PSMA x CD28

摘要:免疫细胞治疗作为一种革命性的治疗方式，显著改变了癌症护理。这是一种专业的免疫疗法，利用活的免疫细胞作为治疗癌症的疗法。与传统药物不同，细胞疗法被认为是“活药”，这些产品目前是定制的，需要先进的制造技术。尽管嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在治疗血液恶性肿瘤方面受到了行业的极大关注，但其在治疗实体瘤方面的有效性常常受限，导致替代性免疫细胞疗法的出现。肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）细胞疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞疗法、树突状细胞（DC）疫苗和DC/CIK细胞疗法旨在利用身体的自然防御机制来定位和消除癌细胞，通常具有较少的副作用或风险。另一方面，如嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞、T细胞受体（TCR）-T、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞（CAR-NK）或CAR-巨噬细胞（CAR-M）等细胞疗法通常使用自体干细胞、同种异体或异种细胞，或基因修饰细胞，需要更高水平的操作，被认为是高风险的。这些高风险细胞疗法通常在肿瘤靶向和信号传导方面具有特殊特性，触发新的抗肿瘤免疫反应。最近，在抗肿瘤机制和细胞疗法产品设计的基本和临床研究以及技术创新方面取得了显著进展。随着技术的迅速整合和高创新格局，关键的未来发展方向已经出现。为了满足细胞疗法技术进步治疗癌症的需求，我们在本研究中全面系统地调查了免疫细胞疗法的技术创新和临床进展。基于免疫细胞疗法的治疗机制和方法学特点，我们分析了这些疗法的主要技术优势和临床转化风险。我们还分析和预测了应用前景，为相关企业提供必要的信息，以便他们做出关于研发方向选择的明智决策。 1.引言 癌症是一种利用多种逃逸机制来躲避抗癌免疫的全身性疾病，并且显著改变整个免疫系统的功能和组成。抗癌治疗的演变跨越了一百多年，其效果和特异性不断提高，旨在消除癌细胞的同时尽量减少对健康组织的损害。为了实现这一目标，免疫细胞治疗在现有方法中脱颖而出，成为了一种改变游戏规则的解决方案。2017年，食品药品监督管理局（FDA）批准了两种嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞疗法，即Kite Pharm的axicabtagene ciloleucel（Yescarta）和Novartis的tisagenlecleucel（Kymriah），用于治疗淋巴瘤。这些批准标志着抗癌治疗加速发展的一个重大里程碑。免疫细胞治疗的基本概念是通过外部供应具有所需功能的细胞来增强免疫反应，以帮助患者对抗癌症。它不仅重新激活了现有的免疫反应，还推动了新的免疫反应加入到抗肿瘤努力中。免疫细胞治疗的反应通常涉及多种免疫细胞类型的激活和协作，包括抗原呈递细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，T淋巴细胞（T细胞）和自然杀伤（NK）细胞。肿瘤负担的免疫系统不仅在免疫细胞数量上失衡，而且在调节抗癌免疫反应的分子和信号通路上也表现出功能异常。因此，精确施用适当的治疗策略是必要的，以防止免疫细胞治疗的效果不佳。 根据癌症类型及其机制，免疫过程的各个领域为治疗干预提供了途径。方法包括，例如，提取和扩增具有预先癌症识别能力的免疫细胞（例如，肿瘤浸润性免疫细胞），外部分化有效的细胞类型[例如，细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞]，以及基因修饰细胞以实现特定识别和肿瘤细胞消除[例如，T细胞受体（TCR）工程，嵌合抗原受体（CAR）]。在本综述中，我们将讨论最新的免疫细胞治疗，总结应用于实现和优化这些治疗类别的策略，并提供未来的展望。 2.用低风险免疫细胞治疗癌症 低风险免疫细胞治疗旨在使用患者自己的免疫细胞来消除癌细胞。需要注意的是，“低风险”强调的是细胞治疗领域内某些治疗相对更安全、副作用较少，属于再生医学或先进治疗药物产品（ATMPs）。低风险免疫细胞治疗包括四种关键技术：肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）疗法、CIK细胞疗法、DC疫苗和DC/CIK细胞疗法。为了更全面地理解这些方法，必须深入研究促进这些细胞治疗的基本机制和临床进展。 2.1.TIL细胞治疗 TILs是存在于实体肿瘤微环境（TME）中的天然单核细胞，包括肿瘤内肿瘤浸润性淋巴细胞（iTILs）和基质肿瘤浸润性淋巴细胞（sTILs）。与iTILs相比，sTILs主要是效应记忆T细胞，更容易被检测到。作为一群已经接触过肿瘤组织的异质性淋巴细胞，TILs“预训练”攻击癌细胞，同时留下健康的细胞。在小鼠肿瘤模型中，这些异质细胞已经显示出治疗晚期癌症的潜力，第一个人类TIL治疗导致转移性黑色素瘤显著消退。实体瘤缺乏理想的肿瘤标志物，使得靶向肿瘤相关抗原（TAAs）具有挑战性。TILs作为具有多样化受体的多克隆细胞，为实体瘤提供了独特的治疗选择。与基因修饰的免疫细胞相比，TILs在克服实体瘤的异质性方面表现出优越性，特别是像黑色素瘤这样高度异质性的肿瘤。此外，它们具有注射后迁移至TME的趋化因子受体，并且与CAR-T细胞相比，它们的非靶向毒性较低，这归因于T细胞成熟过程中的负选择。 TILs可以从切除的肿瘤组织中分离出来。鉴于TIL在原始TME中的稀缺性，可供扩增的TIL数量有限，以及阻碍TIL抗肿瘤细胞毒性的额外因素（例如，Treg，肿瘤相关巨噬细胞，髓系抑制细胞和各种免疫抑制分子）。TIL的生产和扩增是TIL治疗成功的至关重要步骤。TIL在体外的扩增涉及快速扩增协议（REP）。在REP前阶段，TILs在高剂量白细胞介素（IL）-2下进行初级扩增。一些方法涉及选择肿瘤特异性TILs进行进一步扩增，而其他方法则扩增大量TILs以保持疗效。在REP阶段，同时给予高剂量IL-2和抗CD3，并使用辐照的同种异体外周血单核细胞（PBMCs）作为饲养细胞，直到获得足够数量的细胞。然后，经过质量控制的扩增细胞产品准备用于患者给药后进行淋巴细胞减少。 自1988年Rosenberg等人成功将TIL治疗应用于转移性黑色素瘤患者以来，一系列临床试验相继出现。1996年，TIL治疗首次被引入用于治疗非小细胞肺癌（NSCLCs），在涉及113名患者的临床研究中。结果显示，TIL与IL-2联合使用对NSCLCs是一种有效的治疗方法，与II期或IIIa期相比，对IIIb期NSCLCs有选择性益处。在初步成功后，TIL治疗的后续发展一直朝着提高治疗其他肿瘤类型的疗效方向发展，包括皮肤、肾脏和胃癌。这些发展中的具体方法旨在阐明TIL细胞类型的组成及其与临床结果的相关性。例如，成功生成的肿瘤浸润性B淋巴细胞（TIBs）已被发现可以预测转移性肾细胞癌（mRCC）患者的临床结果改善。另一项关于胃癌TIL治疗的研究表明，TIL的组织学亚群与不同的存活时间相关。目前，TIL治疗的临床转化仍处于初步阶段，缺乏长期临床观察。然而，初步成功表明有机会开发具有更有效分离和扩增方法的有希望的治疗性TILs，并可能与其他抗肿瘤疗法结合使用。 2.2.CIK细胞疗法 CIK细胞是具有混合T和NK细胞样表型的异质免疫效应细胞。它们是通过将人的PBMC或脐带血单核细胞与干扰素γ（IFN-γ）、抗CD3抗体、重组人IL-1和IL-2一起体外培养产生的。CIK细胞独特地表现出对肿瘤的主要组织相容性复合体（MHC）不受限制的靶向性，减少异体反应性，并能够攻击各种肿瘤类型。在体外培养过程中，CIK细胞分泌各种细胞因子以激活巨噬细胞、NK细胞和CD8+ T细胞的细胞毒性活性，从而直接抑制肿瘤细胞的生长并促进间接杀伤效果。CIK细胞诱导凋亡基因和抗肿瘤基因的表达，进行细胞毒性活动并促进肿瘤细胞凋亡。它们主要通过粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-1/认知配体细胞间粘附分子-1（LFA-1/cam-1）与肿瘤细胞上的抗原结合的机制来实现肿瘤杀伤效果。这促进了MHC-I或MHC-II分子的表达，导致增强的呈递、激活、识别和直接杀伤肿瘤细胞。 激活的CIK细胞分泌各种细胞因子，包括IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和其他细胞因子，不仅直接增强细胞毒性效果和抑制肿瘤细胞，还通过调节免疫系统间接杀死肿瘤细胞。主要由CIK细胞产生的IFN-γ增强了NK细胞、巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。它还可以促进肿瘤细胞上MHC-I分子的表达，导致CTL杀伤增加。最近的研究指出，CIK细胞分泌的IFN-γ可以促进慢性淋巴细胞性白血病（CLL）细胞上ICAM-1的表达，对细胞毒性效应细胞的凋亡诱导产生积极影响。肿瘤细胞的凋亡基因也可以被CIK细胞激活，因为这些细胞表达FasL，一种属于TNF超家族的Fas配体，它诱导肿瘤细胞凋亡。Verneris指出，某些肿瘤细胞（如黑色素瘤和卵巢癌）通过诱导表达FasL的淋巴细胞凋亡来逃避免疫清除，但它们对CIK细胞敏感。这是因为，在CIK细胞的诱导过程中，Fas敏感或激活的T细胞被IFN-γ等细胞因子的作用或激活诱导的细胞死亡机制选择性地消除。结合CIK细胞中高水平的抗凋亡基因表达，这些因素使CIK细胞能够耐受表达FasL的肿瘤细胞诱导的凋亡。 尽管存在复发和无反应性的担忧，CIK细胞的异质性使它们能够靶向并杀死各种肿瘤细胞。自1991年引入CIK细胞疗法以来，已有超过5,000名患有多种肿瘤类型的患者，包括肺癌、乳腺癌、脑癌和结肠癌等，参与了CIK细胞疗法。全球CIK细胞（或CIK细胞与DC联合）的临床试验已超过80项。CIK细胞的治疗潜力超出了它们与NKG2D的相互作用，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）轴。与其他免疫疗法、常规化疗或放疗一起，CIK疗法表明了协同的抗肿瘤效果，正在发展中，是治疗癌症的一条令人鼓舞的途径。虽然临床前景看好，但一些公开讨论是必要的。与其他免疫细胞相比，CIK细胞输注后的毒性效应、最小化额外的支持性护理、确定与其他免疫疗法的优势、了解与CIK细胞在癌症微环境中的串扰的关键决定因素，以及在多个中心推广这种方法需要探索。 2.3.DC疫苗 操纵患者的自体DCs进行“疫苗接种”以对抗肿瘤组织是一种有前景的方法。DC疫苗涉及用TAAs（如肽、蛋白质、DNA/RNA或病毒）处理体外培养的DCs。DCs将摄取抗原，然后在仔细控制的培养过程中激活。DCs作为强大的抗原呈递细胞，对影响免疫系统起着至关重要的作用。虽然未成熟的DCs处理外来抗原，触发成熟和迁移到淋巴结，成熟的DCs可以在TME内促进肿瘤耐受，可能导致T辅助型2反应。 DC疫苗，通常采用体外成熟的自体单核细胞并用抗原冲击，已在多种肿瘤患者中显示出良好的耐受性和最小的毒性。然而，抗原特异性免疫反应的幅度和持续时间普遍较弱，限制了客观的临床反应。尽管在儿童肿瘤中的反应有限，正在进行的研究集中在增强疫苗生产的每一步上。策略包括扩大DC来源、提高免疫原性、优化抗原选择、开发新的免疫佐剂以及探索同时进行的免疫调节或化疗。 Sipuleucel-T是唯一获得FDA批准的自体DC疫苗，为有效的成人恶性肿瘤治疗提供了希望，特别是对于去势抵抗性前列腺腺癌。通过培养患者的PBMCs与一种由TAA（前列腺酸性磷酸酶（PAP））和GM-CSF组成的重组蛋白（PAP-GM-CSF）来生产。这种开创性的疫苗代表了DC疫苗领域的一个重要进展，展示了在成人和儿童恶性肿瘤中改善结果的潜在途径。在临床试验中，DC主要用于与CIK细胞、免疫检查点抑制剂（ICI）以及化疗和放疗结合的免疫疗法中以改善结果。研究表明DC能够激活自然杀伤T（NKT）细胞，或同时激活CD4+和CD8+ T细胞。 2.4.DC/CIK细胞疗法 当多种低风险的免疫细胞疗法一起使用时，可以实现积极的综合协同效应，特别是在DC和CIK的共同应用中尤为明显，它们是可适应和协同的。这种协同作用旨在增强身体对疾病的免疫反应。CIK细胞以其广谱的肿瘤杀伤效果而闻名，但由于缺乏特定的识别能力而受到限制。DC目前被认为是最有效的抗原呈递细胞，最近的研究表明CIK和DC之间的相互作用会在两个群体内部引起免疫刺激性表面分子表达的变化。实际上，与CIK细胞共同培养DCs发挥了互补作用，相互促进成熟，共同增加抗肿瘤活性，并展现出有希望的协同效应，即使在之前对CIKs有抵抗力且之前未与DCs共同培养的肿瘤细胞系上也是如此。DC分泌的细胞因子，如IL-2、IL-12和IFN-γ增强了CIK细胞的成熟，导致CIK细胞中CD3+、CD8+和CD56+亚群的水平增加。值得注意的是，DCs显著增加的IL-12分泌显著增强了CIKs的细胞溶解功能。此外，这种合作环境还减少了IL-10的分泌和调节性T细胞（CD4+CD25+ Treg细胞）的数量，减弱了它们对肿瘤免疫的抑制作用，并增强了CIK细胞的肿瘤杀伤效果。同时，CIK细胞增强了DCs的抗原呈递特异性和共刺激分子的表达，有助于整体增加抗肿瘤活性。此外，DC和CIK细胞的共同培养抑制了人类端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白的表达，抑制了端粒酶活性，并阻碍了肿瘤细胞的增殖。 基于上述机制，DC-CIK疗法以相互适应和协同为特点，已成为近年来肿瘤治疗领域的研究焦点。基础和临床研究迅速发展，并证明了在显著增强抗肿瘤免疫方面的有效性。尽管存在轻度移植物抗宿主病（GvHD）的担忧，试验经验表明结果是可控的。案例研究已经证明了安全性和提高的疗效。DC/CIK细胞疗法针对免疫系统的多个方面，从而形成了更全面的对抗疾病的方法。这在复杂情况或难治性恶性肿瘤中尤为有益，其中多种免疫功能障碍发挥作用。总的来说，低风险的免疫细胞疗法可以帮助增强免疫系统识别和消除有害实体的能力，从而改善健康结果。这些疗法的协同效应有潜力显著提高基于免疫的治疗的有效性，并为患者提供更好的结果。然而，评估和定制这些疗法的确切组合和剂量以确保其对个体患者的安全性和有效性至关重要。 3.高风险免疫细胞治疗技术的进步 高风险免疫细胞治疗使用自体干细胞、异体或异种细胞，或基因修饰细胞，所有这些细胞都需要进一步的操作和评估。这些治疗的设计非常适合其预期目的。这些治疗刺激针对肿瘤的新免疫反应，通常有潜力重新激活已有的反应。在这里，我们描述了高风险免疫细胞治疗中的特征设计、转染方法、细胞来源，以及克服抑制性肿瘤微环境（TME）的方法，包括CAR-T、T细胞受体-T（TCR-T）、CAR-NK和CAR-巨噬细胞（CAR-M）。此外，我们提供了对未来趋势的见解。 3.1.CAR的设计 CAR是工程受体蛋白，为免疫细胞提供了识别癌细胞表面特定抗原的新能力，从而可能触发免疫细胞消除癌细胞的潜力。当前研究表明，即使是对CAR结构的微小修改也可能会显著影响治疗效果。它通常由三个模块化域组成：细胞外域、跨膜域和细胞内域。 细胞外域：靶向的艺术。细胞外域包括一个用于目标结合的单链可变片段（ScFv）和一个铰链区域，通常在CAR工程细胞中的免疫球蛋白（Ig）样域铰链，并通过跨膜域锚定到细胞膜。通过CAR的细胞外域引入了驱动免疫细胞激活的新功能，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞。CAR工程免疫细胞能够识别癌症特异性靶标表位，不受MHC和共受体的限制，使它们在寻找和杀死癌细胞方面更有效。 CAR工程免疫细胞已经从针对单一抗原发展到针对两种不同抗原，以优化治疗阴性抗原癌细胞逃逸或抗原丢失的复发，并且结合任一抗原都将触发CAR工程免疫细胞的激活。这可以通过几种方式实现（图1A-C），例如将编码两个独立CAR分子的单个双顺反子向量转导到单个细胞中，或将编码双价CAR分子的向量转导到细胞中，或共同给药两种不同的CAR工程免疫细胞产品，或共同转导两个向量到单个免疫细胞中编码不同的CAR。这些方法对于B细胞淋巴性白血病特别有前景，尤其是对于复发或难治性B细胞急性淋巴性白血病（B-ALL），因为临床研究表明CD19/CD22共转导CAR-T细胞具有显著的疗效，以及CD19/CD22双特异性CAR-T细胞。同样，I期临床试验表明，双特异性CD20/CD19 CAR-T也可用于治疗复发和难治性B细胞恶性肿瘤患者，治疗28天后的总体反应率为82%，显示出治疗目的的安全性和有效性。此外，Wang等人表明，CD19/CD22双顺反子CAR-T与单特异性CD19或CD20 CAR-T细胞相比，在体外和体内表现出相当或更好的功能。 除了ScFv的优化，细胞外区域也得到了改进。与传统CAR直接作用于靶细胞不同，研究人员提出了一个新概念：模块化CAR（modCAR）。这种CAR-T（图1D、E）通常与其适配器一起工作，适配器的一端结合到细胞上，另一端用于识别和结合肿瘤表面抗原。适配器分子可以是单克隆抗体、抗体片段（图1D）、小分子或任何结构（图1E），只要能针对至少一个所需的抗原并介导目标与效应细胞之间的交联。它提供了一种高度灵活、可定制和通用的方法，以快速优化效应细胞活性，潜在地实现智能抗原靶向。 图1. CAR的设计策略。针对肿瘤的CAR设计示意图。(A) 通过将编码两个独立CAR分子的双顺反子载体转导到单个细胞中，可以生成双顺反子CAR工程细胞。(B) 通过将编码串联CAR分子的载体转导到细胞中，生成双价CAR。(C) 通过共同给予两种不同的CAR工程免疫细胞产品（上图）或共同转导两种编码不同CAR的载体到免疫细胞中（下图），实现双特异性，但产品将复杂且昂贵。可以使用抗体（D）或其他适配器（E）生成modCAR。(F) 设计装甲CAR以共表达分子，包括细胞因子和/或趋化因子，以增加效果和持久性。(G) SynNotch CAR通过添加分泌蛋白和结合剂，并利用特设计对机制执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。这也可以通过特设计的转录因子和转录机制（H）实现。CAR：嵌合抗原受体；modCAR：模块化CAR。 装甲CAR细胞（图1F）旨在分泌细胞因子或其他分子，以帮助抵消肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性，潜在地提高CAR工程细胞的持久性和有效性。有时被称为第四代CAR细胞或TRUCKs（T细胞重定向用于抗原无限制的细胞因子启动的杀伤），它们为CAR靶向组织提供了一种多功能治疗，超越了传统CAR-T细胞的能力。TRUCK概念目前正在通过共表达分子如趋化因子配体或基于第二代或第三代CAR的细胞因子组合进行探索。其中，IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23以及这些分子的各种组合正在早期阶段试验中。值得注意的是，IL-7和IL-15已被发现可以促进CAR-T细胞的增殖，而IL-12和IL-18增强了T细胞的效应能力。此外，表达特定分子的工程CAR-T细胞，如CCL-19或CCL-21，能够趋化其他免疫细胞或CAR-T细胞向附近的癌细胞移动。这增强了免疫细胞的渗透和CAR-T细胞的存活，从而提高了CAR-T细胞的有效性。 CAR设计中的最新发展是合成Notch（SynNotch）受体（图1G，H），它提供了一种精确的靶向策略，允许精确控制CAR工程细胞的激活，同时通过引入可诱导的开关来最小化非靶向效应。一个典型的案例使用了布尔逻辑和逻辑门的原理，当所有条件满足时，通过构象变化激活的共定位依赖的蛋白开关（Co-LOCKR）可以执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。在体外已经证明了针对癌细胞的特异性，但在临床应用中仍面临各种挑战。 细胞内域：信号和细胞功能。细胞内域由一系列共刺激域组成，CAR的分类基于共刺激域的数量。第一代CAR仅由CD3ζ组成，而第二代CAR除了CD3ζ外还含有一个共刺激域，第三代CAR则涉及一个以上的共刺激域以及CD3ζ。 在T细胞中，第一代CAR已构建包含编码针对2,4,6-三硝基苯酚（TNP）抗体的可变区域的重组基因片段，这些片段被拼接到α或β T细胞受体（α或β TCR）的C区之一。转导T细胞后，这种结构可以稳定地表达在T细胞表面，并能够识别MHC非限制性的肿瘤细胞，但在临床试验中显示出较弱的抗肿瘤效果。第二代CAR-T利用T细胞激活的经典信号，并增加了一个共刺激分子，如4-1BB（也称为CD137）或CD28，这显著提高了CAR-T细胞的激活水平和增殖能力。临床数据支持接受第二代CAR-T细胞治疗的患者对其肿瘤负担有延长和有效的控制。新发现的共刺激分子包括可诱导的共刺激分子（ICOS）、OX40（也称为CD134）和CD40等。第二代CAR结构在临床实践中最广泛使用。第三代CAR-T细胞包含两个共刺激分子，导致增强的细胞毒性。在临床试验中，当共同给予淋巴瘤患者CD19导向的第二代CAR-T细胞（带有CD28共刺激域）和第三代CAR-T细胞（带有CD28和4-1BB）时，观察到更长的持久性和优越的扩张。然而，目前评估仅第三代CAR-T的临床数据有限。在一个研究者发起的试验中，HD-CAR-1，一种第三代CAR-T治疗，在成人复发/难治性ALL患者中进行了评估。在90天的研究期结束时，80%的患者实现了完全缓解。此外，最近的研究表明，配备有4-1BB和CD28共刺激域的CAR-T细胞增强了T细胞记忆表型，与仅有一种共刺激分子的细胞相比，表现出更好的增殖和细胞因子释放水平。 迄今为止，大多数涉及CAR-NK细胞的研究都使用了最初用于T细胞的CAR构建。已经开发了包含CD28或4-1BB共刺激域的第二代CAR-NK。最近的研究报告称，含有细胞内域的CAR-NK，包含4-1BB和CD3ζ，克服了抑制信号并诱导了NK细胞特异性，导致杀死CD19+ aALL细胞。然而，已经为NK细胞特别创建了新的CAR设计，这些不同的CAR构建对NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生有不同的影响。研究表明，包含NK特异性共刺激域2B4（也称为CD244）的CAR-NK细胞对肿瘤细胞有显著增强的细胞毒性活性，诱导快速增殖，增加细胞因子产生，并减少凋亡。这表明，与NK细胞上的常规4-1BB CAR相比，NK细胞特异性激活信号在CAR性能中起着至关重要的作用。此外，利用不同的信号域，如CD3ζ、DAP10和DAP12的CAR构建，在原代NK细胞或NK92细胞系中表现出不同的抗肿瘤活性。具体来说，与包含DAP10域的CAR相比，具有CD3ζ信号域的CAR表现出优越的性能，而使用DAP12域的CAR优于包含CD3ζ域的CAR。 CAR-M细胞与CAR-T细胞具有相同的结构和代级分类，但其细胞内信号域的功能不同，主要是为了增强吞噬作用。CAR-M细胞能够直接利用CD3ζ细胞内域传递吞噬信号。Fc受体（FcRγ）的γ亚基和多个表皮生长因子样域蛋白10（Megf10）也可以作为细胞内信号域。最近的研究结果表明，添加一个串联的PI3K招募域可以增加对癌细胞的吞噬。CAR-M的第一个临床试验产品是第一代产品，包含CD3ζ作为其细胞内域，并且第一阶段的临床试验结果显示了有希望的初步安全性和有效性结果，并获得了FDA的快速通道指定。 4.提高基因转移方法的效率 在免疫疗法中引入核酸，包括基因表达和CRISPR基因编辑，是一个至关重要但具有挑战性的步骤。近年来，非病毒转染技术因其在克服与病毒载体生产相关的劳动密集和昂贵程序以及cGMP合规性方面的经济利益而越来越受欢迎。例如，转座子或移动遗传元素被用来实现高效和持久的转基因表达，在产生稳定的CAR-T细胞方面引起了极大的兴趣。此外，电穿孔或机械穿孔能够使免疫细胞如T细胞短暂表达基因组编辑核酸酶，例如CRISPR-Cas9的表达，并已在基于mRNA的人类T细胞修饰中进行了探索。这些非病毒转染技术在程序简单性、容量和吞吐量以及有利的安全概况方面提供了优势。 与非病毒转染相比，病毒转导方法在临床环境中是主流模式，并被广泛认为是转染困难细胞类型（如免疫细胞）的一种高效方法。常用的病毒载体，如腺相关病毒载体和腺病毒载体，不能整合到宿主基因组中。然而，逆转录病毒载体和慢病毒载体可以整合，并且表现出高传递效率，使它们非常适合转导高度复制的细胞，如免疫细胞。Tecartus和Yescarta都是由Kite Pharma生产，依赖于γ逆转录病毒（GRV）载体将CAR构建体转导到T细胞中，而Kymriah则使用慢病毒（LV）载体进行转导。一般来说，γ逆转录病毒和LV系统经常用于将基因转移到T细胞中，研究表明它们通常可以获得30%-80%的转导效率。然而，安全性、效率和便利性问题是必须考虑的问题。 与T细胞相比，病毒基因传递到原代NK细胞已被证明既具挑战性又效率低下，可能由于NK细胞的固有特性。研究表明，使用逆转录病毒载体成功转染原代扩增的NK细胞，单轮转染效率范围为27%-52%，经过两轮转染后为47%-75.4%。虽然逆转录病毒已被广泛用于最近的临床前和临床研究中生产CAR-NK细胞，但缺乏有效的基因转移方法仍是NK细胞在免疫疗法中使用的主要障碍。此外，与逆转录病毒转染相关的插入性突变和对原代NK细胞活性的有害影响是临床应用中的主要限制。与逆转录病毒载体相比，基于慢病毒的转染具有较低的遗传毒性和插入性突变风险。然而，原代NK细胞在LV转导中的效率很低，需要多轮转染。最近，Bari等人表明，用狒狒包膜糖蛋白变体（BaEV-LV）伪型的LV载体的转导效率比用泡状口炎病毒糖蛋白（VSV-G-LV）伪型的高20倍以上，这是用于伪型LV载体的第一种且仍最广泛使用的糖蛋白。他们通过这种转染方法成功地在约70%的不同供体的原代人类NK细胞中表达了CD19-CAR，这些CD19-CAR NK细胞有效地且特异性地根除了CD19阳性肿瘤细胞。用BaEV-gp伪型的慢病毒带有肿瘤特异性CAR在NK92细胞中的转导率几乎达到100%，在iPSC衍生的NK细胞或激活的原代NK细胞中为50%-80%。因此，它可能是NK细胞CAR基因转移的有希望的载体。此外，用长臂猿白血病病毒（GaLV）包膜蛋白伪型的慢病毒可以有效转导原代NK细胞。电穿孔和脂质体介导的转染方法也用于在NK细胞中传递外源基因。与上述病毒转染相比，这些方法提供了更快的转基因表达、降低的凋亡水平、更小的个体间差异和更高的基因转移效率。然而，外源DNA通常不会整合到目标细胞的基因组中，导致转基因表达在转染后约3-5天内下降。但当与DNA整合技术结合时，这些方法可以产生稳定转染并表达转基因的细胞。DNA转座子是可以通过切割和粘贴机制在载体和染色体之间有效转座的移动DNA元素。PiggyBac（PB）和Sleeping Beauty（SB）是迄今为止最常用的两种转座子系统，与其他系统相比，在哺乳动物细胞中显示出最高的转座活性。通过将含有CAR的质粒和转座酶DNA转染到iPSC中，成功地稳定创建了表达CAR分子的CAR-iPSC-NK细胞。 与病毒载体相比，转座子系统提供了许多好处，例如较低的免疫原性、增加的生物安全性、降低的生产成本，以及能够转移基因片段，其载荷能力接近9-10 kb。这些优势使其成为将CAR整合到NK细胞基因组中以实现持久表达的一个有力选择。然而，要充分利用转座子系统对原代NK细胞进行转染，需要进行优化，例如通过电转染提高转导效率和细胞活性。 巨噬细胞比其他造血系统中的细胞更难转染和抵抗遗传操作，因为它们有能力识别并响应外来核酸。Bobadilla及其同事创建了一种基于HIV-1的慢病毒系统，该系统通过感染时Vpx诱导的SAMHD1降解，已被证明可以有效传递转基因到骨髓细胞。Klichinsky团队使用复制缺陷的嵌合腺病毒载体Ad5F35有效地传递CAR到巨噬细胞，并同时促进M1表型的表达，最终增强了肿瘤杀伤活性。这些结果强调了基因工程巨噬细胞在癌症免疫疗法中的潜力。与生成CAR-NK细胞的方法类似，转座子系统也被用来将感兴趣的基因整合到宿主基因组中。 4.1.新型细胞来源方法推动现成的免疫细胞治疗产品 迄今为止，所有商业批准的癌症免疫细胞疗法都依赖于自体使用，即使用的材料是患者自己的细胞。尽管这种方法已证明有效，但存在一些重要的限制，例如在处理快速癌症进展的患者时制造的不良等待时间，由于患者T细胞功能障碍可能导致的生产失败，与健康淋巴细胞一起提取的恶性白血病细胞污染产品的风险，高生产成本，标准化的复杂性，以及再剂量机会的限制。因此，当前的研究工作集中在开发同种异体疗法上，以克服自体疗法的限制。特别是，CAR-NK是一种有前景的同种异体细胞治疗，对实体瘤和血液系统恶性肿瘤均无重大毒性副作用。它是一种更简单、可再注射、更实惠的通用治疗。 然而，当前的治疗尚未显示出强大的疗效和/或长期持久性，并且NK细胞更难进行工程改造。CAR-NK细胞的研究主要在临床前和早期临床试验阶段，很少有临床试验报告。尽管如此，通用的同种异体CAR-NK细胞在癌症治疗中仍显示出巨大潜力。 目前，CAR-M主要是自体疗法，但“现成的”同种异体CAR-M已经出现并正在进行进一步研究。 在开发同种异体方法时，必须系统地解决最重大的风险：免疫排斥和GvHD（移植物抗宿主病）的发展。免疫排斥可能限制治疗的效力，因为接受者的免疫系统可能会排斥移植物。GvHD可能是致命的，由供体T细胞内源性的αβ TCR复合体识别宿主肽-人类白细胞抗原（HLA）复合体引起，导致组织损伤。为了解决同种异体风险，可以采用两种主要策略。第一种是在供体αβ T细胞上除了引入CAR转基因外，还进行额外的遗传修改。另一种是选择替代的细胞来源或亚群，如诱导多能干细胞（iPSCs）、脐带血（UCB）细胞、γδ T细胞、记忆T细胞亚群、病毒特异性T细胞（VST）等。 为了消除内源性αβ TCR介导的GvHD，最直接的方法是破坏编码T细胞受体恒定（TRAC）α链的基因。Eyquem等人开发了一个案例，通过腺病毒转染和CRISPR-Cas9敲入技术将CAR构建体整合到TRAC位点，同时诱导CAR表达和TCR失活。与随机整合相比，CAR表达可以由内源性TCR启动子调控，并在暴露于抗原时模仿TCR转录，防止恒定的和过度的T细胞激活，这可能导致T细胞分化和耗竭。此外，研究结果表明，这些TRAC-CD19 CAR-T细胞在ALL小鼠模型中显示出比用逆转录病毒编码的CAR的T细胞更大的抗肿瘤效力。 此外，除了CRISPR-Cas9，基因编辑技术，如TALENs和锌指核酸酶（ZFNs），也被发现在消除TCR表达以创建“通用”供体T细胞方面有效。然而，尽管TCR缺失的CAR-T细胞降低了GvHD的风险，但其长期持久性较短，可能是由于免疫排斥。因此，科学家们敲除了β2-微球蛋白（B2M）基因以限制HLA类I分子的表达。这种方法防止了异体CAR-T细胞通过它们的TCR被识别为外来物，但仍然容易受到宿主NK细胞的溶解。因此，一项研究使用突变的B2M融合蛋白来解决这个问题。为了在激活的异体CAR-T细胞生产过程中提高HLA-II消除的效率，一些学者提出抑制CIITA或HLA-DRA、HLA-DQA和HLA-DPA基因。 iPSCs具有无限的增殖和分化潜力，使它们成为创建众多同质HLA组合库的理想资源。通过从库中选择一个HLA匹配的iPSC来源，可以最小化宿主和移植物之间CAR-T细胞的免疫排斥风险，但必须进行严格的质量控制以确保安全，因为未分化的、增殖的iPSCs可能引发不良结果。Wang等人生成了缺乏HLA-I/II、B2M和CD155的低免疫原性iPSC衍生的CAR-T细胞。 研究通过体内发挥效应功能证明了它们抑制肿瘤进展的有效性。此外，iPSCs也为生产满足临床需求的CAR-NK和CAR-M细胞铺平了道路。与分化的NK细胞或巨噬细胞相比，iPSCs可以更有效地被工程化以稳定表达CARs。Li等人通过在培养基中添加各种细胞因子和促分化蛋白来分化CAR转染的iPSCs为CAR-NK细胞。这些iPSC衍生的CAR-NK细胞在体外和体内都显示出强大的抗肿瘤活性。Zhang等人建立了一个骨髓/巨噬细胞分化协议，诱导CAR-iPS向骨髓细胞系分化，成功产生了足够的CAR-iMac细胞（iPSC衍生的CAR-M细胞）。然而，当在小鼠模型中测试时，CAR-iMacs的有效性有限。总的来说，iPSC衍生的工程免疫细胞的发展涉及复杂的生产程序，需要精确的细胞产品制造和质量保证，以支持更广泛的临床应用。 γδ T细胞表达TCRγδ并以HLA独立的方式识别恶性细胞。它不需要消除TCR表达或信号，并且GvHD的风险低或不存在。研究表明，γδ CAR-T细胞显示出与传统的αβ CAR-T细胞相似或更大的细胞毒性效应，并且在体内没有观察到GvHD。然而，它们在体外的细胞毒性能力持续性较差。此外，针对CD20的γδ CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤的动物模型中取得了有希望的结果，目前正在进行第一阶段的临床试验。 脐带血（UCB）提供了一个容易获得的NK细胞和同种异体T细胞来源。它们富含γδ T细胞和造血干细胞（HSCs），尽管总细胞数量有限。UCB衍生的CAR-T细胞在体内显示出增强的肿瘤抑制作用，减少了IL-10的分泌，并降低了调节性T细胞（Tregs）的比例，表明了改善的治疗潜力。Van Caeneghem等人从脐带血中分离出CD34+ HSCs，然后生成CAR-T细胞。这些CAR-T细胞具有原始表型（CD45RA+ CD62L+），并且不表达TCRαβ复合体，显著降低了GvHD的风险，并有效地消除肿瘤细胞。 记忆T细胞的特征是CD45RA−CD45RO+表型，它们不太可能发展为GvHD，也不太可能迁移到表现GvHD的器官。研究表明，T记忆干细胞（TSCM）和中央记忆T细胞（Tcm）与它们的分化对应物相比，具有优越的增殖和干细胞潜力，并且在T细胞转移后的临床研究中表现出高扩张和持久性。 VSTs拥有能够识别病毒抗原的TCR，如巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）等。经过CAR改造的VSTs在实体瘤中显示出有希望的结果，但与CARs相比，工程化针对肿瘤的转基因TCR VSTs更具挑战性。在肿瘤细胞中表达EBV相关抗原的霍奇金淋巴瘤患者中，输注CAR-VST细胞取得了良好的耐受性和缓解率。针对HER2的CAR-VST细胞产品在CMV血清阳性和进行性胶质母细胞瘤患者的第一阶段临床试验中显示出既安全又临床有效。值得注意的是，可以建立VST库，以覆盖大多数患者，并促进CAR-T或TCR-T重定向到肿瘤的临床使用。 PBMCs通常来自外周循环或脐带血等。它是临床目的的主要NK细胞来源。PBMC衍生的NK（PB-NK）细胞可以从HLA匹配和不匹配的供体中分离出来，扩大了潜在供体池。通常，它们显示出成熟的表型，增殖能力降低，细胞毒性增加，没有GvHD的风险。Töpfer等人已经证明，表达CAR的NK细胞系YTS以及PB-NK细胞可以成功地重定向针对前列腺干细胞抗原（PSCA）阳性肿瘤，导致大部分治疗小鼠的肿瘤被完全根除。一种短暂表达针对间皮素的mRNA CAR，MCY-M11的CAR-PBMC细胞产品已进入临床试验，它是一种混合产品，包含不同的CAR工程T细胞亚群、单核细胞和B细胞群体，展现出理想的功能和免疫表型特征。 NKT细胞，也称为CD1d限制性T细胞，是一类同时具有T细胞和NK细胞特性的异质性T细胞群。这些细胞主要识别非多态性CD1d分子，这是一种结合自身和外来脂质以及糖脂的抗原呈递分子。I型NKT细胞或称为iNKT细胞不具有HLA限制性，可能作为通用供体细胞发挥作用，但其在体内的持久性尚未知晓。研究表明，CAR19-iNKT细胞表现出抗淋巴瘤活性，并且具有增强的消除脑淋巴瘤的能力。另一种异体NKT细胞，表达带有CD28和IL-15的抗CD19嵌合受体，目前正在进行临床试验，针对复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者（NCT03774654）。 4.2.改善肿瘤微环境以增强治疗性免疫细胞的效果 免疫细胞治疗实体瘤的效果受限于低持久性和注入后的不充分增殖，这在很大程度上归因于免疫抑制微环境，它不是被动的旁观者，而是癌症进展的积极推动者。肿瘤细胞居住在这个由浸润和驻留宿主细胞（如T细胞和巨噬细胞）、分泌因子（如IL-10和转化生长因子-β（TGFβ））以及细胞外基质（ECM）组成的异质微环境中。这些组分可以相互作用，为恶性细胞的生长、迁移和转移创造支持性环境，从而逃避免疫系统和肿瘤特异性细胞毒性T细胞。为了根除肿瘤，科学家们开发了几种策略来促进CAR工程或TCR工程治疗性免疫细胞向癌症焦点的迁移和渗透，包括利用趋化因子受体如CCR2、CXCR2、CCR4、CXCR4等。这些研究表明，CAR-T、TCR-T和NK细胞显示出增加的肿瘤渗透率，导致肿瘤退缩和增强的抗肿瘤效果。然而，将基因工程免疫细胞渗透到肿瘤中只是抗癌的第一步。有时，可能需要直接转化方法来修改免疫抑制微环境。使用免疫检查点抑制剂，如抗PD-1、抗PD-L1抗体和抗CTLA4抗体，可以改善免疫抑制肿瘤微环境。然而，它可能导致药物抗性的出现、T细胞耗竭和复发，有时甚至会导致危及生命的毒性。在肿瘤微环境中阻断TGF-β信号是另一种提高检查点抑制剂效果和增强抗肿瘤反应的方法，因为它在肿瘤信号、重塑和代谢中起着至关重要的作用。临床证据也表明TGF-β信号与对检查点阻断剂无反应的患者之间存在相关性。为了解决这个问题，已经开发了双功能抗体-配体陷阱，使用针对CTLA-4或PD-L1的抗体与TGFβ受体II外域（TGFβRIIecd）融合。它可以在肿瘤微环境中隔离TGF-β，耗尽调节性T细胞，并促进CTL共刺激。此外，通过转导优势负性TGFβ受体-II（dnTGFβRII），开发了对TGFβ有抵抗力的肿瘤特异性T细胞，并已在动物模型和临床研究中显示出治疗益处。另一种新策略是利用肿瘤微环境中高浓度的免疫抑制信号分子，通过引入嵌合开关受体（CSR），如PD-1:CD28、TIGIT:CD28、CTLA-4:CD28、TGF-βRII:4-1BB、Fas:4-1BB。CSR由PD-1、CTLA-4或TGF-βRII的细胞外域和CD28或4-1BB的细胞内域组成。T细胞与CSR一起被转导，与CAR或TC共表达，以产生工程化CTL。这些工程化CTL仍然与肿瘤细胞上的免疫抑制分子相互作用，但通过细胞内域传递共刺激信号而不是抑制信号。最近，这一策略已经进行了临床测试。这些工程化细胞被发现能有效克服免疫抑制肿瘤微环境，例如分泌更多的IFN-γ，积聚在肿瘤中，并展现出优越的抗肿瘤功能。细胞外基质为各种抗癌疗法创造了物理屏障。然而，巨噬细胞在调节ECM和展示肿瘤归巢行为方面发挥着关键作用。CAR工程巨噬细胞被证明能主动迁移到肿瘤部位，可以作为药物递送系统在抗原特异性环境中局部递送细胞因子和/或细胞毒性物质，显著改变免疫抑制肿瘤微环境，并通过吞噬作用消除肿瘤细胞。张等人使用CAR修饰的巨噬细胞解决了ECM引起的免疫细胞渗透不足的问题。体外研究表明，CAR-147巨噬细胞能够重塑肿瘤的ECM，诱导CD3+ T细胞渗透，并提高肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ的水平，最终展现出抗肿瘤效果。 4.3.临床研究进展 从临床进展的角度来看，自2017年FDA批准首个CAR-T细胞疗法产品以来，全球已有10个CAR-T产品获得批准（补充表1）。自2013年以来，CAR-T、CAR-NK和TCR-T疗法的临床研究迅速增加，到2022年CAR-T细胞疗法的数量达到258例，值得注意的是，2023年的数据来自1月至10月（图2A）。从国家角度看，高风险细胞疗法的临床研究主要分布在美国和中国，占全球研究的80%以上（图2B）。CAR-T疗法的主要临床治疗靶点是CD19、CD22、CD20和B细胞成熟抗原（BCMA）。在血液肿瘤中，增长最快的适应症是淋巴瘤和骨髓瘤。目前，TCR-T有一种治疗产品在市场上，用于转移性葡萄膜黑色素瘤。总的来说，TCR-T在实体瘤中的进展速度比血液肿瘤快（图2C）。TCR-T的靶抗原主要集中在MART-1、HPV16-E6、NYESO、HPV16-E7等。在病症方面，TCR-T的临床研究主要用于实体瘤的治疗。这些实体瘤大多与病毒感染有关，如与人类乳头瘤病毒（HPV）感染相关的宫颈癌。此外，TCR-T在头颈、肝脏和结肠癌症的临床研究正在迅速进展（图2C）。就CAR-NK病症而言，血液肿瘤仍然是进展最快的，其中淋巴瘤病症的进展速度更快（图2C）。 图2. CAR-T、TCR-T和CAR-NK疗法的临床试验。临床试验数据统计。(A) 2018年至2023年细胞疗法临床研究的数量，分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组。(B) 按国家分组的细胞疗法临床研究数量，同样分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组，Y轴在50到450之间中断。(C) 针对不同适应症的细胞疗法药物的临床进展，细胞疗法药物的分组与(A)相同，适应症分为液体和固体肿瘤两组。原始数据下载自https://classic.clinicaltrials.gov/，更新至2023年10月30日。CAR-T：嵌合抗原受体T细胞；CAR-NK：嵌合抗原受体自然杀伤细胞；CNS：中枢神经系统；HPV：人乳头瘤病毒；TCR-T：T细胞受体T细胞。 CAR-NK的临床治疗靶点主要是血液肿瘤的CD19、CD22和BCMA，以及实体瘤的PSMA、HER2、ROBO1和MUC1。总的来说，TCR-T和CAR-NK仍处于早期临床开发阶段。到目前为止，CAR-M的临床研究仍处于起步阶段，只有一个I期临床试验（NCT04660929）。图2的数据可从补充表2获得。 5.结论与展望 免疫细胞治疗在肿瘤治疗中变得越来越重要。与替代免疫治疗方法（如免疫检查点抑制剂和细胞因子）相比，免疫细胞治疗表现出了优越的疗效、特异性，并倾向于引起可接受的副作用。当作为某些癌症的独立治疗时，特别是采用性T细胞转移疗法，在血液系统恶性肿瘤如白血病和淋巴瘤中显示出了显著的成功。然而，由于免疫抑制肿瘤微环境、肿瘤异质性、靶标抗原表达低等因素，一些实体瘤对单独的免疫细胞治疗更具挑战性。在许多情况下，转向另一种免疫细胞治疗或将免疫细胞治疗与其他治疗策略（如化疗、放疗、其他免疫治疗或靶向治疗）结合起来被认为是有益的，可以通过不同的机制增强整体治疗效果。目前，全球已有10个CAR-T产品获批，而DC疫苗和TCR-T各有一个获批产品。在低风险免疫细胞治疗方面，TIL和DC疫苗在治疗实体瘤方面显示出了希望。此外，CIK治疗与其他免疫策略结合使用时显示出协同的抗肿瘤效果。这些方法通常由具有不同功能特征的异质细胞组成，在治疗相对高异质性的恶性肿瘤方面具有优势。另一方面，高风险免疫治疗如CAR-T和TCR-T通常是定向的和高度特异性的，使它们特别适合相对快速增殖的恶性肿瘤。在血液肿瘤中，CAR-T和TCR-T已经得到了临床验证，它们在治疗实体瘤方面的应用正在稳步进展。而基于其生物学特性，CAR-NK和CAR-M在治疗实体瘤方面具有固有优势。TCR-T专注于特定的肿瘤相关抗原和新抗原，使它们在外来抗原如病毒相关恶性肿瘤方面受益。研究人员目前正在努力突破包括CAR-T在内的细胞治疗技术的瓶颈。新的细胞来源和降低GvHD风险和其他风险的方法为“现成的”或同种异体细胞治疗创造了机会，这些治疗可以事先准备并在需要时轻松地给多个患者使用，实现更快的诊断和癌症治疗。此外，针对CAR的新颖设计最小化了对健康组织的损害，并与传统治疗相比减少了副作用。某些设计甚至为治疗实体瘤提供了可能性。此外，修改肿瘤环境和诱导记忆T细胞的策略使得实现长期效果成为可能。同时，由于这些疗法新颖、复杂和技术性，它们可能对公共卫生和个体患者构成以前未探索的风险。TIL细胞治疗、DC/CIK细胞治疗和DC疫苗被认为是低到中等风险。风险因素包括生产中使用的生物活性物质，如抗体、细胞因子、血清、生长因子和抗生素，以及在保存、冷冻、解冻和冷链运输过程中的产品稳定性和活性风险。此外，产品本身可能存在固有风险，如不完全去除肿瘤细胞或其他不需要的细胞，以及与归巢、植入、迁移和增殖相关的潜在并发症或降低的产品活性。然而，高风险免疫疗法需要更多的操作，使用基因修饰细胞、自体干细胞或同种异体或异种细胞，这需要额外的评估。在临床上，这些疗法有时可能引发细胞因子风暴和细胞因子释放综合征（CRS），这两种都是危及生命的全身性炎症综合征。因此，这些产品的风险管理考虑相应更具挑战性。必须仔细评估产品与患者相互作用产生的即时和延迟影响的潜在风险。这些风险包括不需要的免疫原性及其相关效应，包括CRS、GVHD、移植物排斥、过敏反应、超敏反应和免疫缺陷。此外，评估与患者细胞的预期和非预期遗传修饰相关的潜在风险也很重要，包括细胞功能、细胞凋亡、生长或分化的变化、插入性突变或遗传毒性以及恶性转化的可能性。然而，准确评估免疫细胞治疗的风险仍然具有挑战性。一些真正的风险超出了预期或在临床前研究中没有被揭示。重要的是要理解风险在临床研究中无处不在，它被定义为在特定时间框架内发生不利结果的可能性。评估可接受的免疫细胞治疗风险水平涉及权衡各种因素，而不仅仅是绝对风险，而是可能随之而来的潜在治疗益处。与患有较轻微肿瘤或癌症适应症且存在适当治疗方法的患者相比，患有危及生命的晚期或严重恶性肿瘤的患者可接受的风险水平要高得多。总的来说，免疫细胞治疗的技术障碍相对较高，创新动力强，技术发展多。近年来进展呈爆炸性增长。尽管CAR-T、TCR-T和DC疫苗已获批准，但其他免疫细胞治疗仍处于早期临床和临床前研究阶段。低风险疗法如TIL面临由于无法完全消除Tregs而有限的效力。CIK细胞治疗在获取和扩增方面遇到困难。DC肿瘤疫苗受到缺乏理想的肿瘤特异性抗原、TAA免疫原性弱、难以高效诱导免疫原性DC以及体外DC致敏方法的静脉回输无法有效激活DC分化和成熟的影响。高风险细胞治疗在克服肿瘤异质性的障碍方面仍有很长的路要走。CAR-T细胞仍面临效应T细胞耗竭、细胞因子风暴和免疫抑制微环境等挑战。TCR-T细胞治疗的挑战包括如何减少TCR不匹配和针对新抗原的最小选择。CAR-NK疗法正在经历遗传操作和细胞增殖困难。尽管CAR-M可能成为有希望的抗癌疗法，但它们尚未完全实现。临床研究需要确认肿瘤相关巨噬细胞在决定TME是否可以将肿瘤靶向CAR-M转化为肿瘤支持表型方面的高适应性。然而，免疫细胞治疗在抗癌疗法的未来开发中仍具有至高无上的潜力。人们普遍认为，快速的技术创新将使这些疗法成为高效的癌症治疗手段，显著改善治疗效果，推进人类医疗保健。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

ADC热潮之后，很多制药巨头在布局前沿技术赛道时瞄准了一个共同的方向——双抗。 根据医药魔方数据库，2024年前9个月，全球药企围绕双抗药物达成了31笔交易，数量上比之前三年的每一年都要多。 这其中也不乏制药巨头的重量级押注。8月，默沙东以7亿美元的首付款将同润生物一款处于I期阶段的CD3/CD19双抗CN201收入囊中。7月，诺华与Dren Bio就髓系细胞募集双抗的开发达成合作，交易总额达30亿美元。 与此同时，一些药企也在加快双抗药物的临床开发布局。比如阿斯利康在今年接连启动了TIGIT/PD-1双抗rilvegostomig的4项注册性临床试验，包括联合化疗对比K药的III期头对头研究。 更早下注的玩家已经步入收获。比如，罗氏的眼科双抗法瑞西单抗已成为其业绩增长的核心驱动，上市第2年的销售额便轻松突破25亿美元。强生的埃万妥单抗则在研发端实现了重要突破，联合兰泽替尼头对头击败奥希替尼，并借此拓展了新适应症。 本文对制药巨头的双抗产品管线进行梳理，并对管线较丰富的几家企业进行分析，揭示它们不同的布局重点与扩张策略。 制药巨头双抗产品及临床管线 罗氏：打造畅销产品，站上赛道制高点 在双抗赛道，罗氏已展现王者风采，强大的已上市产品阵容就是其实力的最好印照。根据医药魔方数据库，全球共有15款双抗获批上市，罗氏独占4款，与Genmab并列为全球拥有最多上市双抗产品的药企。不仅仅是数量上的领先，这些产品的商业化成绩亦斐然。立足于已有产品，罗氏徐徐铺开布局版图。 艾美赛珠单抗是首个非凝血因子类血友病药物，可每4周皮下给药一次。它巧妙地利用双抗的作用模式，同时结合凝血因子IXa（FIXa）和FX来模拟FVIII的凝血功能。凭借创新性与变革性治疗价值，艾美赛珠单抗逐步“征服”广大患者，销售额一路攀升，2024上半年创收21.43亿瑞士法郎（约合24.21亿美元），是全球销售额最高的双抗药物。 新一代FX/FIXa双抗RG6512也已推进至I/II期临床阶段，其与FIX和FX形成三元复合物的能力显著优于艾美赛珠单抗，有望以更低的剂量和更长的给药间隔实现突破。继罗氏之后，诺和诺德也看好血友病双抗的开发前景。Mim8的III期研究已传来捷报，预计年内申报上市。 在血液疾病领域，罗氏还先后推出了两款CD3/CD20双抗莫妥珠单抗和格菲妥单抗，形成差异化布局。莫妥珠单抗被设计成典型的1:1结构，疗效相对温和，更适用于惰性淋巴瘤，而格菲妥单抗具有2:1比例的CD20与CD3结合位点，对表达CD20的恶性B细胞产生更强的靶向作用，可以攻克侵袭性和难治淋巴瘤。 除淋巴瘤外，罗氏还希望借力双抗打破多发性骨髓瘤（MM）的现有格局。针对发病率第二高的血液肿瘤，与多数企业押注CD3/BCMA双抗不同，罗氏主要将希望寄托于FCRH5/CD3双抗cevostamab和GPRC5D/CD3双抗forimtamig。I/II期CAMMA 2研究显示，cevostamab针对三重难治性MM患者的总缓解率（ORR）为67%。 法瑞西单抗是当下罗氏增长势头最强劲的双抗产品。今年上半年，法瑞西单抗销售收入几近翻倍，达17.94亿瑞士法郎（+93%，约20.27亿美元），未来销售峰值或将超越巅峰时期的阿柏西普。 法瑞西单抗的成功不是偶然，这依赖于罗氏在眼科赛道的深厚底蕴，此前罗氏已打造出全球首个应用于眼科的抗血管内皮生长因子（VEGF）药物雷珠单抗。法瑞西单抗同时靶向VEGF-A和血管生成素2（Ang-2）两条不同的信号通路，获批了湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD）、糖尿病黄斑水肿（DME）和视网膜静脉阻塞（RVO）继发黄斑水肿三大适应症。与单纯抗VEGF疗法相比，法瑞西单抗显著减少了眼部注射给药频率，只需每4个月给药1次。 眼科赛道，罗氏继续向着“进一步提高护理标准”的战略目标前进。两款靶向VEGF的双抗应运而生。下一代Ang2/VEGF-A双抗zifibancimig采用港式给药系统（PDS）尝试进一步延长nAMD治疗间隔；VEGF/IL-1β双抗经玻璃体内给药，用于治疗RVO继发黄斑水肿。 罗氏在实体瘤领域推进最快的双抗是靶向PD-1/LAG-3的tobemstomig，处于II期临床阶段。PD-1与LAG-3的协同作用已经得到充分验证，BMS的双免疗法Opdualag于2022年3月获批上市。围绕tobemstomig，罗氏重点开启了一项单药或联合TIGIT单抗tiragolumab一线治疗尿路上皮癌的注册性临床（NCT05645692）。 另有三款CD3双抗夯实罗氏在实体瘤领域的布局。CD3/HER2靶向的runimotamab主攻乳腺癌和胃癌；CD3/GPC3靶向的ERY974在探索治疗肝细胞癌的可行性；CD3/CLDN6靶向的SAIL66具备FIC潜质，CLDN6靶点尚未成药，其开发过程必定充满挑战，今年7月安进已终止开发同靶点双抗AMG 794。 双抗的身影也出现在罗氏的神经科学布局中。Aβ/TfR靶向的trontinemab是罗氏在阿尔茨海默病领域的一次大胆创新。 从作用机制上，trontinemab就体现出了与众不同之处，它运用罗氏大脑穿梭技术（brainshuttle），将靶向Aβ的单抗（gantenerumab）与可以和转铁蛋白受体1（TfR1）相结合的蛋白域融合，通过TfR1介导的胞吞转运有效协助抗体穿越血脑屏障。早期临床数据显示，与标准Aβ单抗相比，trontinemab能以相对较低的剂量（1.8和3.6mg/kg）快速且稳健地减少淀粉样蛋白斑块。 手握如此丰富的产品管线，罗氏已率先占据双抗赛道的竞争高地。在不断地开疆拓土中，罗氏还将继续扩大优势。 强生：血液肿瘤、实体瘤、自免全面出击 近几年，强生以每年推出1款产品的速度在双抗赛道强势崛起。2021年5月，全球首款c-Met/EGFR双抗埃万妥单抗在美获批EGFR外显子20插入突变非小细胞肺癌（NSCLC）适应症，其只需5分钟给药的皮下剂型也已申报上市。 埃万妥单抗正在抢占奥希替尼的市场份额，后者2024上半年销售额达32亿美元。MARIPOSA研究中，埃万妥单抗联合兰泽替尼头对头击败奥希替尼，显示出一线治疗EGFR外显子19缺失或外显子21 L858R置换突变NSCLC的PFS获益。MARIPOSA-2研究则聚焦奥希替尼耐药后的未满足需求。凭借这两项研究，埃万妥单抗接连拓展了2项新适应症。 2022年8月，全球首款CD3/BCMA双抗特立妥单抗首次在欧盟获批上市；一年后，全球首款CD3/GPRC5D双抗塔奎妥单抗也问世了。这两款双抗是强生统治MM业务的重要接力产品。 在MM领域，强生早已建立了霸主地位，从FIC蛋白酶体抑制剂硼替佐米到全球首款CD38单抗达雷妥尤单抗，再到BCMA CAR-T西达基奥仑赛和双抗，产品护城河深厚，持续引领着MM治疗手段的演变。MM这块大蛋糕也有很多玩家竞争，仅双抗这一类型药物的相关管线就达到65项，辉瑞的CD3/BCMA双抗elranatamab已经获批上市。 对于后续的双抗药物储备，强生着重开辟实体瘤，前列腺癌是强生下一个进攻方向。靶向CD3/PSMA的JNJ-8114、靶向CD3/KLK2的JNJ-8343、靶向PSMA/CD28的JNJ-9401都已进入临床阶段。 不过JNJ-8114的一项I期研究（NCT05441501）在今年3月刚刚完成，但却已消失在强生2024Q1的管线图中。此前，强生还放弃了另一款治疗前列腺癌的CD3/TMEFF2双抗管线JNJ-8902。 JNJ-8343建立在强生和Zymeworks 2017年的合作基础上。交易背后，强生看中了Zymeworks的Azymetric和EFECT平台，其中Azymetric平台通过对IgG样抗体的重链和轻链进行专有的氨基酸修饰，从而实现单抗到多抗的转换。 JNJ-9401同样诞生于合作模式。2021年10月，强生与Xencor就CD3/CD20双抗plamotamab和CD28双抗达成一笔超13亿美元的交易。不过并不是所有交易都能走到最后。今年6月，强生已经退回了plamotamab的全球权益。至于CD28双抗的开发，除JNJ-9401外，还延伸出了CD28/CD20双抗JNJ-1493这一产品，剑指非霍奇金淋巴瘤（NHL）领域。 靶向CD3/CD22的JNJ-8780也主要用于NHL，强生于2020年9月启动了该药物的首次临床试验（NCT04540796）。2022年9月，JNJ-8780的临床足迹扩张至中国，然而在2023年10月强生主动终止了这一研究（CTR20222211）。 事实上，之后强生仍开展了有关JNJ-8780的临床试验，不过主要作为联合的选项出现。2023年11月，强生启动了JNJ-1493联合JNJ-8780或CD3/CD20/CD79b三抗JNJ-8543的试验（NCT06139406）。双抗+双抗甚至三抗的组合，还是一个待验证的新方向，也期待强生的突破。 血液疾病领域，强生还布局了一款潜在FIC双抗JNJ-9968，用于治疗骨髓纤维化。该药物靶向CD3/CALR，而CALR（钙网蛋白）是一个极其新颖的未成药靶标，全球在研药物也仅有4款。有研究[1]证实，暴露在表面的CALR可以作为NK细胞的内源性激活剂，向骨髓细胞传递强大的促吞噬信号，协调先天免疫监视的各个方面。 在自免领域，强生也扎下了较深的根基，乌司奴单抗、英夫利昔单抗、古赛奇尤单抗、戈利木单抗等生物制剂每年为其带来了可观的业绩增量。从药物类型来看，这些产品都属于单抗，自免领域双抗药物的迭代也在推进中。 靶向IL-4Rα/IL-31的NM26治疗特应性皮炎（AD）的I期研究于2023年5月启动。一年后，强生又以8.5亿美元现金收购了聚焦于免疫学的Proteologix，目的就是丰富自免双抗管线。收购而来的IL-13/TSLP双抗PX128和IL-13/IL-22双抗PX130均处于临床前阶段，两者主要适应症都覆盖了AD。 针对AD，强生全球免疫疗法负责人David Lee认为双抗有“实现最佳疾病疗效的机会”[2]。AD是一种异质性疾病，不同的患者亚群有不同的致病通路，“目前的AD疗法要么仅能抑制单一致病通路且疗效有限，要么具有广泛的免疫抑制作用，但又会导致严重的安全性问题”，而双抗可以同时针对两种不同的致病通路，可能提供高标准疗效和缓解。 强生在双抗赛道的布局，策略性覆盖了实体瘤、血液学和自免领域这几个优势业务板块。目标明确，火力集中，如此步步为营之下，强生的收获是必然的。 阿斯利康：倾力打造肿瘤免疫双抗“双子星” 阿斯利康在双抗赛道上的布局渐近收获期。靶向PD-1/CTLA-4的volrustomig和靶向TIGIT/PD-1的rilvegostomig这两款肿瘤免疫（IO）双抗均已进入III期临床阶段，共同瞄准NSCLC大适应症，也是阿斯利康着重打造的“双子星”。 在肺癌领域，阿斯利康凭借一个个重磅产品持续引领着临床治疗变革，从一代EGFR-TKI吉非替尼到三代的奥希替尼，PD-L1单抗度伐利尤单抗和HER2 ADC德曲妥珠单抗肺癌适应症的快速拓展，又不断稳固阿斯利康肺癌领导者的地位。阿斯利康与第一三共合力打造的TROP2 ADC药物Dato-DXd也已申报上市，尝试覆盖非鳞状NSCLC人群。 有了小分子、单抗、ADC不同类型的产品之后，阿斯利康并没有停止对新技术的追逐，而且它希望立足现有产品基础打出一套更强的组合拳。双抗就是阿斯利康实现上述目标的重要资产。 透视现有的临床布局，可以发现阿斯利康为IO双抗开辟的版图主要围绕联合治疗展开。一方面是IO双抗与化疗的联合，可能实现比PD-1单抗更强的疗效。2023年10月，阿斯利康启动了volrustomig联合化疗一线治疗PD-L1表达＜50%的NSCLC的III期研究（NCT05984277），头对头K药。今年10月，阿斯利康又登记了rilvegostomig联合化疗一线治疗PD-L1阳性的非鳞状NSCLC的III期头对头研究（NCT06627647），同样对标K药。 在挑战K药的道路上，已经有先行者取得胜利。在一线治疗PD-L1阳性NSCLC的III期HARMONi-2研究中，康方生物的PD-1/VEGF双抗依沃西单抗相较于K药实现了更显著的PFS获益。 另一方面，阿斯利康倾力挖掘更具竞争力的“IO+ADC”组合。比如，rilvegostomig与Dato-DXd的联用。围绕该组合，阿斯利康已先后启动TROPION-Lung10和TROPION-Lung12两项III期研究，分别针对一线治疗PD-L1高表达的非鳞状NSCLC和辅助治疗IB-IIIB期NSCLC场景。 此外，靶向PD-1/TIM-3的sabestomig和靶向EGFR/c-Met的FPI-2053也可能有治疗NSCLC的潜力。Sabestomig已读出单药二线治疗IIIB-IV期NSCLC的I/IIa期研究数据（NCT04931654），19例患者中有2例实现未确认的部分缓解（PR）。 值得一提的是，上述双抗不仅在阿斯利康的肺癌布局中扮演重要角色，也是其进击消化道肿瘤领域的潜在利器。II期GEMINI-Gastric研究显示，接受rilvegostomig联合化疗治疗的40例HER2阴性胃或胃食管交界腺癌患者的确认ORR为52.5%。 靶向CD3/CLDN18.2的AZD5863（HBM7022）主攻胃癌、食管癌和胰腺癌等，由阿斯利康于2022年4月从和铂医药引进来的，交易时其还处于临床前开发阶段。“通过临床前资料，我们发现HBM7022在包括胃癌和胰腺癌在内的实体瘤中表现出强大的潜在功效。”阿斯利康肿瘤研发负责人Susan Galbraith当时表示。敢于在早期就出手押注，也充分说明阿斯利康对于这款中国创新资产的看好。 在实体瘤领域之外，阿斯利康也有两款双抗已推进至III期临床阶段，即gefurulimab和AZD0486。开发gefurulimab的主要目的是为涉及末端补体途径激活的慢性疾病患者提供皮下治疗选择。这是一种迷你双抗（25kD），由一个N端白蛋白结合型VHH和一个C端C5结合型VHH通过柔性linker连接而成。如此设计的巧妙之处在于，较小的分子量可以带来更好的渗透性，与白蛋白的结合能够延长其半衰期。 CD3/CD19靶向的AZD0486由阿斯利康以超12亿美元收购TeneoTwo获得。通过单药或联合BTK抑制剂、CD20靶向疗法治疗，AZD0486有望解锁滤泡性淋巴瘤（FL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）等血液肿瘤适应症。今年8月，阿斯利康已经启动AZD0486联合CD20单抗利妥昔单抗一线治疗FL的III期试验（NCT06549595），计划招募1005例患者。 随着4款不同作用机制的双抗管线相继进入III期临床阶段，阿斯利康已经成为双抗赛道上实力不容小觑的明星玩家。结合联合治疗的策略打法，这些双抗可能将与更多已上市产品形成紧密捆绑的关系，为未来的市场竞争做好铺垫。 参考资料： [1]Jitka Fucikova, Radek Spisek, et al. Calreticulin and cancer[J]. Cell Research volume 31, pages5–16 (2021) [2]https://www.jnj.com/media-center/press-releases/johnson-johnson-to-acquire-proteologix-inc-to-lead-in-atopic-dermatitis-treatment 推荐阅读 安进双抗业务布局的启示 制药巨头的核药版图 制药巨头ADC布局：辉瑞有钱任性，罗氏抢占先机，AZ异军突起，默沙东雄心勃勃...... Copyright © 2024 PHARMCUBE. All Rights Reserved. 欢迎转发分享及合理引用，引用时请在显要位置标明文章来源；如需转载，请给微信公众号后台留言或发送消息，并注明公众号名称及ID。 免责申明：本微信文章中的信息仅供一般参考之用，不可直接作为决策内容，医药魔方不对任何主体因使用本文内容而导致的任何损失承担责任。

摘要:程序性细胞死亡1（PD-1）信号通路是免疫检查点调节的关键因素，已成为癌症免疫治疗的焦点。在癌症的背景下，肿瘤细胞上上调的PD-L1可能导致T细胞耗竭和免疫逃逸，促进肿瘤进展。PD-1/PD-L1抑制剂的出现通过解除T细胞的耗竭显示出临床成功。然而，诸如抗药性和不良反应等挑战促使人们探索创新策略，双特异性抗体（BsAbs）作为有希望的前沿出现。BsAbs通过同时靶向PD-L1和其他免疫调节分子，为癌症免疫治疗提供了一种多方面的方法。我们重点关注PD-1/PD-L1治疗的最新进展，特别强调BsAbs的开发和潜力，尤其是在实体瘤的背景下。讨论了针对PD-1信号的各种BsAb产品，突出了它们独特的作用机制和治疗潜力。值得注意的例子包括抗TGFβ×PD-L1、抗CD47×PD-L1、抗VEGF×PD-L1、抗4-1BB×PD-L1、抗LAG-3×PD-L1和抗PD-1×CTLA-4 BsAbs。此外，我们还总结了正在进行的临床研究，评估这些创新BsAb药物的疗效和安全性。通过揭示肿瘤微环境的复杂性并利用抗PD-1/PD-L1 BsAbs的协同效应，有潜力提高癌症免疫治疗的精确性和有效性，最终实现针对个体患者档案量身定制的个性化治疗策略的发展。 1.背景 程序性细胞死亡1（PD-1）信号作为一种基础的免疫检查点机制，能够降低炎症反应并维持免疫稳态。PD-1中的关键结构，即免疫受体酪氨酸基抑制/开关基序（ITIM/ITSM），促进信号传导并在细胞内招募磷酸酶（SHP1/2）。PD-1/PD-L1信号不仅作为预防自身免疫疾病的关键途径，而且显著影响肿瘤免疫监视与免疫耐受之间微妙的平衡。肿瘤细胞或浸润淋巴细胞上PD-L1的增加可能导致T细胞耗竭，抑制肿瘤特异性免疫并促进肿瘤进展。PD-1/PD-L1抑制剂通过阻断负性调节信号，有效释放T细胞的耗竭状态，成为开创性的治疗方法。自2014年FDA批准首个抗PD-1抗体（帕博利珠单抗）以来，PD-1/PD-L1阻断疗法已经彻底改变了临床实践，展现出对难治性肿瘤特别有效的强大且持久的抗肿瘤效果。PD-1/PD-L1抑制剂通过破坏肿瘤利用的免疫抑制信号，使免疫细胞更有效地识别和杀死癌细胞。抗PD-1/PD-L1药物的临床成功强调了免疫检查点阻断在癌症治疗中的重要性。然而，诸如抗药性、有限的响应率和不良反应等挑战促使人们探索创新策略以优化和扩大治疗影响。与此同时，双特异性抗体已成为癌症免疫治疗中有希望的前沿。通过同时靶向PD-L1和参与免疫调节的其他关键分子，双特异性抗体（BsAbs）提供了一种多方面的方法来增强抗肿瘤免疫反应。本综述深入探讨了PD-1/PD-L1阻断的最新进展，并探索了双特异性抗体的潜力，重点关注它们在实体瘤中的开发和应用。通过阐明针对PD-L1 BsAb开发的进步，特别是为实体瘤量身定制的那些，本综述旨在为癌症免疫治疗的不断发展的理解做出贡献，并为更有效和个性化的治疗策略铺平道路。 2.BsAb的进步 2.1.BsAb的开发 针对肿瘤相关抗原（TAAs）的单克隆抗体，如Her2或EGFR，在乳腺癌和肺癌治疗中的成功，促使人们探索创新方法，包括开发BsAbs。BsAbs自20世纪80年代引入以来，因其在癌症治疗中的潜力而受到广泛关注。从功能上讲，BsAbs作为免疫效应细胞和肿瘤细胞之间的有效连接，或同时阻断两种不同的致癌分子。此外，一些BsAbs通过引导各种效应细胞以非MHC限制的方式杀死肿瘤细胞来增强肿瘤杀伤（图1）。技术的进步已经产生了各种BsAb格式，根据Fc结构域分类为非IgG格式和IgG格式。IgG样制剂保留Fc介导的抗体效应功能，而无Fc的BsAbs缺乏这些功能。双特异性T细胞引导剂（BiTEs）和TriomAbs是著名的BsAb格式。BiTEs缺乏Fc结构域，表现出短的血清半衰期，限制了它们的临床应用。TriomAbs具有IgG样结构，显示出更慢的清除率，但面临免疫原性和由于Fc结构域导致的渗透性受损的挑战（图2）。 图1 双特异性抗体（BsAbs）通过非MHC限制性方式引导各种效应细胞向肿瘤细胞，增强了肿瘤杀伤能力。BsAbs促进了T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，触发了一系列导致T细胞激活的事件。活化T细胞在癌细胞裂解中采用的主要机制涉及Granzyme-B和Perforin（改编自BioRender 2023的“双特异性抗体作用机制”）。 图2 blinatumomab和TriomAbs的杀伤肿瘤机制。Blinatumomab是一种抗CD3×CD19的双特异性T细胞引导剂（BiTE）抗体。Blinatumomab旨在结合B细胞的CD19和T细胞的CD3。通过连接这两种细胞类型，blinatumomab有助于促进T细胞对癌细胞的反应，导致B细胞白血病细胞的破坏。Catumaxomab是基于TriomAbs技术的抗CD3×EpCAM BsAb，结合癌细胞的EpCAM和T细胞的CD3。值得注意的是，Fc结构域可以结合效应细胞（包括NK细胞、巨噬细胞和树突细胞）的Fcγ受体，触发抗体依赖性细胞毒性或吞噬作用，以及对癌细胞的补体依赖性毒性（改编自BioRender 2023的“双特异性抗体设计”）。 在过去十年中，BsAb的开发主要由BiTEs主导。这些抗体同时结合T细胞的CD3和肿瘤细胞的TAAs，激活T细胞信号级联并启动依赖目标的肿瘤细胞杀伤。与检查点抑制剂不同，BiTEs克服了T细胞受体（TCR）的主要组织相容性复合体（MHC）限制，在临床上通过FDA批准的blinatumomab（抗CD3×CD19）得到了验证。此外，抗CD3×CD20 BsAb mosunetuzumab也已获准用于难治性或复发性滤泡性淋巴瘤。然而，尽管在血液恶性肿瘤中观察到有希望的结果，但在实体瘤中的双特异性抗体治疗效果，这些占所有癌症的90%，仍然是一个挑战，主要是由于抑制性肿瘤微环境（TME）损害了T细胞活性并促进了免疫缺陷。 另一条BsAb研究途径涉及同时靶向肿瘤细胞上的两个表位或TME中的细胞因子（图3）。与BiTEs不同，这些双特异性抗体旨在阻断两条促肿瘤信号通路，产生协同抗癌效果或最小化药物抗性。例如，双功能抗体M7824，靶向PD-L1和TGFβ，在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中显示出显著的临床疗效。此外，尽管BsAb在实体瘤中的临床结果与血液恶性肿瘤相比不太令人满意，但正在进行的研究和临床试验，特别关注通常表达的抗原（例如EpCAM、HER2、PSMA和CEA），展示了BsAb在癌症免疫治疗中的巨大潜力。最近，同时靶向PD-L1和其他免疫抑制分子的BsAbs已经开发出来。这些BsAbs在临床前和临床研究中显示出强大的抗肿瘤活性，被视为下一代免疫检查点抑制剂（ICIs）。 图3 同时靶向肿瘤细胞上的两种免疫抑制分子或肿瘤微环境中的细胞因子的双特异性抗体。与BiTEs不同，这些双特异性抗体旨在阻断两条免疫抑制信号通路（4-1BB激动剂抗体除外），产生协同抗癌效果或最小化药物抗性（使用Biorender创建）。 2.2.BsAb在实体瘤中的挑战 在解决实体瘤恶性肿瘤时，BsAbs遇到了阻碍其临床成功的重大障碍。主要挑战包括管理与治疗相关的不良反应，减轻靶向和非靶向毒性，并应对免疫抑制性TME的复杂性。与BsAbs相关的关键问题，特别是那些具有完整Fc结构域的BsAbs，是非靶向毒性的风险，以细胞因子释放综合征（CRS）为例。CRS是一种系统性炎症反应，其临床表现范围从轻微症状到严重的、潜在致命的情况，通常以细胞减少等实验室标志为特征。CRS的病理生理学涉及由活化T细胞释放的IFN-γ触发的免疫级联反应，随后促使巨噬细胞产生过量的炎症细胞因子。这个问题的一个重要贡献者是无意中的T细胞激活，这可能通过非靶细胞上的FcγR结合等机制发生。 标准的缓解策略包括皮质类固醇预处理和优化剂量。此外，针对CRS发病机制中的关键细胞因子IL-6，使用tocilizumab等拮抗剂已显示出在不损害BsAb治疗的抗肿瘤效果的情况下减轻这些不良影响的希望。此外，BsAb设计的创新，如采用无Fc格式或具有修改Fc结构域的抗体，对于减少这些风险至关重要。此外，靶向毒性直接与BsAbs的靶向特异性相关。虽然某些肿瘤相关抗原（TAAs）表现出适用性，但其他由于在正常组织中的存在而带来风险，导致显著的毒性。例如，靶向EpCAM的BsAbs已经显示出这个问题。此外，BsAbs对其靶标的强亲和力可能导致靶向CRS。然而，与组织毒性不同，靶向CRS通常是短暂的，可以通过剂量调节和支持性治疗进行管理。 此外，BsAbs在实体瘤中的有效性受到TME的严重影响。一个重大挑战是免疫沙漠肿瘤中T细胞浸润不足，这限制了BsAb的效力。创新的干预措施，如使用溶瘤病毒，已被用来提高T细胞浸润，将“冷”肿瘤转化为更具反应性的“发炎”肿瘤，从而克服对T细胞参与BsAb治疗的抗性。此外，TME的免疫抑制特性，以BsAb治疗期间PD-1和PD-L1的上调为标志，呈现了另一个障碍。BiTEs在实体瘤中的中等效力导致了探索辅助疗法，如检查点抑制剂和T细胞共刺激因子，以增强其抗肿瘤活性。这些组合在临床前研究中通过克服T细胞耗竭和放大BiTE效果显示出希望。此外，将BiTEs与4-1BB激动剂等T细胞共刺激因子结合使用的策略，在提高BiTE性能方面已经有效。总之，将BsAbs与其他免疫疗法结合可以增强治疗效果，尽管结果因BsAb组成、靶标抗原和肿瘤类型而异。因此，BsAbs与实体瘤TME之间的复杂动态需要多方面和创新的治疗策略，以充分发挥其潜力。 3.抗TGFβ×PD-L1 BsAb 3.1.TGFβ在癌症免疫学和免疫治疗中的作用 转化生长因子β（TGFβ）信号通路在癌症生物学中表现出双重性质，根据特定的细胞和组织环境，既发挥肿瘤抑制作用，也发挥促进肿瘤的作用。在正常细胞中，TGFβ的功能是维持细胞稳态并防止肿瘤起始，主要通过阻断细胞周期、促进细胞分化和触发细胞凋亡。该途径在不同细胞类型中的响应因Smad蛋白等因子的差异表达而异。相比之下，在癌细胞中，TGFβ的调节作用通常因突变或表观遗传变化而受到干扰或改变，导致从控制增殖转变为促进癌症进展。在肿瘤微环境中，过度活跃的TGFβ信号，通常在正常上皮细胞中具有抑制作用，反常地支持肿瘤生长、侵袭和转移行为。值得注意的是，TGF-β诱导的上皮-间充质转化（EMT）在癌症发展、侵袭和扩散中至关重要。EMT对TGFβ水平的灵活性和可逆性强调了它作为潜在治疗靶点的重要性，特别是因为它促进了与肿瘤进展和化疗抗性相关的干细胞样表型。全面了解TGFβ在不同癌症类型和组织中的对比作用，以及其对肿瘤微环境的影响，对于设计靶向治疗以遏制癌症进展至关重要。 值得注意的是，越来越多的证据表明，TGFβ在癌症免疫学和免疫治疗的复杂格局中扮演着核心角色，对肿瘤发生和免疫调节发挥双重作用。其在肿瘤微环境中的作用是多方面的，它不仅有助于促进肿瘤发生，还建立了一个免疫抑制环境，保护癌细胞免受免疫监视。TGFβ的免疫抑制功能通过其能力抑制各种免疫细胞的激活和功能来体现，包括自然杀伤细胞、T细胞和树突细胞。此外，TGFβ增强了免疫抑制性调节性T细胞（Tregs）的分化和扩增，进一步倾向于免疫逃逸，有利于癌细胞。在癌症免疫治疗的背景下，TGFβ的免疫抑制性质构成了一个重大障碍。旨在中和或抑制TGFβ信号的策略已成为提高免疫疗法效果的有希望途径。值得注意的是，抗TGFβ×PD-L1 BsAb的发展代表了一种开创性的方法，同时靶向肿瘤微环境中的多个免疫抑制途径，从而释放免疫系统对抗癌症的全部潜力。 值得注意的是，TGFβ在癌症中的双重作用强调了理解其在有效患者选择中的情景影响的必要性。TGFβ信号的多效性活动在开发癌症治疗的拮抗剂中提出了挑战，特别是由于缺乏特定的生物标志物和确立的剂量方案。为了将TGFβ阻断剂有效地整合到前线癌症治疗中，未来的临床试验需要专注于生物信息学和识别分子生物标志物，用于患者分层和治疗优化。 3.2.M7824和其他双功能抗体 M7824是一种新型双功能融合蛋白，代表了PD-L1×TGFβ双重阻断疗法的重要进展（表1）。这种创新药物结合了Fab中的抗PD-L1域和Fc中的TGFβ受体，允许同时靶向两种免疫抑制途径。M7824旨在靶向肿瘤细胞上的PD-L1分子，将陷阱分子定位在肿瘤微环境中以捕获免疫抑制性TGF-β。然后，M7824被表达PD-L1的细胞内化，导致去除M7824结合的TGF-β。理论上，由于其物理桥接效应，M7824预计对肿瘤细胞的特异性比两种单克隆抗体的组合要大。在动物模型中，M7824显示出强大的抗肿瘤效果，明显延缓肿瘤生长并延长存活。除了其直接的抗肿瘤效果外，M7824诱导了肿瘤微环境的大量重塑，包括预防或逆转TGFβ介导的癌细胞上皮-间充质转化。这种改变增强了肿瘤细胞对免疫介导攻击和化疗药物的敏感性。融合蛋白增加了细胞毒性淋巴细胞的数量和活性，同时减少免疫抑制亚群的比例，包括Tregs、骨髓源性抑制细胞（MDSC）和M2样巨噬细胞。此外，M7824诱导肿瘤基质重塑，有助于改善免疫细胞浸润，并加强其作为多方面免疫治疗剂的潜力。此外，当与放疗、化疗和其他免疫治疗剂结合使用时，它增强了整体抗肿瘤活性。在1期试验中，M7824提供了有希望的响应，特别是在高PD-L1表达的NSCLC中（NCT02517398）（表2）。 M7824的成功促进了额外的抗TGFβ×PD-L1双功能蛋白的探索和发展。其中，SHR-1701的结构让人想起M7824，结合了抗PD-L1域和N末端截短的TGFβRII。在1期临床试验（NCT05179239）中，SHR-1701在复发性转移性宫颈癌中表现出抗肿瘤活性。同样，由抗PD-L1抗体和TGFβRII外细胞域组成的双功能蛋白BR102，在小鼠肿瘤模型中展示了抗肿瘤活性。这些新兴的抗体，包括SHR-1701和BR102，为潜在的抗TGFβ×PD-L1阻断疗法的不断扩大的武器库做出了贡献，为癌症免疫治疗的复杂格局提供了新的治疗策略。 3.3.YM101和BiTP YM101被誉为世界上首个公开报道的抗TGFβ×PD-L1 BsAb，标志着癌症免疫治疗领域的关键进步。利用Check-BODY™技术平台设计，YM101代表了用于对抗PD-L1和TGF-β双重挑战的创新策略。临床前研究揭示了YM101有效抵消TGF-β和PD-1×PD-L1信号通路效应的能力。此外，在体内证据表明，YM101在抗肿瘤活性方面优于单独的抗TGF-β和抗PD-L1治疗。我们假设这种改善的抗肿瘤效果可能归因于YM101独特的物理桥接效应带来的增强的肿瘤特异性。然而，必须承认，我们目前的推测缺乏实验证据来证实它。在未来的研究中，必须使用同位素标记等技术进一步验证并展示YM101的优势，特别是在其增加肿瘤特异性和相关增强抗肿瘤效果的潜力方面。 此外，YM101在塑造肿瘤微环境方面发挥了变革性作用，促进了以增加的肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）数量和活性为特征的炎症肿瘤的形成。YM101还将巨噬细胞的极化平衡转向抗肿瘤的M1表型，进一步增强了其免疫治疗潜力。此外，在临床前研究中，STING激动剂和YM101的组合通过针对三条独立且互补的途径，展示了强大且持久的抗肿瘤免疫保护。STING激动剂诱导树突细胞成熟并激活巨噬细胞，重新点燃免疫学上的冷肿瘤，并增强全身的先天和适应性免疫反应。与YM101结合使用时，STING激动剂协同作用，使肿瘤微环境正常化并阻碍非炎症模型中的肿瘤生长。 受到临床前结果的鼓舞，随后开发了用于临床试验的替代分子（BiTP）。BiTP与YM101具有相似的结构，并使用Check-BODY™平台构建，在小鼠三阴性乳腺癌（TNBC）模型中证明了其有效性。在人源化TNBC模型中的有效性实验表明，BiTP显示出比相应单一疗法更好的抗肿瘤效果。BiTP减少胶原蛋白生成，增强T细胞渗透，并增加淋巴细胞向肿瘤的浸润。目前，正在进行多项BiTP的临床试验，包括CTR20211776（用于实体瘤）和CTR20223410（用于胰腺癌）。总的来说，以YM101、BiTP和M7824为代表的抗TGF-β×PD-L1 BsAb的开发，代表了癌症免疫治疗的变革性方法。这些创新药物旨在同时靶向多条免疫抑制途径，在临床前和临床环境中显示出显著的效果。在组合疗法中观察到的协同效应进一步强调了这些抗体克服抗性机制并扩大其在不同肿瘤类型中的适用性的潜力。 4.抗CD47×PD-L1 BsAb CD47在癌症中发挥关键作用，通过与其配体肿瘤细胞上的信号调节蛋白α（SIRPα）结合传递“不要吃我”信号。破坏CD47或其配体的抗体在临床前研究和临床试验中显示出治疗效果。CD47阻断增强了各种肿瘤模型中的抗原呈递、吞噬作用和免疫浸润，支持了CD47阻断免疫治疗药物的开发。此外，CD47/SIRPα和PD-1/PD-L1信号的双重阻断，分别抑制先天和适应性免疫反应，在多种癌症类型中显示出增强的治疗效果，为刺激免疫系统的两个分支提供了有希望的治疗途径。基于纽扣-入洞（KIH）平台，Wang等人开发了一种抗CD47×PD-L1 BsAb 6MW3211，该抗体设计有一个通用轻链，对CD47具有低亲和力，对PD-L1具有高亲和力。这种独特的亲和力配置文件允许优先结合肿瘤细胞的PD-L1，抑制CD47信号通路。6MW3211在多种小鼠模型中展示了强大的治疗效果，并在体内展示了有希望的药代动力学和安全性。通过多重荧光免疫组化染色确认的多种人类肿瘤上CD47和PD-L1的共表达，支持6MW3211针对PD-L1+ CD47+癌症的临床试验的潜力。 此外，Chen等人构建了一个亲和力调整的抗CD47×PD-L1 BsAb（hBisAb），以提高抗体选择性和治疗效果。hBisAb利用纽扣-入洞技术和通用轻链结构开发，采用IgG1格式。这种人性化抗体对CD47表现出中等亲和力，对PD-L1表现出高度有效的亲和力，这一点通过表面等离子共振和基于细胞的实验获得的动力学速率常数得到证实。特别设计用于优先结合PD-L1，该抗体有效阻断PD-1/PD-L1相互作用，也抑制了CD47/SIRPα轴。这种双重作用机制不仅增强了T细胞功能，还显著提高了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，超过了单独针对任一检查点的单一疗法。体外和体内研究表明，hBisAb对肿瘤细胞具有显著的选择性，超过了红细胞，解决了CD47靶向疗法常见的挑战，通过最小化不必要的血液学效应。这种选择性进一步由抗体在肿瘤微环境中对表达PD-L1的细胞的优先结合所强调，减少了非靶向效应，提高了治疗安全性。特别是IgG1形式的双特异性抗体在促进抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）和DC介导的T细胞激活方面显示出优越的效力，导致同种异体小鼠模型中显著的肿瘤生长抑制和提高的生存率。值得注意的是，这种方法通过维持治疗小鼠的正常红细胞计数和体重，减轻了与CD47靶向相关的潜在毒性，突出了双特异性抗体增强的抗肿瘤效果和减少的副作用。 此外，还有一些其他的抗CD47×PD-L1 BsAbs已被报道。例如，IBI322被设计为通过优先结合PD-L1+CD47+肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞吞噬，同时最小化对CD47+PD-L1−细胞（如红细胞）的影响，以提高治疗选择性和效果。同样，一种双重靶向融合蛋白IAB有效地结合了CD47和PD-L1，展示了强大的抗肿瘤活性，并在激活先天和适应性免疫对抗肿瘤中发挥了至关重要的作用。这些创新方法强调了双重检查点阻断的潜力，同时靶向CD47和PD-L1，以改善治疗结果，同时减轻与传统抗体相关的毒性。 5.抗VEGF/PD-1和抗VEGF/PD-L1 BsAb VEGF是由低氧肿瘤微环境诱导的，刺激内皮细胞增殖和血管生成。此外，VEGF具有免疫抑制作用，促进免疫抑制细胞的招募并阻碍免疫细胞浸润。将抗血管靶向药物与ICIs结合使用已在多种癌症中显示出协同抗肿瘤效果，突出了双重治疗策略在癌症治疗中同时解决血管生成和免疫反应的潜力。目前，已有多种抗VEGF×PD-1和抗VEGF×PD-L1 BsAbs成功开发用于癌症免疫治疗。 Hassanzadeh等人构建了一种双价抗PD-L1×VEGF纳米抗体，证明了其在体外有效抑制血管生成。此外，针对PD-L1和VEGF的BsAb HB0025是利用mAb-Trap技术开发的。临床前研究表明，HB0025在抑制肿瘤生长方面比单独使用抗PD-L1抗体或VEGFR1D2融合蛋白更有效。而且，Xiong等人开发了一种全人源双特异性单链双抗体（BsDb），靶向VEGF165和PD-1。这种BsDb展示了高度特异性，抑制了VEGF165诱导的人脐静脉内皮细胞中的活动，并增强了T细胞增殖和IFN-γ的产生。在小鼠模型中，BsDb通过抑制血管生成和激活免疫反应，表现出强大的抗肿瘤活性，表明其作为双重靶向BsAb用于癌症治疗的潜力。重要的是，2期临床试验评估了AK112（一种人源化IgG1抗VEGF×PD-1 BsAb）与化疗联合用于晚期NSCLC的疗效和安全性。该研究包括具有不同治疗历史和基因组改变的三个队列。1、2和3队列中确认的客观反应率（ORR）分别为53.5%、68.4%和40.0%。研究结果表明，AK112加铂类药物显示出有希望的抗肿瘤活性和安全性，为晚期NSCLC患者提供了一种潜在的新治疗选择。 6.抗4-1BB×PD-L1 BsAb 4-1BB（CD137）是一种由活化的NK和T细胞表达的诱导性共刺激分子。4-1BB信号，由其在专职抗原呈递细胞（APCs）上的配体相互作用触发，激活了通路，导致增强的细胞因子产生、存活、增殖和免疫记忆。在肿瘤微环境中，4-1BB作为肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的标志物，通常与PD-1共表达。4-1BB激活在临床前模型中显示出有希望的抗肿瘤反应，4-1BB激动剂抗体与PD-1/PD-L1抑制剂的组合协同增强了抗肿瘤免疫。目前，4-1BB激动剂与抗PD-1治疗的组合使用面临重大挑战，尤其是系统毒性。例如，由于系统激活4-1BB途径导致的剂量依赖性肝炎，一种治疗性CD137激动剂抗体的临床开发被中止。从理论上讲，BsAb技术具有潜力，因为它可能通过PD-L1结合激活4-1BB，从而增强肿瘤特异性T细胞反应。这种方法看起来很有前景，因为PD-1和4-1BB都在肿瘤特异性CD8+CTLs上共表达。 为了通过将4-1BB激动剂与这些抑制剂结合来增强ICIs的治疗效果，已经开发了几种抗4-1BB×PD-L1 BsAbs。MCLA-145被设计为一种IgG1分子，对Fc CH3域进行了特定修改以鼓励重链异二聚体化，并对CH2域进行了修改以防止Fc受体结合。体外实验表明，MCLA-145可以有效地激活T细胞，加强T细胞启动、分化和免疫记忆，并显示出比ICI对照组更好的抗肿瘤活性。重要的是，MCLA-145在非人灵长类动物中显示出没有移植物抗宿主病和最小的不良影响。在机械上，MCLA-145通过结合肿瘤细胞上的PD-L1和T效应细胞上的CD137，促进了“免疫突触”的创建。在这个突触中，T细胞可以在接受增强的TCR信号的同时解除PD-1抑制，并且CD137激活得到加强。随后的研究已经证实，MCLA-145通过PD-L1邻近细胞表达超过5000份PD-L1时有条件地激活CD137信号。这种有条件的激活提供了安全性和有效性的潜在优势。重要的是要注意，即使在最大饱和条件下，MCLA-145也不能在没有邻近细胞表达PD-L1的情况下触发CD137信号。另一种双特异性抗体ABL503，仅在PD-L1的背景下选择性激活4-1BB信号，避免了用抗4-1BB激动剂抗体治疗的患者观察到的剂量依赖性毒性。ABL503在临床前模型中展示了强大的抗肿瘤活性和改善的安全性。 PRS-344/S095012是为了阻断PD-1/PD-L1通路并定位于PD-L1阳性的肿瘤微环境中的4-1BB共刺激而开发的。这种双特异性分子有效地将免疫检查点抑制剂(ICI)与肿瘤微环境中定位的4-1BB介导的免疫刺激相结合，在小鼠模型中展示了比单克隆抗体组合更优越的T细胞刺激和抗肿瘤活性。此外，HK010，一种Fc突变的IgG4抗4-1BB×PD-L1 BsAb，通过同时阻断PD-1/PD-L1信号和刺激4-1BB信号，展现出强大的抗肿瘤效果。HK010在临床前模型中显示出强大的抗肿瘤免疫，诱导持久的抗原特异性免疫记忆，并且耐受性良好，为癌症免疫治疗提供了一个有希望的选择。另外，PM1003是一种针对4-1BB的独特表位的单域抗体，用于构建多特异性抗体，例如抗PD-L1×4-1BB BsAbs，以在肿瘤微环境中定位4-1BB激活，导致PD-L1活性和体内抗肿瘤活性的有效抑制以及最小的毒性。 值得注意的是，在1期临床试验(NCT03917381)中，研究了DuoBody-4-1BB×PD-L1 (GEN1046)，这是一种首创的双特异性免疫治疗剂，在晚期难治性实体瘤患者中的潜力。在临床前模型中，GEN1046在T细胞增殖、细胞因子产生和细胞毒性功能方面展示了比临床批准的抗PD-1/PD-L1药物更优越的效果。正在进行的人体首项研究揭示了可管理的安全性、与其作用机制一致的药效学免疫效应以及早期临床活性，在患者中观察到的疾病控制率为65.6% (40/61)，包括对先前抗PD-1/PD-L1免疫治疗有抗性的患者。GEN1046的鼓舞人心的临床前和临床结果表明其有潜力填补临床空白，为免疫治疗复发或难治性疾病的患者提供治疗选择，使其成为与其他免疫治疗剂联合治疗的有希望的候选者。总之，这些发展共同为癌症免疫治疗提供了增强的疗效和安全性的新策略。 7.抗LAG-3×PD-L1 BsAb LAG-3是激活的T细胞和NK细胞上的已识别跨膜蛋白，传递抑制信号以抑制T细胞增殖。目前正在评估阻断LAG-3和MHC-II相互作用的单克隆抗体的潜在抗肿瘤效果。然而，LAG-3和PD-1在肿瘤中的共表达意味着它们参与了T细胞耗竭。抗PD-1/PD-L1和抗LAG-3抗体的联合给药显示出协同抑制肿瘤生长的能力，在2/3期试验中，relatlimab和nivolumab的联合使用与单独使用nivolumab相比，显著延长了PFS。目前，relatlimab和nivolumab的联合使用已被批准用于晚期黑色素瘤。此外，如ieramilimab（一种抗LAG-3抗体）和spartalizumab（一种抗PD-1抗体）的组合，在包括非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、肾细胞癌、间皮瘤和三阴性乳腺癌(TNBC)的各种患者群体中展示了持续的积极反应。这些反应在未接受过抗PD-1/L1治疗的患者以及接受过抗PD1/L1治疗的黑色素瘤和肾细胞癌患者中观察到。开发抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体的合理性源于在肿瘤中观察到的共表达，表明其在T细胞耗竭中的潜在作用。 IBI323和ABL501是针对LAG-3和PD-L1的有前途的BsAbs，旨在克服在抗PD-1/PD-L1治疗中对晚期肿瘤观察到的有限效果。IBI323不仅保持了其亲本抗体的阻断活性，还引入了一种新的细胞桥接功能。这种创新机制转化为混合白细胞反应中增强的免疫刺激活性和在人源化小鼠模型中更强的抗肿瘤反应，与肿瘤特异性T细胞的增加相关。同样，ABL501是由一种抗LAG-3 IgG4抗体通过(G4S)3连接子链接到PD-L1靶向scFv构建的，具有战略性的S224P氨基酸替换以增强稳定性。它有效地结合其靶标而不引发Fc介导的效应功能，如ADCC和CDC，将其作用集中在检查点阻断上。体外实验表明，ABL501有效地靶向了LAG-3和PD-L1途径，在增强效应T细胞的激活方面优于单独的抗LAG-3和抗PD-L1抗体。ABL501在人源化异种移植模型中展示了引人注目的体内抗肿瘤效果，强调了其潜在的临床意义。对周围血液中的免疫档案的检查突出了在接受了化疗的复发性胆管癌患者中LAG-3+PD-1+记忆CD4+T细胞亚群的增强存在。值得注意的是，这个亚群预示着对ABL501增加的反应性，为其正在进行的人体首项试验(NCT05101109)提供了有价值的支持。在机械上，ABL501促进了DC的成熟和启动T细胞的能力，导致改善的抗原交叉呈递和更强大的CD8+T细胞激活。此外，ABL501直接增加了CD8+T细胞对肿瘤的细胞毒性。其效果取决于LAG-3和PD-L1的同时参与，促进有效的T细胞-肿瘤细胞相互作用。通过作为T细胞引导剂，促进T细胞激活，同时阻断抑制信号，ABL501协调了强大的抗肿瘤免疫反应。 抗LAG-3×PD-L1 BsAb FS118在临床前和临床研究中展现出了有希望的结果，为癌症免疫治疗提供了一种新的方法。在临床前研究中，FS118展示了对LAG-3和PD-L1的高亲和力同时结合，超越了抗LAG-3和抗PD-L1抗体组合的抗肿瘤活性。在同源肿瘤小鼠模型的机制研究中，使用替代的mLAG-3×PD-L1抗体显示了显著的肿瘤生长抑制。值得注意的是，小鼠替代品导致T细胞上LAG-3的丰度降低，而单独抗体的组合增加了LAG-3的表达。此外，替代mLAG-3/PD-L1抗体的结合导致小鼠LAG-3迅速脱落到血液中。在临床研究中，1期试验(NCT03440437)证明了FS118在晚期、抗PD-1/PD-L1耐药癌症患者中的安全性和耐受性。FS118显示了10 mg/kg每周的推荐2期剂量，持续的药效学活性，以及46.5%的总体疾病控制率，特别是在对PD-1/PD-L1靶向治疗获得性耐药的患者中。这项研究支持了对难治性癌症患者FS118的持续研究，突出了其作为有效的双重PD-L1×LAG-3阻断策略的潜力。除了实体瘤，针对LAG-3的BsAbs也在血液肿瘤中展示了有希望的疗效。在1期临床试验NCT03219268中，探索了抗LAG-3×PD-1 BsAb Tebotelimab在实体瘤或血液肿瘤患者中的疗效。值得注意的是，34%的患者显示肿瘤缩小，包括对抗PD-1治疗有抗性的各种癌症类型的积极反应。 8.抗PD-1/CTLA-4 BsAb CTLA-4和PD-1是抑制各种T细胞功能的免疫检查点，它们的激活通过多种机制导致T细胞功能抑制。CTLA-4在激活时诱导，与CD28介导的激活竞争，并从APCs中移除共刺激配体。PD-1在T淋巴细胞表达时，作为抑制剂减少细胞毒性和细胞因子生成。这两个检查点都被肿瘤用于免疫逃逸。阻断CTLA-4或PD-1的抗体在临床前和临床环境中都显示出抗肿瘤活性，并且组合疗法在各种癌症中展示了改善的反应。此外，TME分析揭示了与正常组织相比，肿瘤中PD-1+CTLA-4+细胞的比例更高，支持了针对PD-1+ CTLA-4+细胞的合理性，以选择性地在TME中阻断检查点，同时避免对正常组织的影响。 PD-1/PD-L1轴的系统阻断在癌症免疫治疗中是基础性的，特别是考虑到其临床意义和良好的安全性。因此，一个优越的组合疗法应该确保它保留了PD-1阻断的效果，而不影响其阻断PD-1与其配体相互作用的能力。然而，CTLA-4的系统性抑制带来了更高的不良反应风险。为了降低这些风险，抗PD-1×CTLA-4 BsAb提供了改进的CTLA-4抑制功能，专门针对在TME中共同表达PD-1和CTLA-4的细胞。例如，MGD019是一种先进的BsAb，设计用于同时靶向PD-1和CTLA-4。这种BsAb具有独特的四价结构，使用高亲和力的抗PD-1单克隆抗体，以及具有类似于众所周知的ipilimumab阻断配体特性的抗CTLA-4单克隆抗体。MGD019的构建在Dual-Affinity Re-Targeting平台上，采用2×2对称格式，结合了铰链稳定的IgG4骨架。MGD019的独特结构允许对PD-1进行强大的阻断，并适应性地抑制CTLA-4，专门针对TME。它模仿了其抗PD-1前体体外阻断PD-1的效果，同时调节CTLA-4阻断，使其在表达PD-1和CTLA-4的细胞中最有效。这种特异性确保了TME中CTLA-4的局部抑制，通过避免广泛的Treg耗尽可能提高了安全性。值得注意的是，MGD019阻断PD-1与其配体的相互作用的能力，结合其适应性CTLA-4阻断策略，在晚期实体瘤患者中显示出显著的抗肿瘤活性和可管理的安全性。 此外，MGD019的IgG4 Fc区域赋予了降低的Fc介导的ADCC能力，从而减少了无意中消除活化的T细胞和Treg。Treg耗尽对ipilimumab的治疗效果和安全性的影响仍在考察中，然而，抗CTLA-4抗体的Fc区域诱导这种耗尽的潜力在临床前研究中与有益和有害的结果都有关联。通过避免Treg耗尽，同时在TME中保持有效的CTLA-4阻断，MGD019旨在提高患者安全性并维持CTLA-4拮抗的有益效果。Treg的免疫抑制作用主要涉及CTLA-4介导的T细胞耗竭。因此，MGD019在TME中对CTLA-4的阻断预计将足够强烈，以补偿缺乏Treg耗尽。这种策略，防止Treg减少，并确保在TME中强烈CTLA-4抑制，旨在优化这些免疫检查点在癌症免疫治疗中的关键功能，可能比传统抗体治疗提供增强的治疗益处，同时最小化不良反应。 抗PD-1/CTLA-4 BsAb QL1706在1/1b期研究中对标准治疗无效的晚期实体瘤显示出可管理的安全性。在推荐剂量下的所有患者中，客观反应率为16.9%，反应的中位持续时间为11.7个月。值得注意的是，未接受过免疫治疗的患者，特别是那些患有非小细胞肺癌、鼻咽癌和宫颈癌的患者，显示出有希望的抗肿瘤活性，反应率分别为24.2%、38.7%和28.3%。QL1706目前正在随机2/3期试验中进行进一步的疗效评估。此外，MEDI5752，一种新型单价双特异性抗体，通过选择性抑制PD-1+活化T细胞上的CTLA4来增强PD-1阻断。它减少了所需的剂量，以分泌IL-2，并迅速内化和降解PD-1。MEDI5752偏好肿瘤定位，与抗PD-1和抗CTLA4抗体组合相比，在体内显示出更优越的活性。两名晚期实体瘤患者对MEDI5752治疗显示出强大的部分反应。这代表了癌症免疫治疗的重大进步，通过选择性靶向PD-1+T细胞上的CTLA4提供独特的好处。 Cadonilimab是一种四价双特异性IgG1抗体，具有创新的Fc-null设计，旨在消除Fc介导的效应功能，以考虑安全性和有效性。它展现出与CTLA-4和PD-1抗体组合相当的生物活性。值得注意的是，Cadonilimab在高密度PD-1和CTLA-4环境中显示出更高的结合亲和力，为肿瘤样环境提供了潜在的优势。在1b/2期试验NCT03852251中，探索了Cadonilimab在晚期实体瘤中的疗效。Cadonilimab显示出令人鼓舞的疗效，宫颈癌的客观反应率为32.3%，食管鳞状细胞癌为18.2%，肝细胞癌为16.7%。这些发现强调了Cadonilimab在实现多种晚期实体瘤类型的积极肿瘤反应中的潜在有效性。目前，Cadonilimab已在中国获得批准，用于治疗铂类化疗后的复发或转移性宫颈癌。 9.其他靶向PD-1/PD-L1信号的BsAbs 除了上述的药剂外，其他BsAbs已经开发并在临床试验中进行评估，如抗PD-L1/CD3、抗PD-1/PD-L1和抗TIM-3/PD-L1 BsAbs。例如，针对现有T细胞引导剂的关键挑战，抗PD-L1/CD3 BsAb的发展取得了最新进展。一个值得注意的创新是Protease-Activated PSTAGylated BiTE (PAPB)，它为实体瘤设计。PAPB结合了一个屏蔽多肽域(PSTAG)、一个蛋白酶激活的链接器和一个带有针对PD-L1和CD3的scFvs的BiTE核心。PAPB展示了BiTE核心对PD-L1和CD3的剂量依赖性结合，能够响应TME中的MMP2释放核心，显著延长其血浆半衰期。此外，一种新型基于纳米抗体的抗PD-L1/CD3 BiTE在与PD-L1表达水平相关的黑色素瘤细胞上显示出细胞毒性活性，突显了其在治疗PD-L1过表达黑色素瘤中的潜力。总的来说，这些进展标志着在实体瘤免疫治疗领域提高抗PD-L1/CD3抗体的安全性、作用持续时间和有效性的有希望的步骤。 TIM-3作为癌症免疫学中的一个关键角色，作为免疫反应的负调节器。在癌症中，TIM-3表达特别识别了最功能障碍的CD8+ T细胞亚群，表明它们的耗竭。在临床前癌症模型的研究中，联合阻断TIM-3和PD-1途径在实体瘤和血液肿瘤中显示出显著的疗效。正在进行的临床试验，特别是在实体瘤中，正在探索抗TIM-3与抗PD-1联合使用的潜力，展示了其作为癌症免疫治疗目标的前景。在1期研究NCT03752177中，评估了TIM-3/PD-L1 BsAb LY3415244在晚期实体瘤患者中的安全性和有效性。虽然一些患者显示出有希望的结果，例如PD-1耐药NSCLC患者(-29.6%)接近部分反应，但试验面临挑战。值得注意的是，16.7%的患者经历了临床意义的过敏性输注相关反应。所有患者都发展出治疗出现的抗药物抗体(TE-ADA)，影响了可溶性TIM-3目标参与，并导致研究提前终止。尽管存在这些挑战，患者结果，特别是在PD-1耐药癌症的背景下，突显了LY3415244的潜在临床影响，值得在未来的研究中进一步探索和考虑。 10.结论和展望 针对PD-1/PD-L1轴以及其他免疫调节分子的BsAbs的出现和临床验证标志着癌症免疫治疗领域的一个关键发展。本综述深入探讨了BsAbs领域的创新进展，特别关注了它们在开发、作用机制以及治疗潜力方面对实体瘤管理的贡献。探索如抗TGFβ×PD-L1、抗CD47×PD-L1等BsAbs，突显了扩大抗肿瘤免疫、克服免疫逃逸以及解决单一疗法固有局限性的战略努力。尽管这些药物的治疗前景得到了临床前和新兴临床成功的强调，但将它们最佳整合到癌症护理中的旅程将需要仔细的研究和对细节的关注。 首先，未来的研究必须集中于提高BsAbs的特异性、有效性和安全性。这包括开发下一代BsAbs，具有减少的免疫原性、改善的肿瘤穿透力和定制的药代动力学特性。先进的分子工程技术可以促进设计在肿瘤微环境中选择性积累的BsAbs，最小化系统暴露和相关的毒性。此外，肿瘤微环境的复杂性仍然是免疫疗法有效性的巨大挑战。能够调节抑制性肿瘤微环境、增强抗原呈递、并促进肿瘤内T细胞的浸润和激活的新型BsAbs尤其令人感兴趣。将BsAbs与破坏肿瘤微环境中物理屏障或中和抑制性细胞群体的药物结合起来的策略，可能会产生协同的抗肿瘤效果。此外，识别对BsAb治疗反应的预测性生物标志物至关重要。对肿瘤进行全面的基因组、蛋白质组和免疫学分析可能会揭示预测治疗反应的生物标志物，指导患者选择，并促进个性化治疗方法。这种精准医疗方法将优化治疗结果并降低不良反应的风险。此外，将BsAbs与其他治疗方式相结合，包括化疗、靶向治疗、放疗和其他免疫疗法，有着巨大的前景。基于机制合理和临床前证据的组合策略可以增强抗肿瘤效果，对抗耐药机制，并扩大BsAbs的治疗窗口。 BsAbs在癌症免疫治疗中的探索为我们对抗癌症开辟了新的前沿，承诺增强免疫介导的抗肿瘤反应的精确性、效力和持久性。BsAbs在癌症治疗中的未来预示着一个范式，其中针对多个免疫检查点的协同或将免疫调节与其他治疗策略相结合，可以为全球患者提供持久、有效和更安全的治疗选择。BsAbs在癌症护理中的实质性前景不仅突出了有希望的治疗途径，也强调了我们通过免疫手段共同致力于扭转对抗癌症的潮流。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。