EGLN2

引言Von Hippel-Lindau（VHL）蛋白在明确细胞肾细胞癌（ccRCC）中经常发生突变，是氧化应激中涉及的缺氧诱导因子（HIF）的主要调节因子。然而，VHL是否具有HIF-独立的抑制肿瘤活性仍然不太清楚。2024年2月15日，浙江大学许大千、吕志民及哈尔滨医科大学雷博共同通讯在EMBO Journal 在线发表题为“VHL suppresses autophagy and tumor growth through PHD1-dependent Beclin1 hydroxylation”的研究论文，该研究证明VHL抑制营养应激诱导的自噬，其在散发性ccRCC标本中的缺失与自噬水平显著升高，并与患者预后较差相关。在机制上，VHL直接结合自噬调节因子Beclin1，其在Pro54上的PHD1介导的羟基化之后。这种结合抑制Beclin1-VPS34复合物与ATG14L的结合，从而抑制了营养缺乏时的自噬起始。非羟基化的Beclin1 P54A的表达使VHL介导的自噬抑制失效，并显著减少了VHL的肿瘤抑制效应。此外，Beclin1 P54-OH水平与野生型VHL表达的人ccRCC标本中的自噬水平呈负相关，并与患者预后不良相关。此外，将VHL缺失的小鼠肿瘤与自噬抑制剂和HIF2α抑制剂联合治疗能够抑制肿瘤生长。这些发现揭示了VHL抑制肿瘤生长的一个意想不到的机制，并暗示了通过联合抑制自噬和HIF2α治疗ccRCC的潜在方法。Von Hippel-Lindau（VHL）肿瘤抑制基因的体细胞突变在散发性肾细胞癌（RCC）中普遍存在，其中明确细胞肾细胞癌（ccRCC）是最常见的亚型。VHL蛋白（VHL）作为一个伏林支架蛋白（CUL2）-环泛素连接酶复合物的底物识别模块，结合到缺氧诱导因子（HIF）1/2α上。这种结合依赖于HIF1/2α中两个保守脯氨酸残基的水化，由脯氨酸羟化酶酶（PHD1，又称EGLN2）、PHD2（EGLN1）和PHD3（EGLN3）催化，这些酶需要氧气作为辅基质。因此，PHD介导的HIF1/2α水化导致VHL介导的HIF1/2α泛素化和在正常氧化条件下降解，但在低氧条件下，PHD的活性被低氧水平抑制，导致增强的HIF1/2α表达诱导下游基因表达。VHL患者肾脏中出现的VHL缺陷病变显示出HIF和HIF靶基因的增加，小鼠VHL–/– ccRCC异种移植实验显示HIF2α促进肿瘤的作用，而HIF1α限制肿瘤的作用。然而，一些VHL–/–ccRCC细胞系不受HIF2α活性操纵的影响，一些VHL突变的ccRCC对HIF2α抑制剂治疗具有抵抗性，这表明VHL缺陷通过尚未确定的和与HIF2α无关的机制促进肿瘤发展。模式图（Credit: EMBO Journal）自噬在癌细胞中经常失调，并在肿瘤发生中起着关键作用。癌细胞可以具有高水平的基础自噬，通过利用自噬分解产物，如氨基酸、核苷酸、碳水化合物和脂肪酸，进行生物合成和能量生成，来增加自噬，从而生存于微环境应激，并增加生长和侵袭性。在自噬启动期间，自噬体核形成需要一个复合物，在这个复合物中，哺乳动物Beclin1（酵母中的APG6）招募III型磷脂酰肌醇3激酶VPS34来生成磷脂酰肌醇3磷酸（PI（3）P），以便结合具有PI（3）P结合结构域的蛋白质，从而调节细胞内的内部运输和自噬体形成。与VPS34形成复合物的ATG14L与Beclin1相互作用，并将VPS34以及其膜锚VPS15靶向到前自噬体结构，并促进自噬体-内吞体融合。除了通过含有ATG14L的Beclin1/VPS34调节自噬外，Beclin1/VPS34还形成与UV辐射抵抗相关基因（UVRAG）的不同复合物，以调节内吞运输。AMP激活的蛋白激酶（AMPK）、雷帕霉素抑制的机械靶向拉帕霉素样激酶-1（ULK1）、磷酸甘油酸激酶-1（PGK1）和Bcl-2依赖的调节Beclin1/VPS34/ATG14复合物在自噬活动中发挥重要作用。然而，肿瘤抑制因子是否以肿瘤类型特异的方式直接和差异地调节Beclin1/VPS34/ATG14L复合物活性和自噬仍然未知。该研究证明VHL通过直接与由PHD1水化的Beclin1结合并抑制ATG14与Beclin1/VPS34的结合来抑制ccRCC细胞中营养应激诱导的自噬。Beclin1 P54A敲入表达使VHL介导的自噬抑制失效，并促进肿瘤生长。原文链接https://doi.org/10.1038/s44318-024-00051-2责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文Nature | 癌症与神经系统的致命舞蹈

2023年7月19日，Nature(《自然》)杂志在线发表清华大学李海涛课题组携手清华大学闫创业课题组、上海交通大学李兵课题组合作完成的题为“ Diverse modes of H3K36me3-guided nucleosomal deacetylation by Rpd3S ”（H3K36me3指引下的多模式Rpd3S核小体去乙酰化）的研究长文。研究团队通过化学生物学手段构建人工修饰核小体，利用单颗粒冷冻电镜技术解析了酵母Class-I类型组蛋白去乙酰化酶复合物Rpd3S的自由态和H3K36me3核小体结合态下的结构，并结合去乙酰化酶活分析以及酵母遗传学等功能实验，全面地对Rpd3S复合物的组装模式、底物识别催化和修饰介导调控等过程进行了分子机制解剖，揭示出甲基化指引的染色质去乙酰化动态和多样化模型。组蛋白去乙酰化酶分为多个亚家族，常常形成样式繁多的功能复合物，通过在不同染色质区域去除乙酰化发挥基因抑制功能。本项围绕Rpd3S的研究成果首次系统揭示了Class-I类型HDAC复合物发挥功能的结构基础，凸显了表观遗传调控的精妙复杂性，完美展示出大自然通过形成多亚基大分子复合物机器来获得高阶调控能力的精巧设计。研究表明，人体中Rpd3S复合物同源蛋白Sin3B的异常激活或表达与肿瘤发生有关，尤其涉及到肿瘤抑制基因和细胞周期调控基因。依赖于上下游修饰的动态组蛋白修饰调控是基因转录过程中的重要表观遗传机制。例如，组蛋白H3第4位赖氨酸的三甲基化修饰（H3K4me3）和H3第36位赖氨酸的三甲基化修饰（H3K36me3）是区分转录起始位点和转录编码区域的标志【1, 2】。在酵母中，组蛋白甲基转移酶Set2可以被RNA聚合酶II直接募集，并特异性甲基化H3K36位点。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）Rpd3S复合物在转录编码区域被H3K36me3修饰所招募，并通过其去乙酰化酶活性抑制异常启动子的转录【3, 4】。因此，Set2-Rpd3S调控通路介导了H3K36甲基化和组蛋白去乙酰化的偶联从而维持基因的正常转录延伸并防止异常转录发生。Rpd3最初被认为是一种全局基因调控因子和共抑制因子，1996年首次报道其作为HDAC发挥作用【5, 6】。这一发现，与同年组蛋白乙酰转移酶GCN5转录共激活功能的突破性发现，奠定了现代表观遗传学新范式。在酵母中，Rpd3与Sin3、Ume1、Rco1和Eaf3进行组装形成0.6-MDa的Rpd3S复合物，通过Eaf3亚基的CHD结构域识别H3K36me3和Rco1的PHD结构域识别未修饰的组蛋白H3 N-端尾部（H3K4un）来定位与调控【7-9】。然而长久以来，Rpd3S复合物催化修饰核小体底物的分子识别模式及其去除组蛋白H3、H4各位点乙酰化修饰的特异性催化机理都缺乏深入的研究。李海涛合作团队通过样品制备条件的优化，利用冷冻电子显微镜技术（cryo-EM）解析出Rpd3S复合物的3.2 Å分辨率的电镜结构。研究成果展示出Rpd3S复合物的独特分子结构，其中双拷贝的Eaf3和Rco1蛋白形成异源二聚体与Rpd3和Sin3不对称地结合形成一个催化核心复合物，而核心催化酶Rpd3受到其他亚基共同的复杂调控。同时两分子Eaf3-Rco1异源二聚体呈现出不对称组装方式，类似于两个手臂介导Rpd3S复合物的酶活催化。与此同时，李海涛研究团队结合复合物分子模型和ITC等生化技术重新定义了Rco1两个PHD结构域的识别互作机理：PHD1参与识别H3K4un并介导复合物的催化与定位；PHD2主要作为组装模块确保复合物组装的稳定性，但缺失组蛋白修饰的识别能力（图1）。图1. Rpd3S复合物的整体结构以及亚基间的相互作用与调控随后李海涛研究团队利用修饰多肽分段合成和化学连接方式合成了多种修饰组蛋白，包括H3K36me3H3K9acK14acK18acK23acK27acH3K9acK14acK18acK23acK27acK36me3H3K4me3K9acK14acK18acK23acK27acK36me3H3K9RK14acK18acK23acK27acK36me3H4K5acK8acK12acK16ac等修饰，并构建出复合修饰核小体底物以用于后续结构生物学和生化酶活研究。依托人工合成的修饰核小体以及进一步优化样品制备条件，李海涛合作团队成功解析出两种状态的Rpd3S- H3K36me3修饰核小体的结合催化复合物电镜结构，分别命名为“close”状态和“loose”状态，体现出Rpd3S复合物在去乙酰化催化过程中的动态性。其中至关重要的是，两个Eaf3蛋白的CHD结构域分别识别在一个核小体的两个H3K36me3修饰上面，提示染色质双H3K36me3修饰状态的建立与维持是Rpd3S复合物被招募进而行使去乙酰化过程的关键条件（图2）。图2. Rpd3S与H3K36me3修饰核小体的互作催化复合物结构与此同时，复合物结构中，Eaf3、Sin3和Rco1蛋白通过建立与双H3K36me3修饰、核小体DNA以及Linker DNA的多价识别，将Rpd3的催化中心定位在组蛋白H4 N-末端尾部附近进行去乙酰化酶活，这揭示了Rpd3S复合物去除H4 N端乙酰化的分子机理（图3）。图3. Rpd3S与H3K36me3修饰核小体间的分子互作细节为进一步探究Rpd3S复合物在多价态结合介导下对修饰核小体去乙酰化的特异性分子机制，李海涛团队合成H4（K5acK8acK12acK16ac），H3（K9acK14acK18acK23acK2 7acK36me3）的修饰组蛋白，并重组多类型修饰核小体作为底物参与酶活鉴定与分析发现。Rpd3S复合物对H3K14ac、H3K23ac以及H4K5ac和H4K12ac具有优先催化的能力。研究同时发现Rpd3S在高效去除H3和H4上的其他各位点的乙酰化修饰的同时，却特异性保留了H3K9位乙酰化修饰（H3K9ac），且加长酶活反应时间并不影响H3K9ac的保留。通过薛定谔软件将H31-16K14ac修饰多肽摆放入Rpd3S结构内部可见，H3K9ac的保留是由于PHD1对于H3K4un的识别从而使H3K9位点远离Rpd3催化中心所致。为进一步探究Rpd3S复合物去除H3 N端乙酰化的分子机理，研究者设计了PHD1结构域的突变，酶活结果证实了PHD1仅参与去除H3 N端乙酰化的分子机理。除此之外，通过特定设计的SBD结构域的突变（7mu）影响了左臂区域包括Eaf3B-CHD结构域的稳定性，酶活实验结果进一步证实了左臂区域对去除H3和H4 N端乙酰化的重要性，尤其针对于H4（图4）。图4. Rpd3S复合物识别结构域间协同调控去乙酰化活性然而复合物体外酶活实验并不能直接反应复合物体内的调控模式，故李海涛课题组研究人员进一步利用STE11-HIS3酵母报告系统去探究野生型Rpd3S和突变株在酵母表型上的影响。PHD1和SBD结构域的突变都能导致酵母异常转录的发生，且酵母整体的组蛋白H3和H4的乙酰化水平都不同程度上受到了影响，且与体外突变体的酶活实验结果完美吻合。综上，研究人员基于分子结构、生化实验和功能研究结果，提出了Rpd3S复合物去乙酰化的动态调控模型：Rpd3S在单个核小体上利用双分子的CHD结构域识别双组蛋白N端H3K36me3修饰从而将Rpd3的催化中心定位在组蛋白H4 N端尾部附近，从而实现H4高效的去乙酰化。另一种调控模式下，在一个组蛋白H3尾部附近，Rpd3S复合物通过Rco1-A 的PHD1结构域对H3K4un的识别和Eaf3-B CHD结构域对H3K36me3的识别协同实现H3高效的去乙酰化（图5）。图5. Rpd3S复合物体内功能研究和催化模型由于对去乙酰化过程中H3K9ac修饰被特异性保留的意外发现，李海涛研究团队通过引入体内H3K9位点突变（H3K9R）以影响H3K9ac乙酰化的建立，可以看到酵母体现出明显的生长抑制性表型。对H3和H4的整体乙酰化修饰水平进行进一步系统研究，研究者发现H3K9ac修饰的缺失进一步影响了近乎H3和H4所有其他位点乙酰化水平的建立，这暗示H3K9ac的存在对后续其他位点的乙酰化建立至关重要。鉴于乙酰化转移酶NuA3和NuA4都存在H3K9ac和H3K36me3的识别结构域，研究人员进一步提出了修饰重建模型：Rpd3S催化反应后，被保留的H3K9ac修饰连同H3K36me3修饰可以作为NuA3-NuA4招募和高乙酰化H3和H4重建的“种子”标记。Rpd3S和NuA3-NuA4作为“eraser–writer”反作用调控酶组合，在转录过程中动态调控基因表达（图6）。图6. “Rpd3S-NuA3/NuA4”在转录过程中动态调控染色质乙酰化水平模型原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-023-06349-1会议推荐1大会信息  会议名称 | 2023第六届单细胞多组学研究与临床应用峰会会议时间 | 2023年9月14-15日会议地点 | 上海虹桥西郊丽笙大酒店大会规模 | 800人主办单位 | 生物谷扫码立即报名

每一个由AI催生的故事，剧情大抵相似，AI制药也不例外。每家公司都描绘了一个AI制药世界的宏大故事，也都在“顶级学术会议与期刊”发表论文来证明自己的技术实力。AI与制药的碰撞，足够颠覆的前景，让市场趋之若鹜。在资本追逐下，AI制药公司成了时代的宠儿，成了一个又一个的融资机器。雪球越滚越大，挑战也随之而来。在商业世界，不论有何种宏伟愿景，一家公司最基本的职责，始终是赚钱回报股东。二级市场亘古不变的衡量标尺，就是收入、利润。但问题也在于此。大部分AI制药公司的财务指标并不好看。技术不是最终目的，获得商业回报才是。恰恰，AI制药公司如今很难回答这一问题。这也由此引发了信仰崩塌。资本寒冬下，全球大部分AI制药公司，都在想办法活下去。只有活下去，那些宏大故事才有存在的意义。01对AI制药的无限期待一个新兴的商业模式，必然都是为解决现有世界的痛点而生。AI制药也不例外。创新药研发，最大的痛点是，反摩尔定律的存在：当低垂的果实被逐渐攻克，新药研发难度只会越来越大；叠加治疗选择越来越多的情况下，新药监管要求不断提高、研发周期拉长，导致研发难度、成本逐渐增高。双重暴击之下，新药研发成本直线上升。医药产业流行的一句话是，“大约每九年，药物研发的成本会翻倍”。AI制药，则是为了解决这一BUG而生。简单来说，AI制药就是利用大数据等能力，缩短药物的研发进程和成本。例如，英矽智能在招股书表示，正常情况下一款药物从进入临床需要4.5年的时间，而其应用Pharma.AI研发平台，可能只需要12个月时间。根据目前全球各AI制药公司的业务来看，基本覆盖了新药研发的各个环节。可以说，新药研发，哪里有困难，哪里就有AI制药。当然，不同的公司业务布局不尽相同。例如，英国AI制药头部玩家Exscientia专注于小分子药物的靶点选择和药物设计，而英矽智能的Pharma.AI则能兼用小分子药物和大分子药物的研发。正是因为AI制药描绘的故事足够性感，全球资本市场都一度为之疯狂。2020年2月，Schrodinger在美股上市，随后股价持续攀升，此后涨幅一度接近6倍，彻底引爆AI制药赛道。在其之后上市的Relay Therapeutics等公司也都表现不俗。很快，热潮从美股蔓延到了国内。以晶泰科技、英矽智能、冰洲石、百图生科、望石智慧等为代表的国内AI制药企业，倍受一级市场追捧。据悉，英矽智能2018年估值为5440万美元，2022年估值高达8.94亿美元的公司，增长了近20倍。期间，公司完成了7轮融资，化身融钱机器。一切皆源于市场对AI制药的无限期待。02服务赚钱的难点疯狂之后，所有公司都面临着一个灵魂拷问，AI制药如何赚钱？从盈利模式来看，AI制药公司作为服务方或平台方，为药企提供AI相关的软件或解决方案方向是热门方向之一。不管是卖软件还是卖服务，看上去都是好模式。因为，AI制药公司相当于扮演CRO的角色，也就是“卖水人”，只需要为药企提供药物发现服务，按需收费，自己不用承担创新药研发的风险。但是在这种模式下，AI制药公司的天花板能有多高，还是一个未知数。因为，这取决于AI制药的服务价值，以及药企的付费意愿。就服务价值来说，药物发现的确重要，但在药物研发的总成本中占比并不高。根据Schrodinger招股书，一款小分子药物从发现到获批临床，成本大概是3500万美元。按照业内公认的10亿美元研发成本计算，药物发现的成本仅占3.5%。你可能会说，3个百分点也不错了，全球那么多药企、那么多项目呢。但现实是，药企愿意为AI制药支付多少费用，也是值得商榷的。这也是AI制药公司面临的第二个问题，药企的付费意愿并不高。本质上，AI制药带来的只是一种提高成功概率的可能性。至于是否真实可行，还需要后续的动物实验、临床试验等一系列研究去验证。在这种情况下，想让药企为之付出高价，似乎很难。从全球来看，当前收入规模最大的是Schrodinge，2022年为1.35亿美金。天花板、付费意愿都有待商榷，从这个角度来说，AI制药公司是在一个看似十分性感的市场，打着最苦的仗。03制药业务如何变现除了卖软件和卖服务，AI制药公司的另一个盈利模式是自己下场研发创新药，最终依靠商业化变现或对外授权赚取里程碑款。这样一来，AI制药公司与当前的biotech们便没有什么区别。这也是英矽智能当前的核心变现模式。当前，公司构建了超过30余条管线，包括TNIK抑制剂、USP1抑制剂、3CL主蛋白酶抑制剂、QPTCL抑制剂、PHD1/2抑制剂、肠道限制性PHD1/2抑制剂、TEAD1/2/3/4抑制剂、ENPP1抑制剂、KAT6抑制剂、MAT2A抑制剂等。不过，进展最快的TNIK抑制剂尚处于2期阶段，因此现阶段谈商业化变现并不现实。当前，英矽智能最核心的收入来源是对外提供研发服务，即为药企推进目标靶点的AI药物研发，英矽智能获得服务费，或是首付款和里程碑式付款。从这个角度来说，虽然AI制药讲述的是一个有关AI改变药物研发的故事，核心还是“制药”本身，而非单纯为“AI”付费。这也意味着，考验企业的不仅是AI技术，还包括进入临床之后的后续一系列能力。从英矽智能的发展来看，AI制药公司与传统的制药公司，界限越来越模糊。某种程度上，传统制药的研发焦虑，也成了AI制药公司的焦虑。全球AI制药如今回归冷静。当然，有AI平台在手，或许它们能走出不一样的路径。来源 | 氨基观察（药智网获取授权转载）撰稿 | 黄恺责任编辑 | 八角声明：本文系药智网转载内容，图片、文字版权归原作者所有，转载目的在于传递更多信息，并不代表本平台观点。如涉及作品内容、版权和其它问题，请在本平台留言，我们将在第一时间删除。 阅读原文，是昨天最受欢迎的文章哦