FGFRs x EGFR x RTK

前言 粘蛋白（MUC）家族是一组高度糖基化的大分子，在哺乳动物上皮细胞中大量表达。粘蛋白有助于粘液屏障的形成，因此对感染具有保护作用。有趣的是，一些MUC蛋白在癌细胞中异常表达，并参与肿瘤的发生和发展，包括细胞生长、增殖、凋亡抑制、化疗耐药、代谢重编程和免疫逃避。 由于其独特的生物学和结构特征，MUC蛋白被认为是某些癌症的重要生物标志物，以及非常具有前景的治疗靶点。 粘蛋白的结构和分类 粘蛋白分为两类：分泌粘蛋白和跨膜粘蛋白。分泌性粘蛋白包括凝胶形成粘蛋白和非凝胶形成粘蛋白，包括MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC9（OVGP1）和MUC19。跨膜粘蛋白还包括一个跨膜结构域和一个细胞内结构域，包括MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC12、MUC13、MUC14（内皮粘蛋白）、MUC15、MUC16、MUC17、MUC20、MUC21和MUC22。 跨膜粘蛋白是单次跨膜的I型膜蛋白，其N端胞外区域包括串联重复序列（TR）结构域、SEA（海胆精子蛋白-肠激酶-聚集蛋白）结构域和/或EGF（表皮生长因子）样结构域。TR结构域包含数量可变的重复氨基酸序列，富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸（S/T/P）。这些S/T/P残基是O-连接N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）加成的位点，以启动进一步的N-连接糖基化链反应。TR结构域由于其高度糖基化的结构而成为这些分子的物理和化学特征的基础，例如润滑或免疫保护。 SEA结构域有一个高度保守的裂解位点，位于细胞膜外侧附近。跨膜粘蛋白的蛋白水解裂解将它们分成一个N端亚单位（包含TR结构域）和C端亚单位（包含跨膜和细胞质结构域）。这两个亚单位可以形成一个非共价且稳定的复合物。EGF样结构域与一些生长因子序列同源，并与ErbB受体等生长因子受体相互作用。 MUC1是第一个被识别的粘蛋白，也称为EMA（肿瘤相关上皮膜抗原）或CD227，是一种大的糖基化蛋白质，根据糖基化状态，其预期分子量在120到500 kDa之间。MUC1中的可变数量串联重复序列（VNTR）域由20个氨基酸（PAPGSTAPPAHGVTSAPDTR）的20–125个重复序列组成。MUC1还包含110个氨基酸长度的SEA、短跨膜区和74个氨基酸的胞内区。其胞内结构域具有几个短的（4~9个氨基酸）蛋白质结合基序，促进其与GSK3β（糖原合成酶激酶3β）、β-连环蛋白、GRB2（生长因子受体结合蛋白2）、SRC和ESR1（雌激素受体1）的相互作用。此外，它还拥有一个p53结合区，这是一个相对较长的37个氨基酸序列。 MUC16（CA125）是最大的跨膜粘蛋白，由于已知MUC16在卵巢癌细胞表面过表达并分裂/脱落到血液中，因此它是卵巢癌的一种公认的血清生物标记物。MUC16包含约14000个氨基酸，分子量在1.5到5 MDa之间。MUC16包含三个主要结构域：N端结构域（MUC16-N）、串联重复结构域（MUC16-TR）和C端结构域（MUC16-C）。其N-末端结构域在一个约12000个氨基酸长的富含苏氨酸区域内包含多个富含丝氨酸的区域，该区域仅为O-糖基化。TR结构域包含156个氨基酸的12~60个重复序列，具有散布的SEA结构域，其中包含O-连接和N-连接的糖基化位点。MUC16的C端结构域包括一个胞外结构域、短跨膜区和一个32个氨基酸的胞内结构域。 跨膜粘蛋白在肿瘤发生中的作用 肿瘤发生是一个复杂的过程，涉及细胞内外的各种事件，许多报道表明，跨膜粘蛋白可能在肿瘤发生和进展中发挥多种作用。 促进癌细胞增殖 癌细胞的基本特征之一是由异常生长信号通路维持的无限增殖潜能。致癌突变或受体酪氨酸激酶（RTK）的过度表达赋予生长因子信号的组成性激活。MUC1的细胞质结构域具有多个蛋白质结合基序和磷酸化位点，已知RTK与MUC1直接相互作用可以产生致癌信号。 ErbB是一个RTK家族，MUC1与所有ErbB家族受体相互作用，相互传递致癌信号。此外，MUC1还与成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）结合，FGFR3是肿瘤发生中的另一个关键RTK。在FGF1配体刺激下，FGFR3与MUC1相互作用并磷酸化MUC1细胞质结构域的YEKV基序。 抗凋亡作用 癌症的另一个重要标志是抗凋亡细胞死亡。癌细胞通过各种机制逃避应激诱导的凋亡，MUC1具有促进这种生存的保护作用。首先，MUC1通过DNA复制机制或抗癌药物的作用减弱DNA损伤引起的遗传毒性应激。MUC1通过与p53调节域和p53反应元件的直接关联来调节p53依赖性基因转录。另一方面，MUC1通过转录多药耐药（MDR）基因直接利用药物外排系统，据报道，该基因可保护肺癌和胰腺癌细胞免受化疗的影响。 MUC1可以减弱线粒体凋亡因子，如细胞色素c或Bcl-xL，保护癌细胞免受阿糖胞苷、吉西他滨和顺铂等抗癌基因毒素的侵害。此外，MUC1还通过清除氧化应激为癌细胞提供生存优势，MUC1去磷酸化并激活FOXO3a，FOXO3a激活诱导其核定位和随后的ROS清除基因转录激活。 MUC16也被认为在癌细胞中起着抗凋亡的作用。MUC16 c端结构域的异位表达诱导卵巢癌细胞对顺铂产生耐药性，该作用是通过抑制p53介导的。尽管其结合蛋白和耐药表型的确切分子机制尚不清楚，但MUC16的胞内结构域被认为具有与MUC1相当的信号作用。 能量代谢重编程 各种癌症组织中粘蛋白表达的改变被认为是能量代谢重编程的调节因素。一项早期研究中证明MUC1可以增加胰腺癌患者的糖代谢水平。在原位胰腺癌小鼠模型中，MUC1过表达也与葡萄糖摄取增加以及HIF-1α、GLUT1和LDHA蛋白表达相关。 脂质代谢的改变也与癌症的进展有关。一项研究提出了一个包含38个基因的子集，命名为MLMS（MUC1诱导的脂质代谢信号），由与MUC1转化的3Y1细胞中脂质代谢相关的差异表达基因组成。在tamoxifen治疗的乳腺癌患者中，MLMS过度表达与不良预后相关，表明脂质代谢改变可能导致tamoxifen耐药。 EMT与转移 最近，一系列研究支持了粘蛋白在乳腺癌和胰腺癌EMT中的作用。对MUC1过表达细胞和敲除小鼠模型的分析表明，胰腺癌中MUC1强烈影响EMT过程。例如，当MUC1胞内结构域中的所有酪氨酸残基被苯丙氨酸取代时，EMT被阻断。该MUC1突变体不能与β-连环蛋白结合，因此无法转移到细胞核以促进EMT基因的转录。 MUC16也是胰腺癌中EMT的介质，其敲除导致癌细胞在体外迁移减少，在体内转移减少。事实上，最近描述的MUC16和FAK之间的相互作用被认为是胰腺癌转移的一种机制。 逃避免疫监视 由于在正常上皮细胞中表达的粘蛋白在抵抗细菌感染的粘膜免疫中具有重要作用，癌症相关粘蛋白被认为可以调节肿瘤免疫。粘蛋白参与多种策略以逃避宿主免疫，包括（1）阻断免疫细胞和癌细胞之间的相互作用，（2）通过共刺激或共抑制分子调节免疫细胞信号，以及（3）调节促炎细胞因子的产生。由于其胞外区域的巨大糖基化结构，粘蛋白对细胞间的相互作用具有抑制作用。 TCGA样本的免疫细胞浸润分析表明粘蛋白mRNA表达与肿瘤细胞毒性淋巴细胞浸润之间存在强烈的负相关。此外，癌细胞表面过度表达的MUC1和MUC4为癌细胞和细胞毒性淋巴细胞之间的结合提供了空间障碍，导致癌细胞裂解减少。癌细胞上的糖基化MUC1直接与免疫细胞（包括巨噬细胞）上表达的选择素或siglec家族蛋白结合，并抑制其功能。此外，MUC1通过与T细胞上的细胞间粘附分子1（ICAM-1）结合并抑制其功能而发挥免疫检查点分子的作用。 MUC靶向的肿瘤治疗 许多研究表明，粘蛋白是癌症治疗的有希望的靶点。由于其在肿瘤信号转导途径中的作用，跨膜粘蛋白的信号通路可能在抗肿瘤治疗研究中具有特殊的潜力。膜结合粘蛋白的胞外结构域也可以作为抗体介导治疗的良好靶点，如中和抗体、CAR-T、BsAb和ADC。某些粘蛋白的癌症特异性表达也表明了开发基于粘蛋白抗原的癌症疫苗的可能性。 MUC1的靶向治疗 MUC1的多种候选治疗药物正在开发中，用于多种癌症类型，包括实体瘤和血液瘤。  GO-203是MUC1二聚化的细胞穿透肽抑制剂，其直接结合到MUC1胞内结构域的CQCRK区域。GO-203通过阻断多种肿瘤类型中的AKT途径而具有抗肿瘤效力。GO-203还显示出与化疗耐药癌细胞或难治癌症类型的标准化疗相结合的潜力。 选择性RNA适配体结合MUC1胞外结构域是靶向MUC1的另一种策略。将抗肿瘤微RNA导入MUC1过度表达的癌细胞，这些搭载miRNA-29b的杂交纳米粒通过下调DNMT3B在肺癌小鼠模型中显示抗肿瘤作用。此外，使用双有效载荷策略，geistein-miRNA-29b双共轭杂化纳米颗粒通过靶向AKT、PI3K、DNMT3B和MCL-1在小鼠肺癌模型中显示出比单一有效载荷纳米颗粒更大的效力。 基于抗体的治疗方法，如ADC、BiTE和CAR-T以及中和治疗性抗体都在积极开发中。BM7-PE和M-1231是目前临床试验中MUC1 ADC的主要候选药物。BM7-PE是由抗MUC1抗体BM7与假单胞菌外毒素A（PE）偶联的ADC。在一项临床前研究中，BM7-PE在乳腺癌裸鼠模型中显示出抗转移作用并促进长期存活。BM7-PE目前正在进行转移性结直肠癌的1/2期临床试验（NCT04550897）。M-1231是一种针对EGFR和MUC1的双特异性抗体的ADC，目前正在进行各种转移性实体瘤的1期临床试验。 Pab-001是针对OT-MUC1（肿瘤栓系MUC1）的第一类治疗性抗体。Pab-001-MMAE ADC在各种临床前环境中对TNBC和其他癌症显示出有希望的结果。DS-3939是一种PankoMab GEX（gatipotuzumab）ADC，靶向肿瘤特异性粘蛋白碳水化合物-蛋白质表位（TA-MUC1）,目前正在同时开发使用PankoMab的双特异性抗体。PM-CD3-GEX是一种BiTE，它将抗肿瘤CD3+T细胞招募到表达MUC1的癌细胞。PM-IL15-GEX将IL-15与PankoMab GEX结合起来，同时刺激抗肿瘤NK或T细胞。PM-PDL-GEX是一种针对MUC1、PD-L1和FcγR的三功能抗体。 目前也正在开发几种针对MUC1抗原的CAR-T疗法。由Tmunity Therapeutics开发的Tn-MUC1-CAR是领先的MUC1-CAR-T细胞疗法，目前正在进行1期临床试验（NCT04025216）。由于Tn（GalNAcα1-O-Ser/Thr）是癌症组织中最常见的异常糖类，因此MUC1的Tn糖类（Tn-MUC1）是CAR治疗的一个有希望的靶点。Tn-MUC1 CAR-T已显示出针对T细胞淋巴瘤和胰腺肿瘤的靶向抗肿瘤效力。 Leucid Bio开发的MUC-1 pCAR是一个平行CAR平台，分别引入两个具有不同抗原结合域和共刺激域的嵌合抗原受体（WO2020183158）。这种双重受体的组合有望使T细胞对MUC1阳性肿瘤具有更高的特异性，并且比标准CAR-T更有效。 Minerva Biotechnologies Corp开发的huMNC2-CAR44 T细胞可对抗实体癌细胞上的MUC1裂解形式，huMNC2-CAR44正在进行乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和肺癌的1期临床试验（NCT04020575），这些肿瘤均是MUC1高表达的肿瘤类型。 ONKT-103是ONKTherapeutics开发的MUC1靶向CAR-NK细胞疗法。ONKT-103通过引入DR5-TRAIL变体死亡受体信号通路，最大限度地发挥抗肿瘤活性，ONKT-103目前处于临床前阶段。 MUC16和其他粘蛋白靶向治疗 与MUC1一样，其他膜结合粘蛋白也被认为是抗癌治疗的潜在靶点。 Oregovomab（OvaRex）是临床试验中研究的第一种单克隆抗体药物。Oregovomab以高亲和力结合MUC16的糖基化区域，并通过抗独特型抗体级联反应诱导间接免疫反应。Oregovomab与卡铂和紫杉醇（CP）联合治疗97例III/IV期卵巢癌患者的2期临床试验显示了非常有希望的结果。与CP对照组相比，CP加oregovomab组的无进展生存期（PFS）结果为41.8个月，而CP组为12.2个月（p=0.0027）。CP与oregovomab联合给药导致外周血中MUC16特异性IFN-γ+CD8+T淋巴细胞增加。然而，尽管与标准化疗的联合研究结果令人鼓舞，但oregovomab的单一疗法在2期和3期临床试验中并未显示出临床益处。oregovomab的另一个3期临床试验（NCT04498117）正在进行中。 Abagovomab是针对抗MUC16抗体OC125产生的抗独特型抗体。Abagovomab诱导特异性免疫反应，进而激活针对表达MUC16的癌细胞的细胞毒性反应。作为一种用于维持治疗的卵巢癌疫苗，在1b/2期试验中，abagovomab在免疫应答和总生存期（OS）方面改善（23.5个月vs.4.9个月；p<0.001）。然而，一项涉及888名患者的多中心3期临床研究（NCT00418574）未能证实这些临床益处。 DMUC5754A（RG-7458，sofituzumab-vedotin）是一种ADC，包含人源化抗MUC16抗体，与MMAE偶联。对铂类耐药卵巢癌（OC）和不可切除胰腺癌（PC）患者进行的1期研究显示，尽管DMUC5754A具有安全性，但OC患者的有效率仅为17%（5/29；1 CR；4 PRs），PC患者均未观察到CR或PR。 Regeneron目前正在开发MUC16的BiTE，在小鼠和猴子模型中，REGN4018显示出MUC16依赖性抗肿瘤效力和良好的耐受性。REGN4018目前正在进行2期临床试验，单独或与PD-1抗体cemiplimab或REGN5668（MUC16/CD28 BiTE）联合治疗复发性卵巢癌患者（NCT03564340、NCT04590326）。 JCAR-020由Juno/Celgene/Bristol-MyersSquibb开发，是一种含有IL-12受体激动剂的MUC16CAR-T细胞疗法。JCAR-020目前正在进行一期临床试验（NCT02498912）。 除了MUC1和MUC16外，其他跨膜粘蛋白也被评估为潜在的癌症靶点。Amgen正在开发一种针对CD3和MUC17的BiTE，用于治疗胃癌和食管癌，目前正在进行一期试验（WO2019133961A1，NCT04117958）。 肿瘤疫苗 除了以粘蛋白为靶点的被动免疫疗法，粘蛋白抗原疫苗也被积极尝试用于治疗各种实体瘤。 CVac是用甘露糖基化MUC1蛋白诱导的自体单核细胞衍生DC。目前已经对这些细胞进行了两项2期临床研究：一项用于标准化疗后病情进展的晚期OC患者，另一项用于OC患者临床缓解后的维持治疗。CVac DC疫苗被发现具有足够的安全性，副作用最小，但与单独标准化疗相比，未能增加PFS。 ImMucin是一种21肽疫苗，包含MUC1蛋白的信号肽结构域，与各种MHC I类和II类等位基因结合。多发性骨髓瘤ImMucin与GM-CSF联合应用的1/2期研究表明，该疫苗具有安全耐受性，成功诱导了疫苗介导的细胞和体液免疫应答，11/15患者的临床疾病得到控制。 ONT-10是一种脂质体治疗性疫苗，由来自MUC1的20-mer合成糖肽与季戊四醇脂质a（TLR4激动剂）的两个重复组成。ONT-10的临床前研究表明，在同基因B16-MUC1和MC38-MUC1模型中，诱导了对MUC1的细胞和体液免疫反应以及抗肿瘤作用。对28名晚期实体癌患者进行的1期研究表明，ONT-10安全且耐受性良好，但未观察到CR和PR。最近，在晚期卵巢癌和乳腺癌患者中进行了ONT-10与varlilumab（抗CD27激动性抗体）联合的1b期研究（NCT02270372）。 Emepepimut-S（L-BLP25）是另一种针对MUC1的已开发肽疫苗。然而，在非小细胞肺癌患者的3期研究中，观察到OS没有显著差异。 ETBX-061是一种靶向MUC1蛋白的治疗性腺病毒疫苗。考虑到实体瘤的异质性，ETBX-061已在临床试验中与其他疫苗或治疗药物进行联合研究。在一项针对晚期癌症患者的1期临床试验中研究了三重（CEA/MUC1/Brachyury）疫苗组合方案，该试验证实了抗原特异性T细胞的生成和疾病控制（60%SD和40%PD）。 TG4010是一种改良的安卡拉痘苗（MVA），表达MUC1和IL-2。在晚期非小细胞肺癌的2b/3期试验中，TG4010加化疗与安慰剂加化疗相比，PFS有显著改善，但生存期获益微乎其微（5.9个月vs.5.1个月）。 MicroVAC LLC正在开发一种ad-sig-hMUC1/ecdCD40L疫苗，其中MUC1与CD40配体（CD40L）的胞外结构域融合，以促进DC活化并促进T细胞和B细胞扩增。该疫苗的一项小型队列1期研究表明，它是安全的，并且具有令人鼓舞的抗肿瘤活性。 小结 跨膜粘蛋白在维持粘膜结构和生理稳态方面具有重要作用。粘蛋白是高度糖基化的蛋白质，在不同类型的癌症中过表达。人们一直在努力寻找新的治疗策略，以利用某些跨膜粘蛋白作为治疗靶点。许多以粘蛋白为靶点的治疗药物正在对几种癌症进行不同阶段的临床试验，这些药物包括基于抗体的疗法、小分子抑制剂、疫苗和细胞疗法。为了开发更有效的基于粘蛋白的治疗策略，需要更好地理解粘蛋白糖蛋白的脱落机制、异常糖基化、可能的剪接变体、致癌信号级联和相互作用的结合蛋白。 参考文献： 1.Mucin1 and Mucin16: Therapeutic Targets forCancer Therapy. Pharmaceuticals (Basel). 2021 Oct; 14(10): 1053. 药渡媒体商务合作 媒体公关 | 新闻&会议发稿 张经理：18600036371（微信同号） 点击下方“药渡“，关注更多精彩内容 免责声明 “药渡”公众号所转载该篇文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。 微信公众号的推送规则又双叒叕改啦，如果您不点个“在看”或者没设为"星标"，我们可能就消散在茫茫文海之中~点这里，千万不要错过药渡的最新消息哦！👇👇👇

和誉马上面临核心管线的三期临床揭盲，股价成败在此一举。 作为一家港股市值并不大的biotech，和誉目前具备非常多的加分项：有和MNC的稳定BD，有即将商业化的潜在best in class管线，后续管线也具备着充足的想象力。 ABSK021临床III期揭盲如果成功，将会使其前景大幅度明朗起来。 01 ABSK021——即将到来的核心催化 ABSK021是一条针对CSF-1R（集落刺激因子1受体）的管线。与从前所述的CD47靶点类药物类似，它在机制上也是主要针对巨噬细胞的。 对于肿瘤微环境（TME）中的巨噬细胞而言，它在极端状况下有两种形态，分别是抑制肿瘤生长的M1形态，和促进肿瘤生长的M2形态。而在大多数情况下，巨噬细胞都是两种情况的中间形态，主要看复杂的靶点通路将巨噬细胞往哪个方向去诱导。因此，对于抗肿瘤疗法而言，自然希望巨噬细胞能够尽可能转化成M1形态，在肿瘤微环境中起到抑制肿瘤的作用。 而CSF-1/CSF-1R，就是起到这样关键作用的靶点，它在巨噬细胞表面大量存在，可以促进肿瘤微环境中的巨噬细胞向M2型分化激活。并且巨噬细胞表面的CSF-1R与CSF-1 结合后，可使其分泌VEGF等多种细胞因子，进一步促进肿瘤的增殖、侵袭转移以及血管生成。因此，可以通过阻断该通路来抑制肿瘤微环境中的巨噬细胞向M2型去转化。 而CSF-1R抑制剂或是相关抗体，起的就是该作用。目前该类药物的主要适应症方向，在腱鞘巨细胞瘤（TGCT）上。 目前市场上唯一一款获批的CSF-1R小分子抑制剂是第一三共的PLX3397。但该药由于分子结构的原因，使其对靶点的特异性不是很好。特异性不佳的处理方式是增大剂量，而增大剂量的后果是毒性的增大。目前PLX3397被FDA打上了黑框警告的标签，first in class的商业化并不是很顺利，这也给后继者们留足了商业空间去拓展。 而ABSK021，目前是best in class的最强竞争者。如图所示，在临床Ib期试验中，ABSK021初显峥嵘，在初步的25周随访中ORR便达到了68%，DCR直接达到了100%。而在一年后的2023年CTOS年会上，ABSK021公布了一年随访的最新数据：ORR直接达到了87.5%。 （图片来源：和誉官网PPT） 可以将该数据与PLX3397进行对比，PLX3397的III期临床来看，在24周的初步评估疗效中，仅有39%的患者达到了ORR（肿瘤体积至少减小30%，可以视为PR＋CR），而后续的治疗中，达到ORR的比率为53%。 （图片来源：ENLIVEN study: Pexidartinib for tenosynovial giant cell tumor (TGCT)） 目前PLX3397真正的强有力对手是罗氏的RG-7155（Emactuzumab），它是一款针对CSF-1R的大分子抗体。从临床Ib期的数据来看，ORR为71%（45/63），DCR为98%（62/63），与ABSK021旗鼓相当，不过一年后随访数据来看，ORR为70%，疗效持续性上不如PLX3397。此外，作为大分子抗体来说，大部分都是以静脉注射的方式给药，部分依从性好一些的剂型是皮下注射，而小分子可以采取口服方式给药，从患者便利性来说，小分子这方面占据着较大的优势。 ABSK021马上到了开盲盒的阶段。根据和誉九月份发布的临床公告，ABSK021已经在今年三月完成了三期临床的所有患者入组，而试验周期为24周，今年Q4有较大可能发布临床III期顶线数据。如果真的开出了一款best in class，那么和誉公司的价值，可能远不止如今的数字。 （图片来源：和誉官网PPT，ABSK021三期临床试验设计） 除此之外，ABSK021在cGvHD（慢性移植物抗宿主病）适应症上的II期临床预计也离数据揭盲并不遥远。前不久，同靶点单抗Axatilimab刚刚获FDA批准，该靶点抑制剂在cGvHD上的疗效已经能得到证实：根据AGAVE-201这项关键II期临床试验，每两周接受0.3mg/kg剂量（推荐剂量）的axatilimab治疗的患者，在治疗的前六个月内获得了75%的ORR。 该适应症上，ABSK021目前并不算落后，目前需要的则是临床II期数据的验证。 02 ABSK011——肝癌潜在破局者 如果说ABSK021是腱鞘巨细胞瘤适应症的潜在BIC的话，那么ABSK011就是肝癌细分领域的潜在破局者了。 ABSK011靶向FGFR4（成纤维细胞生长因子受体4），与EGFR同为酪氨酸激酶（RTKs）家族的成员，它近年来被引起广泛关注，是因为它的过表达导致的细胞癌变。FGFR4和FGF19是受体和配体的关系，FGF19和FGFR4的过表达都会导致肝癌风险的上升，因此，可以用抑制FGFR4的方式，来对FGF19亦或FGFR4过表达的患者进行治疗。 （图片来源：《FGFR4:一种有望治疗肝癌的靶点》） 而目前的研发管线来看，ABSK011是一条被寄予很高预期的药物。今年9月，ESMO大会上展示了ABSK011的I期临床数据。给药方面，分为每日一次给药（QD）和每日两次给药（BID）。从疗效方面来看，主要关注FGF19过表达肝癌患者的疗效数据。在40例FGF19过表达患者中，采用220mg每日两次给药进行治疗，其中38例可评估疗效，ORR达到了36.8%，DCR达到了78.9%。比较惹人注意的是，接受过ICIs（免疫检查点抑制剂，如PD-1）和mTKIs（多靶点酪氨酸激酶抑制剂，肝癌适应症药物如索拉非尼）治疗的患者应答率达到44.8%。 事实上，高选择性FGFR，例如FGFR4抑制剂也是近些年来才火的方向，更早流行的是pan-FGFR（泛FGFR，不针对某种特定FGFR亚型），但FGFR4在近两年来大部分管线进入了瓶颈期。2024年10月24日去检索clinical trial网站（关键词：FGFR4），目前还在进行的FGFR4的临床试验仅仅有5个，而其中两个试验并不针对肝癌适应症，目前仅BB-102，SY-4798和和誉的ABSK011还处于临床试验正在进行的状态。并且之前两条管线都还在在临床I期（Phase I）阶段，而ABSK011临床II期已经将要完成。 此前被寄予厚望的管线是BluePrint的BLU-554，该药进展较早，算是这个领域的开拓者，但在临床I期公布数据后，迟迟未有新的进展，目前查阅BluePrint官网，也已经无法看到该条管线。 不知不觉间，和誉的ABSK011已经将要成为first in class。而接纳它的市场，是我国发病率第四的癌症（数据来源：J Natl Cancer Cent.2024,4(1)）。在肝癌适应症中，FGFR19过表达的比率为30%。未来，将会有三成肝癌的患者迎来它们的救命稻草——这个适应症将不再只有免疫检查点抑制剂疗法苦苦支撑。 根据CSCO（中国临床肿瘤协会）诊疗指南，对于中晚期的肝细胞癌（HCC）而言，一线疗法目前为VEGF（如贝伐珠单抗）联用PD-1（信迪利单抗），而二线疗法为K药，恒瑞的PD-1或者百济的PD-1，此外，还有主要针对VEGFR的多靶点抑制剂瑞戈替尼，以及针对VEGFR2靶点的阿帕替尼。总体来说，肝细胞癌药物还是处于非常匮乏的状态，除了ADC等新一代大分子外，也急需类似于EGFR TKI之于NSCLC的靶向药去横扫这个市场。 现在，这一切都成为了可能。 03 和誉——被低估的小而美 按照从前筛选港股biotech的标准来看，和誉在小市值biotech里质地是非常好的。 BD方面，和誉在去年12月与默克达成了BD的协议，授予了其在大中华区对ABSK021的独家商业化权利，研发与商业化里程碑付款达到6.055亿美元，此外还有超过10%的销售分成。以默克的商业化渠道来说，将比和誉自己搭建商业化团队放量减少相当大的成本，风险也小得多，是一个比较稳健的选择。 毕竟对一个还没有商业化产品上市的biotech而言，最重要的是通过第一个商业化单品“回血”，为之后更大规模的自研铺路。 而更为重要的是，默克除了拿到其大中华区的商业化权利外，还拿到了未来全球其它地球商业化权利的选择权，这也是和誉的三期临床试验做的是MRCT（国际多中心临床的原因）。默克大概率会根据之后三期临床的结果，来决定是否行使该期权，将该药物推向发达国家的市场，毕竟在药物定价方面，中国和欧美是有相当大差距的。这也是这次三期临床极为关键的原因所在，如果入组人种足够复合具有多样性，那么之后直接申报FDA等并不是不可能。 推向全球，在此一举。 当然，BD交易方也并不止默克。2023年3月，和誉与艾力斯就当时的一条临床前小分子管线——ABK3376达成BD，合同总金额达到了1.88亿美元，该分子由和誉发现，未来和誉和艾力斯将共同推进研发。该管线则是耳熟能详的EGFR-TKI抑制剂，它的潜力在于能够针对三代TKI耐药——即C797S突变的患者，这实际上已经有了四代TKI的雏形。 ABK3376已经于今年9月进入临床阶段。 （图片来源：公司官网） 估值方面，和誉目前的市净率仅为1.15，市值为26.84亿港元（10月24日），距离其过往的巅峰市值接近90亿港元还有很大一段距离，这当然与和誉还没有商业化单品有关，但目前而言以和誉稳定的BD结果来看，这个市值显然是被低估的。 结语：和誉目前主要的市值弹性在于ABSK021这波临床三期的催化，毕竟大概率是第一个商业化的单品，也有着best in class的潜力。但和誉公司的长期竞争力却不止于此，以目前公司的自研能力以及各大龙头与其BD的进展来看，未来成为国内小分子biotech的头部企业，并不是不可能。 免责声明 “药渡Daily”公众号所转载该篇文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。

摘要：腺相关病毒（AAV）是治疗遗传性疾病的新兴方法中的领先载体。为了更广泛的临床应用，需要更高的转导效率和细胞特异性，这激发了对病毒-宿主分子在细胞进入过程中相互作用的调查。高通量方法更全面地鉴定宿主蛋白，随后的分子研究揭示了意想不到的复杂性和血清型特异性。冷冻电子显微镜（cryo-EM）为这些有时是不均匀的病毒-宿主复合物的结构细节提供了一条途径，并且有望更充分地阐明进入的步骤。这里介绍的，是理解糖基附加和受体介导的进入/运输的不同步骤的进展。与抗体复合物的结构比较为免疫中和提供了新的见解，这对改进基因治疗载体的设计具有重要意义。 亮点 高分辨率冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构详细说明了腺相关病毒（AAV）受体蛋白的结合相互作用。AAV的糖基“主要受体”被重新定义为“附着因子”。AAV5类病毒与受体的不同结构域相互作用，其结合位点与其他AAV不同。许多AAV中和抗体的表位与衣壳上的受体结合位点重叠。未来的结构研究重点将放在AAV受体非依赖途径以及进入和运输的其他步骤上。 1.病毒-宿主相互作用：改进基因治疗载体的基础 AAV（见术语表）是一种小的单链DNA病毒，属于细小病毒科，其三个病毒衣壳蛋白（VP1、VP2和VP3）构成了一个二十面体对称的非包膜壳。由于野生型（wt）AAV具有广泛的组织趋向性和低致病性（作为复制缺陷的依赖性细小病毒），重组生产的AAV载体（rAAV）现在已成为治疗性基因传递的杰出载体，临床有效载荷取代了约4.7 kb的天然基因组。在过去的3年中，FDA批准了两种AAV疗法，LUXTURNA™（rAAV2用于RPE65相关视网膜营养不良）和ZOLGENSMA®（rAAV9用于脊髓性肌肉萎缩症）。尽管取得了成功，但目标特异性载体优化和更高的转导效率仍然是更广泛临床应用的关键。我们发现，每个被发现、工程化或衍生的AAV衣壳变体，都可以通过其独特的序列编码表型，揭示改善靶向、转导和免疫逃逸的线索。特别是AAV衣壳与宿主细胞进入因子的相互作用，一直是最近研究的焦点，并取得了令人兴奋的成果。 高通量筛选和结构测定的进步正在被AAV界用来识别和可视化对细胞转导至关重要的AAV-宿主分子相互作用。日益高分辨率的冷冻电镜（cryo-EM）结构有助于阐明受体、抗体和细胞表面糖基相互作用的分子决定因素。在这里，我们总结了当前对AAV进入因子及其鉴定的理解，以及高分辨率结构对未来载体设计的潜在影响。Riyad和Weber最近的一项综述提供了关于AAV进入和运输细胞过程的极好视角，而这里则强调了生物物理化学和分子相互作用的详细表征。 2.AAV细胞进入：事件序列 AAVs对细胞表面糖基的广泛附着被认为增加了通过增加与介导进入的跨膜受体蛋白的接触来内化的可能性。正如后面所详述的，特定糖基类型的表达可能会以血清型特异性的方式影响结合和内化，这可能会对趋向性产生潜在的影响。当我们考虑各种病毒-宿主细胞的相遇时，我们将需要区分成功的感染或转导所需的有效进入和运输，以及即使在非许可受体敲除突变体中也可能被检测到的背景“死路”内化。AAV病毒通过受体介导的内吞作用穿过质膜。特定的机制仍然是讨论的话题，但在识别AAV宿主附着因子和受体，并物理表征它们与衣壳的相互作用方面已经取得了实质性进展。附着因子和受体的术语被谨慎选择，以反映我们的新理解，混淆的潜力最好通过提供一些历史文献的背景来解决。 早期研究集中在血清型2上，将其作为模型AAV。在其中，硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）被证明对细胞结合和转导是必要的，并被认为是第一个已知的受体。不同的糖基随后被确定为其他血清型的特异性，例如，AAV5、-1、-6和-4的唾液酸（SIA）的组分，以及AAV9的半乳糖。这些蛋白多糖被称为“主要受体”，因为它们是细胞趋向性的决定因素，但也被认为需要其他蛋白质“核心受体”来进行内化。AAV-核心受体关联在覆盖层分析中最直接地被证实，但与其他已知病毒-受体对的结合亲和力从未建立，AAV-核心受体复合物仍有待分离。 正如在历史文献中使用的，“主要受体”可能适当地暗示了一个早期的相互作用，其中一个糖基的作用是低亲和力、广泛的附着，隔离和浓缩AAV在宿主细胞质膜上。通过类比其他病毒，我们将这些糖基（具体来说，蛋白多糖的糖胺聚糖部分）称为附着因子，这是现在需要与历史AAV文献不同的称呼。进一步复杂化的情况是，越来越多的证据表明，AAV2对HSPG的强结合可能是一种适应细胞培养中病毒传播的方式。根据最近的筛选结果，报道的核心受体也需要在功能上重新考虑。 3.AAV与细胞糖基的相互作用 到2014年，已确定了13种血清型中有8种使用的糖基。除了半乳糖（AAV9）[7]外，糖基带有负电荷：硫酸肝素（HS）用于AAV2、3B、6和13[6,8-10]，唾液酸（SIA）用于AAV1、5和6（α2-3和α2-6 N-连接）以及AAV4（α2-3 O-连接）。通常通过调节细胞表面糖基和/或糖胺类似物的竞争抑制后的转导测定来识别。 通过晶体学/电镜分析糖基复合物（表1）以及定点突变来确定AAV糖基结合位点。AAV2的晶体结构[1]允许Kleinschmidt和Muzyczka小组通过突变分析来表征位于Arg585和Arg588之间的RXXR基序作为肝素结合域（HBD）。在分辨率上，冷冻电镜开始时很难验证与结合肝素的微妙差异。一项研究似乎显示肝素在RXXR外某处结合，这与可能引起它们结合并触发病毒解壳的构象变化相合理化。另一项研究表明肝素片段缠绕在每个三重相邻的突起周围，由带正电荷的AAV2残基结合，包括前述的Arg585/Arg588。这种配置，没有提议的构象变化，将通过更高分辨率的冷冻电镜得到验证，其中可识别的硫酸根团确认了糖基与HBD紧密接触的位置。 表1. 带有附着因子、受体或抗体结构域的AAV结构 表1列出了与糖基附着因子模拟物（第一区块）、受体（AAVR）域（中央区块）以及针对这些衣壳的抗体结合的AAV复合物。b衣壳类型：wt，野生型；rAAV，重组腺相关病毒；VLP，病毒样颗粒。 3.1.结构生物学 - 中分辨率的挑战 由于技术进步（见下文）推动的冷冻电镜“分辨率革命”，自2010年以来EMDB数据库沉积物增加了十倍，对AAV结构病毒学的日益增长的影响引起了极大的兴奋。越来越多地，冷冻电镜可以在比晶体学更好的分辨率下进行，但并不总是能够实现，且分辨率并不总是在整个给定图中均匀的，后者对于解释即使是最新的结构也有影响。 当我们从原子模型分析生物学推断时，我们应该强调原子模型不是主要的可观察现象，而是在晶体学中从实验推导出的电子密度图，或在冷冻电镜中的电势图的解释。验证模型和估计准确性的方法对晶体学来说已经发展了多年，对冷冻电镜来说还没有成熟。通常未声明的是，准确性在冷冻电镜模型之间和内部有显著变化，因此对机械推断的信心也有所变化。即使在最高分辨率下，原子很少单独解决，通过识别化学基团并执行已知的立体化学（键长、角度等）来实现精度。因此，地图显示化学基团的独特特征的地方精度更高。蛋白质主链通常比更灵活的（模糊的）侧链和可能不那么牢固锚定的配体更可靠。冷冻电镜结构的部分可能有模糊的解释，有时很难区分真实特征和实验噪声。 在实践中，电子显微镜模型通常仅通过与理想立体化学的一致性来验证。然而，这只有在模型也适合独特地图特征时才有意义，因为仅优化立体化学是非常容易的。此外，由于空间限制，论文可能只展示最令人印象深刻的区域，因此建议下载地图和模型，检查对生物学结论重要区域的良好立体化学和适应独特地图特征，在差异图中检查一致性的敏感度。 3.2.糖基相互作用的细节 得益于更高分辨率的数据，AAV-糖基结合复合物的后续结构较少引起争议。对于AAV3B，与硫酸化蔗糖（SOS）的共晶体揭示了一个由三重轴上的三个Arg594副本独特形成的位点。AAV5与唾液酸（SIA）的晶体在3.5 Å分辨率下揭示了两个结合位点（A和B）。A位点也在三重轴上，当突变时显示SIA介导的转导减少，而B位点突变，位于五重轴附近，揭示了SIA独立的作用在转导中。对于AAV1，三糖浸泡的晶体揭示了三重轴突起底部的五重轴上的SIA位点，相应位点在同源AAV6中的突变证实了其作用。 一个重要的警告是，高分辨率结构使用生物相关多糖的短模拟物。单糖官能团、异构体和连接的多样性使均匀试剂的合成复杂化，并且糖基的添加通常对病毒晶体具有破坏性。高分辨率冷冻电镜需要均匀的糖基，因为重建需要平均许多颗粒。然而，在体内，这种多样性肯定占主导地位，并且可能是功能性的。通过表面等离子共振（SPR），肝素类的亲和力随着链长增加而增加，直到n = 5，可能对应于单个结合位点，然后在n = 16时再次增加，足够长以与AAV2上的第二个与对称性相关的结合位点结合。使用小模拟物的高分辨率结构显示了每个位点的核心相互作用，但没有显示更长聚合物如何可能在多个位点结合。 通过将配体结合结构（和突变位点）叠加到AAV1上，比较了不同的血清型。代表性的糖基位点稍后在AAVR蛋白受体结合分析中进行了说明（见图2）。结合位点围绕AAV表面突起，特别是在它们之间的三重凹陷处。从这里，一条山谷通向两重轴，由于地形的原因，它在免疫监视下受到一些保护，也许受到的选择压力较小。虽然不同血清型的糖基结合位点看起来在类似的位置，但它们没有在系统发育上对齐的氨基酸。例如，HBD的Arg585/Arg588，特别是高肝素亲和力是AAV2独有的。血清型特异性的糖基结合为重新定位基因治疗载体带来了希望，而广泛的相互作用多样性引发了一个问题，即糖基结合机制是冗余的还是累加的。 我们发现，AAV2和/或AAV3样肝素位点的糖基结合和转导都可以在嵌合体中调节。通过将类似AAV9的半乳糖结合位点移植到AAV2中，也可以增加转导效率。人们强调了对载体工程的影响，但也有助于对AAV的糖基相互作用是大量、累加和非特异性特征的日益认识。糖基阵列已经测量了不同类型的SIA的结合差异，Linhardt和Chapman小组测量了AAV2和AAV-DJ对合成肝素类的文库的亲和力。令人惊讶的是，几种肝素类比涉及细胞感染的HS具有更强的结合力。Heilbronn小组对AAV1、4、5和6的SIA亚型特异性，以及AAV3和AAV2的肝素特异性的阵列分析也发现了类似的结果。不同的糖基偏好可能对组织和宿主范围很重要，如流感病毒，可能对载体工程有影响，但另一个不可避免的结论是：糖基特异性很低。 还需要改进的冷冻电镜来解决化学均匀的小合成糖基模拟物。我们在4.8 Å分辨率下看到的AAV-DJ与SOS的复合物，以及在2.8 Å分辨率下看到的五糖fondaparinux，证实了直接在HBD处的结合，并揭示了能够适应不同糖基序列的硫酸的侧链相互作用。低特异性因此得到了结构上的合理化。 3.3.变革的种子 如果没有糖基，那么报道的核心受体（如FGFR1、HGFR、EGFR、PDGFR、LamR和alphaVbeta5整合素）是主要的特异性介导者吗？我们尝试将核心受体外细胞结构构建与AAV2体外结合，并通过siRNA敲除进行转导抑制，但未成功。实验并不全面，对负面结果的原因也不明确，但对这些核心受体的角色越来越担忧。后来，CRISPR-Cas9敲除表明核心受体对转导的影响远小于糖基附着因子或AAVR。核心受体可能在进入中起辅助作用，但也有可能它们的调节通过改变信号影响转导。 我们担心AAV进入的主要决定因素尚未被识别：（i）糖基相互作用的特异性低于预期的经典受体， （ii）核心受体-AAV复合物的生物物理表征证明是难以处理的。使用新兴技术进行无偏见的重新检查是必要的，用于全基因组筛选。 4.AAV受体的鉴定 4.1.与新兴的全基因组筛选的共识 多种技术进步已经增进了我们对AAV感染（或载体转导）的理解。siRNA敲减筛选是首先识别出多种宿主因子的方法，包括干扰素反应、DNA修复、细胞检查点、RNA剪接和SUMOylation。令人惊讶的是，siRNA敲减对转导只有适度的影响，筛选也没有突出当时的候选细胞核心受体。 敲除筛选更具决定性。这首先在一种近乎单倍体的人类细胞系（Hap1）和一种衍生的基因陷阱库中成为可能，该库具有随机位置的单基因敲除，已证明在鉴定流感病毒和埃博拉病毒的受体。通过选择表现出抗性的突变细胞，然后进行深度测序，鉴定了感染所需的宿主基因。对于AAV，Carette和Chapman小组使用编码荧光的rAAV载体，并迭代使用荧光激活细胞分选（FACS），选择转导抗性。深度测序富含AAV抗性引起的突变的细胞，鉴定了进一步通过CRISPR-Cas9和其他方法表征的基因。现在，使用CRISPR-Cas9库的类似筛选已经证实了这些结果，并鉴定了额外的宿主因子。虽然预计结果会因不同的库技术和选择方法而有所不同，但Meisen等人已经通过针对八种AAV血清型的双重筛选测试，证实了KIAA0319L、GPR108、TM9SF2和其他几个顶级命中的重要性（表2）。 Table 2. 与AAV进入相关的细胞蛋白 a人类基因，这些基因编码跨膜蛋白、糖基生物合成或内质网/高尔基体运输，它们通过全基因组筛选被认为与AAV2转导有关，根据每个筛选中结果的统计显著性进行排名。b缩写：不适用。*在Meisen等人的筛选中，只在一个筛选中被识别，而不是两个筛选都被识别。 值得注意的是，GPR108也作为另一个筛选中的下游因子出现，该筛选使用了在AAVRKO背景下准备的GeCKO库，使用AAVR非依赖性载体AAVrh32.33进行探测，试图表征AAVR非依赖性途径。Pillay等人和Meisen等人研究之间的一致性为结果提供了信心。在Pillay等人的前50个筛选命中中，有37个与膜相关（高尔基体或内体）或参与糖基合成（表2）。 应该注意到敲除筛选的警告。首先，细胞库不包含是致命的突变或在细胞复制所需的基因中。其次，选择是通过降低转导来进行的，所以通过突变AAV限制因子（如核DNA损伤反应元件）增强转导没有被记录。最后，最重要的敲除比siRNA抑制报告的影响更大，而且可能在一组具有冗余功能的基因中发生突变不会被认为是显著影响。这种考虑与在核中与载体基因组的宿主分子相互作用有关，这些内容在其他地方进行了综述。 4.2.  AAVR作为进入/运输因子 基因陷阱产生了50多个基因，在为AAV抗性选择的细胞中具有很高的敲除频率（表2列出了一个子集）。排名第一的是KIAA0319L，它编码一个特性较差的膜蛋白，该蛋白似乎短暂出现在细胞表面，但主要位于核周的跨高尔基体。它可能作为回收受体本地功能，用于未知配体，而AAV可能已经进化到利用逆行KIAA0319L受体运输。 通过CRISPR-Cas9敲除和在HeLa细胞中的补充，以及在八个细胞系中，验证了七个AAV血清型对KIAA0319L的需求。AAV2的转导被抗KIAA0319L抗体或竞争KIAA0319L外细胞结构域抑制，而在体内，KIAA0319L KOs在转基因小鼠中废除了载体转导。因此，KIAA0319L具有以前从未为AAV建立的病毒进入受体的特征。由于没有经过充分表征的功能，KIAA0319L被命名为AAVR，即AAV受体。 5.AAVR的特性及其与AAV的相互作用 5.1.域结构与作用 AAVR具有单个跨膜区域和短的C末端细胞质域，该域需要逆行运输至跨高尔基体网络（TGN）。其外细胞结构域，与AAV的衣壳结合，包括五个串联的Ig样PKD（多囊肾病）域、一个MANEC域和一个N末端信号肽。在Hap1 AAVRKO细胞中表达PKD缺失突变体显示，进入决定因素位于N末端PKD域1-3，并且通过ELISA检测到AAV2结合位点。高亲和力，通过SPR估计的KD约为~150 nM，表明强结合特异性。复合物的稳定性和涉及域的鉴定允许进行结构分析，这对于之前报道的核心受体已经证明是难以处理的。 5.2.冷冻电镜下的高分辨率AAV结构 得益于冷冻电镜技术的戏剧性进步，现在可以对病毒-宿主相互作用进行结构表征。改进包括直接电子探测器、帧收集和束流诱导运动校正、更稳定的透镜以及用于对异质复合物进行对齐和分类的算法。第一个AAV结构，AAV2在~3 Å分辨率，来自2002年的X射线衍射。多年来，冷冻电镜为难以结晶的复合物提供了低分辨率结构，但现在冷冻电镜经常等于或超过X射线分辨率。病毒组装的体型大和对称性使它们特别容易处理。偶尔，实现了异常分辨率，AAV-DJ在1.56 Å下，是分辨率最高的生物分子冷冻电镜结构之一。冷冻电镜现在也在为与蛋白质受体的复合物提供原子结构的路径，这些受体的结晶将非常困难或不可能。 5.3.AAV2-AAVR结构 冷冻电镜已经定义了受体结合足迹，这对血清型特异性和宿主免疫有影响（表1）。2019年发表了两项研究。Zhang等人使用包含所有五个PKD域的构建，在他们的2.8 Å EM图中看到了其中之一。Meyer等人结合了类似复合物的较低分辨率冷冻电子断层扫描（cryo-ET），揭示了更灵活的域，并从2.4 Å的冷冻电镜中获得了细节，来自两个域复合物（PKD1-2）。两个高分辨率图（2.4和2.8 Å）都只显示每个三重轴周围的突起上紧密结合的一个AAVR域。独特的侧链识别它为PKD2。其他域只通过低分辨率冷冻ET看到，它不假设二十面体对称性，从而揭示了AAVR的低分辨率轮廓，未结合域以几种配置连接。PKD1-2复合物中PKD2的精炼占据率为0.59，反映了部分结合和更高的无序性（比病毒），但它足够高，可以排除PKD1-2结合到对称病毒表面上邻近位点的冲突。 AAV2-AAVR结构相似，两者都得到定点突变的支持。Zhang等人报告了针对观察到的界面的突变，而Meyer等人分析了Colosi实验室的98个替代在64个表面位点上的数据。Muzyczka实验室的数据添加在图1D中。虽然不是完全隔离的，但影响转导的突变（红色）在PKD2接触界面内更为普遍。不足为奇的是，一些结合位点残基的保守突变影响很小（绿色）。值得注意的是，当比较不同实验室的结果或在同一位点分析多个替代时，测量转导的变化很大（橙色），提醒我们，需要冗余数据才能进行稳健的表型推断。 图 1. 腺相关病毒（AAV）与AAV受体（AAVR）的相互作用位点。(A) AAV2衣壳结构具有五个、三个和两重对称轴（箭头），共有60个与AAVR PKD2（青色）等效的结合位点。这些与AAV5上的PKD1位点在映射到AAV2时（黄色）有所不同。红色框架勾勒出后续面板的视图。(B,C) 在AAV2和AAV5复合物的冷冻电镜（cryo-EM）结构上，显示了AAVR PKD2和PKD1（及其对称等价物）的青色和黄色主链轨迹。每个实验结构仅显示一个域，但在这里通过叠加结构添加了另一个域。在AAV5复合物中，可以看到AAVR PKD1，残基S392–K399（PKD1），在AAV2复合物中，残基N405–V499（PKD2）可以被看到。对于AAV2（而不是AAV5），PKD1和PKD2都有助于结合，尽管只有单个域在高分辨率下被解析。尽管将两个叠加的结构连接起来很诱人，但这将需要移动域以便连接链能够到达。(D) AAV2的表面根据氨基酸对细胞转导的影响着色。单点突变从多个来源综合而来，按照从红色（转导消除）到绿色（中性/增强）的规模着色。对于不同作者或同一位点的不同替代，增加了黄色调。（通过结构比对添加了AAV1的突变数据。）(E) AAV5的表面使用可用的突变数据进行类似的着色。另见在线补充信息中的图S1–S5，对应于A–E面板。 5.4.AAVs展示不同的AAVR结合模式 在AAV2-AAVR复合物的结构之后，报道了AAV5与AAVR PKD1-5的复合物在3.2 Å分辨率下。同样，只看到一个域，但现在是PKD1，与之前的结合、转导和覆盖一致。PKD1的图特征较弱，平均约为AAV-5内类似特征强度的40%。如果图的弱点主要是由于未饱和结合，PKD1应该均匀地弱。然而，PKD1在与AAV5的三重轴突起结合界面附近显得强大，并逐渐减弱，向域的N末端，靠近五重轴。这与由于旋转无序而增加的模糊一致。对于最靠近五重轴的三分之一域，主链特征低于1σ显著性，在该区域，除了定位同源模型（如PDBid：2E7M）之外，不应解释为超出范围。即使在PKD1-2 AAV5复合物的更高（2.5 Å）分辨率结构中，只有在域的结合端才能看到预期的这种分辨率的细节。如果PKD1的C末端端被AAV5强相互作用锚定，旋转这个支点导致远离结合位点的逐渐无序，那么两个结构都可以合理化。 最值得注意的是PKD1在AAV5上和PKD2在AAV2上的近乎独特的足迹，它们仅在V708AAV2/Q697AAV5处相交（图1B,C）。PKD1的N末端接近AAV5的五重轴，然后该域横跨峡谷，其C末端锚定在三重突起的二重侧[靠近AAV5的Y542、N546、F698和R710以及可变区（VR）VII和IX环，图1C]。如果将AAV2和AAV5复合物叠加，PKD2（来自AAV2）从Asn405开始，距离AAV5中PKD1的C末端Lys399 19 Å，爬上另一个突起的肩部（通过五重对称性相关）其C末端靠近顶部。对于AAV2，尽管只有PKD2紧密结合到足以进行高分辨率可视化，PKD1也增加了相互作用。然而，看到的域与AAV5和AAV2不能通过看不见的五残基域连接子以立体化学上合理的配置连接。人们只能推测，PKD1和PKD2与类似AAV2的病毒的相互作用在进入的不同时间点，这些域来自不同的AAVR亚基，或者涉及构象重排。 来自一些AAV5丙氨酸替代突变体的低转导表型的证据支持了不同的AAVR足迹（红色，图1E），但并非全部（绿色），注意到突变数据并不像AAV2那样全面（图1E）。与早期的推测相关，AAV2表面，对应于AAV5上的PKD1足迹，包含一些突变会引起对转导的显著影响的残基，以及一些突变影响微不足道的残基（图1E）。 两种结构中PKD1之间的差异（2.3 Å rms）大于3 Å分辨率下预期的误差，尽管基本相似。统计数据被扩大了，因为域的N末端附近差异高达10 Å，相邻环（334-336和386-387）的背骨差异为2 Å，该区域的图很弱，以及Gly361附近的路径不清晰时差异为6 Å。 Zhang等人的原子模型有AAVR Val305与AAV5 Ser319相互作用，但是N末端区域在两个图中都不清楚。当低通滤波到10 Å时，在这个分辨率下主链无法解析，PKD1的包络清晰，并认为结构可能与同源物相似，没有差异允许N末端区域与AAV5在Zhang等人的模型中相互作用。的确，很可能缺少这样的相互作用允许域围绕其C末端旋转，解释了图中观察到的无序。 在其C末端，PKD1通过其与AAV5的相互作用被锁定到位。与2.1 Å未结合结构比较，AAV5诱导的变化很小。在2.5 Å分辨率下可视化复合物可以识别推定的氢键和盐桥。特别值得注意的是AAV5表面上的两个负电荷口袋，AAVR Arg353和His351（PKD1的）插入其中。 AAV-1与AAVR的复合物结构与AAV2非常相似。这与早期的域敲除结果一致，对于AAV1和AAV8，像AAV2一样，关键的要求是PKD2，但PKD1比AAV2有更大的影响。类似AAV4的病毒不与AAVR结合，AAV5（和很可能类似的病毒）仅与PKD1结合，但是考虑到AAV1、2和8代表了AAVs最大分支的系统发育多样性，很可能，除了已知的例外，AAV2代表了其他AAVs。然而，足迹内序列变异如何更微妙地调节相互作用还有待确定。 5.5.AAVR受体结合与糖基附着 在分析了AAV2、AAV5和AAV1之后，Zhang等人得出结论，AAVR结合与糖基附着无关。虽然对AAV5来说可能正确，但对于大多数AAVs来说，以AAV1和AAV2为例，考虑到病毒的对称性，PKD2足迹与糖基附着位点重叠（图2）。在图2中，与AAVR结合的冲突被低估了，因为小模拟物在结构中是生物相关多糖的替代品。在类似AAV2的病毒上，AAVR结合似乎与糖基附着竞争。因此，如果糖基和AAVR同时参与，它必须是在AAV2的不同对称等位点上。图1还显示，PKD2糖基化位点远离病毒，表明是其他细胞表面糖基介导附着。 图 2. 腺相关病毒受体（AAVR）结合位点与糖基附加位点的比较。AAV2（棕色）和AAVR（青色PKD2）如主文本图2B所示。叠加上的是fondaparinux（空间填充，灰色碳原子），一种肝素类似物，来自AAV2复合物，以及唾液酸（SIA，绿色碳原子）来自AAV1复合物，以及它们的对称等价物。还指出了来自与AAV3B的低分辨率复合物的蔗糖八硫酸盐（SOS）的位点，AAV3B是一种使用精氨酸（R594）在三重表面上结合肝素硫酸蛋白多糖（HSPG）的血清型。AAV5的SIA 'A'位点映射到相同的SOS区域，而涉及AAV4和AAV6糖基附加的残基也接近三重凹陷。AAVR的糖基化位点，Asn472和Asn487向外，远离AAV，表明AAV附着到其他细胞外糖基，这与AAVR的结合不依赖于其糖基化一致。AAV上的糖基附加位点是通过使用比细胞外糖基小得多的类似物揭示的。可以想象，结合的多糖与AAVR PKD2之间存在广泛的冲突，这意味着，如果两者都结合在类似AAV2的复合物中，那么必须是结合在病毒上不同的对称等价位点上。对于较小的AAV5样病毒组，三重位点上的'A'位点，涉及SIA依赖的转导，与AAVR的PKD1结合位点相距较远。另见在线补充信息中图S6的相应立体图。 5.6.抗体和AAVR足迹的重叠 尽管结构相似，但两篇论文在评估AAVR结合位点与强烈中和单抗A20[61,62]表位的重叠程度上有所不同。当考虑到二十面体病毒对称性，在叠加结合蛋白的结构时，AAVR与Fab′ A20表位的核心重叠（图3A）。Meyer等人报告了与AAV2中和抗体和其他表位的重叠，并提出AAVR结合的竞争性抑制，因此病毒进入，可能是AAVR依赖血清型中和的几种可能机制之一。 图 3. 腺相关病毒受体（AAVR）与抗体足迹的比较。视图方向和颜色方案与主文本图1中的相似。(A) AAV2与AAVR（青色）和单克隆抗体（mAb）A20（红色）的复合物结构被叠加，突出显示了重叠，暗示进入抑制可能是中和机制。(B) PKD1的足迹与AAV5中和抗体（NAb）ADK5b （蓝色）的接触面有广泛的重叠，但与NAb HL2476（白色/绿色）没有重叠。(C) 突出显示了被认为是非中和性的抗-AAV5单克隆抗体的接触面：3C5为蓝色，ADK5a为洋红色，两者均为紫色。AAVR与ADK5a之间的重叠之前没有预料到，但在高ADK5a浓度下现在已经报道了竞争性结合抑制。另见在线补充信息中图S7-S9的相应立体图。 对于AAV5，PKD1结合位点与中和抗体ADK5b的重叠程度令人惊叹（图3B）。对AAV5的重叠评估更加困难，因为相关抗体结构没有存放在公共数据库中（表1）。PKD1和NAb HL2476（图3B）的AAV5接触残基是不同的，但复合物的插图表明在AAV5表面以上几埃的地方可能存在冲突。对于mAb 3C5和ADK5a（图3C），可以提出类似的论点，据报道它们是非中和性的。的确，ADK5a和AAVR之间的竞争现在已经通过实验确定，这引发了ADK5a可能在比以前测试的更高滴度下具有中和性的可能性。 空间重叠只是决定抗体能否在体内保护免受AAVR介导进入的几种决定因素之一。每个衣壳上有60个对称等价的结合位点，抑制程度将取决于抗体结合强度和饱和度。抗体可能通过多种机制中和AAV。然而，随着我们最近认识到基于糖基的附着和AAVR介导的进入是不同的，细胞结合不能再被假定为感染性的代理。是时候重新评估中和机制了，进入抑制可能比之前认为的更常见。 6.超越AAVR，一个并非完全普遍的受体 多项研究表明，40多个宿主基因影响AAV转导（表2）。虽然AAVR最初是研究的焦点，但其他基因可能在进入和运输中发挥作用。它们可能是AAVR的合作伙伴，或者在AAVR介导的途径上与AAV在不同步骤发生相互作用。有些可能还在AAVR非依赖性进入中发挥作用，稍后将讨论。需要注意的是，涉及的基因产物并不一定直接与AAV相互作用，但可能调节所需的细胞功能，特别是糖基合成和内体运输。注释潜在角色，并充分表征最感兴趣的角色是一项艰巨的任务，才刚刚开始（见未解决问题）。 正如前面提到的，Dudek等人揭示了AAVR非依赖性AAV菌株。他们在转导野生型和AAVRKO A549、HeLa和Huh7细胞中测试了18种自然分离株，以及定向进化变体和假定的祖先构建物。AAV4（源自非洲绿猴）和相关的猕猴衍生嵌合体AAVrh32.33在AAVRKO细胞中以野生型水平转导，表明存在替代的进入途径/受体。有趣的是，对于AAVR依赖性AAV6.2和AAV3，加入辅助病毒Ad5在AAVRKO细胞中产生了一些转导，这表明进入机制的复杂性需要进一步考虑。 6.1.探索其他候选宿主因子 AAVR非依赖性AAV4样类群的发现，重新聚焦了对G蛋白偶联受体GPR108的关注，它在基因陷阱筛选中突变频率排名第三，并且在AAVRKO背景下筛选CRISPR敲除库时变得突出。事实证明，它不仅对AAVR非依赖性AAVrh32.33很重要，而且是许多AAVR依赖性血清型（除了AAV5）的第二个要求。然而，对于这些血清型，GPR108的过度表达并不能补偿AAVR的缺失。Dudek等人将GPR108依赖性定位于VP1u区域，该区域在内体逃逸之前的构象变化中被隐藏在AAV衣壳内。这和GPR108在TGN的位置暗示了它在运输到核周区域或内体释放中的下游作用。GPR108也最近被Meisen等人的CRISPR筛选所涉及。它的确切作用机制、与AAV的关联表征以及分子相互作用的映射仍是优先事项。 在基因陷阱和CRISPR筛选中被涉及的是ATP2C1（表2），编码SPCA1钙泵。ATP2C1的敲除降低了多种AAV血清型的转导，但可以通过细胞内Ca2+螯合剂来挽救。影响可能主要是间接的：低Ca2+似乎需要触发VP1u的暴露，但可能存在多效性效应。TM9SF2在基因陷阱列表中排名第四，并被CRISPR筛选所涉及。Meisen等人验证了它的重要性，并提出它可能通过适当定位NDST1来支持用作附着因子的糖基合成，而不是与AAV直接关联。反过来，NDST1与其他筛选命中的EXT2和SLC35B2在HS合成中起作用，可能是以MOI依赖的方式。已经对GPR108、ATP2C1、TM9SF2和NDST1（表2）进行了部分表征的工作强调了完成我们对AAV附着、进入、运输和解壳的理解所需的工作。 7.AAV库筛选将功能映射到衣壳结构 对受体介导进入的理解进展（前面讨论）始于对宿主细胞基因组的系统探测，但也可以查询病毒基因组。Nakai实验室开发的丙氨酸扫描突变体的条形码库，例如，允许在Illumina条形码测序后，使用KIAA0319L敲除突变体特异性非编码标签，将可选择表型映射到衣壳结构。这为开发改进载体的库筛选设计提供了信息，并有助于定位参与受体结合、中和抗体逃逸和血液清除等表型的相互作用位点，补充了结构研究。 Church实验室的一个令人兴奋的发展是对所有单密码子替代、插入和删除的病毒库的表型进行了分类。一个新的开放阅读框（ORF）被涉及在衣壳组装中，并且为高效选择所需的衣壳特性指明了路径。通过成功比较中和逃逸突变体的分布与之前AAV2与单抗（mAb）A20结合的结构，证明了研究病毒相互作用的潜力。 未解决问题： AAV2样和AAV5样组内AAVR足迹的血清型变异程度有多大？ AAV血清型和载体变体的宿主特异性（或组织特异性）能否通过AAVR相互作用合理化？ AAV在细胞进入时必须与哪些其他宿主因子相互作用？ 在AAVRKO背景下使用敲除库，GPR108被确定为AAV-4样AAVR非依赖性病毒所必需，但也增强了许多AAVR依赖性病毒的转导。 能否通过在双重敲除中准备的库对AAVR和GPR108依赖性血清型进行额外筛选来识别替代途径？ 使用敲除库涉及的约40个宿主基因产物中，哪些与AAV有直接相互作用，哪些只是支持AAV所需的细胞过程？ 有证据表明更高阶的相互作用吗，即AAV与一个宿主蛋白的相互作用是否取决于其他宿主因子的存在？ 关键宿主因子在细胞进入、运输和解壳的哪些阶段参与？ 有任何必需的宿主因子介导AAV所需的构象转变吗？ 受体能通过差异表达、亚型、翻译后修饰等，调节AAV的组织特异性吗？ AAV对细胞的转导能否通过受体结合界面的突变在上调和下调中调节？ 中和抗体的表位在多大程度上也是受体相互作用的关键？能在保持细胞转导效率的同时设计出免疫逃逸载体吗？ 8.结论 虽然AAV已成为许多新批准的临床基因治疗的首选载体，但在传递效率和特异性以及对所需高剂量的免疫反应方面仍存在挑战。为了工程化解决方案，我们应该解决我们对AAV-宿主相互作用基本分子理解上的空白。最重要的是AAV进入细胞的机制。 我们可以很容易地想象受体相互作用作为AAV细胞特异性的决定因素。在调节细胞趋向性方面将面临许多挑战，包括现在明显的关键受体AAVR的高度保守性。在短期内可能对AAV载体进行修改以减少免疫中和，并且至关重要的是要了解病毒的哪些部分参与了对进入至关重要的相互作用，并且在免疫调节方面是禁区。 我们的理解在5年内发生了多么大的变化是令人惊讶的。糖基已从“主要受体”降级为低特异性附着因子。全基因组筛选已经鉴定出几个对转导影响更大的宿主蛋白，而不是糖基或之前报道的核心受体。其中最重要的是AAVR，它在运输中很重要，GPR108在下游过程中很重要，这些过程尚待阐明。 到目前为止，只有AAVR的相互作用通过最近的冷冻电镜进展进行了详细表征。它产生了自己的惊喜。我们仍然需要解释AAV2和AAV5的相互作用为何如此不同。我们还看到AAVR与抗体结合之间的干扰比预期的细胞结合试验要多，促使我们重新评估我们对中和机制的了解。可以预期，AAV与其他宿主分子的相互作用的表征将提供对转导至关重要的过程的见解，我们可能现在还无法想象，这将为改进载体的设计提供更加坚实的基础。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。