PRMT4

2024年4月4日，叶飞教授等人在Journal of Medicinal Chemistry上发表题为“Development of (2-(Benzyloxy)phenyl)methanamine Derivatives as Potent and Selective Inhibitors of CARM1 for the Treatment of Melanoma”的文章。在这篇文章中，作者等人设计了一系列高效和高选择性的CARM1抑制剂；其中，化合物17e展现出非凡的药效和选择性（IC50 = 2 ± 1 nM），同时对黑色素瘤细胞系有显著的抗增殖活性。此外，化合物17e在黑色素异种移植模型中有良好的抗肿瘤活性，这意味着该化合物作为一种潜在的抗癌药物值得进一步研究。蛋白质精氨酸甲基化是由精氨酸甲基转移酶（PRMTs）催化的一种重要的翻译后修饰。PRMTs利用S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体去执行这一催化过程，从而产生S-腺苷-l-高半胱氨酸（SAH或AdoHcy）和甲基化底物。PRMT有9个成员：PRMT1到9，根据其甲基化不同可分为I型，II型和III型。I型PRMTs（PRMT1、2、3、4、6和8）催化单甲基化和不对称甲基化，产生ω-NG-单甲基精氨酸（MMA）或ω-NG和Ng-不对称二甲基精氨酸（aDMA）；II型PRMTs（PRMT5和9）催化单甲基化和对称二甲基化，产生MMA或ω-NG和NG对称二甲基精氨酸（sDMA）；III型PRMT（PRMT7）是只能催化单甲基化，专门产生MMA。与大多数的PRMTs相比，PRMT4又称为共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1（CARM1），表现出一个松散的作用基序，不会轻易被其他PRMTs识别，因此这是CARM1在其底物识别方面具有独特性的原因。另外，在胚胎的发育过程中，CARM1耐受性缺失意味着与靶向PRMT1或PRMT5抑制剂相比，CARM1抑制剂可能提供更广泛的治疗窗。这独特方面突出了CARM1作为治疗干预靶点的潜在优势。CARM1能够甲基化各种组蛋白和非组蛋白底物，包括H3R2、H3R17、H3R26、7RUNX1、BAF155、8PABP1、和TARPP。值得注意的是，组蛋白H3R17和H3R26的甲基化是CARM1的一个特殊的特点。因此，CARM1在多种细胞过程中发挥作用，包括细胞自噬、代谢、早期发育和mRNA的预剪接。由于其重要的生物学功能，越来越多的证据表明CARM1的过表达与多种癌症有关，包括乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、白血病和黑色素瘤。另外，Kumar等人发现抑制CARM1可以通过对肿瘤细胞和T细胞的双重作用对耐药肿瘤进行免疫治疗。因此，CARM1是癌症治疗的一个潜在靶点，特别是对耐药肿瘤。作者提出目前大多数具有肿瘤抑制作用的CARM1抑制剂主要是针对血液肿瘤，而针对实体肿瘤的抑制剂却很少，其疗效也有限。因此，文章重点致力于更有效的CARM1抑制剂的开发，特别是提高对实体肿瘤的选择性和疗效。在前期研究工作中，作者报告了ZL-28-6 (6)对CARM1表现出强效的抑制作用，但其选择性没有明显提高（图1）。因此，对化合物6进行结构修饰旨在进一步提高该化合物的选择性和抑制活性。图1 化合物6的结构及生物活性作者把化合物6的化学结构分为三个部分。首先，N, N-二甲基乙二胺的尾部基团插入入口通道，模拟底物精氨酸的侧链，与残基E257和E266形成氢键和盐桥，这对CARM1的催化活性至关重要。第二，中间的苯环与保守的疏水界面相互作用。第三，位于非保守区域的头部基团。此外，该化合物两个芳环之间的乙氧基增加了两个芳香环之间的灵活性，导致π−π与F152的相互作用；头部基团的氯原子与Q148形成卤素键，从而增加了对CARM1的抑制活性。（图2）图2 化合物6与CARM1的相互作用因此，作者以化合物6作为先导化合物，针对头部和尾部进行结构修饰得到一系列衍生物，评价了合成衍生物对CARM1和PRMT1的抑制活性。其中与先导化合物相比，化合物14g、14h、17e、17g和17h对CARM1抑制作用更好，同时对PRMT1抑制活性较弱（表1）。初步评价了这五个化合物在浓度为1 μM和10 μM下在A375和A2058黑色素瘤细胞系中的抗增殖活性，结果发现这些化合物在黑色素瘤细胞系中均表现出显著的增殖抑制作用，超过了已报道的阳性CARM1抑制剂EZM2302（表2）。随后，作者评价了这些化合物在小鼠肝微粒体中的代谢稳定性，化合物17e具有较低的体外清除率（CL = 132 mL/min/kg）以及半衰期延长（T1/2 = 41.55 min），展现出较高的微粒体代谢稳定性（表3）。因此，基于酶活性、细胞活性和体外代谢稳定性的评估，作者最终选择了化合物17e进行进一步的研究。表1衍生物对CARM1和PRMT1的抑制作用表2 选定的潜在CARM1抑制剂对两种细胞系的抗增殖活性表3 化合物在小鼠肝脏微粒体中的代谢稳定性首先，评估了化合物17e对不同癌细胞和正常乳腺细胞MDA-KB2的抑制作用。结果发现该化合物对黑色素瘤细胞A375具有特异性的抗增殖作用。此外，化合物17e抑制MDA-KB2细胞生长（IC50= 6.60 μM），但比A375的抗增殖半抑制浓度值大12倍，表明其有良好的安全性。图3 化合物17e对7种细胞系的抗增殖作用接下来评价了化合物17e对不同PRMTs的选择性。结果表明该化合物对不同的PRMTs表现出良好的选择性，PRMT1超过100倍，PRMT3超过450倍，PRMT6和PRMT8的选择性均超过30倍。此外，在浓度为100 μM时，17e对PRMT5和PRMT7均无抑制作用，这些结果表明该化合物具有显著的选择性。图4 化合物17e的选择性评价随后分析了化合物17e与CARM1的结合模式，利用分子对接技术预测了CARM1/17e复合物的结构，并进行了200 ns的分子动力学（MD）模拟，结果显示化合物17e在150 ns后达到平衡（图5 A）。紧接着利用MM-PBSA方法进行MD模拟，对相对结合能进行残基分解，研究与17e结合的关键氨基酸残基。Y149、F152、Y153、Q446氨基酸与化合物17e头部的苯和噻唑环形成π−π堆叠和疏水作用；氨基酸E257、M259、E266、H414和W415与化合物17e的尾部形成氢键相互作用（图5 B-D）。值得注意的是，F152和Q446在I型PRMT中是不保守的，表明它们与化合物17e的高选择性有潜在的关键作用（图5 E）。图5 （A）蛋白质和化合物17e的RMSD运动轨迹；（B-D）化合物17e与氨基酸的相互作用模式；（E）CARM1与PRMT1、3、6和8的序列比对随后，使用细胞热位移试验（CETSA）测定化合物17e是否可以进入细胞直接与CARM1蛋白相互作用。结果表明化合物17e以浓度依赖性的方式增强了CARM1的蛋白热稳定性，说明化合物17e可以进入细胞并直接与CARM1结合（图6 A，B）。此外为了探究17e是否能抑制细胞中CARM1的甲基化活性，作者检测了与17e孵育后CARM1底物的甲基化变化。用17e处理A375细胞72 h，结果显示化合物17e以剂量依赖的方式降低不对称二甲基-PABP1和整体aDMA的水平（图6 C）。另外，在A2058细胞中，17e也呈剂量依赖性地降低了不对称二甲基-PABP1的水平（图6 D）。这些发现证实了化合物17e可以通过抑制CARM1的甲基转移酶活性来影响细胞中CARM1底物的不对称二甲基化。图6 （A-B）化合物17e与CARM1蛋白之间的相互作用；（C）化合物17e降低A375中的精氨酸甲基化水平；（D）化合物17e降低A2058中的精氨酸甲基化水平最后，作者研究了化合物17e在体内的抗肿瘤活性，通过建立A375异种移植BALB/c裸鼠，分别以10 mg/kg/d和25 mg/kg/d腹腔注射药，持续14天。结果发现，化合物17e在体内可显著抑制肿瘤生长，肿瘤生长抑制率（TGI）分别为63%（25 mg/kg）和55%（10 mg/kg）（图7 A-D），并且没有明显的毒性。此外，通过蛋白印迹分析了肿瘤组织中aDMA、PABP1和PABP1me2a的水平，结果显示不对称二甲基化显著降低，这与细胞研究的结果一致（图7 E）。图7 化合物17e在A375细胞来源的异种移植物中的体内抗肿瘤活性。（A）肿瘤体积；（B）体重；（C）化合物17e处理后小鼠肿瘤重量；（D）对照组和治疗组肿瘤体积的视觉图；（E）蛋白免疫印记检测PABP1不对称二甲基化和aDMA水平在本研究中，作者采用结构辅助药物设计，对先前鉴定的I型PRMT抑制剂化合物6进行化学修饰，得到了一系列衍生物。值得注意的是，化合物17e对CARM1表现出显著的抑制活性，并对其他PRMT表现出较高的选择性。化合物17e有效抑制各种肿瘤细胞的生长，特别是黑色素瘤A375细胞，在A375异种移植模型中也显示出了抗肿瘤活性，没有引起明显的毒性。总之，化合物17e是一种高选择性和高效的CARM1抑制剂，具有良好的药理活性。这一发现为探索精氨酸甲基化调节作为一种新的癌症治疗策略铺平了道路。原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.3c02265声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

Researchers reveal how cells accelerate changes to their identity, a process known as cell fate conversion. The study has implications for cancer research as the disease often arises from errors in cell fate decisions. The study could eventually lead to new methods of accelerating or manipulating the molecular mechanisms involved in the formation of cancer. Researchers at the Centre for Genomic Regulation (CRG) in Barcelona and the Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association in Berlin reveal how cells accelerate changes to their identity, a process known as cell fate conversion. The study, published today in the journal eLife, has implications for cancer research as the disease often arises from errors in cell fate decisions. The study could eventually lead to new methods of accelerating or manipulating the molecular mechanisms involved in the formation of cancer. Central to the study is C/EBPα (CCAAT/enhancer-binding protein alpha), a protein that orchestrates the conversion of B lymphocytes to macrophages, another type of immune cell. C/EBPα is a transcription factor, a type of protein which binds to specific DNA sequences in the regulatory regions of genes to influence the rate of transcription, the first step that leads to the activation or silencing of protein expression. Transcription factors play a vital role in the transformation of one cell type to another during differentiation and development, as well as in the growth and function of cells. Like many other proteins, C/EBPα is modified by enzymes, for example through the addition of a methyl group to specific amino acids. These modifications can have significant effects on interactions of the protein. The researchers found that when one specific arginine residue of C/EBPα is left unmethylated, it greatly accelerates the conversion process of B lymphocytes to macrophages. The study also found that the methylation of this specific arginine residue is mediated by the enzyme Carm1. Previous research has shown that Carm1-deficient mice are resistant to induced forms of acute myeloid leukaemia. The researchers hypothesise that the mechanisms they uncover in the present study can explain why: the unmethylated version of C/EBPα is a stronger inducer of macrophage differentiation compared to its methylated counterpart. As macrophages are a non-dividing cell type, this could prevent the formation of cancer cells. The researchers made the discovery while screening for C/EBPα mutants which affect the efficiency of cell fate conversion using human and mouse models. The location of the critical amino acid within C/EBPα was found when the authors tested a mutant form called C/EBPαR35A. This mutant dramatically accelerated the speed by which B cells could be turned into macrophages. To induce a cell conversion, C/EBPα works by interacting with another transcription factor called PU.1, which itself is essential for the development of immune cells and is already expressed in B cells. C/EBPαR35A had a much higher interaction affinity with PU.1, increasing the speed by which the combination of the two proteins silence the genes associated with B cells and activate the genes associated with macrophages. The methylation of C/EBPα is an example of an epigenetic mechanism. These are mechanisms which modify how the genome -- the instruction manual inside every cell of the human body -- is read. "Drugs that affect epigenetic mechanisms as described in the present study may indeed alter the function of transcription factors and correct cells that went astray, such as seen in cancer and leukaemia," says Dr. Achim Leutz, senior author from the Max-Delbrück-Center. "In this novel mechanism PU.1 is triggered by C/EBPα to switch from a B cell regulator into a macrophage regulator, an elegant 'on-off' mechanism that ensures the faithful formation of a mature cell type, avoiding the formation of 'confused' cells often seen in blood cancers. Therefore, drugs might be found that target this mechanism to correct such defects" adds Dr. Leutz. According to the authors of the study, much remains unknown about what determines the speed and directionality of cell fate decisions and their new work suggests that the two processes are two sides of the same coin. For instance, how do stem cells sequentially transform into the many different types of cells in the body? Better understanding how cells change their identity and how to manipulate the process might have applications from regenerative medicine to improving the efficacy of drugs against cancer. The research was led by a joint collaboration between the Centre for Genomic Regulation in Barcelona, the Max Delbrück Center for Molecular Medicine in Berlin and the University of Pennsylvania in Philadelphia. The study was funded by the Spanish Ministry of Economy, Industry and Competitiveness, the Catalan Agency of Research and Universities, a 4D-Genome European Research Council Synergy grant, by funds from the Max-Delbrueck-Center, and the United States National Institute of Health.