许多患者在CAR T细胞治疗后复发,原因是癌细胞表达的相关抗原低于CAR T细胞有效反应所需的阈值,即使同时靶向不同抗原的CAR T细胞试验也出现了类似的复发情况,如靶向CD19和CD22。需要开发更有效的CAR T细胞疗法,以提高对抗原低表达细胞的敏感性和持久性。3月10日,科罗拉多大学在《Cancer Cell》期刊上发表了一篇文章,研究开发了一种新的ALA-CAR-T,通过恢复LAT活性,增强了CAR-T细胞的抗原敏感性、疗效和持久性,从而克服了CAR-T细胞治疗后复发的多种机制。在体外和体内均表现出更强的细胞毒性、增殖能力和抗肿瘤活性,有望改善CAR-T细胞疗法的长期疗效,并拓展其在实体肿瘤等领域的应用。CD22抗原低表达的癌细胞通过削弱CAR T细胞远端信号传导逃避免疫攻击。尽管CD22BBz CAR T细胞对CD22-low(22Low)和野生型(WT)NALM6细胞的体外杀伤能力无显著差异,但在小鼠模型中无法有效控制22Low-NALM6的生长,与T细胞体内扩增能力显著下降相关。蛋白质组学分析显示,22Low-NALM6刺激导致CAR T细胞中与细胞骨架重组(如ACTN1、TLN1)和MAPK信号通路(如MAPK1、MAPK3)相关的磷酸化位点显著减少。这种信号抑制可能源于CAR受体在低抗原密度下无法有效聚集,导致T细胞免疫突触形成障碍,进而影响远端信号传导的持续性和强度,最终削弱CAR T细胞的体内持久性和抗白血病活性。低抗原刺激导致CAR T细胞中ERK/MAPK信号通路激活不足。与野生型NALM6刺激相比,CD22-low NALM6(22Low-NALM6)刺激的CAR-Jurkat细胞中磷酸化ERK(pERK)水平显著降低,这一现象在健康供体来源的CD4+和CD8+ CAR T细胞中一致出现。低抗原刺激通过抑制LAT磷酸化阻断下游信号传导。近端信号分析显示,ZAP70激活位点Y319的磷酸化仅轻微下降,可能与CAR的scFv结构域自二聚化引发的抗原非依赖性激活有关。健康供体来源的CAR T细胞在低抗原刺激下同样表现为LAT-Y226和PLCγ-Y783磷酸化减弱,但ZAP70-Y319磷酸化无显著变化。双靶向ALA-CART平台通过强制激活LAT信号逆转低抗原刺激下的功能缺陷。设计了双顺反子载体22x19ALA-CART,共表达CD22BBz CAR和含LAT胞内域的CD19靶向辅助CAR。该设计使22x19ALA-CART在受到WT或22Low-NALM6刺激时,LAT-CAR的磷酸化水平显著高于传统CD22BBz CAR,进而增强下游PLCγ的磷酸化,通过补偿LAT信号缺陷克服了抗原密度限制。ALA-CART在体内完全清除CD22-low白血病并依赖CD4+ T细胞扩增。在NSG小鼠模型中,传统CD22BBz CAR T细胞对22Low-NALM6的控制效果有限,而22x19ALA-CART实现白血病完全清除并显著延长生存期。进一步分析显示,22x19ALA-CART的疗效与骨髓中CD4+ T细胞在第7天和第15天的显著扩增相关。双CAR结构在ALA-CART平台中独立且叠加发挥抗白血病作用。当靶细胞仅表达CD22(CD22+)或CD19(CD19+)时,22x19ALA-CART分别通过CD22BBz CAR或19LAT-CAR单独激活即可有效杀伤,且两种CAR独立激活时均能诱导IL-2和IFNγ分泌。在低剂量治疗实验中,22x19ALA-CART不仅完全清除野生型NALM6,还能根除仅表达CD22或CD19的白血病细胞,表明两种CAR独立激活即可实现治疗效果,且未观察到CAR激活模式对T细胞持久性的影响。CD22靶向ALA-CART通过优化scFv组合与信号强化实现低抗原白血病清除。将ALA-CART平台改造为单一靶向CD22的22ALA-CART,其体外杀伤能力显著增强,并在小鼠模型中完全清除22Low-NALM6,而传统CD22BBz CAR T细胞治疗组白血病持续进展。进一步验证显示,仅完整包含LAT信号域的22ALA-CART能清除低抗原白血病,而高亲和力CD22BBz或缺失LAT域的22Null CAR均无效。ALA-CART平台具有广谱抗原适用性并显著提升低抗原阈值下的疗效。在患者来源的B-ALL异种移植模型(PDX)中,当CD22密度低于1,500分子/细胞时,传统CD22BBz CAR T细胞治疗组外周血仍可检测到白血病细胞,而22ALA-CART实现完全清除,且脾脏肿瘤负荷显著降低。此外,研究扩展至CD19靶向的19ALA-CART,其对CD19-low NALM6的体外杀伤能力增强,并在体内显著延长小鼠生存期。这些结果表明,ALA-CART通过强制激活LAT信号,可在不依赖抗原密度的情况下提升CAR T细胞敏感性,为单靶点低抗原逃逸提供了通用解决方案。ALA-CART细胞增强的体内疗效未伴随毒性增加。在高负荷白血病小鼠模型中,22ALA-CART对野生型NALM6的清除速度显著快于传统CD22BBz CAR T细胞,但两组小鼠体重下降程度无显著差异。22ALA-CART组小鼠TNFα水平升高,而CD22BBz组IL-2水平较高,但与细胞因子释放综合征(CRS)密切相关的IL-6水平在两组间无显著差异。ALA-CART的体内扩增能力依赖于LAT-CAR,而效应功能由第二代CAR主导。通过拆分双CAR结构发现,单独表达22BBz-HA CAR的T细胞在应对22Low-NALM6时扩增能力显著受限,而LAT-CAR的共表达通过促进T干细胞记忆(TSCM)和中央记忆(TCM)表型的形成,显著提升ALA-CART的体内持久性。双CAR协同实现增殖与效应功能的平衡以应对抗原异质性。体外实验表明,22BBz-HA CAR单独可介导对WT-NALM6的杀伤,但对22Low-NALM6的清除需依赖LAT-CAR的协同作用。LAT-CAR通过增强T细胞增殖支持效应分子(如颗粒酶A/B)的分泌,而22BBz-HA CAR则负责直接触发细胞毒性功能。这种功能互补机制使ALA-CART在提升疗效的同时维持安全性,为克服抗原逃逸提供了动态调控策略。ALA-CART平台通过转录组重编程维持T细胞未分化状态。转录组显示,未受刺激的22ALA-CART细胞呈现初始T细胞特征,而传统CD22BBz CAR T细胞富集效应分化和干扰素应答通路。22ALA-CART中与长寿命T细胞相关的基因(如SELL、CD27、IL7RA)表达显著上调,表型分析证实其T干细胞记忆(TSCM)比例高达53%,远高于CD22BBz组的13.4%,同时效应记忆(TEM)和中央记忆(TCM)亚群比例显著降低。LAT-CAR在制造阶段抑制分化,但体内疗效需双CAR协同。体外重复刺激实验显示,22LAT-CAR单独可维持较低CD39表达和较高增殖能力,但其TOX和TCF1表达水平介于22ALA-CART与22BBz-HA之间。过表达野生型LAT(LAT-OE)虽能模拟22ALA-CART的TSCM优势表型和体外杀伤能力,却无法在体内清除CD22-low白血病。这表明,ALA-CART的体内疗效不仅依赖LAT-CAR对分化的抑制,还需第二代CAR在遭遇肿瘤时的主动信号协同。ALA-CART细胞通过维持中央记忆表型显著提升体内持久性。在清除野生型NALM6白血病的小鼠模型中,22ALA-CART的CD4+ T细胞在骨髓中持续存在长达35天,且中央记忆T细胞(TCM)比例显著高于传统CD22BBz CAR T细胞。双靶向22x19ALA-CART的CD4+亚群也富集TCM表型,且持久性与CD39低表达相关。LAT-CAR通过抑制终末分化维持T细胞持久性。拆分双CAR结构发现,单独表达22LAT-CAR或完整22ALA-CART的T细胞在清除白血病后持久性显著优于仅表达22BBz-HA CAR的T细胞,这与其更高的TSCM比例和更低的TEMRA分化相关。此外,22BBz-HA CAR持久性差的T细胞高表达耗竭标志物KLRG1,而LAT-CAR通过抑制效应分化程序,维持T细胞的长期存活能力。CD4+ ALA-CART亚群主导持久性与效应功能的平衡。无论抗原密度如何,CD4+ 22ALA-CART细胞在体内扩增优势显著,其TCM比例更高,IL7RA表达上调,并富集多功能性T细胞。CD4+细胞在低抗原刺激下虽减少细胞因子分泌,但其持续增殖能力和效应功能足以清除白血病,揭示了ALA-CART通过CD4+主导的持久性与CD8+效应功能的协同实现长期疾病控制。总之,这种新型ALA-CART通过恢复LAT活性,提高CAR T细胞对低抗原急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞的敏感性和持久性,从而克服了传统CAR T细胞疗法在治疗抗原低表达癌症细胞时面临的挑战,这种新型的设计应该对实体瘤同样有效。推文用于传递知识,如因版权等有疑问,请于本文刊发30日内联系医药速览。原创内容未经授权,禁止转载至其他平台。有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。©2021 医药速览 保留所有权利往期链接“小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点 人人学懂免疫学| 人人学懂免疫学(语音版)综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普|医药前沿笔记PROTAC技术| 抗体药物| 抗体药物偶联-ADC核酸疫苗 | CAR技术| 化学生物学温馨提示医药速览公众号目前已经有近12个交流群(好学,有趣且奔波于医药圈人才聚集于此)。进群加作者微信(yiyaoxueshu666)或者扫描公众号二维码添加作者,备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”,此群仅为科研交流群,非诚勿扰。简单操作即可星标⭐️医药速览,第一时间收到我们的推送①点击标题下方“医药速览” ②至右上角“...” ③点击“设为星标