LMP2

旨在预防传染病的疫苗是20世纪最大的医学进步之一，但疫苗接种的概念早已超出了预防。旨在治疗感染的治疗性疫苗已进入后期临床试验，并取得了可喜的结果，通过对基础免疫学的蓬勃发展的了解，使更强效的疫苗制剂成为可能。肿瘤疫苗，也正在如火如荼的研究之中。图1：癌症疫苗类型肿瘤特异性抗原(TSAs)主要分为两大类，包括病毒抗原和非同义体细胞突变导致的新表位，以及两种类型的肿瘤相关抗原(TAA)，包括组织特异性抗原和发育特异性抗原。表1 TSA和TAA分为4组APC摄取肿瘤抗原是关键事件（图1b）。大多数TAA是细胞内的，因此难以靶向体液应答或衍生治疗，如单克隆抗体、CAR T细胞。尽管TAA特异性T细胞可通过肿瘤细胞上的HLA分子检测到细胞内TAA，但肿瘤共刺激分子的缺陷一般会产生T细胞无能或耗竭。因此，APC，特别是DC，对于抗肿瘤T细胞启动至关重要。cDC1亚群特异性地能够交叉呈递：摄取外源性抗原，并在HLA-I上呈递给CD8 + T细胞。因此，通过激活负载肿瘤抗原的DC，癌症疫苗可能诱导针对大量细胞内抗原的免疫应答。预定义抗原预定义抗原可通过患者队列间的表达比例进一步分类。共同抗原是在足够比例的患者中表达的抗原，因此疫苗接种学家可以使用标准检测靶向这些患者组。因此，共同抗原疫苗可同时靶向TSA和TAA。例如，新表位TSA EGFRvIII在EGFR过表达的胶质母细胞瘤(GBM)中的表达率约为25%，病毒TSA HPV E6和E7在口咽癌和几乎所有宫颈癌中的表达率约为60%，而TAA WT1在大多数急性髓系白血病(AML)、乳腺癌和Wilms肿瘤中过表达。共同抗原疫苗与个性化抗原疫苗的区别在于前者可以通过细胞学、免疫组织化学和流式细胞术等标准检测进行评估。个性化抗原是接种疫苗患者所特有的。个性化抗原疫苗伴随着高通量基因测序的现代时代而发展，通常由TSA新表位组成。共同抗原疫苗共同抗原疫苗可作为‘现成’疗法，其资源强度和耗时均低于个性化疫苗。TSAs是肿瘤细胞中特有的，常驱动肿瘤发生；其中一种亚型是病毒抗原。EB病毒编码包括潜伏膜蛋白（LMP1和LMP2）在内的多种抗原，可在鼻咽癌、自然杀伤(NK)-T细胞淋巴瘤和其他肿瘤中表达。同样，HPV E6和E7是病毒TSA，可隔离肿瘤蛋白53(p53)和Rb蛋白，促进鳞状上皮增殖和肿瘤发生。过表达的突变自身蛋白是TSAs的另一个亚类。EGFRvIII是一种组成性激活、体细胞突变的EGFR变体，通常在GBM和非小细胞肺癌(NSCLC)中表达。EGFRvIII聚体肽疫苗(Rindopepimut)联合粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)和替莫唑胺的II期试验引起体液免疫应答，尽管III期试验尽管有显著的体液应答但未能显示临床获益。相比之下，TAA并不完全而是优先存在于肿瘤组织中，可能构成异常表达或过表达的蛋白。这一广泛的类别可分为发育特异性（即癌胎、癌-睾丸）、组织类型特异性或肿瘤富集蛋白。WT1是一种发育特异性转录因子，有助于肿瘤发生。短（9聚体）WT1肽疫苗的初步试验产生了免疫和临床应答，随后接种了HLA亲和力更高的改变的“异源”WT1肽，在大多数AML患者中诱导了T细胞应答，并促使进行了一项正在进行的III期试验(NCT04229979)。黑色素瘤相关抗原3(MAGE-A3)是一种癌睾丸抗原，在黑色素瘤、NSCLC和骨髓瘤中优先表达具有抗凋亡功能。TLR4激动剂-佐剂(AS02B)MAGE-A3蛋白疫苗在一项小型随机研究中诱导了体液抗肿瘤应答，但无明显临床获益。然而，在相同疫苗中加入TLR9激动剂(AS15)的随机II期试验显示，体液和CD4 + T细胞应答更大，临床应答更大，生存期延长。p53在一半的癌症中发生改变，在肿瘤中经常丢失，但也发生缺失突变和过表达。考虑到靶向个性化突变的复杂性，野生型(WT)p53的小型试验包括病毒载体编码、基于DC和长肽库疫苗以及与检查点抑制的组合，在大多数患者中证明了抗p53 T细胞应答，但临床缓解很少。相反，在接种突变型p53的结直肠癌患者中进行的一项研究显示，与相应的WT肽相比，T细胞对突变型肽的反应更大，进一步表明了自身肽的耐受性。表2. 部分共同抗原癌症疫苗试验个性化抗原疫苗与许多个体中存在的共享抗原不同，个性化抗原是一名患者所特有的，并且是最常见的新表位TSA（图1a）。设计个性化抗原疫苗包括从肿瘤和生殖系组织中提取DNA和RNA进行外显子组和RNA测序以及HLA分型的变异。新表位疫苗可与佐剂联合给药，以优化APC摄取（例如脂质体）或APC活化（例如模式识别受体(PRR)激动剂），以辅助其免疫原性。使用编码10个新表位候选靶标的合成RNA疫苗的早期个性化疫苗在转移性黑色素瘤患者中引起了大部分CD4 + 和一些CD8 + 新表位特异性T细胞应答。D-1阻断可增强这些多特异性反应，或肿瘤细胞HLA I类递呈缺失可消除这些多特异性反应。在60例黑色素瘤、NSCLC和膀胱癌患者中进行的一项新表位疫苗联合抗PD-1的大型研究也观察到新抗原特异性T细胞应答和临床应答可能高于单独抗PD-1治疗。另一种肿瘤特异性突变虽然本身不具有致癌性，但是由基因座基因重排和体细胞超突变引起的独特免疫球蛋白或TCR独特型，通常在转化细胞和由此产生的骨髓瘤、淋巴瘤或白血病中得以维持。随着临床前研究的进展，淋巴瘤患者的肿瘤特异性独特型已作为疫苗进行了检测。avrille和Genitope III期试验对利妥昔单抗或化疗治疗的伴KLH独特型的淋巴瘤患者接种GM-CSF，与安慰剂相比，两项研究均未产生临床获益。一项使用相同疫苗策略的单独III期试验(NCI-Biovest)证明了对化疗后完全缓解的患者给药时具有显著的生存获益，但接种前频繁的患者脱落混淆了结果的显著性。尽管GM-CSF已被证明可动员一些APC亚群，但其他方法，如Flt3L，已被证明在启动适应性免疫应答方面显著更有效。表3. 个性化抗原癌症疫苗试验匿名抗原匿名抗原不能通过其抗原同一性进行分类，而是可以通过其APC上样的方法和位置进行分类。匿名抗原离体疫苗来源于切除的肿瘤细胞，裂解后递送至自体APC（图1b）。匿名抗原原位疫苗依赖于内源性APC，其在肿瘤部位或附近诱导摄取抗原，可能在治疗诱导免疫原性细胞死亡后发生。与预定义的抗原疫苗相反，匿名抗原疫苗可能包括更多的抗原，甚至新的抗原类型，如肽融合表位和转录后产生的表位。匿名抗原原位疫苗在概念上与离体疫苗相似，并绕过为每例患者开发定制的符合GMP的治疗。尽管原位疫苗的种类很多，但其有效使用应诱导APC募集和肿瘤抗原负载和活化，使APC能够有效地交叉启动肿瘤反应性T细胞。原位疫苗接种结合了呈现全谱肿瘤抗原的免疫学获益与现成方法的实用性。多种类型的肿瘤内给药药物（包括病毒、PRR激动剂和其他免疫刺激剂）如果可诱导全身抗肿瘤免疫应答或疫苗接种效应，可能对原位疫苗有效。结论几十年的缓慢进展为癌症疫苗确实可以引起全身肿瘤消退、持久缓解和OS改善提供了原理证明。我们站在推进我们的免疫学理解的先驱的肩上，并将利用这种理解来开发合理有效的癌症疫苗，推动有希望的免疫治疗领域走向一个新的前沿，节省资源、时间，并最终挽救患者的生命。参考文献：Lin, M.J., Svensson-Arvelund, J., Lubitz, G.S. et al. Cancer vaccines: the next immunotherapy frontier. Nat Cancer 3, 911–926 (2022). https://doi.org/10.1038/s43018-022-00418-6

摘要细胞内抗原虽然占肿瘤抗原的90% ,但已获FDA批准并上市的药物几乎都是针对细胞外抗原的。细胞内抗原的CAR-T疗法（也称为TCR样抗体CAR-T疗法）则能扩展单克隆抗体的应用范围，将治疗领域拓展到大多数未开发的肿瘤抗原，即细胞内抗原。本文论述了针对细胞内抗原的部分TCR样CAR-T疗法的现状和局限性，特别强调了单域抗体（纳米抗体）对优化TCR样CAR-T疗法治疗效果所具有的潜力。图1 T细胞受体(TCR)和TCR样抗体示意图1.TCR抗体对胞内抗原的靶向作用胞内抗原在细胞内产生，然后被蛋白酶体降解，并在肿瘤表面以MHC或肽复合物的形式呈现在MHC-I信号通路中。为了靶向这些胞内抗原，在临床前过程中已经开发出一组称为T细胞受体（TCR）样或模拟抗体的特异性抗体。它们能够识别MHC或肽复合物以及真正的T细胞受体，随后在有效的共刺激信号下触发T细胞活化和增殖。TCR受体的开发与使用有望拓宽单克隆抗体的应用范围，并为未来的研究提供方向。为了挖掘TCR样抗体在免疫治疗中的潜力，从2001年起，与CAR-T治疗相关的TCR样抗体的研究就开始出现，但迄今为止，基于TCR样抗体的CAR-T疗法并没有得到普及（表1）。表1：在人类疾病中应用的细胞内抗原CAR-T疗法CAR设计依赖于细胞外抗原结合域、铰链区、跨膜域和传递激活信号的细胞内域。这些分子分为三代，共刺激区的数量也各不相同。众所周知，第一代仅包含CD3z，第二代在第一代的主干上添加一个共刺激域，例如4-1BB（CD137）、CD28或OX40（CD134），并且在第三代中添加了多个共刺激域。对CAR结构任何部分的微小修改都可能产生重大影响。对细胞内抗原的CAR-T疗法来说也是如此，无论是噬菌体展示或杂交瘤衍生的各种抗原结合模块还是各种共刺激域，都可在一定程度上提高治疗效果。因此，这一领域具备很大的发展潜力，值得进行深入挖掘。2.细胞内抗原CAR-T疗法现状与局限性 (一）细胞内抗原CAR-T疗法优势细胞内抗原CAR-T疗法与表达细胞外抗原的传统CAR-T疗法相比显示出一些优势。细胞内抗原的CAR-T疗法（TCR-like antibody CAR-T therapy）将治疗领域扩展到大多数未开发的肿瘤抗原，即细胞内抗原。细胞内抗原已被证明占肿瘤抗原的90%。尽管如此，针对细胞内抗原的治疗药物的数量仍然远低于针对细胞外抗原的常规CAR-T治疗药物。由于TCR样抗体的特异性以及成功的CAR-T细胞活化和肿瘤溶解，治疗效果已经得到验证 。细胞内抗原的CAR-T疗法克服了肿瘤细胞表面特异性生物标记物的不足这一难点，在实体瘤治疗方面取得了一些突破 。（二）细胞内抗原CAR-T疗法局限性01特异性难以保持据报道，由于聚集CAR的高亲和力，任何与人类白细胞抗原（HLA）的结合都可能让CAR失去特异性，因此保持TCR-like CAR 识别MHC/肽复合物的特异性是很复杂的。Maus等人已经证实，低亲和力DN-28z CAR（试图保持特异性）会触发T细胞活化和细胞毒性。02肿瘤破坏效率不足TCR样抗体介导的肿瘤破坏效率还不够。免疫抑制环境可能是原因之一。一旦T细胞进入肿瘤细胞，肿瘤细胞就会迅速隐藏自己，并分泌免疫抑制性细胞因子，从而触发自然T细胞、单核细胞、巨噬细胞或NK细胞的耗尽或死亡。分泌的细胞因子包括白细胞介素10（IL-10），它可能促进T调节细胞（Treg）的抑制活性或增加免疫抑制分子如HLA-G的表达。最终，由于肿瘤细胞表面MHC/肽复合物的表达缺失或下调，肿瘤细胞可能逃避免疫监视。然而，有证据表明，一些细胞因子和化学物质通过激活MHC信号通路和上调MHC的表达 可以逆转这种情况，在某种程度上，上述问题可以解释细胞内抗原的CAR-T疗法为何如此稀少，也表明在开创CAR-T疗法上迫切需要进一步举措。综上所述，细胞内抗原CAR-T疗法疗效有限的原因是多方面的。生产抗体的杂交瘤技术昂贵，过程复杂也是其中一大原因，不过随着噬菌体展示技术的出现，这一问题正在逐步得到解决。3.细胞内抗原CAR-T疗法优化方案图2 针对细胞内抗原的TCR样 CAR-T细胞疗法降解并以MHC/肽复合物的形式呈现在肿瘤表面。三种可能的方法。（a）传统的TCR样抗体CAR-T细胞疗法，使用单链抗体识别MHC/肽复合物，然后触发T细胞活化和增殖。（b） 纳米抗体替代传统抗体作为TCR样纳米抗体CAR-T细胞治疗的细胞外抗结合域。（c） 纳米抗体除被设计成细胞外抗原结合域之外在肿瘤内免疫环境中同时分泌，用于TCR样纳米抗体CAR-T细胞治疗。（一）靶向TCR-like CARs的单域抗体为了提高具有更高抗原结合特异性和生产效率的TCR样抗体CAR-T的治疗效果，同时寻找耗时昂贵的常规抗体的替代品，单域抗体上引起了研究人员的兴趣。骆驼的单域抗体(sdAb)，或者说重链可变区（VHH）指的是纳米抗体（图3）。骆驼重链抗体（HCAbs）由两条重链组成，每条重链都有一个可变结构域（VHH）和一个缺少CH1的恒定区域，这两条重链通过二硫键连接形成均聚物，在某种程度上，纳米抗体作为骆驼重链抗体最小的抗原结合域，其结构特征显示出优越性，包括较长的互补决定区3（CDR3），能延伸到传统抗体无法结合的凹表位。此外，疏水性氨基酸参与CDR1和CDR2的副作用域，甚至更多的残基与框架区（FR）中的抗原发生反应。图3 各种抗体的形式。（a） 单克隆抗体。（b） 骆驼重链抗体。（c） 单链抗体片段。（d） 骆驼重链抗体衍生的单域抗体或纳米抗体。 纳米抗体的主要优势在于其体积小，其分子量约为12-15kDa，这一特点能让纳米抗体穿透肿瘤样致密组织，通常使用方法简单、成本低廉的噬菌体展示技术生产纳米抗体。此外，基于上述结构特征，纳米抗体还具有高亲和力和特异性的特征，能够处理普通抗体无法达到的隐蔽表位。纳米抗体的其他优点在于低免疫原性、良好的溶解性以及在不同温度和pH值下的高稳定性。因此，纳米抗体参与了连续的实验和临床试验，尤其是在新兴的CAR-T治疗领域。然而，有限的基于纳米抗体的CAR-T工程主要针对细胞外抗原，如肿瘤相关标记物如MUC1和CD38，很少针对细胞内抗原。 据报道，特异性识别gp100 209–217 /HLA-A2的TCR样纳米抗体GPA7被导入GPA7-28z CAR，并在GPA7-28z CAR转导至T细胞后与HLAA2一起介导对人类黑色素瘤细胞的有效细胞毒性。即使可能性很小，这一假设的可能性仍然得到了证实。为了克服抗原逃逸变体的生长，HER2和CD20特异性的两个纳米抗体串联构成双特异性CAR，诱导T细胞活化和肿瘤溶解。同时，基于纳米抗体的CAR靶向肿瘤基质标记物，如PD-L1和VEGFR2，它们直接影响肿瘤微环境并延缓肿瘤生长，上述研究为细胞内抗原的CAR-T疗法提供了信息，该疗法由两个TCR样纳米抗体串联而成，两个TCR样纳米抗体对特定类型的癌症具有特异性，或者添加了针对特定类型免疫检查点抑制剂的纳米抗体，它为细胞内抗原的CAR-T疗法中基于纳米抗体的抗原结合域的改进提供了一种选择。（二）潜在的单域抗体分泌TCR-like CARs。细胞内抗原的CAR-T疗法介导的肿瘤杀伤效率低下可能与免疫抑制环境和肿瘤免疫逃逸有关，也可能阻碍相关研究。例如，肿瘤免疫抑制微环境在体外和体内模型中的不完全复制可能是实体瘤研究成功的一个挑战。为了克服这一问题，在第二代或第三代CAR序列中添加基因修饰的armored CAR-T可导致细胞因子和促炎配体分泌到肿瘤微环境中，并提高CAR-T的疗效和持久性。IL-12、CD40L、4-1BBL通常被认为是增强树突状细胞（DC）和巨噬细胞的潜能或抑制肿瘤微环境中Treg抑制的可能靶点。例如，Pegram等人报道了在一个带有武装的抗CD1928ζ/IL-12 CAR-T细胞的同基因小鼠模型中增强的肿瘤根除。在同一研究中，证明分泌的IL-12通过CAR-T细胞上的IL-12受体参与对Tregs的耐药性，这是一种自分泌模式，因此，适度的细胞因子释放可能有助于提高细胞内抗原CAR-T疗法的效果。 图4 新表位生成和靶向作用除了CAR分泌的细胞因子和促炎配体外，CAR-T还可以分泌单域抗体（VHH或纳米抗体），改变肿瘤内免疫环境，从而促进CAR-T细胞的良好功能。Yushu等人证明，与全身应用相比，CAR-T分泌的抗CD47 VHH系统性地刺激巨噬细胞吞噬，并且分泌的抗CD47 VHH Fc融合物局部增强了安全性。同时，分泌的抗PD-L1或抗CTL-4 VHH有助于CAR-T细胞的持久性。由于CAR-T可能分泌纳米抗体，这表明TCR样 CAR-T同样可能会分泌纳米抗体，来特异性识别MHC/肽复合物，从而减弱肿瘤免疫抑制微环境的影响，并增强先天免疫系统。（三）肿瘤抗原的选择细胞内抗原占肿瘤抗原的90%以上，根据不同的特征可分为三类：肿瘤病毒抗原、新抗原（肿瘤特异性抗原）、癌-睾丸抗原（肿瘤相关自身抗原）。源于EB病毒（EBV）的肿瘤病毒抗原如潜伏膜蛋白1（LMP1）、LMP2和EB核抗原1-3（EBNA 1-3）以及源于肝炎病毒（HBV）的乙肝病毒X蛋白（HBX）定位于细胞质，通过抗原呈递途径呈现在细胞表面，专门针对肿瘤特异性高的肿瘤病毒。新抗原或肿瘤特异性抗原是在肿瘤细胞发生基因或染色体突变时产生的，这些突变，如染色体易位、重复或基因每个区域的丢失，会导致如肺癌中的α-肌动蛋白-4 K122N这样的新抗原产生。癌-睾丸抗原或肿瘤相关自身抗原，如黑色素瘤抗原-1（MAGE-1），不仅能在肿瘤细胞中表达，而且在正常组织（如胚胎或生殖细胞）中也有部分表达。在所有潜在的靶向抗原中，癌-睾丸抗原（肿瘤相关自身抗原）在现有的实验结果中脱颖而出。一旦识别出潜在的靶向抗原，它们就有可能被加工并以肽的形式呈现在细胞表面。从20世纪90年代首次利用T细胞表位克隆鉴定人类肿瘤抗原MAGE-1，到利用重组cDNA表达文库（SEREX）的血清学分析鉴定NY-ESO-1等高免疫原性抗原，科学家们主要关注免疫学方法。然而，肿瘤抗原的鉴定还有很长的路要走。而其他技术，如色谱和质谱、DNA微阵列和反向免疫学也得到了发展，而质谱在直接识别肿瘤抗原肽方面显示出了优势。（四）关于CAR的其他新颖方法为了限制抗原逃逸并将毒性降至最低，引入了可切换的通用CAR，该CAR包含肿瘤特异性抗体的靶模块（TM）和对肿瘤无特异性但对标记在TM上的短肽有特异性的UniCAR-T。正是TM为UniCAR提供了特异性，一旦肿瘤不在周围，UniCAR就会保持不活动状态。在将UniCAR应用于二价表皮生长因子受体（α-EGFREGFR）的过程中，将UniCAR-T重新定位到EGFR低表达的肿瘤细胞的TM被证明是有效的，一个分离的、通用的和可编程的（超）CAR系统被设计成一种有效的工具，用于治疗基因不稳定或高度异质性的肿瘤类型，包括两部分：（1） 一种zipCAR，几乎与CAR的传统结构相同，但在胞外区有一个亮氨酸拉链；（2）一种zipFv，在外部添加有配体结合域，并融合到zipCAR上的第二个亮氨酸拉链上,在抗原结合特异性方面发挥重要作用。因此，zipCAR的效率可能因输入ZIPFv的数量和质量而异，从而拓宽了可治愈恶性肿瘤的范围。已经观察到，通过亮氨酸拉链降低zipFv输入或zipFv和zipCAR的结合亲和力将减少干扰素-γ（IFN-γ）的产生和肿瘤溶解。生物工程的非凡突破为CAR-T的进展提供了新的思路，扩大了细胞内抗原治疗的可能性。 结 论基于TCR样抗体的CAR-T细胞疗法目前虽尚未进入临床试验，然而该疗法的局限之处一旦得到解决，以细胞内抗原为靶点的CAR-T的进展将会得到理想改善。特别是，纳米抗体成本低廉和易于生产的优势有利于其进入生产。而在CAR-T中工程分泌的纳米抗体也可能会增强识别MHC/肽复合物的特异性，并改善免疫抑制环境。参考文献1.Zhu, L., Yang, X., Zhong, D., Xie, S., Shi, W., Li, Y., Hou, X., HuaYao, Zhou, H., Zhao, M., Ding, Z., Zhao, X., Mo, F., Yin, S., Liu, A., & Lu, X. (2020). Single-Domain Antibody-Based TCR-Like CAR-T: A Potential Cancer Therapy. Journal of immunology research, 2020, 2454907. https://doi.org/10.1155/2020/24549072.He, Q., Liu, Z., Liu, Z., Lai, Y., Zhou, X., & Weng, J. (2019). TCR-like antibodies in cancer immunotherapy. Journal of hematology & oncology, 12(1), 99. https://doi.org/10.1186/s13045-019-0788-4