淋巴瘤治疗中的作用。此外，我们将提供目前批准的ADC在这一设置中的综合分析，以及正在进行的进展的概述。这包括突出来自临床前和临床试验的有希望的结果，以及讨论下一代ADC开发的未来方向。 2.ADC的基本结构  ADC由抗体、药物（有效载荷或细胞毒素）和连接子组成。抗体结合恶性细胞表面表达的特定抗原。一旦结合，ADC被内化，细胞毒素有效载荷释放到细胞内，导致细胞周期终止和凋亡。在周围目标阴性细胞中也可以看到细胞毒性效应，当药物扩散到它们中并引起“旁观者杀伤”时，这是一种当有效载荷从被内化和降解的ADC释放或当药物释放到细胞外空间后从目标细胞释放时发生的细胞死亡。值得注意的是，为了获得更好的结果和更少的副作用，抗原和抗体之间的结合需要尽可能特异性。有效载荷的内化率、连接子的稳定性和相应抗体的选择是影响ADC在临床实践中使用的一些变量。 2.1. 单克隆抗体 选择合适的抗体是ADC工程中的关键步骤；它通常被设计为特异性结合癌细胞表面表达的目标抗原。理想的单克隆抗体应具有低免疫原性、低交叉反应性、长的血浆半衰期，以及对肿瘤细胞表面抗原的高结合亲和力。最常用的类别是免疫球蛋白G（IgG），更具体地说是IgG1亚型，因其血清稳定性。在ADC开发的早期阶段，主要使用小鼠来源的抗体。然而，这些抗体报告有很高的失败率，可能归因于它们缺乏临床效益，同时引起严重的免疫原性相关的不良效应。这些ADC也被人类抗小鼠抗体迅速清除，限制了它们的疗效。此外，这些早期ADC中使用的连接子在人体循环中不稳定，导致有效载荷过早释放，大大降低了效果并增加了毒性。自从出现显著降低免疫原性的人源化小鼠单克隆抗体以来，已经取代了小鼠抗体，导致更优化的设计，如2000年FDA批准的针对CD33阳性急性髓系白血病患者的首个ADC药物吉妥单抗奥佐米星。迄今为止，已有十四种ADC获得FDA市场批准，其中三种如前所述已获批准用于治疗淋巴瘤。其中，只有本妥昔单抗使用嵌合抗体。嵌合抗体是通过融合不同物种的域（例如，整个小鼠或兔的可变区与人类来源的恒定域）设计的。相比之下，人源化抗体含有嵌入人类来源的Fab区和恒定区的外来氨基酸段。因此，它们较少免疫原性，是更安全的选择。在全人抗体中，没有一部分是小鼠来源的，与人类化抗体相比，它们在免疫反应中的发生率更低；例如FDA批准的enfortumab vedotin。 2.2. 有效载荷 ADC的理想有效载荷应具有低免疫原性、长半衰期、小分子量、在抗体的水性环境中良好的溶解度、在循环和溶酶体中的高稳定性、体外亚纳摩尔半最大抑制浓度（IC-50）以及有助于与抗体结合的官能团，同时保持ADC的内化特性。每个抗体平均结合两到四个强效的细胞毒素分子。目前，ADC设计中最受欢迎的两类有效载荷是微管破坏剂和DNA靶向剂（图1）。 图1. 设计ADC时常用的十种不同有效载荷的分子结构 微管抑制剂可以根据它们的作用机制分为两大类。第一组包括微管稳定剂。这些药物通过抑制微管解聚和促进聚合来增强丝状体的稳定性，使丝状体功能降低。第二组由破坏微管的物质组成，阻止微管蛋白组装和成熟微管的发展。在ADC开发中使用和研究的主要微管抑制剂包括长春碱类、紫杉醇类、auristatins、美登素类、隐孔菌素、海葵素和圆盘菌素。auristatins如单甲基auristatin E (MMAE)通过阻止α-和β-微管蛋白单体聚合并触发凋亡来破坏微管并阻止细胞分裂。结合区域位于两个纵向排列的微管二聚体的β1-微管蛋白和α2-微管蛋白亚基之间。根据体外研究结果，auristatin-微管蛋白键合形成环状或螺旋形聚集体，改变微管的功能。长春碱类如长春新碱或长春碱，以及隐孔菌素和多拉斯他汀，诱导微管形成类似的弯曲结构构象。 在细胞周期的任何阶段，DNA损伤剂通过双链断裂、烷基化、插入和交联四种主要机制可以杀死癌细胞。最常用的DNA损伤有效载荷是卡利烯胺、二酮霉素、吡咯并苯并二氮杂环（PBD）、多柔比星和喜树碱类似物。针对BCL-2抑制剂、剪接体抑制剂和针对RNA聚合酶II的转录抑制剂等靶向药物是具有不同作用机制的额外有效载荷。 值得注意的是，根据FDA对15种含有PBD有效载荷的ADCs的肿瘤学分析，PBD有效载荷的毒性概况更高，这表明常见的不良事件包括可能的血管渗漏综合征、转氨酶升高、骨髓抑制、胃肠事件、代谢效应、肌肉骨骼事件、神经病变、呼吸困难和肾损伤，所有这些都源于PBD的非靶向输送；该分析表明，2013年至2017年间47%的PBD偶联ADCs的新药申请被中止。这些高效ADCs发生危及生命的毒性的更高发生率是一个限制。 目前减轻PBD毒性的机制包括药物-连接子组分的聚乙二醇化，这显著提高了ADC的耐受性。另一种机制是使用对氨基苄氧羰基（PABC）自毁间隔基，在连接臂-药物中；该间隔基具有稳定的二硫键，允许在细胞内快速释放自由有效载荷，从而实现更好的血浆稳定性和与可裂解连接臂相比提高的毒性。后一项研究认为，肽连接的和二硫键连接的PBD ADC在两种不同的淋巴瘤模型中提供了相似的疗效，并且二硫键连接的PBD ADC具有更好的安全性。第三种机制是通过减少PBD结构中的一个亚胺官能团进行化学修饰，从而将DNA交联的PBD二聚体转变为DNA烷基化代谢物，称为吲哚喹喔啉二聚体（IGN），这在小鼠肿瘤模型中实现了更有效的载荷释放，其中小鼠能够耐受更高剂量的IGN偶联ADC。 近期在有效载荷方面也取得了进展。主要的进展是免疫调节ADC，如干扰素基因刺激剂（STING）激动剂、Toll样受体（TLR）激动剂和使用蛋白酶体靶向嵌合体（PROTAC）策略的目标蛋白降解剂（TPD）。STING激动剂激活干扰素和其他细胞因子的产生，从而增强免疫和抗肿瘤反应。将STING激动剂作为有效载荷纳入ADC可以实现其向肿瘤目标的传递，具有更高的疗效和由于免疫激活导致的过度炎症反应而减少的毒性。STING激动剂的例子包括DMXAA、c-di-AMP、c-di-GMP、cGAMP、ADU-S100、MK-1454、SB11285、BMS-986301、E7766、MSA-1和MSA-2；它们主要在乳腺癌中被探索。TLR激动剂通过增强肿瘤微环境中抗原呈递细胞的抗原呈递，改善先天和适应性抗肿瘤免疫，从而促进更多细胞毒性T细胞的促进和活性。它们在局部癌症中发挥作用，例如，BCG（TLR2/4激动剂）用于膀胱非浸润性癌，AS04（TLR4激动剂）用于宫颈癌，以及咪喹莫特（TLR7激动剂）用于表皮基底细胞癌。目前，许多TLR激动剂正在作为ADC中的有效载荷在癌症免疫疗法中进行研究。一个例子是BDC-1001（TLR7/TLR8激动剂与抗HER2抗体偶联的ADC），在临床前模型中显示出有希望的结果。目前正在进行一项I/II期临床试验，该试验正在招募表达HER2的晚期实体瘤患者（NCT04278144）。PROTAC是一种催化作用于小剂量的催化剂，它通过泛素化介导的蛋白水解作用靶向特定的蛋白质。当PROTAC有效载荷与抗体偶联时，它会产生PROTAC催化行为和抗体的组织特异性的新型组合，具有更好的疗效和更少的限制。在表达HER2的细胞中存在成功的例子。这些在ADC设计中的微妙改进具有巨大的潜力，通过不断的研究可以为肿瘤学带来更好的结果，并为包括淋巴瘤在内的其他癌症类型的发展打开大门。 2.3. 化学连接臂 连接臂是成功开发ADC的最重要和最复杂的部分，因为它们形成了治疗和抗体之间的联系。它们的结合机制、稳定性和化学性质对于防止意外释放药物进入血流以及在癌细胞内吞后促进容易裂解至关重要，允许有效载荷仅在预期的地点释放。它们在确定ADC的药代动力学、药效学和治疗窗口方面至关重要。目前FDA批准的ADC使用两类连接臂，它们在有效载荷释放机制上有所不同：可裂解和不可裂解连接臂。最常用的四种可裂解连接臂是β-葡萄糖醛酸酶敏感连接臂、谷胱甘肽（GSH）敏感二硫键连接臂、卡他蛋白B敏感连接臂和腙连接臂。前面描述的旁观者效应，它影响肿瘤微环境中的正常细胞和没有或低目标表达的肿瘤细胞，更有可能发生在使用可裂解连接臂的ADC中。 不可裂解连接臂与可裂解连接臂相比，具有更好的血浆稳定性、较低的非目标毒性和抗蛋白水解降解的能力，因为它们与抗体的氨基酸残基具有不可还原的键。通常，不可裂解连接臂由硫醚或马来酰亚胺己酰基团形成。附着在由降解的抗体衍生的氨基酸残基上的不可裂解连接臂必须在ADC内化后，由细胞质和溶酶体蛋白酶完全分解抗体部分才能释放有效载荷。图2展示了一般的基本结构。 图2. ADC的一般基本结构。ADC由一个嵌合或人源化（免疫原性较低）的抗体组成，该抗体对淋巴瘤癌细胞表面表达的抗原具有强烈的结合活性。抗体应在循环中具有较高的半衰期，以便被输送到目标细胞表面。抗体与不同结构的有效载荷（主要是微管抑制剂或DNA相互作用）相连，这些是具有理想药物/抗体比例的高效药物。抗体与有效载荷之间的连接是通过可裂解或不可裂解的连接臂实现的，这些连接臂应具有精确的结合、在循环中的稳定性，并确保在目标处有效分配有效载荷。 3.FDA批准用于淋巴瘤的ADC  截至2023年，已有三种ADC获得了FDA对各种类型淋巴瘤的批准，分别是Brentuximab Vedotin（BV）、Polatuzumab Vedotin（PV）和Loncastuximab Tesirine（LT），如表1所示。 Brentuximab Vedotin（BV）由针对CD30的IgG1嵌合单克隆抗体“cAC10”和细胞毒素MMAE组成，它们通过一个稳定的连接臂（Cathepsin可裂解连接臂和对氨基苄基-羰基间隔基）结合在一起。嵌合单克隆抗体cAC10与CD30结合，随后通过内吞作用和随后与溶酶体的囊泡融合，在溶酶体中，溶酶体半胱氨酸蛋白酶裂解连接臂，释放MMAE直接进入癌细胞内，从而导致癌细胞毒性。抗体和MMAE之间的连接系统设计为在循环中稳定，由马来酰亚胺己酰基间隔基、蛋白酶敏感的二肽Val-Cit、自毁PABC基团以及二肽和药物之间的附加间隔基组成。后者具有自裂解的能力，并有助于卡他蛋白B进入其裂解序列。马来酰亚胺部分与抗体重链和轻链中的半胱氨酸残基的末端硫醇形成硫醚键，将连接臂连接到抗体。由蛋白酶裂解Cit-PABC酰胺键产生的不稳定PABC取代的MMAE中间体，通过自发的1,6-消除反应，产生自由的MMAE分子、CO2和对氨基苄基醇。值得注意的是，CD30在恶性淋巴瘤细胞上表达非常强，在正常组织上表达较少。与单独的抗体相比，BV可以使CD30+细胞系的生长停滞高达340倍。BV的结构和作用机制如图3所示。cHL的恶性Reed-Sternberg细胞以表达CD30为特征，CD30是肿瘤坏死因子超家族的成员，鉴于其对一小部分活化的B细胞、T细胞和嗜酸性粒细胞的表达限制，它代表了单克隆抗体治疗的理想靶点。BV在未经治疗的cHL患者和R/R疾病中表现出显著的活性，导致在这些情况下获得FDA批准。 图3. BV的结构和作用机制。它由一个针对淋巴瘤细胞上CD30抗原的单克隆抗体组成。结合后，整个ADC-抗原复合物被细胞内运输到溶酶体，在那里释放MMAE（有效载荷），干扰细胞核中的微管结构，导致细胞周期停滞和凋亡。 ECHELON-1 III期试验将1334名未经治疗的III期或IV期cHL患者随机分配接受BV-AVD（Brentuximab Vedotin、Adriamycin、Vinblastine、Dacarbazine）或ABVD（Adriamycin、Bleomycin、Vinblastine、Dacarbazine）。试验显示BV-AVD组的2年修正无进展生存期（PFS）为82%，而ABVD组为77%，风险比（HR）为0.77，6年总生存期（OS）分别为93.9%和89.4%，HR为0.59。基于ECHELON-1的结果，FDA批准BV与化疗联合用于成人未经治疗的III期或IV期cHL的治疗。最近，SWOG S1826试验被开发出来，比较BV-AVD与N-AVD（Nivolumab、Adriamycin、Vinblastine、Dacarbazine）对儿童和成人新诊断的晚期cHL（III期或IV期）患者的疗效。S1826研究表明，Nivo-AVD的1年PFS（94%）优于BV-AVD（86%），HR为0.48，并且两组的不良事件（AE）概况相当，因此它目前是未经治疗的cHL的一线治疗的首选方案。 尽管年轻患者更容易耐受多药化疗方案，但由于多种因素，包括合并症、身体状况差、无法耐受全剂量化疗以及治疗相关AEs增加，老年cHL人群的治疗结果较差。一项多中心II期研究评估了60岁及以上患者的序贯BV方案，随后进行AVD化疗，并在随后进行BV维持治疗。研究报告了84%的2年PFS率和93%的2年OS率。这种序贯方法提高了这一脆弱人群中cHL的治愈率，是新诊断cHL老年人的首选方案。 在R/R cHL环境中，BV最初在自体造血干细胞移植（ASCT）失败的患者中进行了研究。BV单药治疗显示总响应率（ORR）为75%，完全缓解（CR）为34%，中位无进展生存期（mPFS）为5.6个月。值得注意的是，CR患者的中位持续响应时间（mDOR）为20.5个月。这些结果导致BV首次获得FDA批准，用于治疗ASCT失败或至少两个先前的多药化疗方案失败的cHL患者。随后，AETHERA III期试验包括了接受过ASCT并具有以下不利风险之一的cHL复发难治性疾病患者，例如原发性难治性HL、初次缓解<12个月的复发HL，或一线治疗后复发时的结外受累。AETHERA研究表明，ASCT后早期巩固使用BV将mPFS提高到42.9个月，而对照组为24.1个月，HR为0.57。基于AETHERA试验，FDA随后扩大了BV的批准范围，用于治疗ASCT巩固后有高复发或进展风险的cHL患者。 除了前述的FDA批准外，BV还根据CheckMate 744 II期研究的结果，被国家综合癌症网络（NCCN）指南推荐与Nivolumab联合用于复发或难治性cHL患者的二线或后续治疗。该研究评估了涉及Nivolumab加BV，随后对次优反应患者使用BV加Bendamustine的风险分层响应适应方法。CheckMate 744研究表明，59%接受BV和Nivolumab治疗的患者，以及94%随后接受BV和Bendamustine治疗的患者，实现了完全分子反应（CMR）。这些结果明显优于历史上60至70%的CMR率，为R/R环境中的更高治愈率奠定了基础。 正在进行的BV在cHL的试验如图2所示。 BV在CD30阳性T细胞淋巴瘤中的作用 系统性间变性大细胞淋巴瘤（sALCL）中CD30的普遍表达，以及在外周T细胞淋巴瘤-未另行指明（PTCL-NOS）、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（AITL）和成人T细胞白血病或淋巴瘤（ATLL）等亚型中的高表达，为在T细胞淋巴瘤中靶向CD30提供了强有力的理由。 一项针对至少一种联合化疗方案失败后的R/R ALCL患者的II期研究显示，86%的患者实现了客观反应，其中57%为CR，mDOR为12.6个月。这项研究的结果导致FDA批准BV用于R/R PTCL。ECHELON-2试验旨在比较BV与环磷酰胺、多柔比星和泼尼松（A+CHP）联合使用与标准CHOP（环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松）治疗未经治疗的CD30阳性PTCL患者的疗效和安全性。A+CHP显示出48.2个月的mPFS，与CHOP的20.8个月相比，具有可比的安全性概况。5年PFS分别为A+CHP的51.4%和CHOP的43%（HR 0.7），5年OS分别为A+CHP的70.1%和CHOP的61%（HR 0.72），两组之间的安全性概况相当。随后的亚组分析显示，S-ALCL主要从A+CHP中受益，而AITL和PTCL-NOS亚组的益处尚不明确。 除了PTCL，BV在皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）中的作用也得到了探索。ALCANZA III期试验包括了接受过一线系统治疗的原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤（pcALCL）或表达CD30的蕈样真菌病（MF）的患者。在平均45.9个月的随访中，试验偏爱BV组，ORR为54.7%对12.5%，mPFS为16.7对3.5个月。同样，与医生选择相比，BV组的下一次治疗的中位时间显著更长（14.2对5.6个月；HR 0.27）。基于ALCANZA试验的结果，FDA批准BV用于治疗接受过先前系统治疗的pcALCL或表达CD30的MF患者。目前，BV正在许多早期阶段的试验中进行评估，这些试验包括在表2中。 波拉图珠单抗（PV）由一种抗CD79B的人源化IgG1单克隆抗体组成，通过一个可被蛋白酶裂解的马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-PABC肽段连接臂与MMAE结合。一旦波拉图珠单抗与CD79b结合，它就会被内吞并通过内质网运输到溶酶体，在那里发生连接臂裂解，导致有效载荷释放到细胞内诱导凋亡。PV的结构和作用机制如图4所示。 图4. PV的结构和作用机制。PV由一个针对淋巴瘤细胞上的CD79b抗原的单克隆抗体组成。结合后，整个ADC-抗原复合物被内吞到内质体，并与溶酶体融合。然后连接臂被裂解以释放MMAE（有效载荷），这反过来导致细胞核中的有丝分裂停止和细胞死亡。 5.1. PV在弥漫大B细胞淋巴瘤中的应用 弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）最常见的形式。虽然利妥昔单抗的加入显著提高了CHOP化疗的治愈率，但大约40-50%的患者最初反应后会出现难治性疾病或复发。 POLARIX是一项具有里程碑意义的III期研究，评估了PV加入R-CHP（利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、泼尼松）在DLBCL一线治疗中的疗效，并与R-CHOP进行了比较。POLARIX证明了pola-R-CHP组2年PFS为76.7%对70.2%，（分层HR 0.73）。两组的整体安全性概况相似。值得注意的是，pola-R-CHP的益处在60岁以上的患者、国际预后指数（IPI）在3到5之间的患者以及具有活化B细胞样亚型的DLBCL患者中观察到。相反，在60岁或以下的患者、有大量疾病、较低IPI评分或滤泡中心B细胞样亚型的DLBCL患者中没有明显益处。基于POLARIX试验，pola-R-CHP是第一个在DLBCL一线治疗中证明比R-CHOP具有更好PFS的方案，并获得了FDA对先前未经治疗的DLBCL、未另行指明（NOS）、高级别B细胞淋巴瘤（HGBL）或IPI评分为2或更高的患者的批准。 POLAR BEAR III期试验比较了mini-R-CHOP与pola-mini-R-CHP作为老年DLBCL患者的一线治疗。初步安全性数据显示，两种方案在老年人（69%在80至90岁之间）和脆弱人群中（16%脆弱，12%的ECOG表现状态为3）都是可耐受的，用波拉图珠单抗替代长春新碱并没有导致3到4级血液学毒性或神经病变的发生率更高。值得注意的是，pola-mini-R-CHP组的胃肠道不良事件频率更高（31%对16%）。基于POLARIX试验的结果，人们倾向于假设pola-mini-R-CHP可能显示出比mini-R-CHOP更好的PFS。因此，这项研究的结果备受期待。 在R/R DLBCL环境中，评估PV安全性和有效性的第一项试验是Ib/II期试验，该试验比较了PV与利妥昔单抗（R）和苯达莫司汀（B）联合使用与单独BR对不适合移植的R/R DLBCL的疗效。pola-BR组显示更高的CR（40%对17.5%），更长的mPFS（9.5对3.7个月，HR 0.36），以及更高的mOS（12.4对4.7个月，HR 0.42）。然而，它导致了更高比例的3到4级中性粒细胞减少症（46.2%对33.3%）、贫血（28.2%对17.9%）和血小板减少症（41%对23.1%），尽管3到4级感染的发生率相似（23.1%对20.5%）。与PV相关的周围神经病变在43.6%的患者中观察到，但大多数是1到2级并解决了。这项试验导致了2019年6月pola-BR的初步批准及其在这种情况下的广泛使用。 波拉图珠单抗的另一个有希望的组合在Ib/II期试验中得到证明，该试验结合了Mosunetuzumab，一种针对CD20和CD3的人源化IgG1双特异性抗体，在R/R DLBCL、HGBCL、转化的FL或3b级FL中。在平均23.9个月的随访中，59.2%的患者对波拉图珠单抗加Mosunetuzumab有反应，45.9%的患者达到了CR。mPFS为11.4个月，mOS为23.3个月。这种方案被良好耐受，最常见的AE是25%患者的中性粒细胞减少症。总的来说，这些结果表明波拉图珠单抗和Mosunetuzumab的组合可以在不适合移植的R/R LBCL中带来具有临床意义的反应和有利的安全性概况。 5.2. PV在其他B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）中的应用 除了DLBCL，包括PV的联合疗法也在惰性B-NHL中进行了探索。在Ib/II期试验中，评估了波拉图珠单抗、奥比妥珠单抗（G）和来普尼（Len）联合治疗R/R FL的安全性和有效性。在平均27个月的随访后，结果显示ORR为76%，CR率高达63%，尽管没有达到预先设定的活性阈值。在平均43.3个月的随访后，mPFS和mOS尚未达到，而4年的里程碑PFS为53%。这些结果与R/R FL的现有标准化疗选择相当，并支持在FL中进一步研究Pola-G-Len方案。 PV的疗效也在套细胞淋巴瘤（MCL）中进行了研究。在一项针对R/R MCL的II期研究中，PV与Mosunetuzumab联合用于先前接受过两线或以上治疗的患者，包括布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂（BTKi），并显示出75%的高ORR和70%的CR。然而，需要更多的结果数据来评估其在MCL中的作用，对于对化疗免疫疗法和BTKi耐药的患者迫切需要新的方案。 6.隆卡图珠单抗  CD19是一种在B细胞分化的最早阶段直到浆细胞发育过程中表达的表面糖蛋白。除了正常的B细胞，CD19也在大多数B细胞淋巴瘤中表达。与CD20相比，CD19表现出更均匀的表达，并在抗CD20靶向治疗后的小部分CD20阴性肿瘤中保留，使其成为免疫疗法和联合疗法的选择性靶点。隆卡图珠单抗（LT，ADCT-402）是一种ADC，由一种人源化抗CD19单克隆抗体组成，通过一个可被卡他蛋白裂解的连接臂与高度细胞毒性的DNA小沟交叉链接吲哚喹喔啉二聚体毒素（PBD二聚体）结合。由于其快速的内吞动力学、运输到溶酶体和在循环中的稳定性，LT是针对CD19最有效的ADC。LT的结构和作用机制如图5所示。 图5. LT的结构和作用机制。LT由单克隆抗体Loncastuximab通过可裂解连接臂(统称为Tesirine)与PBD二聚体(有效载荷)相连。该抗体与淋巴瘤细胞上的CD19抗原结合，之后整个复合物被内吞并合并到溶酶体中。接着，PBD被释放到细胞质中，它移动到细胞核，在那里发生DNA交叉链接，导致细胞死亡。 6.1. LT在弥漫大B细胞淋巴瘤中的应用 LT在人体I期研究中显示出对R/R NHL具有临床意义的活性，这导致了LOTIS-2研究，该研究评估了其在R/R DLBCL中的疗效。LT显示出48.3%的ORR，其中50%的应答者达到了CR。虽然mPFS为4.9个月，但达到CR者的mDOR为13.4个月。它展示了通常被良好耐受的安全概况，中性粒细胞减少症是最常见的3级AE（26%），其次是血小板减少症（18%）和γ-谷氨酰转移酶升高（17%）。显著的抗肿瘤活性、持久的反应和可接受的安全概况导致了2021年FDA批准用于治疗经过两线或以上系统治疗后的R/R大B细胞淋巴瘤。批准包括那些有DLBCL NOS、由低级别淋巴瘤引起的DLBCL和HGBL。 在具有里程碑意义的LOTIS-2研究之后，LT与其他靶向疗法的组合，如LOTIS-3中的ibrutinib和LOTIS-5中的单克隆抗CD20抗体rituximab对R-GemOX（利妥昔单抗、吉西他滨和奥沙利铂）进行了评估，但目前尚不清楚这些组合是否会进入临床应用（表2）。 6.2. LT在滤泡性淋巴瘤中的应用 LT在复发/难治性非霍奇金淋巴瘤(R/R NHL)的I期研究中进行了评估，其中在滤泡性淋巴瘤(FL)中显示了78.6%的客观反应率(ORR)。在2023年美国血液学会(ASH)会议上，最近展示了将LT与利妥昔单抗联合应用于R/R FL的II期试验的非常鼓舞人心的结果。该试验显示了95.2%的客观反应率，其中包括66.7%的完全缓解(CR)和28.6%的部分缓解(PR)的比率。 7.其他正在研究、开发和评估用于治疗淋巴瘤的抗体药物偶联物  7.1 针对CD19的抗体药物偶联物  7.1.1 科尔图珠单抗拉伐坦辛  科尔图珠单抗拉伐坦辛（SAR3419）是一种IgG1抗体（huB4），通过二硫键交联剂SPDB与细胞毒素药物DM4相连，靶向CD19。CD19是一种在血液形成分化过程中的B淋巴细胞系高度表达的蛋白，从早期B细胞到成熟B细胞，并在大多数B细胞恶性肿瘤中保持表达。两项II期试验已经研究了科尔图珠单抗拉伐坦辛作为单药或联合用药的使用。一项正在进行的试验正在检查其在R/R DLBCL患者中单药治疗的使用，初步数据显示ORR为44%；然而，mPFS、mOS和DOR尚未得出。它具有可接受的安全性概况，药物在41名患者中有4名因不良事件而中断。另一项试验检查了科尔图珠单抗拉伐坦辛与利妥昔单抗联合用于DLBCL患者，显示出ORR为31.1%，在复发疾病患者中疗效最高（ORR 58.3%），与难治疾病（ORR 43%）或一线治疗（ORR 15.4%）形成对比。总体而言，它显示出mPFS为3.9个月，mOS为9个月，DOR为8.6个月。 7.1.2 德尼珠单抗马佛多汀 德尼珠单抗马佛多汀（SGN-19A或SGN-CD19A）是另一种针对CD19的ADC。它是一种抗体（hBU12-491），通过不可裂解的马来酰亚胺己酰基连接臂与MMAF偶联。一项主要纳入了B-ALL患者（n = 59）的I期试验，以及侵袭性B细胞淋巴瘤（n = 6）和伯基特白血病/淋巴瘤（n = 6），显示DOR为27个月。每3周给药一次，在B-ALL中显示CRc（CR+CRi+CRp）为35%。在六名伯基特白血病/淋巴瘤患者和六名B-LBL患者中，每组只有一名达到CR。最常见的AEs是发热（54%）和恶心（52%）。另一项主要纳入了R/R DLBCL（n = 53），以及MCL（n = 5）和FL（n = 3）的I期试验，与前一次试验相比，在DLBCL中显示出略高的活性，ORR为33%，CR为22%，复发病例的DOR为39周，难治病例为41周。最常见的AEs与眼睛相关：视力模糊（65%）和干眼（52%）。德尼珠单抗马佛多汀在两项II期试验中进一步与化疗联合研究，一项将其与RICE化疗联合用于R/R DLBCL或3B级FL，与单独RICE进行比较，而另一项研究了其与R-CHOP或R-CHP联合对照R-CHOP单独作为DLBCL或3B级FL的一线治疗；然而，这两项试验都被赞助商终止。 7.2 针对CD22的抗体药物偶联物 7.2.1 伊诺珠单抗奥佐加霉素 CD22是一种135 kDa的I型跨膜糖蛋白，是一种在未成熟和成熟B细胞上表达的B细胞系特异性蛋白。它在B细胞恶性肿瘤包括大多数淋巴瘤和白血病中上调表达。目前有两种针对CD22的ADC正在淋巴瘤中进行研究。第一种是伊诺珠单抗奥佐加霉素（CMC-544），一种IgG4 kappa单克隆抗体，带有N-乙酰-γ-卡利奇霉素二甲基肼，一种卡利奇霉素的半合成衍生物，通过4'-乙酰苯氧基丁酸连接，于2017年8月获得FDA批准用于R/R B细胞ALL。一项I期试验研究了其在R/R B细胞NHL患者中的应用，显示79名入组患者的ORR为39%，在FL中为68%，在DLBCL中为15%。然而，DOR很短，DLBCL的mPFS为10.4个月，FL为49天。患者中有90%出现最常见的AE，即血小板减少。一项针对顽固性B细胞NHL（n = 81）的II期试验显示了类似的结果，ORR为67%，CR为31%，mPFS为12.7个月。 7.2.2 匹那珠单抗韦德汀 匹那珠单抗韦德汀（Pina，DCDT2980S，RG-7593）是一种抗CD22的单克隆IgG1抗体，通过可裂解的马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-PABC连接臂与MMAF偶联。一项I期试验显示，与利妥昔单抗联合使用相比，作为单药治疗使用时显示出更高的疗效，DLBCL组的ORR分别为25%和17%。在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中未见客观反应。在II期试验ROMULUS中进一步检查了其与利妥昔单抗的联合使用，与R-pola相比，在DLBCL患者中显示出更优越的反应，但在FL患者中没有；DLBCL队列在R-Pina（n = 42）上显示ORR为60%，CR为26%，而R-Pola（n = 39）上为ORR 54%，CR 21%。在这项试验中，两者的AEs相当，R-pina组DLBCL队列的3-5级AEs为79%，R-Pola为77%。在FL队列中，AEs略低，R-Pina和R-Pola的3-4级AEs分别为62%和50%。 7.3 针对CD25的抗体药物偶联物 卡米达卢单抗特西林 CD25是一种I型跨膜蛋白，是白细胞介素-2受体α链，是一种在活化的B细胞、活化和调节性T细胞以及髓系前体上表达的蛋白，在包括淋巴瘤和白血病在内的各种肿瘤中过度表达。卡米达卢单抗特西林（ADCT-301，HuMax-TAC）是一种IgG1单克隆抗体，通过可被卡他蛋白裂解的缬氨酸-丙氨酸二肽连接臂与PBD二聚体弹头（SG3199）偶联。一项I期试验检查了其在R/R cHL（n = 133）和R/R NHL（n = 56）中的疗效，其中在cHL患者中显示出71%的优越ORR和42%的CR，与R/R NHL相比（ORR 38%和CR 9%）。3级及以上AEs包括GGT水平升高（15%）、皮疹（12%）和贫血（11%）。更重要的是，3.8%的患者出现了严重的神经系统事件，包括吉兰-巴雷综合征（GBS）/多神经根病变，27.4%的患者因不良反应而中断治疗。尽管研究报告的CR令人鼓舞，但FDA建议不要提交用于治疗R/R HL的批准文件，因此其未来仍不明朗。 7.4 针对CD37的抗体药物偶联物 纳拉图珠单抗艾美曲辛 CD37是一种参与细胞膜组织和共刺激信号的跨膜蛋白，主要在成熟B细胞上表达，在T细胞、巨噬细胞/单核细胞和粒细胞上表达较少。它在成熟的B细胞恶性肿瘤中高度表达，如CLL，在DLBCL中表达不一，CD37阳性范围从40%到90%的病例，而在急性淋巴细胞性白血病（ALL）和HL中低表达或缺失。纳拉图珠单抗艾美曲辛（IMGN529）是一种IgG1单克隆抗体，通过硫醚连接臂N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC)与美登木素DM1偶联，靶向CD37。 纳拉图珠单抗艾美曲辛最初在R/R B细胞淋巴瘤的I期试验中研究，结果显示最小的效果，总有效率（ORR）为13%。然而，纳拉图珠单抗艾美曲辛与利妥昔单抗联合的II期试验结果显示，在DLBCL中ORR更高，达到44.7%，完全缓解（CR）为31.6%，在FL中的响应率略高，ORR为57%，CR为36%。在中位随访15个月和21.8个月时，DLBCL和FL亚组的中位持续缓解时间（mDOR）尚未达到。治疗总体上被良好耐受，如在FACT-Lym QoL的淋巴瘤子量表上平均提高了三点的生命质量（QoL）测量所示。总体而言，目前尚不清楚它是否会进入III期研究。 7.5 针对CD70的抗体药物偶联物 Vorsetuzumab Mafodotin CD70是一种共刺激分子，也是肿瘤坏死因子超家族的成员，它在抗原激活的B细胞、T细胞、NK细胞和成熟的树突状细胞上短暂表达。它在实体瘤和血液学恶性肿瘤中异常表达。Vorsetuzumab Mafodotin (SGN-75)是一种ADC，靶向CD70分子和微管毒素分子，连接到单甲基奥瑞斯他汀F（MMAF）。在R/R CD70+ NHL的I期试验中显示出不可接受的毒性，主要是血小板减少症。此外，SGN-CD70A是一种通过稳定、可被蛋白酶裂解的肽基连接臂与PBD二聚体偶联的工程半胱氨酸单克隆抗体（EC-mAb），靶向CD70。同样，它也与不可接受的毒性相关，并且只有适度的活性。 7.6 针对ROR1的抗体药物偶联物 7.6.1. Zilovertamab Vedotin ROR1是一种酪氨酸激酶跨膜受体，表达在未成熟的B淋巴细胞、内分泌腺和小肠上。它在血液学恶性肿瘤中高度表达，尤其是B细胞淋巴瘤。Zilovertamab Vedotin (MK 2140或VLS-101)是一种针对ROR1的人源化IgG1单克隆抗体，通过可被蛋白酶裂解的连接臂与MMAE偶联。在一项具有里程碑意义的I期试验中，Zilovertamab Vedotin在R/R MCL患者中显示出47%的ORR，CR为20%，在R/R DLBCL患者中ORR为60%。II期waveLINE-004研究，将Zilovertamab Vedotin作为R/R DLBCL的单药治疗，显示出略低的疗效，ORR为30%，有10%的患者实现了CR。最常见的3-4级AEs是中性粒细胞减少症（18%），其次是贫血（15%）。目前有额外的研究正在进行招募；一项是将Zilovertamab Vedotin与R-CHP联合用于DLBCL的前线治疗的II期试验，另一项是评估其与R-GemOX联合对照R-GemOX单独用于R/R DLBCL的II/III期研究。 7.6.2. Cirmtuzumab-ADC-7 另一种针对ROR1的ADC是Cirmtuzumab，一种针对ROR1的单克隆抗体，通过UC-961连接臂与MMAE偶联。在I/II期，Cirmtuzumab与ibrutinib联合用于R/R MCL或治疗未经验（TN）或R/R CLL的管理。在MCL队列中，Cirmtuzumab显示出80%的ORR，35%的患者实现了CR。值得注意的是，在中位随访14.9个月时，mPFS尚未达到。在CLL队列中，结果随着成熟仍然令人鼓舞，TN和R/R CLL患者的mPFS在中位随访14个月和7个月时也未达到。总体而言，该研究正在进行中，结果看起来很有希望。 7.7 临床前开发中的ADCs 7.7.1. 新型CD30靶向ADC：SGN-35C SGN-35C在组成上与BV相似，都是抗CD30抗体，但在连接臂上有所不同，它连接的是一种新型的喜树碱衍生的拓扑异构酶1抑制剂有效载荷。在CD30阳性ALCL和HL细胞系上进行的体外和体内研究，包括那些对BV有抗性的细胞系，显示出治疗诱导的细胞毒性。值得注意的是，这种效果扩展到了CD30阴性细胞，表明了旁观者效应。非人灵长类动物模型也证实了其安全性。下一步是人类临床试验，目前正在计划中。 7.7.2. CD19靶向ADC：IKS03 IKS03由一种针对CD19的人源化抗体组成，设计用于位点特异性结合PBD前药有效载荷。它通过生物结合激活，产生一种药物与抗体比率为2的偶联物。体外和体内研究已经证明了其在多种CD19阳性淋巴瘤细胞系中的有效细胞毒性，最值得注意的是在含有经常在R/R NHL中观察到的遗传异常的MCL和DLBCL异种移植模型中，如CCND1 t(11;14)易位和三重打击淋巴瘤，涉及BCL-2、BCL-6和c-MYC的基因重排。此外，与其他使用PBD前药的ADC相比，它展示了更低的非特异性有效载荷从偶联物中的释放率，包括LT。目前正在进行I期临床试验NCT05365659，以评估其在晚期B细胞NHL患者中的安全性。 7.7.3. CXCR5靶向ADC：VIP924 VIP924是一种首创的ADC，靶向CXCR5，由一种可被legumain裂解的连接臂和一种微管蛋白抑制剂（KSPi）有效载荷组成。CXCR5是一种趋化因子受体，在B细胞和T细胞来源的淋巴瘤上高度表达，并参与调节肿瘤细胞侵袭、生长和迁移的途径。一项体内研究比较了VIP924与PV和LT在MCL的人性化小鼠模型中的效果。结果表明VIP924在抑制肿瘤生长、提高存活率和耐受性方面的优势。值得注意的是，与LT不同，VIP924组的动物没有经历细胞减少症。这些有希望的结果支持在人类临床试验中进行进一步研究的需求。 8.ADCs的未来发展方向 最近在设计位点特异性ADCs、利用双特异性抗体以及修改可裂解连接臂方面取得了进展，以期使ADCs更有效、更高效，同时最小化毒性。一种新颖的偶联化学方法涉及位点特异性附着，其中一些技术利用抗体中的天然链间二硫键，而其他技术则需要生物工程将酶促偶联标签整合到抗体序列中。尽管在淋巴瘤中尚未探索，但位点特异性偶联已在实体恶性肿瘤（如乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌）中得到评估。其中一种应用是ThioMab技术，它涉及使用工程化半胱氨酸进行位点特异性偶联。使用这种技术生产的ADC包括抗MUC16 ADC，它由在曲妥珠单抗的轻链和重链的特定位置插入半胱氨酸残基组成，然后与MMAE上的硫醇基团结合。此外，pClick技术提供位点特异性偶联；然而，它使用天然抗体和近距离激活的交联剂，不涉及任何生物工程。ThioBridge技术包括一种可裂解的连接臂，也使用天然抗体，并由三碳桥接附着提供增强的稳定性。此外，最近创新的AJICAP第二代技术通过利用硫酯化学的选择性裂解反应，实现了无聚集挑战的位点特异性ADC的生产，并有望成为无需抗体工程的位点特异性ADC。最后，通过不同的方法（如糖基重塑、转谷氨酰胺酶或脂酸连接酶方法）对天然抗体进行无标签酶促修饰，作为推进ADC发展的潜在工具具有潜力。 一类有前景的ADCs由双价双特异性抗体组成，如在HER-2靶向ADC中所示。双特异性抗体靶向两个不重叠的表位，随后诱导受体聚集和内化。这类ADCs已在乳腺癌中显示出疗效，并且在临床前研究中检查了MET过表达肿瘤，提供了有效的细胞毒性。 关于连接臂的最新进展，工作集中在制造稳定以避免非目标有效载荷释放的连接臂，但也容易在目标部位裂解以有效传递。这导致制造具有pH和微环境依赖性裂解的连接臂，允许ADCs在细胞内释放有效载荷。 这些进展正处于开发或临床前阶段研究中，有望提高下一代ADCs在包括淋巴瘤在内的各种癌症中的治疗效果。 9.结论  ADCs是革新了霍奇金和非霍奇金淋巴瘤治疗的新方法。抗体、连接臂和有效载荷的进步将导致ADCs的进一步发展，对淋巴瘤具有更高的特异性和细胞毒性。虽然获得抗性将是一个限制因素，但与其他新型药物的联合疗法，如单克隆抗体、分子靶向疗法和双特异性抗体，将为新的突破性治疗铺平道路。我们迫切需要创新的I期研究，以更好地理解ADCs在不同疾病环境中的作用，因为我们的目标是提高淋巴恶性肿瘤的治愈率。

摘要：过继免疫治疗使用嵌合抗原受体（CAR）重定向的T细胞是一种新的治疗范式，它使用一类新的治疗“药物”在某些迄今为止难以治疗的B细胞恶性肿瘤患者中产生完全且持久的缓解。CAR T细胞源自患者自身的免疫细胞，这些细胞在体外通过基因工程改造，带有能够结合特定目标并在目标结合时传递激活信号的CAR。CAR激活细胞毒性T细胞以有效、重复和持久的方式破坏和消除识别的癌细胞。然而，各种障碍限制了CAR T细胞在其他类型的癌症或其他疾病中的广泛应用。目前的挑战包括设计最优的CAR、积极穿透肿瘤病变，并在不诱导对健康组织产生毒性的情况下维持T细胞的抗肿瘤激活。本章回顾了CAR的代际、增强CAR T细胞效力和选择性的策略，以及为日益增多的患者建立高效的制造流程。 1.原型嵌合抗原受体（CAR，T-Body，免疫受体） 在20世纪80年代中期，Steven A. Rosenberg（美国国立卫生研究院）将从黑色素瘤活检中分离并大量体外扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）重新注入黑色素瘤患者体内时，患者T细胞识别和有效摧毁癌细胞的能力变得显而易见。这些以及随后的发展促使了采用自体免疫细胞治疗肿瘤患者的概念，这些免疫细胞有能力在大量患者中诱导肿瘤退缩和长期缓解。这些扩增的TILs被认为对特定肿瘤抗原具有特异性，并具有迁移能力以进入肿瘤病变；然而，抗原特异性大多仍然未知。 接下来的几年中，为了给患者的T细胞提供明确的靶向特异性，人们付出了巨大的努力；与T细胞受体（TCR）链或重组嵌合抗原受体（CAR）的遗传工程化，证明是成功的策略之一。与TCR不同，CAR是一个复合的、单多肽链跨膜受体，它在目标识别时提供靶向特异性和T细胞激活能力。原型CAR由四个主要结构域模块化组成：在细胞外末端是用于目标识别的单链可变区（scFv）抗体，一个连接到跨膜结构域的间隔区，以及主要来自TCR/CD3ζ或Fcε受体I（FcεRI）的细胞内信号传导结构域，有或没有连接的共刺激结构域（图1）。目标细胞表面的同源抗原的参与启动了CAR工程化免疫细胞的激活，导致持久的T细胞反应。每个CAR结构域都有独特的功能，并对重定向的T细胞激活产生影响；对于每个特定应用，CAR设计需要进行一些调整，以提供优化的靶向和T细胞激活，如下文详细描述。 图1 嵌合抗原受体（CARs）的世界在不断增长。第一代CAR在细胞外域（外域）中拥有抗原结合和间隔基团，在跨膜域中，在细胞内域（内域）中拥有来自CD3ζ或FcεRI γ链的激活基团。第二代CAR除了拥有一个共刺激域之外，第三代CAR在内域中拥有两个共刺激域。第四代CAR（“TRUCK”，“T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤”）由第二代或第三代CAR组成，该CAR在CAR信号传导后诱导转基因蛋白的表达。虽然在规范设计中描绘，但已经工程化了大量CAR变体，每种变体都针对不同的应用进行了优化。 原型CAR的基本设计最初由Zelig Eshhar及其同事（魏茨曼科学研究所）提出，他们展示了一个模块化复合受体，最初命名为“T-Body”或“免疫受体”，具有用于结合的抗体衍生结合域和用于T细胞激活的TCR信号域，为工程化T细胞提供了特异性识别和激活。在随后的几年中，引入了许多修改，允许靶向广泛的抗原，并通过各种细胞内结构域发送信号，以启动和重定向定义的免疫细胞功能（表1）。 表 1 CAR构建模块及其替代模块。 EMA（欧洲药品管理局）批准。其他使用其他宿主细胞和不同CAR设计的应用程序也在早期临床试验中越来越多地被研究。 规范的CAR由抗体衍生的结合域、间隔区、跨膜域和细胞内主要及共刺激信号域模块化组成。每个结构域可以通过不同的模块构建，这些模块影响不同的变量，并最终影响T细胞的激活和性能。 CAR工程化的细胞毒性T细胞重定向至癌细胞是该技术研究最多的应用；自体抗CD19 CAR T细胞的过继转移成为美国食品药品监督管理局（FDA）批准的首个基因工程细胞疗法；随后，欧洲药品管理局（EMA）也批准了。使用其他宿主细胞和不同CAR设计的其他应用也越来越多地在早期临床试验中研究。 2.CAR的模块化组成：细胞外CAR结构域 2.1.结合域 抗原结合域传统上由来自小鼠或人类单克隆抗体的单链可变区（scFv）组成。通过短柔性连接子（通常是(Gly4Ser)3肽）将重链（H）和轻链（L）抗体链的可变（V）区域连接起来，形成VH-linker-VL或VL-linker-VH的顺序。甘氨酸残基提供了灵活性，以允许VH和VL正确折叠形成抗原结合口袋，而丝氨酸则为连接子提供了一些溶解性。VH和VL链的空间位置和相互作用可以显著影响亲和力、特异性和溶解性。足够高的结合亲和力对于诱导T细胞激活至关重要；然而，存在一个亲和力上限，超过该上限CAR介导的T细胞激活不会改善，但会导致激活诱导的细胞死亡（AICD）。在CAR的背景下，一些scFvs通过张力信号独立于抗原参与诱导AICD、耗竭和T细胞的终端分化。除了亲和力和细胞表面的抗原密度外，目标表位在抗原内的位置也很重要；通常，靶向膜近端表位比靶向膜远端表位诱导更强的T细胞激活。 通过使用抗体进行靶向，CAR介导的识别是MHC独立的。这在靶向MHC-肽处理和呈递机制有缺陷的肿瘤时是有益的。此外，通过抗体识别目标，还可以识别传统T细胞看不见的抗原，如碳水化合物、脂质或抗原的结构变体。规范的CAR识别目标细胞表面的抗原；也可以通过使用特异性针对定义的MHC-肽复合物的抗体，工程化MHC-肽识别CAR，使其能够感知由MHC呈递的细胞内抗原。例如，一个scFv识别HLA-A2背景下的NY-ESO-1肽的CAR提供了与相应TCR类似的TCR样识别目标。 2.CAR的模块化组成：细胞外CAR结构域 2.2.间隔区 原型CAR经常在抗原结合域和跨膜域之间包含一个“间隔区”，以便接近目标抗原；连接的铰链区提供了一定的灵活性。间隔区的类型和长度对于最佳目标结合和信号传递至关重要。间隔区并非必需，因为有些CAR在scFv直接融合到跨膜域时是活跃的，而其他CAR只有在具有一定长度的间隔区时才活跃。间隔区通常来源于IgG1或IgG4恒定域或来自细胞外CD28、CD4或CD8（图2）。一般的想法是，间隔区在工程化T细胞和相应目标细胞之间提供最佳距离，以允许与目标细胞形成有效的接触区。基于TCR-MHC相互作用的知识，人们普遍认为CAR-目标相互作用需要在T细胞和目标细胞之间创建约15纳米的距离，以最佳形成接触区。因此，针对膜近端表位需要较长的间隔区，而较小的间隔区对更远离膜的表位是最佳选择；通过使用不同长度的间隔区可以轻松调整距离。在这个背景下，IgG衍生的间隔区具有可以通过结合一个、两个或三个CH1-CH2-CH3部分来调整长度的优势。IgG1衍生的间隔区还有利于CAR分子的稳定；然而，它可能与髓系细胞上的Fcγ受体（FcγR）（CD64）结合，介导CAR T细胞和髓系细胞的“非肿瘤”激活。这可以通过删除间隔区内的IgG1 CH2域或通过删除IgG1 Fc受体结合部分内的Asn297糖基化位点来预防。类似的修改也可以引入到IgG4间隔区。 图 2 第二代CAR设计的变体。由于模块化组成，可以使用各种替代域来构建CAR，其中一些示例性地列出。各个组分的变化允许调节CAR的结合和信号传导，最终调节细胞功能、代谢和工程化T细胞的抗肿瘤活性。其他变体旨在提高结合亲和力、目标的可及性、信号强度和细胞膜上的持久性等。最后，安全预防措施导致CAR设计中进一步的修改。 2.3.跨膜区 典型CAR的跨膜区来源于如CD3ζ、CD4、CD8α、CD28或OX40等类型1跨膜蛋白，由20-23个疏水性氨基酸组成，富含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸（图2）。带有CD3ζ跨膜域的CAR似乎比其他CAR更有效地整合到TCR/CD3复合体中，因此在表达和信号传导方面更为稳健；带有CD28跨膜区域的CAR似乎同样稳定。另一方面，带有CD8α铰链和跨膜域的CAR不易于AICD；然而，它们通过减少促炎细胞因子的释放来介导较少的T细胞激活。 2.4.细胞内信号传导域 “第一代”CAR完全通过主要信号传导域（信号-1）进行信号传导。TCR/CD3ζ细胞内链含有三个免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs），FcεRI γ链含有一个ITAM，这些在磷酸化后作为下游信号蛋白的特定适配器。因此，CAR利用内源性TCR信号机制来启动T细胞激活事件的级联。下游激酶如Lck或Fyn也可以作为CAR介导的T细胞激活的主要信号，等等（图2）。CAR信号传导域本身足以与下游激酶结合并启动有效的激活级联，因为CAR在TCR敲除细胞和非T细胞如NK细胞中也是功能性的。然而，仅有主要信号的CAR不足以激活以允许长期持久；这样的CAR T细胞迅速进入凋亡。根据“双信号假说”，静息T细胞还需要一个共刺激信号以持续激活。这就是将主要信号与共刺激信号（信号-2），如CD28或4-1BB（CD137），结合在“第二代”CAR中的理由。也在临床前和临床上探索带有替代共刺激域的CAR，如OX40、ICOS、CD27、CD40-MyD88、CD2和CD244。为了方便下游激酶的接近，CD28通常位于膜近端位置，随后是远端位置的CD3ζ；OX40和4-1BB在膜远端和近端位置都活跃。与第一代CAR相比，第二代CAR T细胞在细胞因子释放、扩增和抗肿瘤活性方面显示出稳健和持久的反应。 CAR介导的共刺激以不同的方式影响T细胞效应功能、存活、持久性和代谢。例如，4-1BB CAR T细胞在患者血液中的持久性超过6个月，而CD28 CAR T细胞在3个月之后大多无法检测到。经过重复刺激后，CD28 CAR T细胞重新编程为CD45RO+ CCR7−效应记忆细胞，这些细胞随后需要OX40来延长持久性并避免快速耗竭；4-1BB CAR T细胞主要转化为CD45RO+ CCR7+中央记忆细胞，并在外围血液中长期持久。CD28 CAR信号激活PI3K/Akt/mTOR途径，刺激有氧糖酵解，增加葡萄糖摄取和ATP生成，而4-1BB CAR信号激活Wnt/β-catenin途径和脂肪酸氧化，增加代谢和线粒体呼吸链能力。典型的Wnt/β-catenin有利于中央记忆细胞的形成和T细胞的长期存活，而CD28诱导的PI3K/Akt信号维持效应细胞的即时响应。在高剂量下，CD28和4-1BB CAR T细胞都能在临床前模型中根除大型已建立的肿瘤；在低剂量下，CD28 CAR T细胞比4-1BB CAR T细胞表现出更大的耗竭程度，结果是4-1BB CAR T细胞在长期内更有效地根除大型肿瘤负荷。另一方面，带有4-1BB CAR的T细胞仍然对肿瘤介导的通过TGF-β的抑制敏感，这对CD28 CAR T细胞来说较少见。因此，选择CAR设计的标准取决于多个参数，包括T细胞持久性、抗抑制能力、共刺激和共抑制配体的模式、肿瘤细胞上的抗原密度、T细胞上的CAR密度等。 “第三代”CAR结合两个共刺激域以及主要激活信号。联合共刺激的好处只在少数情况下得到证明，例如，通过CAR提供CD28-OX40共刺激对T细胞在终端成熟中的进展有益。 3.TRUCK：“第四代”CAR T细胞 CAR T细胞可以用来按需将转基因蛋白输送到预定的、靶向的组织。因此，CAR T细胞被设计成带有CAR诱导表达盒的额外“有效载荷”。所谓的“第四代”CAR T细胞，即TRUCKs（“T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤”），旨在在靶向组织中沉积分泌型转基因蛋白，以实现治疗有效浓度（图3）。“有效载荷”的表达受NFAT6-IL-2最小启动子的控制，该启动子在CAR信号传导时被激活；有效载荷可以是转基因编码的任何蛋白或肽。这种策略特别有趣，因为它结合了重定向CAR T细胞攻击和局部沉积的生物活性蛋白的作用，同时避免了系统毒性。只要CAR T细胞保持激活状态，TRUCKs就会沉积转基因产物，例如，IL-12或IL-18作为转基因免疫调节剂，以特定方式塑造靶向肿瘤环境，而不引起系统毒性。累积的TRUCK产生的IL-12在CAR靶向的肿瘤组织中招募天然免疫细胞，如NK细胞和巨噬细胞，在那里反过来启动二次抗肿瘤免疫反应。IL-12 TRUCKs抵抗Treg细胞的抑制，并显示出增加的细胞因子释放和扩增。当快速进展的肿瘤积累抗原丢失的癌细胞，导致对CAR T细胞不可见的肿瘤复发时，这种策略特别有趣。释放IL-18的TRUCKs将CAR T细胞转化为T-bet高FoxO1低效应细胞，抵抗耗竭并显示出对大型已建立肿瘤的优越细胞毒性。IL-18 CAR T细胞治疗改变了整个肿瘤免疫细胞景观，特别是通过增加CD206− M1型巨噬细胞和NKG2D+ NK细胞的数量，减少抑制细胞如Tregs、抑制性CD103+ DCs和M2型巨噬细胞。其他例子包括释放过氧化氢酶以保护T细胞免受过氧化压力介导的抑制和释放肝素酶以改善T细胞通过肿瘤基质的穿透。 图 3 第四代CAR T细胞（“TRUCKs”）。在抗原结合时，第二代或第三代CAR诱导表达一种转基因蛋白，该蛋白在细胞内作用、整合到膜中或由CAR T细胞释放。释放的转基因蛋白旨在改变肿瘤环境、重塑肿瘤组织或吸引二次免疫反应。CAR T细胞被诱导仅在CAR与其靶标结合时释放蛋白质，从而将“有效载荷”在预定义的交付点作为“TRUCK”进行交付。这种CAR T细胞被理解为“活体工厂”，用于精确和持续地交付治疗性细胞产品。 所谓的“装甲CAR”通过产生4-1BB配体提供增加的共刺激通过刺激4-1BB途径。工程化的T细胞被设计为分泌Toll样受体（TLR）配体，可以刺激T细胞和抗原呈递细胞上的TLR途径，然后可以激活一组T细胞进行广泛的抗肿瘤攻击。靶向Muc16ecto（即黏蛋白-16（CA-125）的膜保留残余物）并分泌IL-12的CAR T细胞正在临床试验中评估（NCT02498912）。IL-15 TRUCK细胞显示出改善的扩增和抗肿瘤活性，但在未受控制的扩增情况下需要自杀基因，由于其白血病潜力。“装甲”CAR通过与CAR共表达IL-7受体-α链来恢复对IL-7的反应性，并促进Th1反应。类似地，在IL-4水平增加的前列腺癌中，共表达IL-4结合/IL-7信号传导受体提高了抗PSCA CAR T细胞的抗肿瘤活性。另一方面，CAR T细胞上共表达的显性负性TGF-β DNRII受体可以在TGF-β存在的情况下与TGF-β竞争，以改善T细胞的抗肿瘤活性。也可以设想提供细胞因子或细胞因子受体之外的应用，如输送可溶性HVEM外域，以靶向肿瘤血管，以维持肿瘤穿透。 4.具有双重特异性、组合抗原识别和条件性CAR的CAR T细胞 原型CAR通过一个scFv将特异性重定向到一个抗原；多种原因要求具有多重特异性的CAR：(1)肿瘤病变在可靶向抗原方面可能是异质的，或在肿瘤进展过程中丢失抗原；(2)靶向癌细胞和肿瘤基质或血管可能有益或需要增加治疗效果。将两种或更多CAR T细胞产品应用于癌症患者基本上是可行的，尽管需要在GMP条件下制造两种细胞产品。例如，通过顺序输注应用CD19和CD22 CAR T细胞目前正在评估治疗难治性B-ALL的试验中（NCT03620058）。或者，T细胞被设计为表达两个CAR，即所谓的双顺反子CAR，每个CAR针对不同的抗原（图4）。通过灵活的连接子将两个scFv相互连接，设计出具有双重特异性的CAR。这种串联排列的双特异性CAR（“串联CAR”，“Tan-CAR”）或环状结构，针对两种不同的抗原，并能够在结合任一抗原时提供T细胞激活（“或”门控）；具有其中一种相应抗原的目标细胞仍然被识别。除了两个连接的scFv外，双抗体、二合一抗体和双变量域抗体也可以用来设计具有两种特异性的CAR。三特异性CAR包含单价和/或多价CAR结构的组合，以针对三种抗原，进一步扩大靶向特异性。一个例子是设计了一种双特异性CAR，将针对CD20和CD19的scFv连接起来，旨在减轻在接受CD19 CAR T细胞治疗后经常发生的B细胞白血病/淋巴瘤的复发。CD19− CD20+白血病细胞的复发旨在通过CD20-CD19双特异性CAR T细胞得到控制。双特异性CAR中scFv的顺序取决于特定抗原中目标表位的空间可及性。CD20-CD19 CAR对CD19和CD20都具有相同的结合能力，并重定向T细胞激活，而CD19-CD20 CAR则效率要低得多。其他双特异性CAR的例子是针对CD19和CD123治疗B-ALL或CD19共靶向CD22、ROR1和免疫球蛋白κ轻链（Igκ）。多特异性CAR T细胞目前正在早期临床试验中评估。通过双顺反子表达盒设计了同时具有CD19和CD22 CAR的T细胞，正在进行治疗高风险B-ALL或干细胞移植后复发的试验（NCT03289455）。具有CD19和CD22特异性的双价CAR正在评估治疗B-ALL或B细胞淋巴瘤（NCT03241940, NCT03233854, NCT03330691, NCT03448393, NCT03019055）。目前正在进行的II期试验中评估了针对BCMA两个表位的双特异性CAR（NCT03758417）。 图4 基于逻辑门控的CAR介导的T细胞激活，以证明在肿瘤靶向中的选择性。共表达两种CAR，每种CAR在与相应的目标抗原结合时都能完全激活T细胞；双特异性CAR（串联CAR，Tan-CAR）也是如此。在这种情况下，通过表达抗原A或B或两者的细胞激活T细胞（"OR"门控）。为了仅通过同时表达A和B抗原的细胞激活CAR T细胞，识别A的CAR仅通过CD3ζ提供基本激活，这不足以实现完全和持续的激活，而识别B的CAR提供共刺激；通过两种CAR的同时信号传导诱导T细胞完全激活（"AND"门控）。识别抗原A的synNotch CAR驱动转录并表达第二种CAR，该CAR在识别抗原B时驱动T细胞完全激活。具有ITIM（免疫受体酪氨酸基抑制基序）的抑制性CAR在其识别的抗原B结合时阻止通过激活CAR的信号传导。当抗原B不存在时，CAR可以在结合抗原A时激活T细胞（"A-not-B"门控）。 当结合两种抗原时，双特异性CAR比单特异性CAR具有更高的亲和力，理论上稳定了突触并改善了T细胞对低抗原水平目标细胞的反应。这种情况可以用来只将CAR T细胞重定向到表达两种抗原而不是一种的细胞（图4）。这种“与”门控的抗原模式旨在提高对癌细胞的靶向选择性，同时保留健康细胞。两个共表达的抗原被两个共表达的CAR识别，每个CAR识别特定的抗原，并分别提供主要或共刺激信号。这样，只有同时结合两种抗原才提供完全T细胞激活所需的两个信号；结合一种抗原是不足够的。组合抗原识别的例子是，通过CD3ζ CAR靶向ErbB2和通过CD28 CAR靶向Muc1，或通过CD3ζ CAR靶向间皮素和通过CD28 CAR靶向叶酸受体-α。靶向CD13和TIM3的双特异性和分裂CAR T细胞在临床前模型中根除患者衍生的急性髓性白血病细胞，减少了对骨髓和外周髓性细胞的毒性。 通过异二聚体化两个多肽链，可以加强两个CAR上的初级和共刺激信号的组合；一个链由细胞外和跨膜以及初级信号传导部分组成，第二个链提供共刺激信号传导部分，并通过添加“二聚体化剂”与第一个链相连。CAR在二聚体化剂允许异二聚体化和功能性CAR形成之前保持沉默。通过滴定二聚体化剂剂量可以微调T细胞活性；撤除二聚体化剂终止CAR信号。只有当每个CAR信号单独不足以驱动T细胞激活时，才能通过组合抗原识别实现清晰的“开-关”T细胞激活。由于预先激活的T细胞中的CD3ζ信号可能重新诱导T细胞反应，因此需要调整信号或降低结合亲和力以实现平衡的激活阈值。 可调CAR的另一种策略基于合成Notch（synNotch）受体。Notch由一个细胞外受体、一个跨膜域和一个细胞内转录调节器组成，激活后介导内部域的蛋白水解，释放细胞内转录调节器。这些特性用于控制与Notch受体不同特异性的真正CAR的转录。优点在于Notch受体的抗原识别基于逻辑“与”门控，并以空间定义的方式控制CAR T细胞功能。在CD19结合后，CD19特异性synNotch受体释放转录效应域Gal4-VP64或TetR-VP64以诱导抗间皮素CAR的表达。只有当在靶向组织中同时识别synNotch配体和CAR配体时，T细胞才被激活。另一个例子是通过CAR靶向ROR1和通过Notch受体靶向EpCAM或B7-H3。虽然CAR的“开开关”决定了靶向癌细胞的选择性，但这种策略可能受到诱导足够水平的CAR表达和在没有Notch信号进一步发生时衰减CAR所需的时间的限制。 工程化T细胞的TCR特异性也可以用来提供更复杂的识别轮廓。带有γδ TCR的T细胞识别肿瘤细胞特有的磷酸化抗原；转基因表达GD2特异性CAR和共刺激域只会在γδ TCR和CAR同时结合它们相应的抗原时提供完全的T细胞激活；由于缺乏γδ TCR激活，不会攻击GD2+的健康细胞。 虽然许多可靶向的抗原既表达于健康细胞也表达于癌细胞，但有些抗原仅由健康细胞表达，而癌细胞缺乏表达。在这种情况下，结合共同抗原“A”但在结合健康细胞上的抗原“B”时阻断，将阻止CAR T细胞激活对抗健康细胞（图4）。带有ITIM（免疫受体酪氨酸基抑制基序）的抑制性CAR只要结合其相应的抗原“B”，就阻止通过激活性CAR的信号传导。结合缺乏抗原“B”的“A”癌细胞允许CAR T细胞激活，因为缺乏通过抑制性CAR的信号传导（“A非B”门控）。 5.具有植入多重抗原特异性的通用CAR 目前，原型CAR具有一个确定的抗原特异性；改变特异性需要用新的CAR工程化T细胞。在这种情况下，开发了一种“通用”CAR，它识别一种抗体，该抗体转而提供癌症特异性（图5）。例如，抗癌抗体的免疫球蛋白Fc区域被具有CD16作为结合域的CAR结合。CD16 CAR T细胞结合抗癌抗体，从而获得对癌细胞的特异性。或者，CAR结合至与抗癌靶向抗体相关联的蛋白质表位。具有荧光素异硫氰酸酯（FITC）特异性CAR的T细胞识别FITC标记的叶酸，该叶酸与叶酸受体阳性癌细胞结合。也可以设想将其他表位与桥接抗体相关联，如亲和素。同时添加不同特异性的抗体，允许将相同的CAR T细胞产品（“UniCAR”）重定向至多种抗原，无需重新制造CAR T细胞。该策略的优点是同时使用不同的抗体靶向广泛的抗原，同时只应用一种制造的CAR T细胞产品。实际的特异性由应用的抗体混合物在治疗足够浓度下定义。随着应用的抗体的短半衰期，此外，意外的不良事件在抗体撤除后很快就会有限。从机制上讲，有效的肿瘤控制需要CAR T细胞和连接抗体都渗透到肿瘤病变中；目前尚不清楚这是否适用于晚期实体瘤。也尚未解决“通用”CAR T细胞是否能够建立对癌症抗原的持久免疫记忆，这被认为是长期控制癌症所需的。 图 5 “通用”CAR的概念。T细胞表达一种特异性针对标签的CAR，该标签与连接分子相连，最好是天然抗体、单链抗体(scFv)或双特异性T细胞导向抗体(BiTE)，这些分子能够识别肿瘤细胞上的目标抗原。通过添加不同的连接分子，无需工程化新的CAR T细胞，就可以为T细胞配备不同的特异性。这被认为在将CAR T细胞应用于患者后也是可行的；注入针对不同肿瘤抗原的抗体，为CAR T细胞提供不同的特异性。 6.转换抑制信号为激活信号的Switch CAR 在肿瘤病变中，重定向的T细胞攻击通常以各种方式受到抑制；抑制性配体如程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）和PD-L2与激活的T细胞表达的程序性细胞死亡-1（PD-1）结合。一种结合这种抑制性配体但向工程化T细胞传递激活信号的CAR，不仅可以与抑制性受体竞争结合，还可以通过提供激活信号克服抑制（图6a）。理想情况下，PD-L1:CD28 “开关”CAR在工程化T细胞中克服PD-1介导的抑制信号。特别是，一个具有PD-1细胞外域结合PD-L1和CD28细胞内信号传导域的CAR，将抑制信号转换为激活信号，导致ERK磷酸化增加，促炎细胞因子释放，T细胞扩增和目标细胞的细胞溶解。由TIGIT（具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体）的外域与CD28共刺激域融合而成的嵌合受体，在结合TIGIT配体CD155时增强T细胞功能。鉴于肿瘤组织提供的大量抑制信号，确定需要克服的“关键”抑制因素以维持有效的T细胞反应仍然是一个挑战。 图 6 开关CAR和抑制性CAR（iCAR）。(a) 开关CAR与生理性T细胞抑制性受体的配体结合，但为工程化T细胞提供激活信号。(b) 抑制性CAR在与抗原结合后，通过ITIM信号向工程化T细胞提供负信号。抑制信号压倒了通过TCR或共表达的激活CAR的激活。 7.抑制性CAR：iCARs 虽然原型CAR向工程化T细胞提供激活信号，但具有抑制信号的CAR旨在在结合健康细胞时抑制CAR T细胞激活。理想情况下，抑制性CAR通过在面对健康组织时覆盖激活CAR信号来减轻非肿瘤毒性。与激活性、肿瘤特异性CAR共表达的具有优势抑制信号的CAR，识别健康细胞；从而CAR T细胞只在结合癌细胞时激活，抑制性CAR不结合健康细胞（图6b）。这种抑制性CAR提供PD-1或CTLA-4信号，并覆盖癌症特异性CAR的激活信号。 8.异体CAR T细胞和CAR NK细胞 到目前为止，CAR T细胞治疗是一种通过体外制造患者自己的T细胞的个性化治疗。这不仅繁琐、成本密集和耗时，而且在患者晚期疾病无法提供足够或足够活跃的T细胞进行CAR工程化时通常也不适用。在这种情况下，异体“现成的”CAR T细胞将为广泛的患者群体带来好处。为了避免移植物抗宿主病（GvHD），需要删除内源性的αβ TCR和HLA分子，这可以通过锌指核酸酶或CRISPR/Cas技术实现。随后清除剩余的TCRαβ T细胞，通过污染的异体TCR+细胞降低GvHD风险。T细胞通过转录激活样效应核酸酶（TALENs）技术在TCRα和CD52位点进行基因编辑，用于治疗无法生产自体CAR T细胞的患者的儿童CD19+ ALL。CD52存在于患者的恶性B细胞上，需要从CAR T细胞中删除，以允许消除恶性淋巴细胞，同时保留注入的CD52阴性CAR T细胞。对于工程化异体CAR T细胞，CRISPR导向RNA和Cas9目前由病毒载体编码以实现组成性表达；当前的研究旨在短暂提供基因编辑工具，而不持久的载体，以最小化非目标编辑。 针对BCMA治疗多发性骨髓瘤的异体CAR T细胞，通过BCMA CAR和基因编辑技术进行了改造，以限制TCR介导的免疫反应。通过将CD20模拟表位整合到CAR的细胞外域，使CAR T细胞能够通过利妥昔单抗消除，从而提供了异体BCMA CAR T细胞的安全性。 关于使用异体效应细胞，NK细胞也可以用于诱导有效的抗肿瘤反应，因为它们具有细胞毒性潜力和分泌促炎细胞因子。除了使用异体细胞，使用NK细胞进行癌症的过继细胞治疗有很强的生物学理由；NK细胞表现出广泛的抑制性和激活性受体库，以识别外来、感染或恶性细胞。两种信号的平衡最终诱导或阻断细胞毒性CD56dim NK细胞释放细胞毒性颗粒以杀死目标细胞。虽然可能存在广泛的NK细胞亚群多样性，基于激活和抑制受体的库，但通过CAR工程化NK细胞将为特定癌细胞提供预定的特异性。原型CAR具有CD28-CD3ζ信号也在NK细胞中活跃；具有NK细胞2DS2和DAP12信号蛋白的CAR产生了更强的抗肿瘤活性。为NK细胞工程化的CAR通常包含DAP10或DAP12用于激活，单独或与CD3ζ一起。具有NKG2D作为结合物和DAP10-CD3ζ用于激活的CAR有效地激活了小鼠模型中针对骨肉瘤的原代NK细胞。CD3ζ在NK细胞中作为激活域优于DAP10，而DAP12优于CD3ζ。 9.制造CAR T细胞用于临床应用 对于临床应用，CAR T细胞产品是根据良好生产规范（GMP）规则，使用预期接受患者的自体T细胞制造的（图7）。在大多数情况下，通过白细胞分离术收集血液，分离T细胞，通过病毒感染或电穿孔进行基因工程改造，并扩增到临床相关的数量。大多数临床试验使用通过γ-逆转录病毒或慢病毒基因转移修饰的T细胞；基于转座子的载体，如Sleeping Beauty和PiggyBac，越来越多地应用于临床，其好处是避免了成本和时间密集型的病毒生产。病毒和转座子介导的基因转移程序旨在永久性地修改患者的T细胞以表达CAR；一些试验使用通过RNA电穿孔修饰的T细胞进行短暂的CAR表达。在永久性基因改造后，插入突变和随后成熟T细胞的致癌转化的风险似乎很低，到目前为止在这方面还没有报告致癌事件。一个需要注意的问题是，通过慢病毒转移，CAR基因插入到Tet2位点导致T细胞的克隆扩增，然而，它们自发地收缩了。然而，白细胞分离产品中污染的恶性细胞也可能意外地被CAR改造，存在重新输注给患者后通过CAR介导的肿瘤促进的风险。 图7 CAR T细胞制造和患者治疗时间表。(a) 通过白细胞分离术从患者体内收集T细胞，并在体外处理以获得最终的CAR T细胞产品，包括T细胞工程化以携带CAR、扩增至临床相关数量，以及最终的质量控制程序（QC）。在输注CAR T细胞产品之前，患者需接受非清髓性淋巴细胞减少（“预处理”），以促进CAR T细胞的植入和体内扩增。随后需要院内护理以管理潜在的副作用，如CRS或神经毒性。(b) 体外CAR T细胞制造过程通常从白细胞分离产品开始，并涉及多个后续生产步骤，包括T细胞分离和激活、基因工程、CAR T细胞扩增、制剂、CAR T细胞产品的冷冻保存，以及最终的质量控制以供释放。整个过程可以手动运行，或在监督下（半）自动化进行。 经过基因改造后，CAR T细胞在细胞因子存在的情况下在体外广泛扩增到临床相关的细胞数量；目前使用手动处理的摇动反应器或袋子以及完全自动化和监督处理设备。自动化的目标是允许以高再现性和质量进行生产，并从越来越多的患者中并行生产细胞，并缩短静脉到静脉的时间。 最适合CAR治疗的T细胞群体被认为是具有急性炎症特征的原始或年轻中央记忆细胞。在IL-2存在下扩增CAR T细胞优先触发效应T细胞，而IL-7或IL-2加IL-15扩增具有持续细胞因子释放和抗肿瘤活性能力的中央记忆T细胞。添加IL-21使CAR T细胞保持较少分化状态。刺激方式不仅决定了扩增CAR T细胞的产量，还决定了代谢依赖性；IL-15增加氧化代谢以及肉碱棕榈酰转移酶，这是脂肪酸氧化的限速步骤。IL-7通过STAT5和Akt激活增加Glut1，并诱导甘油运输和甘油三酯合成，从而改善T细胞持久性和存活。在体外扩增期间抑制Akt触发具有高水平脂肪酸氧化的中央记忆表型，最终改善CAR T细胞的抗肿瘤活性。CD45RO+ CD62L+记忆CAR T细胞比更高级分化阶段的效应T细胞提供更持久的抗肿瘤反应，使富含CD62L的CAR T细胞成为进一步探索的有吸引力的选择。 因此，中央记忆CAR T细胞在临床应用中似乎更优越，因为响应的患者没有累积具有早期记忆和耗竭特征的T细胞，而非响应的患者则累积了。最终产品中工程化细胞的活性可能影响治疗效果。然而，基于制造的细胞产品的活性对CAR T细胞治疗结果的首次回顾性分析表明，当患者接受70-80%活性的产品与至少80%活性的产品相比，CD19 CAR T细胞扩增或患者存活没有差异的证据。 制造T细胞产品是一种个性化方法，当前程序有一些显著的限制： 一些癌症患者淋巴细胞减少或具有低数量的原始T细胞，导致生产延迟或失败，如在为儿科患者生产时所经历的。 生产过程耗时，这对急性或晚期疾病的患者不利。 由于疾病，患者的T细胞可能功能失调，如CLL和一些实体瘤所报告的，导致产品反应率低。 在某些情况下，工程化异体T细胞可能是另一种策略。在接受造血干细胞移植的患者中，使用移植的异体T细胞制造CAR T细胞产品。这样的异体CD19特异性CAR T细胞诱导了部分和完全缓解；然而，一些患者遭受了GvHD。病毒抗原特异性、部分HLA匹配的供体T细胞缺乏异体反应性，并且通过CAR工程化，显示出抗淋巴瘤活性。NK细胞以其MHC独立活性也是第三方供体细胞CAR工程化的来源；然而，它们在患者中表现出较差的持久性。 10.通过CAR T细胞的过继治疗在血液学恶性肿瘤中诱导持久缓解 过继转移CAR T细胞的治疗效果取决于多个参数，包括CAR设计、CAR信号传导、结合亲和力、目标细胞上的抗原数量、目标抗原表位的空间可及性、T细胞的成熟阶段、CAR T细胞的持久性和扩增、患者免疫系统的预处理等。目前的努力旨在优化特定疾病的状况；一些治疗方案已在CAR T细胞治疗恶性疾病的方面证明成功，特别是B细胞白血病/淋巴瘤；少数试验旨在治疗实体癌。 在迄今为止难以治疗的B细胞白血病和淋巴瘤的治疗中，使用“第二代”抗CD19 CAR T细胞的早期临床试验实现了完全且持久的缓解；使用“第一代”CAR T细胞的治疗大多失败，因为CAR T细胞从循环中迅速清除。目前，近600项早期阶段的CAR T细胞试验正在进行临床探索，主要由学术中心进行（截至2020年初，中国有268项，美国有227项，欧洲有67项）。用于治疗儿童B-ALL（Kymriah™，tisagenlecleucel，诺华）和成人大B细胞淋巴瘤（Yescarta™，axicabtagene ciloleucel，Kite-Gilead）的抗CD19 CAR T细胞已获得FDA和EMA的批准；其他将很快跟进。 CAR T细胞治疗的标准程序从患者的白细胞分离开始，分离T细胞，体外基因工程改造相应的CAR，CAR T细胞扩增，以及在非清髓性淋巴细胞减少和IL-2支持后，通过静脉输注将最终的细胞产品重新给患者（图7）。由于CAR T细胞的持久性对临床效果至关重要，目前在试验中使用的CAR具有一个或两个共刺激内域，其中大多数提供CD28或4-1BB共刺激。在持久性方面，4-1BB共刺激的CAR T细胞似乎优于CD28 CAR T细胞，在循环中持续4年以上，而CD28 CAR T细胞持续30天。由于CD19 CAR T细胞不区分健康和恶性B细胞，只要CD19 CAR T细胞持续存在，患者就会经历持久的B细胞耗竭。尽管B细胞耗竭在临床上是可管理的，但这种情况要求在靶向恶性B细胞时更具选择性。最近，Fcμ（IgM）受体被确定为治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）时可能更具肿瘤选择性的目标，由于目标表达水平较低，因此大多数健康B细胞免于被淘汰。目前也在探索其他替代靶标。 在缓解期间，大多数接受4-1BB CAR T细胞治疗的白血病/淋巴瘤患者没有接受进一步的癌症特异性治疗；接受CD28 CAR治疗的患者经常接受异体干细胞移植，这似乎是有益的，因为CD28 CAR T细胞的持久性不如4-1BB CAR T细胞。需要进一步探索以确定长期内更成功的策略。 迄今为止，患有DLBCL、CLL、B细胞急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）和滤泡性淋巴瘤的患者已通过CD19 CAR T细胞成功治疗。值得注意的是，接受CD19 CAR T细胞治疗的多发性骨髓瘤患者也经历了缓解，尽管通过流式细胞术评估，骨髓瘤细胞是CD19low或CD19阴性。目前也在探索用于治疗B细胞恶性肿瘤的其他替代靶标，包括CD20、CD22、Igκ轻链、ROR-1和CD30。 由于缺乏标准化的试验设计、CAR组成、靶向抗原、预处理等方面，很难比较各种试验中CAR T细胞治疗的成功。然而，越来越明显的是，CAR T细胞剂量和淋巴细胞减少的程度或淋巴细胞减少方案对于允许广泛的T细胞扩增、持久性和最终治疗效果至关重要。应用后对CAR T细胞的重复再刺激可能改善它们在长期内的持久性和抗肿瘤效果。这是使用病毒特异性T细胞进行CAR植入的合理性，它们在接触病毒抗原时通过TCR重复再刺激；例如，Epstein-Barr病毒（EBV）特异性T细胞通过CAR工程化，并被EBV感染的细胞触发扩增。事实上，EBV特异性CAR T细胞的表现优于没有病毒特异性的CAR T细胞。 11.治疗实体癌的CAR T细胞面临的挑战 虽然血液学恶性肿瘤的治疗越来越成功，但实体癌的治疗仍然具有挑战性（表2）。作为“活药”的CAR T细胞基本上非常适合治疗实体癌，特别是由于T细胞固有的迁移和组织穿透能力，穿透血脑屏障，并在几乎所有组织中积累，包括睾丸和眼睛等特权组织，因此特别适合消除（微）转移。然而，大多数实体肿瘤具有大量策略，以非常有效的方式对抗CAR T细胞的迁移、渗透和激活。其中，改变的趋化因子环境损害了CAR T细胞向肿瘤的迁移；肿瘤内皮细胞上丢失了一些粘附因子，妨碍了T细胞的渗透。通过局部沉积TNF-α可以对抗后者，它增加了血管粘附分子，如血管细胞粘附蛋白-1和内皮细胞上的细胞间粘附分子-2。靶向血管内皮生长因子（VEGF）受体-2或阻断迁移抑制因子如内皮素B受体也改善了内皮细胞粘附和/或T细胞的跨内皮迁移。在T细胞上下调的趋化因子受体被重新表达，如CXCR2（CXCL1受体），以便于靶向黑色素瘤或CCR2b用于靶向神经母细胞瘤。 表 2 CAR T细胞疗法面临众多挑战。 为了绕过迁移障碍，CAR T细胞被瘤内植入或分别注入胸膜或腹膜以治疗间皮瘤和卵巢癌。通过内窥镜将抗CEA CAR T细胞应用于肝转移；抗c-Met CAR T细胞被注入乳腺癌转移。一旦进入肿瘤病变，CAR T细胞需要突破基质细胞和细胞外基质的障碍，才能接近癌细胞以执行它们的细胞毒性攻击。通过基因工程释放的肝素酶在基质中降解肝素硫酸蛋白多糖，改善T细胞的渗透；需要高水平的IFN-γ来消除基质细胞并根除大型已建立的肿瘤病变。通过直接针对基质细胞的CAR T细胞特异性针对成纤维细胞激活蛋白（FAP），一种参与细胞外基质重塑的丝氨酸蛋白酶，整体抗肿瘤活性得到改善。 许多过程使肿瘤病变对重定向的CAR T细胞产生敌意，使它们变成耗竭状态或进入凋亡。调节性T（Treg）细胞、髓源性抑制细胞（MDSCs）和肿瘤相关M2型巨噬细胞释放抑制性细胞因子，如IL-4、IL-10、白血病抑制因子（LIF）和TGF-β。MDSCs和巨噬细胞降低肿瘤内色氨酸水平；基质细胞释放吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）和犬尿氨酸，抑制T细胞效应功能并剥夺组织中的葡萄糖和其他营养物质。严重的酸中毒也对抗肿瘤活性的CAR T细胞产生反作用。由于MDSCs释放的精氨酸酶，低精氨酸水平抑制CD3ζ表达和TCR信号传导。 12.CAR T细胞治疗与毒性相关 作为“活药”的CAR T细胞治疗在一些试验中取得了显著的治疗效果；然而，CAR T细胞在初始应用后的几天甚至几周内可能导致严重的副作用，需要重症监护干预，甚至可能致命。大多数毒性是由于CAR T细胞的特殊生物学特性，其他与CAR T细胞相关的毒性目前尚未完全理解。从机制上讲，主要毒性是(1)由于大量T细胞激活、细胞因子释放和肿瘤溶解引起的全身毒性，以及(2)由于CAR T细胞与健康组织相互作用引起的特异性毒性（“靶上非肿瘤”毒性）。 12.1.系统性毒性 细胞因子释放综合征（CRS）：大量CAR T细胞与目标细胞的结合导致大量细胞因子释放，血清中促炎细胞因子（包括IFN-γ和TNF-α、IL-10和IL-6）的水平异常高，这本身会导致其他免疫细胞的交叉激活，以及进一步的细胞因子释放，直至达到有毒水平。这些毒性被称为细胞因子释放综合征（CRS），临床上伴有高烧、不适、疲劳、肌肉痛、恶心、厌食、心动过速、低血压、毛细血管渗漏、心脏功能障碍、肾功能损害、肝功能衰竭和弥散性血管内凝血。CRS常与血管渗漏综合征（VLS）一起出现，与巨噬细胞激活综合征（MAS）和巨噬细胞激活密切相关，临床上类似于噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（HLH）。CRS的风险与T细胞激活和扩增有关，这可能与总体肿瘤负荷相关，但并非绝对。为了避免CRS，需要在肿瘤负荷高的患者中使用较低剂量的CAR T细胞，这是一个需要通过精确定义治疗窗口来解决的悖论，通过调整T细胞激活、细胞因子释放和抗肿瘤活性。 CRS的早期诊断和临床管理通过新建立的评分系统和治疗指南得到便利。C反应蛋白，即由肝细胞在IL-6水平增加时释放的蛋白质，目前作为CRS发作和严重程度的实验室标志物；成人的预测标志物还包括可溶性gp130（sgp130）、IFN-γ和IL-1Rα的增加，在儿科患者中，IFN-γ、IL-13和MIP1α的增加。目前CRS的治疗基于阻断IL-6/IL-6受体信号轴，通过阻断抗体如抗IL-6受体抗体tocilizumab或抗IL-6抗体siltuximab，这似乎不会干扰CAR T细胞的疗效。短期系统性皮质类固醇治疗也能迅速逆转CRS，且不影响最初的抗肿瘤反应；然而，它可能在长期内损害CAR T细胞反应。在CRS期间中和促炎细胞因子有助于减轻CRS的严重程度。在CRS期间，活化的单核细胞和/或巨噬细胞释放高水平的IL-1；通过IL-1受体拮抗剂中和可以改善临床模型中的CRS和神经毒性。通过给予lenzilumab抗体中和巨噬细胞-单核细胞激活细胞因子GM-CSF，降低了CRS的风险。通过阻断酪氨酸羟化酶减少儿茶酚胺，降低了小鼠模型中的细胞因子水平，暗示了临床干预的途径。 与CAR T细胞相关的HLH/MAS通常与CRS症状一起出现，伴有铁蛋白和肝酶血清水平升高、噬血细胞现象、细胞减少、肺水肿、脾肿大、肾功能衰竭和NK细胞丢失。治疗包括使用依托泊苷或阿糖胞苷进行系统性化疗，如果与神经毒性相关，也可以鞘内应用；在这种情况下，IL-6/IL-6R阻断大多无效。 神经毒性（ICANS）：CAR T细胞治疗相关的神经毒性现在被称为免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。神经系统效应包括失语症、幻觉、混乱、谵妄、表达性失语症、肌阵挛、谵妄、癫痫发作和脑水肿。这种神经毒性发生在大约40%的患者中，是可逆的，并且在CD19 CAR T细胞治疗期间频繁发生；其他CAR T细胞也可以引起神经毒性，指向由于活化CAR T细胞的浸润导致的弥漫性但暂时性脑病。神经毒性的机制尚不清楚，但与破坏血脑屏障和脑脊液中细胞因子水平增加有关。如果与CRS一起治疗，用IL-6阻断和类固醇治疗可以成功。 12.2.“靶上非肿瘤”毒性 由于大多数靶向抗原也由健康细胞表达，CAR T细胞治疗与攻击健康组织的风险相关，导致巨大的“靶上非肿瘤”毒性。治疗B细胞白血病的CD19靶向CAR T细胞也消除了健康的B细胞；持久的B细胞耗竭需要免疫球蛋白替代和抗生素及抗真菌保护，这在临床上是可管理的。当目标抗原由重要组织表达时，毒性更严重。在一项针对肾癌患者的碳酸酐酶IX特异性CAR T细胞治疗试验中，患者由于胆管上皮细胞上碳酸酐酶IX水平较低而出现肝毒性；通过预先给予阻断抗体，可以减少“非肿瘤”毒性的严重程度。避免“靶上非肿瘤”毒性的策略目前旨在增加肿瘤选择性，并以空间和时间的方式限制CAR活性。T细胞给药的替代途径可能是避免通过血液系统分布大量CAR T细胞的选项。通过内窥镜或胸膜内或腹膜内应用局部CAR T细胞给药，在肿瘤部位提供高剂量的CAR T细胞，并在一定程度上避免了非肿瘤毒性。然而，这种应用是有限的，因为在大多数情况下，肿瘤病变无法接触或肿瘤广泛扩散。 12.3.“靶外非肿瘤”毒性 大多数过去工程化的CAR在细胞外部分包含IgG1 CH2CH3结构域作为间隔区，这可能会与Fcγ受体（FcγR）（CD64）结合，从而激活NK细胞和巨噬细胞等先天细胞。尽管到目前为止在临床上并不突出，但理论上可以通过删除IgG1 CH2结构域或突变FcγR结合位点内的Asn297来减少风险。替代间隔区包括IgG4 Fc结构域或细胞外CD8结构域。 第三代曲妥珠单抗衍生的CAR T细胞靶向ErB2导致可能由于急性呼吸窘迫综合征和CRS导致的致命的心肺衰竭。同样，在用EGFR变体3特异性CAR T细胞和CEA特异性CAR T细胞治疗时记录了肺水肿，而没有直接证据表明CAR T细胞攻击肺上皮。由于使用针对同一目标的不同表位或传递不同信号的CAR可能产生显著不同的毒性，因此毒性概况更加复杂，例如，使用来自FRP5抗体的第二代ErB2 CAR的T细胞在肉瘤患者中并未诱导靶外非肿瘤毒性。 12.4.改善CRS的策略 基本上，当CRS在临床上显著时，需要对CAR T细胞进行下调或去激活；瞬时CAR表达、“关闭开关”和“自杀开关”是常用工具。 当存在严重CAR T细胞相关毒性的重大风险时，瞬时CAR表达可能有益。RNA转移产生瞬时表达的CAR。CAR在T细胞表面存在数天，并在目标细胞结合时介导有效的T细胞激活，然而，随着RNA降解和T细胞扩增时RNA稀释，CAR表达会下降。这种RNA修饰的T细胞在试验中显示出一些虽短暂但有效的效果。然而，由于CAR T细胞迅速清除，其缺点是短期效果。 然而，永久性修改的CAR T细胞需要在毒性不受控制的情况下主动消除这些细胞的策略。大剂量脉冲治疗类固醇在应用碳酸酐酶IX特异性CAR T细胞后停止了自身免疫。虽然这是非选择性地清除激活的T细胞，但可以通过特定靶向更有选择性地消除CAR T细胞。CAR结合域基本上也可以通过抗独特型抗体进行靶向，以诱导CAR T细胞的溶解性消除。通过给予识别细胞外CAR结构域中整合的表位的消耗性、FDA批准的抗体，也可以实现CAR T细胞的消耗。例子包括使用利妥昔单抗来消耗具有CD20表位或模拟表位的CAR T细胞，或使用西妥昔单抗来消耗具有EGFR表位的CAR T细胞。是否能够迅速实现足够的CAR T细胞清除以逆转正在进行的CRS，还有待在临床情况下证明。 诱导凋亡的CAR T细胞消除似乎是这种情况下更快速的解决方案。转基因脲酶-9（Cas9）与FKBP1A相连，在系统应用原本惰性的小分子AP1903后，会在工程化CAR T细胞中诱导凋亡，该分子促进二聚体化和激活诱导性Cas9（iCas9）。这种策略是有效的，因为供体T细胞介导的GvHD可以在实验系统中通过iCas9介导的T细胞凋亡在一小时内停止。 与其消除CAR T细胞，不如通过整合模块控制细胞表面的CAR。CAR被设计为融合蛋白，整合了一个自切割降解结构域，该结构域被可以被特定蛋白酶抑制剂特异性阻断的蛋白酶反向调节。在蛋白酶存在的情况下，产生的CAR融合蛋白从连接的降解结构域分离并表达在细胞表面；抑制蛋白酶导致CAR降解和缺乏表面表达。 CAR也可以通过添加酪氨酸激酶抑制剂dasatinib来降低其表达或调节其信号强度，该抑制剂可以迅速且可逆地阻断Lck激活；从而在小鼠模型中减少CRS的严重程度。该策略的好处是，只要存在dasatinib，CAR T细胞的信号强度就会减弱，但不会被清除；然而，该策略仍需临床验证。 需要进一步开发以降低细胞因子介导毒性风险的CAR。调节信号强度的一个关键是CAR共刺激。CD28-ζ CAR更快地诱导T细胞激活，并诱导更高的细胞因子释放、扩增和随后的耗竭，而4-1BB-ζ CAR则驱动较少的急性扩增，但具有较低的细胞因子水平，因此与严重CRS的风险较低。因此，4-1BB-ζ CAR可能更适用于肿瘤负荷和抗原密度高的患者，而CD28-ζ CAR可能需要用于肿瘤负荷低的情况。 降低CAR介导的T细胞激活的其他策略，例如，修改CD8跨膜和铰链区域，从而降低ICANS或高于1级CRS的风险。作为一种替代策略，“通用”CAR允许通过调整将CAR T细胞与目标细胞链接的适配器分子来动态控制T细胞激活。 13.CAR T细胞治疗的挑战 在过去的几年里，临床试验正致力于将CAR T细胞治疗确立为治疗几种类型的B细胞白血病和淋巴瘤；然而，在治疗其他恶性疾病的方面，仍然存在重大障碍。 13.1.如何选择最佳的肿瘤选择性抗原作为靶标？ 在CAR T细胞治疗中，肿瘤靶向的选择性对于长期兼容性至关重要。大多数可靶向的肿瘤相关抗原并不具有肿瘤选择性，这增加了CAR T细胞疗法中诱导靶上非肿瘤毒性的风险。肿瘤特异性的表面蛋白突变或肿瘤相关糖基化变体如Muc1或Muc16是罕见的。然而，有些抗原虽然由健康组织表达，但似乎是安全的靶标。例如，癌胚抗原（CEA，CD66e）严格表达在胃肠道和肺部健康上皮的腔面，而在癌细胞上以去极化方式表达。系统性应用CEA特异性CAR T细胞（NCT01212887, NCT02349724）和通过肝动脉输注局部给药的抗CEA CAR T细胞（NCT01373047）在减缓肿瘤进展的同时，并未诱发治疗相关结肠炎。其他如ErB2等抗原可能在高表达ErB2的肿瘤细胞被选择性靶向时是合适的靶标，同时保留中低表达的健康细胞。 为了增加肿瘤选择性，优先考虑靶向一组抗原模式而不是单一特定抗原。技术上，在同一T细胞中共表达两种具有不同特异性的CAR，以在两种CAR同时结合它们相应的抗原时仅诱导完全的T细胞激活；一种CAR提供主要信号，另一种CAR提供共刺激信号，从而仅在存在两种抗原的情况下补充完全T细胞激活所需的信号。该策略需要一个弱的主要信号，以避免在存在一种抗原的情况下进行一些基本的CAR T细胞激活，以及一个强的共刺激信号以驱动完全的T细胞激活。 为了在结合健康细胞时阻断CAR T细胞激活，与激活性CAR共表达具有细胞内PD-1或CTLA-4信号传导的抑制性CAR（iCAR）。iCAR识别健康细胞上存在但在癌细胞上不存在的抗原。因此，仅在结合缺乏iCAR识别的抗原的目标细胞时才发生CAR T细胞激活。 有些抗原在癌细胞上的表达水平高于健康细胞；“亲和力调节”CAR结合域可能有助于区分这两种组织。虽然在临床前模型中证明了可行性，但癌细胞可能通过下调相应抗原来逃避监视。亲和力调节的治疗窗口狭窄，因为增加亲和力可能导致识别健康细胞，如GD2特异性CAR在实验模型中诱发致命性脑炎。 13.2.如何优化CAR结构？ 目前临床评估中的大多数CAR基于近二十年前设计的原型CAR结构。临床前研究表明，对于每种抗原，特定CAR需要针对目标抗原表位、结合亲和力、间隔区长度以及信号传导和跨膜结构域等进行优化。由于各组分之间复杂的依赖性，目前无法预测特定抗原的最佳CAR组成。例如，结合亲和力和目标表位的位置为靶向高抗原负载的癌细胞同时保留低抗原负载的健康细胞提供了狭窄的亲和力窗口。 13.3.如何在CAR T细胞治疗后建立长期癌症控制？ 尽管在儿童B-ALL中可以高频率诱导完全缓解，但约40%的白血病患者在持续存在CAR T细胞的情况下仍然复发。多种原因导致复发频率高，包括整个CD19分子的丢失或表达缺乏目标外显子2的CD19异构体，从而使其对CAR T细胞不可见。在CD19 CAR治疗后，B-ALL的两个案例中通过转换为CD19阴性的髓系谱系丢失CD19。在这种情况下，靶向对癌细胞存活至关重要的抗原将是一个理想的策略。由于这样的抗原通常不可用，通过双特异性CAR共靶向第二种抗原（例如CD20或CD22）可能会增加对白血病细胞的治疗压力。在实体瘤中这种情况更为重要，因为它们在抗原表达上通常表现出深刻的异质性；在初始肿瘤消退后的早期肿瘤复发可能是由于选择抗原丢失的癌细胞。这些癌细胞可能以抗原非依赖性方式被先天免疫细胞反应识别和消除。为了吸引和激活先天细胞并启动更广泛的免疫反应，CAR T细胞在实验模型中被赋予了诱导释放转基因IL-12的能力，使抗肿瘤攻击更有效。有一些迹象表明，结合抗原依赖性和非依赖性免疫反应可能在长期内控制肿瘤。 13.4.哪种T细胞亚群提供长期肿瘤控制？ 临床前模型表明，具有增强扩增能力和长期持久性的原始或早期中央记忆T细胞是过继治疗最合适的细胞。沿着这条线，CD62L+记忆T细胞似乎表现出优越的性能。发现中央记忆干细胞（TSCMs），这是CD62L+中央记忆T细胞库的一部分，具有非凡的扩增潜力，激发了对这些细胞进行过继细胞治疗的探索。人们对识别和调节干细胞样T细胞形成和维持的因素和调控网络越来越感兴趣，因为这些细胞在过继转移到患者后似乎对长期治疗效果至关重要。另一种策略是基于预测性地诱导T细胞成熟。例如，4-1BB共刺激在年轻T细胞中启动中央记忆T细胞反应，这与CD28 CAR T细胞表现出更短暂的效应细胞反应形成对比。另一方面，更成熟的阶段的细胞在大多数肿瘤所在的外围显示出优先积累。然而，这些细胞需要不同的共刺激信号，即优先迁移到外围的CCR7− T细胞从联合CD28-OX40共刺激中受益。特定T细胞亚群的功能能力也可以通过与激酶抑制剂的联合治疗来调节；ibrutinib，一种布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂，降低了PD-1和CAR T细胞的耗竭，从而增加了持久性和抗肿瘤活性。 13.5.如何使CAR T细胞制造适应日益增长的患者数量？ 目前，大多数CAR T细胞由专门的GMP设施生产，冷冻并运送到患者的医院。生产越来越多的细胞产品将使当前程序达到极限，特别是当及时需要数千个自体细胞产品时。在医院内（半）自动化、完全控制和完全封闭系统的分散制造是解决这种情况的首选概念之一。这也将需要在制造过程中高度标准化，并避免血液和细胞产品运输中的复杂物流。作为另一种概念，一个高度专业化的、集中的生产设施，具有多个并行的自动化制造过程，可能作为患者细胞产品的区域供应商。 另一个限制是由患者自体T细胞治疗的需要设定的；对于每位患者来说，“通用”供体将使治疗在多个方面更容易。一个包含不同工程化CAR的“通用”供体T细胞产品库将在临床应用中提供更大的灵活性，根据患者的具体情况。此外，扩大生产规模将使更多的患者能够使用CAR T细胞产品。正在努力生成可以应用于众多患者的这种“通用”T细胞。这需要使CAR T细胞对宿主免疫细胞“隐形”，缺乏对患者健康组织的异体反应性，同时保留CAR介导的抗肿瘤活性。在这种情况下，通过基因组编辑技术获得的MHC缺陷、CAR修饰的病毒特异性T细胞和TCRα敲除T细胞，目前正在开发作为“现成的”或“第三方”细胞产品，GvHD风险低。CAR基因插入TCRα位点一步实现CAR的遗传工程和TCR表达的废除。编辑MHC I类以防止宿主识别和排斥供体T细胞可能通过NK细胞诱导消除，并不防止MHC II类介导的排斥。然而，目前探索的所有基因编辑程序在某种程度上都容易受到非目标修饰的影响，因此与意外的突变风险相关。该领域发展迅速，首次使用异体CAR T细胞治疗B细胞恶性肿瘤和实体瘤的试验已经启动。 13.6.如何平衡CAR T细胞的疗效和副作用？ 目前，一些CAR T细胞治疗与高风险的严重副作用相关，可能需要重症监护住院治疗。尽管各种CAR T细胞协议和治疗程序不同，并且没有在比较性的临床环境中进行评估，但一些临床管理规则变得明显。例如，CRS的早期诊断、分级和临床管理将标准化，建立共识的治疗方案。在毒性不受控制的情况下，可以通过各种手段选择性地和迅速地消除CAR T细胞。通过添加二聚体化剂AP1903二聚体化转基因诱导的脲酶-9（iCasp9），在30分钟内消除超过90%的T细胞。或者，通过给予针对CAR结构域或共表达表位的抗体，诱导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）清除循环中的CAR T细胞。免疫介导的CAR T细胞消除的缺陷仍然是，癌症患者的潜在功能障碍免疫系统可能通过ADCC消除CAR T细胞的能力有限。 13.7.我们是否需要针对每种癌症类型的特定预处理？ 在大多数试验中，患者在过继T细胞治疗前接受非清髓性淋巴细胞减少，使用氟达拉滨和环磷酰胺；这种预处理的理由是暂时提供“空间”和细胞因子，以实现转移的CAR T细胞在体内的充分扩增。淋巴细胞减少还通过免疫调节提供抗肿瘤效果，因为它耗尽抑制细胞，并在肿瘤破坏时释放肿瘤相关抗原到免疫系统。尽管目前的预处理方案基本上是有效的，但基本方案可能需要针对每种癌症实体进行调整。例如，用于治疗Her2+肿瘤的调节方案通过应用nab-紫杉醇来耗尽间质性基质，并促进Her2呈递，并通过应用环磷酰胺耗尽Treg和MDSC，用于胆道和胰腺癌的修改。另一方面，预处理在CAR T细胞治疗的背景下可能具有高度毒性，通过诱导脑水肿和神经系统毒性，特别是在最近的一项试验（NCT02535364）中观察到的氟达拉滨治疗后。 13.8.如何激活免疫网络以诱导广泛的炎症性抗肿瘤反应？ CAR T细胞作为“活药”，越来越成为在目标器官产生和释放生物活性化合物的“活工厂”。使用CAR T细胞作为工厂的合理性基于实验肿瘤模型的证据，即宿主免疫系统在肿瘤排斥中起着重要且必要的作用，这使得在目标肿瘤组织内产生免疫刺激性条件成为必要。释放IL-12的CAR T细胞（IL-12 TRUCKs）可以通过吸引和激活M1型巨噬细胞来在肿瘤组织中诱发免疫反应，这些巨噬细胞可以消除CAR T细胞未能识别的癌细胞。其他具有特定影响局部免疫环境的细胞因子也可以使用；释放IL-18的CAR T细胞增加了肿瘤相关CD206+ M1型巨噬细胞和NKG2D+ NK细胞的数量，并减少了如Treg细胞、CD103+树突细胞和M2型巨噬细胞等抑制细胞。目前正在试验中探索使用靶向PD-1的检查点阻断，以激活CAR T细胞和浸润性淋巴细胞（NCT02650999）；其他检查点的阻断或组合，以重新激活肿瘤内源性免疫细胞，同样值得进行临床探索。 14.CAR T细胞用于其他疾病的治疗 将T细胞激活重定向的CAR不仅限于靶向癌细胞，还可以用于靶向任何由目标抗原定义的细胞。通过抗Dsg3 CAR靶向记忆B细胞的CAR T细胞被设计用来消除导致天疱疮病理的细胞。通过识别MHC呈递的自身抗原的CAR T细胞靶向自反应性T细胞。CAR被工程化以靶向病毒感染的细胞，如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒和HIV感染的细胞。源自Dectin-1的CAR T细胞被用于破坏真菌Aspergillus的发芽。实验模型暗示，CAR重定向的Treg细胞可用于促进自身免疫疾病如结肠炎、过敏性哮喘和移植物抗宿主病的免疫耐受治疗，通过靶向HLA。最近，通过识别心脏成纤维细胞激活蛋白（FAP）的CAR T细胞靶向心脏纤维化，该蛋白在心肌损伤重塑时由心脏成纤维细胞高度表达。采用FAP特异性CAR的T细胞过继转移减少了心脏纤维化并恢复了小鼠的损伤后功能。该报告暗示CAR T细胞作为“活药”，在治疗目前疗法非常有限的心脏病中消除激活的心脏成纤维细胞。CAR T细胞用于治疗非恶性疾病其他应用的临床前开发正在进行中。 要点 采用嵌合抗原受体（CAR）重定向的T细胞的过继细胞治疗在某些血液学恶性肿瘤中取得了显著的治疗效果；然而，在其他疾病中的治疗效力仍然有限。 CAR是由结合域、跨膜域和细胞内信号传导域组成的模块化、重组的跨膜分子，用以激活工程化细胞。最佳分子设计需要通过变化组成域在每种情况下探索。 原型CAR设计可以通过使用各种靶向和信号传导元件进行修改，使CAR更加通用。此外，各种免疫细胞可以通过CAR重定向，提供方便的治疗细胞。 CAR T细胞治疗经常与毒性相关，这些毒性可以通过同时进行的治疗、改变CAR设计和靶向替代抗原来减少靶上非肿瘤毒性来减轻。 通过共同激活广泛的免疫反应、共同靶向肿瘤基质、癌症干细胞和其他与肿瘤相关的结构，可以提高CAR工程化免疫细胞的抗肿瘤效力。 生产CAR T细胞产品仍然具有挑战性，为所有患者提供个性化治疗；正在努力为广泛的患者群体制造异体细胞产品“现成”。 下章预告：抗体关键特性的改进 往期内容： 第二章：抗体：发现及特性的历史 第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞 第四章：抗体展示系统 第五章：转基因动物用于产生人类抗体 第六章：抗体在治疗、诊断和科学中的应用 第七章：双特异性抗体 第八章：抗体偶联药物 第九章：替代性结合框架：用于基础研究和治疗应用的多功能结合剂 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 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摘要:抗体-药物偶联物（ADCs）是由单克隆抗体（mAb）与小分子药物结合而成的复杂分子。抗体可以特异性地将细胞毒性剂引导至病变细胞，同时避免对健康组织造成伤害，从而显著提高治疗指数。本章描述了ADCs的多个方面，从ADCs的最初构想到关键发展、缺点以及目前有多种分子被批准用于治疗的情况。之后，我们将关注ADCs的关键组成部分，并描述用于ADCs的mAbs的特殊要求、作为ADC弹头应用的不同类型药物，以及连接mAb与药物的不同类别的连接子。此外，还将回顾用于将小分子连接到mAbs的偶联技术。文中包括了来自临床以及临床前开发和早期研究的多个例子，以说明每个部分描述的不同概念和分子机制。 1.ADCs简介 尽管过去几十年取得了巨大进步，但癌症治疗仍然是一个艰巨的任务。尤其是肿瘤的极大异质性以及开发能够选择性针对癌细胞而不影响健康组织的药物治疗是一个主要挑战。例如，传统化疗利用了大多数癌细胞快速分裂和增殖的事实。因此，干扰细胞分裂（有丝分裂）的细胞毒性化疗药物通常会导致肿瘤退缩。然而，一些正常的细胞类型，如骨髓或消化道中的细胞，也在快速分裂，因此对抗有丝分裂药物敏感，最终导致化疗期间观察到的常见副作用。因此，开发新癌症疗法的一个主要挑战是提高药物的治疗指数（TI）。TI反映了引起有益治疗效果的药物剂量与引起毒性的剂量之间的比率（图1）。换句话说，药物的TI不足意味着这种化合物无法在不引起不可接受的毒性的情况下根除肿瘤。专注于提高TI的下一代癌症疗法开发的学科是靶向癌症疗法领域。靶向癌症疗法是精准医疗的基石，旨在通过干扰肿瘤进展中涉及的特定分子靶标来阻断癌症的生长和扩散。在这个学科中，正在采用多种方法更具体地针对病变组织。例如，信号传导抑制剂干扰不适当的细胞信号传导，基因调节剂允许修改蛋白质表达水平，免疫疗法，抗体-药物偶联物（ADCs）等等。在本章中，我们希望关注ADCs（图2），它们结合了单克隆抗体的优越选择性和一些细胞毒性剂的高效力。ADCs的基本概念相当简单（图3）。前提是一个抗原，可以在分子基础上区分癌细胞和健康细胞。例如，这可能是在肿瘤细胞中高度上调的特定细胞表面受体。针对这种抗原的抗体可以作为高效细胞毒性剂的靶向载体。为了形成ADC，细胞毒性剂需要通过连接子与抗体共价连接，该连接子在循环中稳定，以避免过早释放毒素。在患者中给予ADC后，它遍布全身，一旦接近肿瘤，就会与细胞表面的抗原结合。然后，抗体-抗原复合物被细胞内化，并通过内源性细胞内运输途径定向到溶酶体。到达溶酶体后，ADC被降解，从而释放其有毒有效载荷。游离毒素然后可以结合其细胞内靶标，从而诱导凋亡并杀死癌细胞。在某些情况下，毒素可以离开癌细胞并作用于相邻的，理想情况下也是癌细胞。这个过程称为旁观者效应，其程度取决于应用的连接子和药物。另一方面，健康细胞主要被保留，因为抗体应该只与表达抗原的癌细胞结合并传递毒素。 图 1 治疗指数 (TI) 及其通过 ADC 改善的情况。治疗指数的特征是超过最大剂量会出现毒性（最大耐受剂量，MTD）和达到治疗效果所需的最低剂量（最小有效剂量，MED）。ADC 通过结合目标特异性单克隆抗体和强效有效载荷，同时增加 MTD 并降低 MED，从而最终提高治疗指数。 图2 ADC 的模块化设计和关键参数。ADC 由单克隆抗体、有效载荷和连接子组成。抗体作为偶联的有毒有效载荷的载体，介导特异性抗原结合以及长的血清半衰期。连接子确保在血清中具有高稳定性，但在细胞内有效释放有效载荷。 图3 ADC 作用模式的图解概览。当与癌症特异性表面受体（浅蓝色）结合后，产生的 ADC-受体复合物被内化并运输到内质网。虽然受体循环可以使 ADC 返回到表面，但预期的途径是内质体成熟为溶酶体。随后的溶酶体降解导致药物（红色）的释放，根据所使用的毒素类别，通过不同机制诱导细胞死亡：微管抑制剂与微管结合，DNA 损伤药物扩散到细胞核以诱导 DNA 损伤。根据连接子和药物的类型，细胞内释放的药物可以离开目标细胞并对相邻细胞也起作用（旁观者效应）。 2.ADC发展的里程碑 历史上，ADC的概念起源于Paul Ehrlich在1900年左右进行的工作（图4）。他设想了一种药物，像“魔法子弹”一样只伤害病变组织，同时保留健康细胞。Ehrlich在开发了一种选择性杀死引起昏睡病的寄生虫锥虫的染料后，能够证明他的概念。此外，Paul Ehrlich也是抗体发现的先驱之一，因此为ADC发展奠定了一些基石。然而，在20世纪初引入“魔法子弹”概念后，直到1980年代ADC的发展才缓慢推进。这主要归因于难以生产选择性抗体，因此几乎不可能获得大量特定抗体，可以作为ADC的基础。这一点在Georges Köhler和César Milstein在1975年报告他们的杂交瘤技术后发生了变化。从这一点开始，单克隆抗体的可用性不再是问题，为治疗性抗体以及ADC铺平了道路。Muromonab-CD3（OKT3®）是第一种治疗性单克隆抗体，于1986年被食品药品监督管理局（FDA）批准为免疫抑制药物。然而，由于Muromonab-CD3是一种小鼠抗体，其治疗应用与较高的免疫原性风险相关。因此，患者在接受治疗一段时间后通常会发展出抗药物抗体（ADAs），使他们对这种药物产生抗性。然而，重组DNA技术允许生产嵌合体，以及在后期，人源化抗体，从而可以大幅减少免疫原性问题。这些技术进步最终导致了第一种mAb（利妥昔单抗）在1997年被批准用于治疗癌症。利妥昔单抗是一种嵌合抗体，与大多数B细胞淋巴瘤表面表达的CD20结合。由于抗体是ADC的一个组成部分，抗体领域的技术进步也意味着ADC领域的进步，上述里程碑对ADC的发展做出了重大贡献。 图4 从 1900 年首次构想到 7 种获批 ADC 的 ADC 发展里程碑。 除了抗体，ADC的另一个重要组成部分显然是附着在其上的细胞毒性有效载荷。一些最早研究的ADCs包含了众所周知的具有极高效力的化疗药物，如甲氨蝶呤、阿霉素或长春碱。这些药物通过本章稍后将详细讨论的不同连接子类型和偶联技术与抗体偶联。然而，在小鼠中进行的人体肿瘤异种移植研究中，第一代偶联物的体内评估显示出比相应的未偶联药物更优越的抗肿瘤活性。受到这些数据的鼓舞，启动了两项临床I期试验，使用基于小鼠KS1/4抗体与甲氨蝶呤偶联的ADC。不幸的是，在这些研究中未能观察到令人信服的治疗效果，最终导致这些研究的终止。失败的一个原因归因于对小鼠mAb产生ADAs，导致ADC的快速清除。更成功的是抗体阿霉素偶联物BR-96-Dox，它进入了治疗转移性乳腺癌的II期临床试验。然而，这种偶联物也没有显示出显著的治疗效果，因此停止了进一步的开发。第一代偶联物的缺乏成功抑制了对ADCs的初步兴奋，虽然在1990年代FDA批准了七种mAbs，但第一个ADC的批准却迟迟未来。最终，随着gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®)在2000年获得FDA批准用于治疗急性髓细胞性白血病（AML），第一个ADC获得了FDA的批准。gemtuzumab ozogamicin的基础是gemtuzumab，这是一种针对髓系细胞表达的跨膜受体CD33的人源化IgG4型抗体。作为细胞毒性有效载荷的是calicheamicin，一种高效的DNA损伤剂。不幸的是，由于缺乏对患者的益处，gemtuzumab ozogamicin在2010年被撤出市场。尽管如此，它是ADC发展史上的一个里程碑，最终，由于推荐剂量降低和不同的剂量计划导致风险-效益比改善，gemtuzumab ozogamicin在2017年重新获得批准。ADC作为治疗药物的真正突破随着2011年brentuximab vedotin (Adcetris®)和2013年trastuzumab emtansine (Kadcyla®)的批准而来。这两种ADC为整个领域带来了全新的动力，导致许多不同公司的开发活动，新技术的兴起和多项人类临床试验。我们将在本章中回顾这些下一代技术和发展。对ADCs来说，2019年尤其令人兴奋，因为随着brentuximab vedotin和trastuzumab emtansine的批准，最终有三项晚期临床试验成功结束，并获得三项ADC的批准。今天市场上总共有七种ADC（这里列出了国际非专利名称(INN)，随后是商品名，批准年份和公司）：gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®, 2001/2017, Pfizer/Wyeth)，brentuximab vedotin (Adcetris®, 2011, Seattle Genetics/Millennium)，trastuzumab emtansine (Kadcyla®, 2013, Genentech/Roche)，inotuzumab ozogamicin (Besponsa®, 2017, Pfizer/Wyeth)，polatuzumab vedotin-piiq (Polivy®, 2019, Genentech/Roche)，enfortumab vedotin-ejfv (Padcev®, 2019, Astellas/Seattle Genetics)，和trastuzumab deruxtecan (Enhertu®, 2019, Daiichi Sankyo/AstraZeneca)。这些ADCs的关键参数在表1中描述，接下来的部分将引用其中的一些。 表 1 2020 年初获批用于治疗的 ADC 的关键参数 3.ADCs使用的靶标和抗体 ADC的设计是一项跨学科的努力，因为它们由大型生物技术生产的生物分子和化学合成的高效小分子药物组成。这两种实体分别生产，然后结合成一个高度复杂的混合分子。因此，从设计各个组成部分到最终生产偶联物的整个ADC开发过程伴随着巨大的技术挑战。第一道障碍是确定适合ADC方法的靶标。该靶标应允许通过肿瘤特异性靶标过表达或通过其他机制（如肿瘤细胞上突变蛋白变体的专有呈现）来区分癌细胞和健康组织。它也应该对抗体可接近，这基本上限制了空间到细胞外靶标。此外，靶标在ADC结合后的快速内化对于达到细胞内细胞毒性剂的关键浓度很重要。一个符合这些标准的靶标示例是CD30。CD30是激活的T和B细胞呈现的受体，在癌细胞上表现出高、均匀的表达，在正常组织中表达低，并且在抗体结合后迅速内化。针对CD30的单克隆抗体是brentuximab vedotin (Adcetris®)的基础，这是一种用于治疗复发或难治性霍奇金淋巴瘤（HL）和系统性间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）的ADC。相反，并非每个ADC靶标都必须满足所有这些标准。trastuzumab emtansine (Kadcyla®)的靶标HER2在乳腺癌组织中表达水平高，并且在抗体结合后迅速内化。然而，它也在其他组织中表达，如皮肤、心脏、胃肠道（GI）、呼吸、生殖和泌尿道。尽管如此，ADC仍然具有良好的耐受性，因为健康细胞上的HER2表达量远低于癌细胞。抗体是ADC的第二个关键组成部分，因为它代表了整个分子的靶向和药代动力学（PK）的主要决定因素。因此，mAb应该具有高亲和力和选择性地结合其靶标，以确保细胞毒性弹头被传递到正确的细胞。然而，抗体不仅与抗原结合，还与多种Fc受体进行额外的多种相互作用。特别重要的是与新生儿Fc受体（FcRn）的结合，使抗体受到一种称为FcRn循环的机制的影响。这个过程导致抗体的半衰期显著改善，除了高分子量外，也是抗体非凡长血清半衰期的主要原因之一。考虑到小分子细胞毒性剂通常只表现出几个小时的半衰期，对于ADCs来说，保持FcRn结合是非常理想的，因为与抗体的结合可以将毒素的半衰期延长到几天甚至几周。因此，必须特别注意不要通过例如细胞毒性剂的偶联来损害mAb-FcRn相互作用。一些工程方法甚至旨在增强FcRn相互作用，以进一步改善抗体的PK特性。除了FcRn受体外，还存在许多其他Fc受体类别，它们负责Fc效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）。尽管这些机制通常有助于mAbs的治疗效果，但与这些受体的相互作用可能对ADC方法不利。这些次要免疫功能的参与可能会意外地减少偶联物在肿瘤中的定位或增加健康细胞对表达Fc受体的ADC的摄取。因此，用于gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®)的mAb属于IgG4亚类，没有ADCC或CDC活性，而通常用于治疗性抗体的免疫活性IgG1亚类。因此，使用效应沉默的抗体亚类可能是一个有效的策略，或者进行旨在避免上述问题的抗体工程。 4.ADC细胞毒性有效载荷 ADC最终产生治疗效果的元素是偶联的细胞毒性剂，通常被称为“有效载荷”或“弹头”。到目前为止，已有多种分子类别在ADC环境中证明是成功的，还有更多具有巨大潜力的分子正在研究中。今天用作ADC有效载荷的一些毒素，如美登素、奥瑞他汀和卡利霉素，是因为它们极高的效力而被发现，这使它们成为可能的新抗癌药物的非常吸引人的选择。然而，这些毒素的治疗指数不利，实现抗癌效果所需的剂量伴随着严重的毒性，最终排除了它们作为独立抗癌药物的进一步开发。然而，随着ADC的出现，这些毒素的治疗应用经历了复兴。今天正在开发的大多数ADC携带细胞毒性有效载荷，但值得一提的是，最近的方法也利用了其他药物，如免疫刺激性有效载荷或抗生素。在接下来的部分中，我们将关注不同类别的细胞毒性ADC有效载荷，并仔细看看已经作为目前批准的ADC组成部分取得最终成功的有效载荷。 美登素是一种从非洲灌木美登斯树皮中分离出来的安莎霉素大环内酯。它是一种非常强效的抗有丝分裂药物，通过抑制微管聚合从而在G2/M阶段阻止细胞周期，最终通过凋亡导致细胞死亡。美登素及其衍生物，美登素类，在低皮摩尔浓度范围内对不同的癌细胞系显示出强烈的体外活性。这些化合物最常见的剂量限制性毒性是神经毒性、呕吐和恶心。然而，最初分离的美登素结构并不适合与抗体共价连接。因此，必须开发允许与mAb偶联的衍生物。这些活动中产生的一个化合物是DM1（图5），最终用于曲妥珠单抗emtansine（Kadcyla®）的有效载荷。有趣的是，将DM1作为ADC组成部分使用，将其最大耐受剂量（MTD）至少提高了一倍，证实了将细胞毒性剂纳入ADC可以改善治疗指数的概念。 图 5 DM1 的化学结构，DM1 是曲妥珠单抗艾美汀（trastuzumab emtansine）所使用的有效载荷。 奥瑞他汀是肽基分子，其中第一个描述的这类剂，多拉司他丁10，是从海蛞蝓Dolabella auricularia中分离出来的。奥瑞他汀抑制微管聚合并抑制依赖于微管的鸟苷-50-三磷酸（GTP）水解。这导致有丝分裂受到干扰，最终导致细胞周期在G2/M阶段停止，最终导致细胞死亡。奥瑞他汀最常见的剂量限制性毒性是周围神经病变（PN）、疲劳、恶心和腹泻。 今天，主要使用两种多拉司他丁10类似物，即单甲基奥瑞他汀E（MMAE）（图6）和单甲基奥瑞他汀F（MMAF）作为ADC有效载荷。然而，到目前为止，只有含有MMAE作为活性药物的ADC被批准用于治疗，即brentuximab vedotin (Adcetris®)、polatuzumab vedotin-piiq (Polivy®)和enfortumab vedotin-ejfv (Padcev®)。 图 6 单甲基奥瑞他汀 E（MMAE）的化学结构，它是 Brentuximab Vedotin、Polatuzumab Vedotin 和 Enfortumab Vedotin 中的细胞毒性成分。 卡利霉素是含有内炔的抗癌抗生素，具有特殊的结构元素，如甲基三硫化物基团和糖基化的羟基氨基糖。它们最初是从Micromonospora echinospora calichensis中分离出来的，显示出非凡的高抗肿瘤活性。例如，卡利霉素γ1I在小鼠肿瘤中显示出抗肿瘤活性，剂量低至0.5-1.5 μg/kg。卡利霉素构成gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®)和inotuzumab ozogamicin (Besponsa®)的有效载荷（图7），其中它通过酸敏感连接子与mAb共价连接。它是一种非常强效的DNA损伤剂，与DNA次要沟中的特定区域结合，在那里它诱导双链断裂，最终导致凋亡和细胞死亡。卡利霉素最常见的剂量限制性毒性包括血小板减少症和中性粒细胞减少症。 图7 在临床上批准的 ADC 药物吉妥珠单抗奥扎米星（gemtuzumab ozogamicin）和伊诺珠单抗奥扎米星（inotuzumab ozogamicin）中发现的卡利切阿霉素（calicheamicin）的化学结构。 喜树碱是一种五环喹啉酮碱，最初从亚洲树喜树中分离出来。它抑制DNA拓扑异构酶I，从而有效阻止S期的DNA复制，最终导致肿瘤细胞的凋亡细胞死亡。然而，最初的化合物因水溶性差和在生理条件下其内酯转化为无活性的羧酸形式而受到影响。因此，进行了许多旨在改善喜树碱特性的活动。这些努力导致了拓扑替康和伊立替康的开发，它们已被FDA批准为抗癌药物。喜树碱的另一个重要衍生物是取代的exatecan Dxd（图8），它是用于曲妥珠单抗deruxtecan (Enhertu®)的有效载荷。在喜树碱治疗期间观察到的最严重的副作用包括中性粒细胞减少症和白细胞减少症。 图 8 已批准的 ADC 药物曲妥珠单抗德鲁替康（trastuzumab deruxtecan）中 Dxd 的化学结构。 5.ADC连接子 根据“抗体-药物偶联物”这个术语，ADC的主要成分是药物和抗体。然而，要将这两种实体偶联起来，需要一个连接子，将mAb与药物（图9）连接起来。仔细选择这种连接子，同时考虑mAb和有效载荷，对于最终ADC的效力和安全性至关重要。在血液中，连接子应尽可能稳定，以防止过早释放有效载荷，否则可能导致系统性非靶向毒性。但是一旦ADC到达目标细胞，有效载荷必须在不受到连接子的阻碍下活跃。此外，连接子的长度和化学性质可以对ADC的药代动力学和药效动力学产生强烈影响。 图9 ADC 连接子的图解说明。ADC 连接子通过共价键将细胞毒性有效载荷与抗体连接起来，通常与有效载荷一起合成，形成结合的连接子-有效载荷结构。所有连接子都携带一个反应性基团，使其能够与抗体偶联。许多连接子还包含一个切割位点，这允许在目标细胞内改善有效载荷的释放。一些切割机制需要一个额外的自消除模块，以确保有效载荷的无痕释放。 用于ADC的连接子主要分为不可切割和可切割两类。不可切割连接子在循环和细胞中都稳定，而可切割连接子设计为在目标细胞内被特定的细胞内机制降解。下面描述的连接子的示意图在图10中描述。 图 10 常用 ADC 连接子概览。ADC 连接子可以分为两类：不可切割（上部）和可切割（下部）连接子。通过可切割连接子从 ADC 中释放的有效载荷仍然与用于连接子-有效载荷连接的氨基酸相连。可切割连接子通过酶或化学环境降解。卡特普辛 B 连接子包含肽序列（例如，缬氨酸-瓜氨酸），而葡萄糖醛酸酶连接子包含葡萄糖醛酸。两者都与自消除的 PABC 模块结合，这使得药物可以无痕释放。酸敏感连接子和二硫键连接子分别通过酸性和还原条件降解。 使用不可切割连接子的ADC的释放依赖于抗体被完全蛋白水解降解为其组成的氨基酸。因此，最终释放的药物代谢物仍然连接到它们最初偶联的连接子和氨基酸（例如，赖氨酸或半胱氨酸）。这种修饰可能会干扰细胞毒性药物的活性，因此不可切割连接子只与作为氨基酸加合物仍然活跃的药物结合。此外，由于氨基酸的电荷，这些加合物相当亲水，导致膜透性降低，从而降低了旁观者活性。另一方面，不可切割连接子在循环中非常稳定，从而降低了意外药物释放的风险。一个带有不可切割连接子的ADC的突出例子是曲妥珠单抗emtansine (Kadcyla®)。在这里，弹头通过不可切割的硫醚键连接到mAb，产生DM1-赖氨酸加合物作为最终释放的活性药物。 可切割连接子旨在在肿瘤部位特异性释放药物，最好只在癌细胞内。理想情况下，这种释放是无痕的，使药物没有任何残留的取代基，如连接子或氨基酸的部分，这在许多情况下也有助于改善旁观者效应。典型的切割机制通常利用循环和细胞内区间不同的因素，主要是化学环境或特定的细胞内酶。 一类依赖于化学环境变化触发的切割的连接子是含有腙键的连接子系统。这些连接子被设计为在血液的中性pH下稳定，但在酸性环境中水解。正如前面已经描述的，ADCs的内化通常导致运输到内涵体和溶酶体区间。这些区间呈现出越来越酸性的环境（pH < 5），最终触发药物的释放。尽管这种类型的连接子已与非特异性药物释放相关联，但成功的应用证明了其功能性。实际上，gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®)和inotuzumab ozogamicin (Besponsa®)都依赖于pH敏感的腙键连接子。 含有二硫键的连接子是另一类化学可切割的连接子。这些连接子的好处在于，细胞内区间通常比血液中更具还原性。细胞内区间的还原环境是由谷胱甘肽（1-10 mM）和还原酶的浓度升高创造的，与循环相比（< 5 μM）。值得注意的是，作为对实体瘤中发现的低氧水平的响应，这些效应在癌细胞中可能更加明显。因此，含有二硫键的连接子主要在肿瘤细胞的细胞内空间释放药物。通过在二硫键旁边引入空间位阻取代基，可以微调这些连接子的稳定性，以进一步防止过早的药物释放。 肽连接子旨在通过选择性酶促切割释放药物。由于血液中的蛋白水解活性较低，这些连接子在循环中可以非常稳定，而它们在内化后被溶酶体蛋白酶如半胱氨酸蛋白酶切割。一个经常应用的肽连接子包括二肽基序缬氨酸-瓜氨酸（Val-Cit），在溶酶体中迅速水解。它最初是为半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸蛋白酶B的有选择性切割而设计的，但已显示药物释放也可以由其他蛋白酶触发。进一步成功应用的肽基序是Val-Ala或Gly-Gly-Phe-Gly；后者用于曲妥珠单抗deruxtecan (Enhertu®)。这类连接子-药物经常应用的一个是由Val-Cit肽通过自毁性的对氨基苯甲氧羰基（PABC）间隔物连接到药物MMAE。已经显示取代基可以大幅降低MMAE的效力。因此，已经做出了很多努力来开发这种允许无痕释放MMAE的连接子系统：Val-Cit的蛋白水解切割创造了一个PABC-MMAE中间体，随后PABC部分的自毁，从而释放未修饰的药物。然后MMAE可以在相同细胞内活跃，或者扩散到邻近细胞并引起旁观者效应。这种连接子-药物是brentuximab vedotin (Adcetris®)、polatuzumab vedotin-piiq (Polivy®)和enfortumab vedotin-ejfv (Padcev®)的一部分。 β-葡萄糖醛酸酶可切割连接子代表了另一类酶可切割连接子。β-葡萄糖醛酸酶在溶酶体中大量存在，但也在一些肿瘤中过表达。它选择性地水解带有β-葡萄糖醛酸作为核心单元的连接子的糖苷键，从而触发自毁机制，确保未修饰的有效载荷的释放。有趣的是，由于β-葡萄糖醛酸作为不可分割的一部分，这些连接子更亲水，并允许部署通常会影响ADC的生物物理性质的异常疏水药物。 除了确保药物释放的切割位点外，还开发了额外的连接子组件以产生具有改进属性的ADC。特别是，追求了亲水连接子的概念，类似于β-葡萄糖醛酸连接子，作为可溶性增强剂掩盖有效载荷的疏水性。为此，将非带电聚合物（例如，基于多聚乙醛或聚乙二醇）或带负电的基团（例如，磺酸盐）整合到连接子结构中。有趣的是，这些修饰对ADC稳定性产生积极影响，允许更高的细胞毒素载荷，并导致具有改进的药代动力学和改进的治疗指数的ADC。 6.ADC生成的偶联技术 虽然ADC的三个部分——抗体、连接子和细胞毒性有效载荷——决定了最终偶联物的关键属性，但同样重要的参数是这些组件的组装方式。连接子和有效载荷是通过化学合成产生的，要么作为直接偶联到mAb的联合连接子-有效载荷结构，要么作为在ADC生成期间依次组装的单独组件。 在这两种情况下，都需要将小分子偶联到mAb上，而不影响其有利属性，这是一个主要的技术挑战。在ADC生成过程中需要控制的主要参数是每个抗体偶联的连接子-药物数量，称为药物-抗体比率（DAR），以及结构附着在抗体表面的位点（偶联位点）。这两个参数可以决定性地影响ADC的几个属性，包括其稳定性和药代动力学行为，最终也影响其毒性和效力概况。一方面，用于ADC的弹头大多是疏水性的，DAR的增加可以显著改变整体疏水性，并严重干扰最终偶联物的蛋白稳定性。另一方面，根据其效力，需要一定量的药物，以达到足够活跃的ADC。然而，不仅DAR，而且偶联位点和化学也严重影响这些参数。例如，一些研究表明，某些位点对具有挑战性的有效载荷表现出优越的耐受性，并通过在抗体表面提供有利的微环境和空间屏蔽，比其他位点产生更稳定的偶联物。因此，找到连接子、药物和mAb的有利组合以及合适的DAR、偶联策略和偶联位点对于开发高效安全的治疗药物至关重要。以下，我们将回顾ADC生成的最成熟的偶联策略，并描述一些目前正在开发中的技术。图11提供了这些技术的图形概述。 图11 用于 ADC 生成的偶联技术。传统方法依赖于非工程化抗体的表面赖氨酸或铰链半胱氨酸的修饰，但通常会产生相当异质的产品（除了使用耗尽半胱氨酸偶联的偶联物）。为了增加 ADC 的均质性，已经开发了几种位点特异性偶联策略。重组抗体工程允许引入半胱氨酸（“硫代抗体”）或作为连接子-有效载荷附着位点的非天然氨基酸。同样，遗传引入的肽标签可以通过不同的酶进行修饰，例如，Sortase A、甲酰甘氨酸生成酶或微生物转谷氨酰胺酶（MTG）。相比之下，最近的方法旨在对非工程化的天然单克隆抗体进行位点特异性偶联。通过预定位赖氨酸反应基团可以实现区域选择性赖氨酸偶联。此外，去除 mAb 糖蛋白允许 MTG 介导的偶联，而重塑的糖蛋白本身可以作为附着位点。 抗体是携带大量化学基团的大分子，这使得以目标化的方式偶联连接子-药物变得困难。根据预期的偶联化学，连接子-药物在化学合成期间就需要装备所需的化学基团和结构。传统上，偶联是使用经典的蛋白质化学方法进行的，这些方法针对赖氨酸或半胱氨酸残基的侧链——这些氨基酸自然存在于每一个mAb中。赖氨酸残基在mAb表面大量存在，至少有40个可供偶联。对于赖氨酸偶联，连接子通常配备有N-羟基琥珀酰亚胺酯，与赖氨酸的ε-氨基集团反应形成稳定的酰胺键。遵循这种方法生产的几种ADC（例如，gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®)）已经上市，证明了这是一种可行的策略，可以产生有效的分子。然而，由于分布在整个mAb表面的可接近赖氨酸残基数量众多，这种方法产生了含有不同DAR和附着位点的大量ADC物种的异质混合物。这些物种在几个方面（例如，效力、毒性、聚集和稳定性）具有不同的特征。此外，可接近的赖氨酸理论上甚至可以位于mAb的功能区域，偶联可能会影响关键属性，如对目标的亲和力或mAb特异性受体。 与针对赖氨酸残基不同，连接子-有效载荷通常偶联到mAb的半胱氨酸残基。半胱氨酸比赖氨酸少得多，通常不易于偶联，大大减少了理论上的偶联位点数量。实际上，IgG类型的mAbs包含32个保守的半胱氨酸，形成每个12个结构域内特征性二硫键以及连接mAb链的铰链区域的4个键。传统的半胱氨酸偶联，如基于马来酰亚胺的Michael加成，针对的是半胱氨酸侧链的硫醇基，当硫醇基被二硫键困住时不具反应性。因此，与mAb半胱氨酸的偶联需要二硫键还原，以产生与马来酰亚胺功能化连接子偶联的反应性硫醇。有趣的是，温和的还原条件允许仅还原IgGs的铰链间二硫键，从而将偶联位点数量限制为8个。尽管这个过程部分去除了共价链间连接，但最终的ADC通过非共价相互作用足够稳定。几种半胱氨酸偶联ADC的批准，如brentuximab vedotin (Adcetris®)，以及正在进行的几项临床研究证实了这一过程产生的ADC的完整性和效力。 尽管针对半胱氨酸的偶联位点数量减少导致比赖氨酸偶联更少的异质ADC，但产品通常仍然是由于预期的DAR在大多数情况下低于8，因此仍然是随机混合物。Trastuzumab deruxtecan (Enhertu®)是一个例外，它通过完全装载所有链间半胱氨酸来生产，产生DAR接近8的均匀偶联物。此外，由于天然半胱氨酸在mAb内固定位置，因此没有偶联位点的选择。然而，几项出版物表明，偶联位点可以对ADC稳定性和体内特性产生巨大影响，链间半胱氨酸不一定是最佳选择。因此，已经开发了几种下一代偶联技术，允许将连接子-药物精确地附着到选定位置，从而产生量身定制的均匀ADC。 一种经常应用的位点特异性技术也基于半胱氨酸，但这种情况下半胱氨酸是通过重组工程放置到mAb一级结构中的。表达后，这些mAbs（通常称为“硫醇mAb”）在预期位置将工程化半胱氨酸作为mAb序列的一部分。不幸的是，表达介质中的硫醇基化合物与这些工程化半胱氨酸形成二硫键，从而阻止了直接偶联。为了去除这些硫醇帽并启用偶联，mAbs必须被还原，这不仅去除了帽子，也打开了链间二硫键。因此，在随后的步骤中，链间二硫键被重新氧化，留下工程化半胱氨酸作为唯一的游离硫醇。然后，这种预处理的mAbs与例如马来酰亚胺连接子-有效载荷偶联，这些连接子-有效载荷专门与工程化半胱氨酸残基反应。 与链间和工程化半胱氨酸的偶联通常使用马来酰亚胺功能化连接子进行。然而，几项研究表明，在马来酰亚胺偶联期间形成的硫代琥珀酰亚胺键可能因经历逆Michael加成或其他硫醇交换反应而遭受不稳定性，导致连接子-有效载荷过早释放。这种不稳定性的程度强烈依赖于偶联位点的微环境。因此，大量工作投入到寻找工程化半胱氨酸的完美位置。几个确定的位置不仅允许生产均匀的ADC，而且在偶联物稳定性和药代动力学行为方面也带来了额外的有利属性。作为替代方案，已经描述了几种稳定马来酰亚胺衍生偶联物的策略以及允许形成更稳定产品的替代硫醇化学。 除了与工程化半胱氨酸的偶联外，还存在多种位点特异性ADC生成技术，其中几种依赖于形成键的酶。一个突出的例子是细菌酶微生物转谷氨酰胺酶（MTG），它自然催化谷氨酸和赖氨酸残基之间形成异肽键。尽管IgG抗体在其一级结构中有几个谷氨酸和赖氨酸残基，但通常没有这些被MTG修饰。然而，已经开发了允许高效和位点特异性MTG驱动的ADC生成的策略。最常用的策略依赖于两个原则之一：首先，可以通过重组技术将包含谷氨酸残基的某些肽标签（例如，LLQG）插入到抗体序列中。这些标签随后可以被MTG识别，MTG专门将连接子-有效载荷偶联到肽标签谷氨酸。其次，通过酶促裂解或基因工程从297位点（欧盟编号）去除保守的IgG N-糖蛋白（要么通过酶促裂解或基因工程），暴露相邻的谷氨酸Q295。一旦去除糖蛋白，这个残基就成为一个非常好的MTG底物。在这两种情况下，连接子必须配备有主要氨基集团，将其标记为酶的底物。这两种策略都已成功应用于生产具有良好体内特性的均匀ADC。 与去除保守的N-糖蛋白用于MTG偶联不同，它们本身可以作为连接子-药物附着位点。为此，现有的糖蛋白可以通过化学氧化进行修饰，以允许随后的连接子-药物偶联。或者，糖蛋白可以在重组mAb表达期间通过代谢工程或翻译后使用糖蛋白修饰酶进行重塑。这两种方法最终都产生带有糖蛋白衍生结构的mAbs，这些结构配备了反应性基团。这些基团作为特定连接子-药物偶联的锚点。通常选择的反应性基团来自不断增长的生物正交化学工具箱。ADC的常见选择是叠氮基团，它们可以与紧张的炔烃在无铜点击化学中轻松反应。因此，功能化有这种炔烃的连接子-药物与引入到mAb糖蛋白的叠氮锚点特异性反应。 其他基于引入非天然氨基酸（UAA）的位点特异性ADC生成技术。这些氨基酸不是自然编码的蛋白质氨基酸的一部分，因此不会出现在蛋白质中。然而，扩展遗传密码允许在重组mAb表达期间精确地将UAA并入选定位置。这通常是通过使用一组特定的工程tRNA和tRNA合成酶以及合适的正交表达系统来实现的。与前述重塑的糖蛋白类似，UAA可以配备生物正交反应性基团（例如，叠氮基团），作为连接子-药物的附着位点。 除了描述的技术外，还开发了多种位点特异性ADC生成策略。例如，几种方法依赖于修饰mAbs的酶，这些酶要么在翻译过程中要么在翻译后进行。与MTG类似，这些酶（例如，Sortase A、甲酰甘氨酸生成酶或磷酸泛酰转移酶）识别必须在表达前工程化到mAb序列中特定的氨基酸序列。就像其他描述的方法一样，这些过程可以生成在体外和体内都具有优异特性的ADC。然而，大多数位点特异性生成技术要求操纵mAb序列或糖蛋白。尽管这不一定是主要问题，但它确实存在某些风险（例如，免疫原性），并且需要工程化mAb序列，从而排除了已经批准的具有既定GMP生产过程的抗体。因此，一些研究小组正在寻找允许在不需要序列或糖蛋白修饰的情况下与天然mAb进行位点特异性偶联的方法。例如，一种技术利用亲和肽预先定位胺反应性基团到特定的赖氨酸残基，从而限制在这些位置的偶联。其他研究小组在半胱氨酸偶联期间重新桥接铰链半胱氨酸残基，或工程化MTG变体，允许在不需要肽标签或去除mAb糖蛋白的情况下偶联天然mAb。 总结，有大量不同的ADC生产偶联策略可用，并且正在开发更多技术。目前批准的ADC是通过经典的半胱氨酸或赖氨酸偶联方法生产的，这些方法大多产生异质产品。多个临床前研究表明，位点特异性偶联方法定制的ADC具有更优越的行为，并且其中一些ADC目前正在临床试验中进行研究。然而，将临床前数据转化为有益的治疗效应仍有待证明。偶联策略的选择取决于几个因素，包括连接子、药物和预期的DAR。因此，每种偶联技术都有其各自的优缺点，并且必须考虑多个因素来为每个ADC单独选择合适的偶联策略。 要点信息 ADC由单克隆抗体、连接子和细胞毒性有效载荷组成。 抗体特异性和药物效力的结合导致治疗指数的提高。 目标抗原需要对癌细胞具有特异性，并且在ADC结合后通常发生内化。 抗体介导对目标抗原的高特异性有利的药代动力学。 大多数ADC有效载荷是微管抑制剂或DNA损伤剂。 连接mAb与药物的连接子可以是不可切割的或可切割的。 可切割连接子在目标细胞内通过化学或酶促机制降解以释放药物。 目前批准的ADC是通过经典偶联方法生产的，这些方法大多产生异质产品。 几种最近开发的位点特异性偶联技术能够生成均匀的ADC。 下章预告：替代性结合框架：用于基础研究和治疗应用的多功能结合剂 往期内容： 第二章：抗体：发现及特性的历史 第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞 第四章：抗体展示系统 第五章：转基因动物用于产生人类抗体 第六章：抗体在治疗、诊断和科学中的应用 第七章：双特异性抗体 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。