TAU x α-synuclein x HTT

中枢神经系统疾病的基因治疗：方式、传递和转化挑战 研究概述 2024年6月19日，哈佛医学院的Nitin Joshi 教授及其团队在Nature Reviews Neuroscience期刊发表了题为“Gene therapy for CNS disorders: modalities, delivery and translational challenges”的综述论文。该研究主要概述了针对中枢神经系统(CNS)疾病的基因治疗策略，包括基因治疗的不同模式、在CNS中的传递策略，以及临床转化过程中遇到的挑战。研究团队强调了不同传递方法和给药途径之间的相互联系，并探讨了如何克服这些挑战，以提高基因治疗在CNS疾病治疗中的临床应用性和可行性。 正文 1. 引言 发现导致中枢神经系统(CNS)疾病的遗传因素为基因治疗铺平了道路，这为这些病理的药物开发提供了革命性的潜力。与传统方法不同——例如小分子、单克隆抗体和蛋白质治疗——基因治疗针对疾病的潜在遗传原因，提供了改进的特异性和治疗效果，以及个性化的治疗选择。已经开发了各种工具，如DNA质粒、成簇的规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）相关的核酸酶（Cas核酸酶）和RNA干扰（RNAi），分别促进体内基因增强、编辑和沉默。这个工具箱通过新基因操作技术的发现和系统的进展而得到丰富，这些系统使得安全有效地传递基因治疗成为可能。 截至2023年，已有110种基因治疗干预措施进入临床试验，用于治疗CNS疾病（见补充表1）。其中四种（nusinersen（Spinraza）、onasemnogene abeparvovec（Zolgensma）、elivaldogene autotemcel（Skysona）和tofersen（Qalsody））已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，还有一种（eadocagene exuparvovec（Upstaza））已获得欧洲药品管理局（EMA）的批准。尽管这些成功推动了CNS疾病的基因治疗进展，但这种方法的全部潜力受到两个主要挑战的阻碍：血脑屏障（BBB），它阻止了系统性给药分子进入大脑；以及大脑复杂的解剖结构，治疗剂必须导航到达特定区域或细胞类型。由于其高转导效率，腺相关病毒（AAVs）已在大多数临床试验中用于传递CNS基因治疗。然而，大多数基于AAV的方法依赖于侵入性的局部给药途径。非病毒载体比AAVs表现出更低的免疫原性和更大的包装能力，但面临BBB穿透和转染效率的挑战。替代的给药途径或BBB渗透方法也有其自身的局限性。 CNS基因治疗的转化成功依赖于治疗方式、传递工具和给药途径之间复杂的相互依赖性。在这篇综述中，作者探讨了这些变量及其相互联系如何影响临床适用性、可行性和可转化性。作者首先提供了一个简明的基因操作技术概述，这些技术已被用于治疗不同的CNS疾病，并讨论了它们所呈现的独特机会和挑战。然后，作者概述了当前最先进的基因传递方法，总结了它们的进步和相关的问题。作者特别关注给药途径的重要性及其对剂量、生物分布、基因毒性和免疫原性的影响。此外，作者提供了涉及CNS疾病基因治疗的临床试验的现状，并讨论了从过去的不成功试验中学到的教训。最后，作者概述了未来的发展方向和潜在的进步，这些可能为开发临床上可转化的CNS疾病的基因治疗铺平道路。 2. CNS疾病的基因治疗方式 CNS基因治疗策略大致可以分为三种类型。基因增强为那些稳态受到破坏的细胞提供蛋白质编码基因的功能性副本。基因组编辑涉及通过工程核酸酶在生物体DNA中插入、删除或改变目标序列。基因沉默不是直接影响感兴趣的基因，而是通过针对其转录产物来抑制其表达。 2.1 基因增强 基因增强包括基因替代和基因补充。基因替代通常涉及传递一个突变基因的校正版本，最适合治疗单基因疾病（图1），例如脊髓性肌肉萎缩症（SMA）。SMA的特征是SMN1基因的突变或缺失（或在某些情况下，其转化为SMN2），这导致生存运动神经元蛋白（SMN1）的表达下降，最终导致神经退行性变。FDA批准的基因治疗药物Zolgensma通过AAV9载体传递SMN1的功能性副本。在系统性给药后，Zolgensma穿过BBB并被运动神经元摄取。然后AAV9载体将遗传有效载荷释放到细胞核中，实现SMN1的稳定和持续表达。 图1. 基因增强和基因编辑策略 Skysona是一种FDA批准的基因增强产品，可以延缓由于肾上腺脑白质营养不良引起的神经功能下降（一种由ABCD1编码的过氧化物酶体膜转运蛋白缺乏引起的疾病）的4至17岁男孩。Skysona是一种单剂量、个性化的基因治疗，使用慢病毒载体将ABCD1的功能性副本转染到来自肾上腺脑白质营养不良患者的造血干细胞中。然后，这些干细胞通过静脉输注回输给同一患者以治疗疾病。Upstaza是一种携带AADC基因（编码参与神经递质合成的酶）的重组AAV2载体，是治疗AADC缺乏症的单剂量基因增强疗法，已获得EMA的批准。Upstaza被颅内输送给患有这种疾病的儿童，并已显示出在恢复运动功能方面的前景。 尽管这些商业上成功的罕见例子，但许多基因增强产品在临床试验中表现出失败。例如，CERE-110（Ceregene Inc.）使用编码神经生长因子（NGF）的AAV2载体，旨在挽救与阿尔茨海默病相关的胆碱能功能障碍。尽管I期临床试验结果证明了干预措施的安全性、耐受性和长期生物活性表达，但II期试验没有产生有效结果。 为了确保复杂疾病基因增强治疗的成功临床转化，可能很重要的是要确定一个在疾病发病机制中起主要作用的目标基因。然而，必须考虑到CNS疾病的单基因遗传模式只占有限的患者群体。例如，有几种涉及致病基因的帕金森病的单基因形式。尽管这些单基因形式相对罕见，因此替换这些基因不适用于大多数帕金森病形式，但它们确实共同占到了家族性帕金森病的约30%和散发性帕金森病病例的3-5%。同样，在阿尔茨海默病中，涉及单基因形式的疾病包括β-淀粉样前体蛋白（APP）、早老素1（PSEN1）和PSEN2的突变，值得积极考虑作为靶点。例如，APP突变出现在2-18%的患有常染色体显性早发性家族性阿尔茨海默病患者中，PSEN1突变影响了18-55%的家族性阿尔茨海默病患者，而PSEN2突变迄今只影响了极少数个体。总的来说，阿尔茨海默病的单基因形式可能只占所有阿尔茨海默病病例的一小部分（<5%）。尽管如此，制定临床试验设计时仍需考虑这些稀少的单基因遗传模式。事实上，最近的一项研究报告称，将编码野生型PSEN1的AAV9载体输送到患有单基因常染色体显性阿尔茨海默病的非人灵长类动物中，成功地恢复了皮层和海马中的PSEN1水平。同样，在小鼠和基于患者的细胞模型中，AAV-PSEN1载体显示出满意的结果。 基因补充，是基因增强的另一种形式，涉及在不总是涉及遗传突变的疾病个体中提供基因的功能性副本。这种方法的一个例子是ProSavin（最初由Oxford BioMedica开发，授权给Sio Gene Therapies（Sio），以前称为Axovant）——一种三顺反子慢病毒载体，携带三个编码多巴胺合成酶的基因。ProSavin被测试其恢复帕金森病患者多巴胺水平的能力，并是第一个进入CNS疾病治疗临床试验的基于慢病毒的基因疗法之一。在I/II期开放标签试验中，ProSavin对晚期帕金森病患者安全且耐受性良好，从基线到治疗后1年内，运动行为有显著改善。5年后的长期随访显示，ProSavin继续安全且耐受性良好，一些患者的运动行为有中等改善。然而，关于ProSavin管理后长期持久性和在其他临床结果中的有效性的关注部分归因于传递和载体设计的问题，这促使开发了OXB-102载体。OXB-102，一种改进的基因表达盒，在非人灵长类动物中显示出有希望的临床前疗效。然而，由于开发这种治疗的公司解散，OXB-102的I/II期临床评估被终止。在帕金森病中探索的其他基因补充靶点，如AADC、neurturin（NTN）、谷氨酸脱羧酶（GAD）和胶质细胞系衍生的神经营养因子（GDNF），也未能进入III期试验。传递工具的限制、给药途径、剂量方案和基因转导效率，以及对帕金森病对基因传递和表达的病理生理效应了解不足，被认为是这些失败的可能原因。 总体而言，基因增强和补充的潜在优势在于它们能够以最小的剂量实现治疗效果（为使用相对侵入性的给药途径提供了机会）。然而，其功效取决于传递工具促进基因稳定整合到相关细胞的能力。 2.2 基因编辑 与基因替代相比，用于CNS（中枢神经系统）疾病的基因编辑仍处于探索阶段。用于基因编辑的三大核酸酶家族是锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子效应子核酸酶（TALENs）和Cas核酸酶。图1和方框1提供了每种方式实现基因编辑的机制概要。 这些核酸酶实现编辑的不同机制对它们的设计标准有影响，这决定了它们的整体效用和适用性。例如，与TALENs和Cas核酸酶相比，ZFNs的体积更小，使它们更容易被输送到大脑，但设计ZFNs需要比生产TALENs更复杂的蛋白工程。此外，与TALENs和Cas核酸酶相比，ZFNs更有可能产生非目标效应。然而，研究已经展示了新ZFN架构实现精准基因组编辑的潜力，在黏多糖贮积症I/II型和血友病B患者中应用，并可能为神经系统疾病开辟新的可能性。与ZFNs和TALENs相比，CRISPR–Cas9系统提供了一个更简单、更稳健的方法，它只需要一个单向导RNA（sgRNA）和一个Cas9核酸酶来分别结合和切割目标DNA序列。CRISPR–Cas9系统已经被用于各种临床前和临床应用，并且针对CNS疾病的几个临床试验正在进行中。尽管CRISPR干扰（CRISPRi）仍然是主要技术，CRISPR激活（CRISPRa）是一种较新的策略，其中效应分子缺乏内切核酸酶活性，但引导RNA或非活性Cas核酸酶具有可以诱导基因表达的转录激活元素。这种方法主要在临床前研究中进行了探索，并在神经系统疾病的背景下显示出前景。例如，CRISPRa介导的Kcna1（编码钾通道亚单位）上调，最小化了癫痫动物模型中的癫痫发作和认知障碍。尽管CRISPR–Cas9比其他核酸酶家族具有几个优点，例如使用方便、能够适应任何基因组区域的目标选择、高效的位点选择能力和同时靶向多个位点（多重）的能力，但它也容易受到非目标效应的影响，这需要仔细设计引导RNA。 所有三种核酸酶通过在感兴趣的基因组位点引入双链断裂（DSBs），触发内源性修复机制的招募，该机制可以通过四种主要途径在切割位点插入、替换或删除核苷酸：非同源末端连接（NHEJ）、同源导向修复（HDR）、单链退火（SSA）和微同源介导的末端连接（MMEJ；一种替代末端连接的形式）。NHEJ是一个容易出错的途径，它依赖于催化切割产生的钝端的简单连接，而HDR需要一个供体DNA模板，允许高保真度修复。SSA和MMEJ也通过连接断裂附近的同源序列或通过退火暴露的微同源重复序列实现快速但突变的修复。NHEJ是核酸酶切割后的主要修复过程，但多种因素（如细胞周期阶段、对损伤的转录程序反应、局部染色质相互作用和切割位点相邻序列的身份）决定最终选择哪种修复过程。考虑到NHEJ的总体保真度较低，可能会产生有害产物，正在开发几种基于CRISPR的工程方法，以抑制NHEJ途径或优先招募并提高在修复位点更准确的HDR的效率。 较新的基因编辑技术，如碱基编辑和先导编辑，与基于核酸酶的方法相比提供了更大的精确性，因为它们在不引入双链断裂的情况下改变核苷酸序列。碱基编辑允许通过胞嘧啶碱基编辑器控制C•G到T•A的转换，以及通过腺嘌呤碱基编辑器实现A•T到G•C的转换。先导编辑扩大了可能编辑的范围，理论上可以实现所有12种可能的碱基转换（包括转换和颠换），而无需供体DNA模板或双链断裂，从而最小化了对基因组的附带损害风险。先导编辑和碱基编辑已经建立的能力，可以恢复线粒体DNA突变后的线粒体功能，为这些工具应用于涉及线粒体失衡的神经条件提供了可能性。尽管先导编辑尚未在神经退行性模型中证明成功，但碱基编辑已被用于在肌萎缩侧索硬化症（ALS）小鼠模型中纠正驱动该疾病的SOD1基因突变。除了像ALS这样的疾病需要线粒体恢复外，碱基编辑也显示出在SMA模型中将有缺陷的SMN2转换为健康的SMN1的前景。 基因编辑导致DNA的永久性变化，通常在特定的内源位点，这意味着只需要一次干预。这就证明了使用侵入性程序（如立体定向手术和脑室内及脑实质内注射）的合理性。此外，立体定向脑实质内注射可用于空间靶向的深脑基因疗法。然而，评估应用编辑的疾病阶段也至关重要。以快速空间进展为特征的神经退行性疾病可能受益于能够使工程核酸酶在大脑中扩散的策略，如脑室内和脊髓腔内注射。然而，这些给药途径也可能导致基因疗法的系统吸收，因此重要的是要设计最小化这种风险的传递载体。英国药品和保健品监管署（MHRA）和FDA最近批准了世界上第一种CRISPR疗法exagamglogene autotemcel（CASGEVY），该疗法利用电穿孔介导的体外CRISPR编辑造血干细胞来治疗镰状细胞病。作者相信，CRISPR基因编辑技术在CNS疾病中的应用也将很快进入临床评估。 2.3 基因沉默 CNS基因沉默工具中最常用的是RNA干扰（RNAi）、反义寡核苷酸（ASOs）、CRISPRi和催化核酸（CNAs）（图2）。其中，只有CRISPRi直接针对病理性DNA序列来控制基因表达；其他方法通过针对它们的mRNA转录本来沉默基因。与增强和编辑不同，基因沉默的持续时间通常很短，从几天到几个月不等（取决于所选择的模式和传递载体）。因此，需要多次剂量来提高CNS疾病患者的生活质量和生存率。 图2. 基因沉默模式 RNAi是一种内源性调控过程，依赖于短发夹RNA（shRNA）、小干扰RNA（siRNA）或微小RNA（miRNA）通过RNA诱导的沉默复合体（RISC）诱导特异性基因表达抑制。尽管已有五种FDA批准的siRNA药物用于不同的疾病，但siRNA在CNS中的直接应用很少见。 迄今为止，唯一进入CNS疾病临床试验的siRNA治疗是ALN-APP（Alnylam Pharmaceuticals公司），这是一种针对APP mRNA的合成siRNA。ALN-APP实现了有效的CNS传递，在啮齿类动物和非人灵长类动物中实现了长达3-4个月的基因沉默，经过一次脊髓腔内注射。在阿尔茨海默病患者的I期研究中，ALN-APP被证明是安全且耐受性良好的，并且降低了脑脊液中的淀粉样β蛋白、可溶性APPα（sAPPα）和sAPPβ（与阿尔茨海默病相关的APP蛋白水解产物）的水平。另一种方法是利用慢病毒传递针对BACE1（编码参与APP蛋白水解的酶）的siRNA，有效地降低了海马体中的淀粉样β蛋白水平，并减少了阿尔茨海默病动物模型中的淀粉样β蛋白斑块积累。其他研究已经针对与阿尔茨海默病相关的各种基因，包括APP、微管相关蛋白tau（MAPT）、电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）、与Rho相关的卷曲螺旋含有蛋白激酶2（ROCK II）、PSEN1和乙酰辅酶A乙酰转移酶（ACAT1）。siRNA也已在动物模型中用于针对帕金森病中的α-突触核蛋白（SNCA）、亨廷顿病中的亨廷顿蛋白（HTT）以及与多发性硬化症相关的各种基因，以及用于治疗脊髓损伤。 miRNAs的失调与各种神经系统疾病的发病机制有关，这表明基于miRNA的治疗可能通过调节目标基因的表达来针对其他无法治愈的CNS疾病。例如，miR-SOD1，使用AAV系统性传递，在ALS小鼠模型中延长了生存期，并在非人灵长类动物模型中降低了脊髓SOD1水平。鉴于这一初步的临床前成功，两名ALS患者接受了脊髓腔内注射AAV-miR-SOD1。第一名患者的一条腿的力量有所改善，而第二名患者在ALS功能的综合测量上保持了稳定分数，没有观察到其他临床益处。研究不能得出结论，即SOD1本身的抑制影响了第一名患者的临床过程，因为脑脊液中的SOD1水平没有受到影响。AMT-130（UniQure公司）的I/II期试验，一种AAV编码针对早期亨廷顿病的HTT的miRNA，表明治疗被良好耐受，并成功抑制了突变HTT（mHTT），导致脑脊液中神经丝轻链（NfL）（神经退行性的指标）水平的降低。同样，正在进行一项I/IIa期试验，以评估AMT-260（UniQure公司）在单侧难治性内侧颞叶癫痫成人患者中的应用。AMT-260使用miRNA靶向GRIK2（编码一种谷氨酸受体亚单位），并通过磁共振成像引导的对流增强传递进行管理。 ASOs通过招募RNAse H或其他核酸酶降解mRNA，或者简单地阻碍核糖体接触到mRNA来降低基因表达。一些ASOs通过结合mRNA的剪接增强区域，抑制mRNA剪接抑制，或者通过结合剪接沉默子区域，引起剪接激活和降解。Nusinersen，一种FDA批准用于治疗SMA的ASO，展示了后一种方法的成功。Nusinersen修改了SMN2前mRNA剪接，导致功能性SMN2的产生，并具有主要归因于存在ribose-O-(2-methoxyethyl)修饰和磷酸硫代骨架，增加了其稳定性的长期消除半衰期。在milasen中也使用了类似的化学修饰策略，milasen是一种22个核苷酸的ASO，为神经元脑白质营养不良7型患者提供了个性化治疗。Milasen针对MFSD8前mRNA的隐秘剪接位点，导致癫痫发作显著减少，并为开发患者定制的ASO治疗提供了模板。 针对其他神经系统疾病的ASO开发也显示出相当的前景。Tofersen已证明在降低SOD1蛋白的CSF水平方面有效，推动其进入III期试验，并因SOD1突变引起的ALS获得FDA的加速批准。其他ALS靶点，如FUS、C9ORF72和ATXN2，目前正在ASO治疗的临床试验中探索。正在进行一项I/II期临床试验，以评估ASOs降解MAPT mRNA以减少早期发病阿尔茨海默病的tauopathy负担。Tominersen旨在针对亨廷顿病中的mHTT，尽管最初的III期试验因风险-效益比差而暂停，但最近的事后分析导致了II期剂量寻找试验的重新启动，以调查亨廷顿病负担较低的个体是否可能从tominersen治疗中受益。其他针对mHTT表达的ASOs的试验，如WVE-120101和WVE-120102（Wave Life Sciences），因缺乏疗效而在IIb/IIa期终止。尽管遇到了一些挫折，但ASOs的未来看起来很光明：Ionis Pharmaceuticals公司的反义药物管线是健全的，并且适用于各种神经系统疾病。 CRISPRi通过一种核酸酶失活的Cas蛋白，dCas9，实现翻译控制，该蛋白能够将抑制域招募到基因的转录起始位点。CRISPRi已被用作研究工具，以研究疾病变体的机制、治疗靶点、基因表达的因果变化以及细胞类型选择性脆弱性决定因素，并且也已被用于神经疾病的治疗靶向。例如，在亨廷顿病的小鼠模型中，将Cas9或dCas9与包裹在慢病毒中的sgRNA结合后注射到纹状体，显著抑制了mHTT达4周，导致神经保护和改善行为功能。通过AAV载体将RfxCas13d（来自Ruminococcus flavefaciens的Cas13核酸酶）传递到SOD1的目标上，可在ALS的小鼠模型中减少缺陷基因表达，延缓疾病进展并延长生存期。CRISPR–Cas13也被用于针对亨廷顿病模型中的mHTT mRNA，导致HTT蛋白及其聚集物减少。类似地，一种旨在针对共济失调蛋白2的高保真度RfxCas13d核酸酶在ALS和小脑变性病的小鼠模型中减轻了TDP43病理。研究人员还针对亨廷顿病的啮齿类和人类模型中的mHTT RNA设计了一个RfxCas13d系统。编码此Cas13d系统的AAV载体在小鼠纹状体内部传递，导致mHTT聚集物下调、纹状体萎缩减少和运动协调性改善。另一项研究使用催化非活性Cas蛋白CasRx，针对pre-mRNA进行选择性剪接，缓解了额颞叶变性疾病神经模型中失调的tau异构体比例。 值得注意的是，CRISPRi介导的沉默持续时间取决于其组分的持久性和细胞内目标RNA和蛋白质分子的周转率。 催化核酸（CNAs），如核糖酶和脱氧核酶，为基因沉默提供了替代途径。核糖酶修改mRNA剪接并降解mRNA，而脱氧核酶在特定位点识别并切割mRNA。合成脱氧核酶已成功在亨廷顿病的小鼠模型中沉默mHTT表达，降低细胞毒性和神经毒性。核糖酶和脱氧核酶也已被用于针对阿尔茨海默病模型中的BACE1 mRNA。类似地，通过重组AAV载体传递至黑质的α-突触核蛋白核糖酶在帕金森病的大鼠模型中保护神经元免受凋亡死亡，并延长了治疗大鼠的存活期。 3. 在CNS中的基因传递策略 识别有缺陷的基因和纠正这些基因的工具只是探索治疗途径的一部分。精心构建和优化传递系统以及选择合适的传递途径对于实现理想效果的同时最小化细胞毒性至关重要（图3）。 图3. 病毒和非病毒传递系统的比较 3.1 病毒传递 病毒用于基因治疗的使用历史悠久，最早成功的临床治疗可追溯至1985年。该策略涉及将病毒基因组替换为定制的载体，并利用病毒固有的能力劫持宿主细胞的分子机制，以整合和复制治疗基因。由于它们对神经细胞的强烈转导、高转基因表达和对工程策略的适应性，各种病毒载体已被用于开发CNS基因治疗。 慢病毒载体在传递功能基因治疗脑白质营养不良方面显示出前景。例如，Skysona向患有脑肾上腺白质营养不良的个体传递功能性ABCD1基因，而其他慢病毒载体已被用于向患有异染性脑白质营养不良的个体传递功能性的硫酸酯酶A（ARSA）基因。然而，慢病毒使用的整合机制有可能导致突变和致癌，因此目前仅限于在移植前对体外自体干细胞进行转染。尽管这种策略对特定病理有效，但在调控基因表达、系统性评估移植细胞、大脑分布和制造可扩展性方面面临挑战。 与慢病毒不同，AAV将其遗传物质传递到目标细胞而不整合到宿主的DNA中，最小化了突变风险。AAV还可以通过改变它们的血清型、伪型和衣壳蛋白来工程化，以展示更广泛的组织趋向性。尽管AAV9是首个在静脉注射后显著转导大脑的血清型，但AAVrh8和AAVrh10也被证明与AAV9同样有效。此外，AAVrh10在静脉注射后在脊髓中表达，AAV5有效地转导了光感受器和视网膜色素上皮细胞。不同的AAV血清型具有不同的CNS趋向性能力，但AAV9仍然是最被充分表征的血清型，并且最常被用于进一步工程化，以增强其穿透BBB的能力，并使其能够在脑实质中的神经元和非神经元群体中转导。 例如，一种AAV衣壳变体AAV.CAP-B10最近被证明能够以高度特异性向CNS神经元传递基因疗法。AAV衣壳也已被修改以展示细胞穿透肽，导致在小鼠和非人灵长类动物中CNS转导效率提高。同样，称为基于Cre重组的AAV靶向进化（CREATE）的衣壳选择平台已被用于识别比野生型AAV9更具有特异性和效率地转导CNS或外周神经系统的AAV9变体。更令人印象深刻的是，变体被工程化以在多种非人灵长类动物物种的CNS和外周神经系统中实现稳定转基因表达。最后，通过改变细胞特异性启动子、进一步修改衣壳变体或使用特定的AAV血清型，研究人员已经能够实现对血管周细胞、内皮细胞和星形胶质细胞的细胞选择性AAV转导。 随着这些工程策略的进行，研究正在进行中，以剖析和应对AAV载体必须传递的特定基因治疗方式所提出的挑战。对于基于CRISPR–Cas的模式，通常使用的Cas9变体占据了大约4.1–4.5 kb的DNA长度，而伴随的引导RNA占据了大约0.1 kb。因此，它们的累积大小可能会排除在标准AAV载体中包装（大约4.7 kb）。最初尝试工程更小的Cas9同源物成功地绕过了包装瓶颈，但需要更长的原间隔相邻基序（PAM）序列（参与Cas9与目标DNA的结合）并且相对于未截断形式具有更低的靶向效率。此后，设计了各种小Cas9同源物，它们具有增强的结合效率和特异性，同时适应识别多样的PAM序列。AAV大小限制也促进了AAV载体共同转导（双AAV载体）和分割货物的方法的发展。然而，值得注意的是，病毒载体长期表达Cas9从免疫角度引发了担忧，其持续的核酸酶活性可能导致随时间推移的非目标效应和意外的遗传后果。因此，可能需要使用非病毒传递系统来实现CRISPR基因编辑所需的Cas9的临时表达。 使用具有更大包装能力的病毒载体也可以扩大可以使用的操纵模式库。例如，高容量腺病毒载体（HCAds）不具有病毒编码序列。这扩大了它们的包装能力到37 kb，使它们适合携带ZFNs、TALENs和CRISPR–Cas系统。HCAds对于大型、多重化的CRISPR–Cas系统特别有益，这些系统可以同时靶向多个基因，并且可以用于多基因疾病。尽管AAVs也具有多重化潜力，但它们在安全性方面存在显著问题，特别是关于它们在Cas9核酸酶诱导DSBs后整合到大脑内的治疗基因中。以这种方式，HCAds和其他创新的病毒平台，它们能够实现高通量传递，可能会简化原本需要单独试验或在单一试验中需要多个侵入性剂量的治疗干预。 对于基因沉默模式，向CNS中的细胞群体传递足够的遗传有效载荷是一个主要挑战，因为它们的持续时间相对较短，这意味着需要重复给药。RNAi等基因沉默模式比用于基因增强或编辑的模式更小，允许它们被装载到AAVs中，这有助于提高转导效率和持续沉默。实际上，已经探索了编码RNAi的AAVs用于CNS疾病，如ALS或亨廷顿病。系统性给药融合到多丙氨酸肽（AAV-AS）的AAVs，编码针对HTT的miRNA，在小鼠CNS中实现了33–50%的基因敲低。令人印象深刻的是，AAV-AS在转导纹状体和大脑皮层的神经元方面表现出比传统使用的AAV9s更高的效率。最后，将编码针对突变SOD1的shRNA的AAV9通过脊髓和腰椎脊髓的脊髓下皮层传递给早期发病ALS的小鼠模型，延缓了疾病进展，并导致持续5个多月的神经保护效果。 正如这些例子所展示的，病毒载体的临床效用可以通过合理地将每种基因操纵模式与适当的载体配对来增强。这可能允许以最小剂量实现最大的治疗效果，因此防止未来的临床试验受到高剂量病毒基因疗法相关的致命和非致命毒性的影响。AAV介导的肝脏毒性风险是一个特别紧迫的问题，在临床试验中受到高度监控。更有效的AAV衣壳的发展可能会导致减少载体负荷，从而降低与系统性基因传递相关的毒性水平。 尽管病毒载体存在缺点，以及它们所伴随的制造和可扩展性挑战，但它们对神经细胞的可靠转导、增强的转基因表达和对工程策略的适应性或许解释了它们在大多数正在进行的临床试验中的持续使用。重要的是指出，AAV载体工程的范围远远超出了这篇综述所涵盖的内容（关于设计和特定的AAV载体工程技术的更多细节可以在最近的文献中找到）。 3.2 非病毒传递 对病毒载体的长期担忧激发了寻找替代技术的动力。非病毒载体，如化学缀合物和纳米颗粒，表现出更好的安全性、相对容易的生产、减少对环境降解的敏感性和高基因载荷效率。非病毒载体由广泛的材料组成，这些材料在它们的物理化学属性（大小、电荷、刚度和形状）以及它们能够结合促进大脑靶向配体方面提供了极大的灵活性。大小在100纳米以下的颗粒具有增强穿透BBB的能力，而结合能够针对大脑内皮细胞或神经细胞上的受体的配体可以促进细胞特异性传递。用polysorbate 80、poloxamer、转铁蛋白和谷胱甘肽等材料涂覆纳米颗粒表面进一步增强了它们穿透BBB的能力。 纳米颗粒提供的排列组合可能性已被利用来针对各种CNS病理。除了化学修饰，使用物理工具如磁转染和聚焦超声可以增强纳米颗粒对特定大脑区域的精准靶向。磁转染是一种策略，通过将遗传物质加载到磁性载体（通常是铁纳米颗粒）中，然后应用外部磁场将载体集中在体内的期望区域。另一方面，聚焦超声涉及应用声波来穿透BBB，之后非病毒载体或充满气体的微泡可以被定向到大脑的特定区域。这种方法已成功地帮助在阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病模型中非病毒传递编码神经营养因子的基因。尽管在临床前探索非病毒载体携带基因编辑工具方面的研究有限，但新兴的证据突出了它们将CRISPR–Cas9系统传递到大脑的潜力。 非病毒载体尚未在CNS基因治疗的临床试验中找到位置，可能是由于它们在有限的BBB穿透、低基因转移效率和短期基因操作方面的挑战。此外，通过静脉注射将非病毒载体传递到大脑的效率仍然不理想。例如，通过转铁蛋白受体靶向大脑的纳米颗粒通常导致不到0.1%的大脑传递效率。某些情况，如创伤性脑损伤，会诱导BBB破裂，这可以被非病毒载体利用来传递基因治疗。例如，在脑损伤后5分钟系统性给予针对神经元的纳米颗粒在小鼠受损部位附近的大脑组织中累积。然而，开发一个能够在这个破裂窗口之外传递基因治疗的系统将是至关重要的。为了实现这一点，开发了一个纳米颗粒平台，用于在创伤性脑损伤中独立于BBB病理生理学的siRNA靶向MAPT的传递。联合调节纳米颗粒的表面化学和涂层密度，无论颗粒是在破裂窗口内还是外注射，都实现了MAPT的40-50%沉默。需要更多的努力来以一致和可控的方式增强BBB穿透。 研究工作一直在持续地进行，以修改非病毒载体的可调节组分，并确定它们是否可能更适合携带某些有效载荷而不是其他。然而，需要进行广泛的筛选以确定理想的配方，这需要高通量方法来提高筛选效率。在身体的其他部位，使用DNA条形码已经使得同时在体内评估成百上千的纳米颗粒的分布成为可能。类似地，编码肽的mRNA条形码已经允许高通量筛选离子化脂质，以最大化肺部的基因表达。需要类似的努力来进行广泛的筛选，以构思一个完美的CNS载体；然而，仅通过物理化学属性的修改能否延长这些系统所关联的有限转基因表达仍然是未知的。如果解决了非病毒载体在效率低下的转染和BBB渗透性方面的问题，那么它们在可扩展性、较低的制造成本和更大的灵活性方面所提供的优势可能使它们成为受欢迎的病毒载体的替代品。 4. 临床转化的考虑 尽管有着充满希望的候选基因干预措施，但大多数针对中枢神经系统(CNS)疾病的基因治疗临床试验结果并不理想。系统地检查与传递方法、给药途径、体外和体内模型以及患者异质性相关的障碍，可以使研究者们设计更好的基因治疗和临床试验，最终提高转化成功的几率（图4）。 图4. 基因操作方式、传递载体和给药途径的关联性 4.1 传递系统 病毒载体在获得批准用于CNS疾病的基因治疗中占据主导地位。然而，许多挑战仍然限制了这些方法。病毒载体的可扩展性和产量差是众所周知的，一批中经常产生多个空衣壳，以及整体上多步骤的迭代制造过程增加了最终产品的成本。实际上，Skysona的每次治疗成本大约为300万美元，使其成为世界上最昂贵的治疗方法，显著阻碍了可及性，特别是对于低收入和中等收入国家的人们。在合成之外，病毒载体触发的宿主免疫反应是一个长期的安全问题，也可能导致疗效降低。这在考虑如siRNA介导的基因沉默等模式时尤其相关，这些模式很可能需要重新给药（重新给药也增加了宿主产生中和抗体的机会）。尽管在试验中已结合了免疫抑制药物，但由于记忆免疫反应和不良反应的风险，病毒载体对CNS疾病的重复给药成功仍然存疑。从失败的临床试验中学到的经验可以为未来的载体和研究设计提供关键见解；然而，许多涉及AAV载体的终止试验没有提供充分的终止理由，导致人们对原因的猜测。 非病毒传递方法在CNS疾病的应用也面临多重挑战。例如，需要精确控制脂质纳米颗粒(LNP)组分，以实现高效的细胞内传递和高转导效率。对于系统性基因治疗，BBB的穿透性和有效的大脑分布是主要障碍。LNP在肝脏中的积累也引起了肝脏毒性问题。需要核内传递的DNA疗法要求开发更先进的LNPs，这可能增加了制造过程的固有复杂性。同样，为了实现神经趋向性，将配体如肽或抗体结合到LNPs上可能会导致合成过程中的批次间变异，并进一步使转化复杂化。最后，通过非病毒传递系统传递的基因疗法的效果持续时间必须延长，以减少给药频率。 4.2 给药途径 精心选择的传递工具必须与最合适的给药途径配对，这取决于CNS疾病的时间空间表现。对于病毒载体，不同的给药途径影响其体内动力学、生物分布和免疫原性（如最近的预印本报告），以及病毒脱落（病毒粒子从体内的排出），这具有强烈的公共卫生意义。 给药途径的侵入性将决定其适用于需要重复给药策略的可行性（尽管重要的是要注意，无论给药途径如何，导致免疫反应的疗法都不太可能适用于重复给药）。静脉注射因其给药便利性和适合重复给药而具有吸引力。然而，低BBB穿透性和首过代谢可能导致低CNS转导和/或转染效率，以及增加肝脏毒性的风险。微泡增强的聚焦超声(MB-FUS)可以以时间和空间控制的方式暂时使BBB通透。例如，将MB-FUS与阳离子纳米颗粒结合使用，将siRNA传递到大脑的效率提高了十倍。 脑实质内给药经常在临床试验中被利用，因为它允许直接向目标区域传递。然而，这种途径高度侵入性，因此最适用于仅需一次性治疗的疗法（基因增强或基因编辑）。有时，脑实质内给药必须与实时磁共振成像结合使用，以提高准确性并最小化附带损伤。这种给药途径还只提供对受影响区域的有限覆盖，需要使用策略如对流增强传递来改善药物分布。对载体与细胞外基质之间相互作用的深入理解将有助于控制注射后的分布。尽管脑实质内途径的侵入性是一个问题，但应该与所针对疾病的严重性以及可能已经存在颅内干预措施的可能性（如用于治疗帕金森病运动症状的深脑刺激电极）相平衡。同样，围绕AAV介导的毒性和药物诱导的肝损伤的担忧应该与潜在的颅内手术相关的不良事件和副作用相权衡。 脑脊液内给药绕过了BBB，允许治疗更直接地传递到CNS，与系统性注射相比。由于脑脊液在CNS中循环，治疗可以传递到更广泛的区域，这可能对影响多个大脑区域的疾病有益。尽管比脑实质内给药侵入性小，但这种途径不适合需要深度脑穿透治疗的疾病，因为治疗在大脑组织中的扩散速度远慢于脑脊液推动药物清除的速率，从而最小化了载体在期望的大脑区域内的接触时间。此外，通过这条路线重复给药可能会增加脑膜炎损伤的风险并降低患者的依从性。 鼻内给药提供了一个替代的非侵入性途径来绕过BBB。通过鼻内传递的siRNA负载的PNP已成功在海马、丘脑、下丘脑和小脑中被检测到。然而，鼻内给药存在一些缺点，包括可注射体积小（限制了可以给药的总剂量）、药物的生物利用度低、给药效率取决于鼻腔通道的状况以及药物在嗅觉粘膜中的滞留。 4.3 体外和体内模型 评估基因疗法有效性的一个重要挑战是体外和体内获得的结果之间的相关性差。在各种基因治疗应用中，器官体和芯片上的器官系统的进展已显示出规避这些问题的希望。然而，这些技术仍然缺乏只有在动物模型中才能完全评估的某些生理细微差别。例如，器官体通常专注于特定组织，这使得捕捉更广泛的系统效应变得具有挑战性，而芯片上的器官系统可能无法完全复制体内观察到的免疫反应范围。 选择合适的动物模型至关重要，因为不当的选择会导致临床试验中治疗方法的效果不佳。大型动物，特别是非人灵长类动物，比啮齿类动物更好地再现人类神经生态位的结构和功能复杂性。然而，伦理问题和高成本限制了它们的可及性，使啮齿类动物成为主要选择。在推断结果之前，了解每种模型的前景和局限性至关重要。例如，尽管表达人类APP突变形式的小鼠是模拟阿尔茨海默病中神经退行性变的首要选择，但这些模型中的行为改变与淀粉样β蛋白聚集的相关性很差。人源化的小鼠模型规避了这些问题中的许多，但它们本身也很难处理。这在AAV基因治疗评估的背景下尤其如此，因为人源化的小鼠通常是免疫缺陷的，这使得研究AAV的免疫原性变得困难。基因编辑工具已经导致了更准确的动物模型的创建，并可能推动下一代模型的开发，以实现更可靠的临床前评估。同样值得注意的是，神经系统疾病的遗传表现受到年龄和性别的强烈影响，这要求在临床前研究中包含平衡的队列。 4.4 患者异质性 临床试验成功的一个关键因素是受影响个体的异质性，无论是在疾病表现还是对治疗干预的反应方面。改善患者分层的方法应该提高临床试验的成功率。例如，尽管tominersen在亨廷顿病的III期试验中被终止，但研究数据表明，该药物可能帮助较年轻且疾病较不发达的人。目前正在计划进行中期临床试验来测试这一理论。捕获推动特定疾病的全部遗传因素可以帮助更好的分层，但目前的技术还无法实现。某些变量，如BBB的渗透性和区域易感性，在个体间也存在显著差异，使得可靠测量变得困难，并可能削弱得出结论的力量。同样，关键病理事件的动态性质，这些事件在临床试验过程中可能会发生变化，需要考虑。根据疾病严重程度对患者分层进行改进可以帮助研究人员设定现实的主要和次要终点。实施更严格的纳入和排除标准可能会减少研究规模，但可能在更同质的群体中提高试验成功的机会。 对于基因治疗来说，尤其重要的是评估表观遗传和等位基因特异性对异质性的贡献和群体大小。像CRISPR这样的编辑工具可能实现等位基因特异性靶向，以实现更高的灵敏度，并引发不受导向RNA和目标DNA序列不匹配影响的编辑反应。这可能赋予靶向具有显性遗传模式或由单个核苷酸变异支撑的疾病的能力。事实上，大多数基因组变异起源于单核苷酸多态性(SNPs)，过去已经通过使用siRNAs实施了等位基因特异性干预。然而，患者异质性可能影响这些潜在的等位基因特异性靶向方法，使它们难以实现。即使在明确定义的患者群体中，基因组位点的等位基因变异可能仍然难以靶向，而且采取的规避这种变异的方法可能导致应用的治疗干预和试验设计的成本更高。另一方面，作为某些单倍型的共同SNPs可以用于靶向突变等位基因，从而实现更具成本效益的等位基因特异性治疗。两项研究提出了这种策略来治疗亨廷顿病，表明基于SNP的等位基因特异性个性化治疗确实可以应用于神经退行性疾病。 最后，用于神经系统疾病的预测性、预后性和安全性生物标志物的日益增长的库也提供了进一步扩大分层程度的机会。与基因治疗相关的一个经典陷阱是背景突变对应用干预措施的解释的影响，这要求开发能够更好地预测这些非目标现象的技术。然而，从另一方面看，开发和验证能够分析非目标效应的工具可能是耗时的。此外，一旦这些工具被部署，它们必须对现有的基因治疗系统进行询问和纠正，直到检测到最小的非目标效应或没有非目标效应，所有这些都可能延长从临床前到临床研究的进展时间线。尽管如此，作者对进入一个时代持乐观态度，在这个时代，考虑到患者特定的突变、风险和结果，可以使精准的基因干预在神经疾病中得到广泛应用。 5. 总结和展望 在这篇综述中，作者阐明了各种基因治疗方式和应用于治疗CNS疾病的传递方法所提供的承诺。作者还概述了各种传递载体和给药途径的优缺点，并提出了如何将基因操作方式与传递方法和给药途径相匹配的方法。此外，作者还深入探讨了将CNS疾病的基因治疗转化为临床应用的关键挑战。基因治疗为CNS疾病提供精心设计、长期解决方案的潜力是可以实现的，只要不断适应由不同的DNA和RNA编辑方式塑造的不断发展的格局。 例如，光遗传学和化学遗传学通常不被列为本综述中概述的传统基因治疗应用的同一类别，因此在这里没有深入覆盖。然而，如设计师药物专门激活的受体（DREADDs）和药物选择性执行模块（PSAMs）等光遗传和化学遗传技术正在开创基因治疗的新时代，因为它们允许精确操纵基因定义的大脑细胞。特别是化学遗传学在各种神经发育、神经精神和神经回路功能障碍疾病的背景下显示出巨大的前景，并有可能定义下一代基因治疗。 遗传学和神经科学研究的进步不断加深对CNS疾病机制的理解。这为研究者们提供了宝贵的见解，从而识别出更有希望的治疗靶点，从而增加开发成功疗法的可能性。从传递的角度来看，BBB的复杂性质和不同CNS疾病中神经元和神经胶质景观的复杂变化提出了主要挑战。所有变量——包括免疫调节、微血管动力学和细胞特异性差异——都应该被考虑，以实现成功治疗途径的开发。从长远来看，针对个人的特定遗传档案量身定制的基因治疗方法对CNS疾病的治疗至关重要。通过考虑每个人的独特遗传变异和疾病特征，这种方法有潜力提高治疗结果并最小化非目标效应。 还需要集中努力通过非侵入性给药将基因治疗有针对性地传递到大脑的特定区域或细胞。例如，体内选择肽展示AAV库可能有助于识别能够转导CNS中的小胶质细胞的AAV衣壳变体，并随后优化以有效增加小胶质细胞趋向性和表达。基于在单个载体中表达两个或多个转基因包的组合基因治疗，也可能提高功能性效果。 在所有这些进步中，需要在创新传递工具和克服现有转化挑战之间取得平衡。还需要降低基因治疗的成本，以增强可及性，特别是对于资源有限环境中的个体。实现这一目标需要在研究开发、制造、监管流程和全球合作方面的共同努力。这些集体行动对于应对挑战和促进CNS基因治疗领域的全球健康公平至关重要。 转自：NeuExpress   https://mp.weixin.qq.com/s/hW493-nN8TnHBPTIqkRhHw 关于派真生物

近年来，蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）技术已成为一种新型治疗范例。PROTAC 是异双功能分子，通过劫持泛素-蛋白酶体系统来降解靶蛋白。目前，大约 20-25% 的蛋白质靶点正在研究中，大多数工作都集中在它们的酶功能上。与小分子不同，PROTAC 通过与靶蛋白结合并诱导随后的蛋白酶体降解来抑制靶蛋白的整个生物学功能。PROTAC 弥补了传统小分子抑制剂难以处理转录因子、核蛋白和其他支架蛋白的局限性。目前，PROTACs已成功降解多种蛋白，如BTK、BRD4、AR、ER、STAT3、IRAK4、tau等。然而，哪些靶点适合PROTAC技术以实现比小分子抑制剂更好的效益尚不完全清楚。如何合理设计高效的PROTACs并优化其口服有效，给研究人员带来了巨大的挑战。在这篇综述中，我们总结了PROTAC技术的特点，详细分析了设计高效PROTAC的一般原理，并讨论了针对不同蛋白质类别的PROTAC的典型应用。此外，评估了PROTAC可能面临的挑战和局限性。1. 背景介绍Sakamoto 等人2001年首先报道了蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC)。PROTAC 是异双功能分子，包含三个组件：目的蛋白 (POI) 结合部分、接头和 E3 泛素连接酶结合部分（图 1a) 。PROTAC分子可以与E3连接酶和靶蛋白结合形成POI-PROTAC-E3连接酶三元复合物。劫持泛素蛋白酶系统（UPS）随后导致目标蛋白被多泛素化，然后蛋白质被蛋白酶体降解。PROTAC 同时招募 E3 连接酶和 POI，使 POI 和 E3 连接酶在空间上接近。PROTAC 模拟 E3 连接酶对底物的特异性识别并劫持细胞内蛋白质破坏机制以从细胞中去除 POIs。图 1. a.基于UPS的PROTAC机制。UPS 由用泛素修饰蛋白质的特定酶（E1、E2 和 E3）和降解泛素标签蛋白的蛋白酶体组成。PROTAC 包含 POI 配体、E3 配体和接头。E3-PROTAC-POI 三元复合物诱导 POI 的多泛素化和蛋白酶体介导的降解。b. PROTAC 技术发展的里程碑现代药物发现的重点是寻找与目标蛋白具有高结合亲和力的小分子，这些小分子通过占据酶活性位点来调节蛋白功能。然而，一些蛋白质缺乏可结合位点或酶活性位点，如转录因子、RAS家族蛋白、支架蛋白和调节蛋白，使得它们对传统小分子药物不敏感。随着 PROTAC 的出现，无需考虑活性位点的存在即可降解“不可成药的蛋白质”。PROTAC 具有独特的优势，拓宽了未来药物发现的视野。一系列用于降解雄激素受体（AR）和雌激素受体（ER）的PROTACs药物已进入临床试验。到目前为止，PROTAC 已被证明可以有效降解多种蛋白质，例如代表性的 AR、ER 核受体、各种激酶、转录因子和异常蛋白质聚集体。2001年，报道了第一个PROTAC，它由招募蛋氨酸氨基肽酶2（MetAP-2）的血管生成抑制剂卵酸素和招募E3泛素连接酶β-TRCP的IкBα磷酸肽组成。F-box 蛋白 β-转导蛋白重复序列蛋白 (β-TRCP) 已被证明可与 IкBα（NF-кB 的负调节因子）结合(即连接的双功能肽段)。研究表明，该PROTAC可以在体外有效降低MetAP-2水平。在细胞外研究显示出希望后，这项开创性的工作得以持续下去。2003年，PROTAC被应用于靶向降解ER和AR受体。IкBα 磷酸肽分别与雌二醇和二氢睾酮 (DHT) 连接，使得 PROTAC 能够有效降解 Erα 和 AR。2004年，含有E3连接酶结合肽ALAPYIP来招募von Hippel-Lindau (VHL)，它可以诱导AR和FK506结合蛋白12 (FKBP12)的降解。虽然基于肽的PROTAC具有生物相容性高、体内毒性低的优点，但不能忽视大分子量带来的有限的细胞通透性和合成问题。随着E3连接酶小分子配体的发展，如MDM2、cIAP、VHL、Cereblon（CRBN）、DCAF11、DCAF15 、DCAF16、KEAP1和 RNF114，PROTAC 快速进入小分子化。CRBN E3复合物的研究在2010年取得了重大突破。CRBN是CUL4-RBX1-DDB1-CRBN（CRL4 CRBN）E3泛素连接酶的底物受体亚基，已被确定为沙利度胺免疫调节药物的直接靶点（ IMiD）。这些IMiD结合CRBN连接酶，为具有锌指结构域的多个转录因子（例如IKZF1和IKZF3）提供结合位点，形成其抗癌作用的基础。在过去的几年中，沙利度胺及其衍生物因其有效的POI降解和良好的成药性而成功应用于PROTAC中，用于多种蛋白质类别的靶向降解。ARV-825（图 2a) 是第一个结合泊马度胺和含溴结构域蛋白 4 (BRD4) 抑制剂 OTX015 的 PROTAC（图 2b）。该PROTAC可以有效降解伯基特淋巴瘤(BL)细胞中的BRD4蛋白。图2. 针对不同蛋白质的代表性 PROTAC2012年，Crews和Ciulli团队鉴定了第一个具有微摩尔解离常数的VHL小分子配体。为了提高第一代VHL配体的亲和力和亲脂性，Galdeano等人发现了VHL 的第二代配体，VH032 被确定为具有纳摩尔亲和力。新型 VHL E3 配体的鉴定标志着 PORTAC 技术的一个里程碑（图 1b)。这些新发现的VHL 配体为设计 VHL 招募 PROTAC 开辟了新的机会。VH032与VHL的晶体结构，为构建第一个VHL招募PROTAC MZ1提供了结构细节（图 2b)。化合物 MZ1 能够有效且选择性地去除 BRD4。后来揭示了BRD4-MZ1-VHL复合物的晶体结构，揭示了MZ1被“夹在”BRD4和E3连接酶之间，并且BRD4-VHL的新接触是由MZ1诱导的协同识别产生的，发现PROTAC诱导的静电表面靶蛋白和 E3 连接酶之间的相互作用对于稳定三元复合物非常重要。上述突破性研究为后来基于VHL的PROTAC研究奠定了基础。迄今为止，基于VHL的PROTAC已成功应用于各种疾病相关蛋白的降解，例如BCR-ABL、ALK和FAK。越来越多的靶点被确认为“PROTACable”基因组，部分PROTAC分子已取得临床效益。例如，已进入临床试验的PROTAC靶点包括AR、ER、IRAK4、STAT3、BTK、BRD9、BCR-Xl等。至少有20个PROTAC进入临床试验。其中，来自Arvinas的ARV-110和ARV-471是临床研究最先进的PROTAC药物。Arvinas、C4 Therapeutics、Kymera Therapeutics 和 Captor Therapeutics 是 PROTAC 领域的先锋制药公司，推动了 PROTAC 的临床转化。Arvinas 致力于将其代表性的 ARV-110 和 ARV-471 推向市场。ARV-110和ARV-471的早期临床数据显示出理想的安全性、有效暴露和对患者有意义的临床疗效，证明了该方法的治疗可行性。研究数据表明，ARV-110 作为口服生物可利用的降解剂是安全的。I 期试验表明，在具有特定基因突变的人群中，ARV-110 将 40% 的 mCRPC 患者的前列腺特异性抗原 (PSA) 水平降低了 50% 以上。此外，在最初的临床研究中，一名患者的活检数据显示AR下降了70%~90%。一项针对平均接受5次连续治疗的ER+和HER2-乳腺癌患者的I期临床研究表明，ARV-471可以显着降低患者肿瘤组织中ER的表达水平，平均降低ER水平62% ，最多可达90%。此外，ARV-471的I期临床数据还显示，在30-700 mg的所有剂量水平下均观察到高水平的ER降解（89%），且耐受性良好。最先进的PROTAC药物ARV-110和ARV-471的临床试验结果被认为是PROTAC领域发展的风向标。作为一种新的药物范式，PROTAC药物的临床转化仍存在相当大的疑问。PROTAC如何在不满足Lipinski五法则的情况下保证治疗效果，以及如何研究、阐明和减少PROTAC药物异双功能分子形式可能引起的复杂脱靶效应和副作用，是临床试验中不可避免的挑战。作为首批进入III期临床试验的PROTAC药物，ARV-471在早期试验中就表现出了强劲的临床表现。如果后续临床试验结果能够达到预期目标，PROTAC可能会在不久的将来进入临床使用，这将为靶向蛋白降解药物的研发带来历史性突破。在这篇综述中，列出了过去 5 年来 PROTAC 首次应用的靶标。同时简要回顾一下 PROTAC 技术与其他技术相比的优势。然后，作者概述了 PROTAC 在靶向多种相关蛋白（尤其是临床试验中的分子）方面的最新进展。还讨论并推荐了设计新 PROTAC 分子的基本考虑因素。试图为相关领域的人们设计有效的PROTAC提供有价值的参考。2.PROTAC 的优点多样化的新型治疗策略（例如小分子抑制剂、单克隆抗体和RNA干扰（RNAi））已成为药物发现的既定范例。小分子抑制剂的活性通常取决于占据靶标的活性口袋，与内源配体竞争以抑制靶蛋白或酶的功能。小分子抑制剂的长期临床应用面临耐药性和脱靶效应的挑战。单克隆抗体药物通过阻断细胞外蛋白质-蛋白质或蛋白质-配体相互作用来调节细胞反应。单克隆抗体药物的主要优点在于其与靶蛋白的高亲和力，但其不足之处在于细胞渗透性差、口服不可用以及成本高。RNA 干扰用于通过敲低 mRNA 来诱导基因沉默，因为 RNAi 的催化性质能够降解多个 mRNA 转录本。然而，脱靶效应、口服生物利用度差和组织渗透性不理想使得药物递送研究具有挑战性。作为一种有前途的治疗范例，PROTACs 比小分子抑制剂、单克隆抗体和其他治疗策略具有独特的优势（表 3）。当目标蛋白被蛋白酶体降解时，PROTACs可以从复合物中解离出来，并继续发挥降解作用（称为“事件驱动”机制），从而使低暴露量发挥功效。此外，PROTAC 完全废除了靶标的功能，甚至 POI/E3 亲和力较低的配体也可用于靶标降解。在本节中，我们将简要比较 PROTAC 与其他治疗策略。表3 PROTAC 与其他治疗策略的比较2.1 降解“不可成药”的蛋白质尽管FDA已经批准了近400种针对人类蛋白质的药物，但与疾病相关的蛋白质约有3000种，远远超出了我们的处理能力。然而，它们中的大多数没有合适的治疗药物，因为缺乏所谓的可成药深沟和活性口袋来占据小分子，例如支架蛋白、转录因子和RAt肉瘤（RAS）蛋白，长期以来被认为是“不可成药”的蛋白质。因此，小分子很难调控这些不可成药的蛋白质，只能依靠持续占据靶蛋白的结合口袋来发挥其药理活性（称为“占据驱动”机制）。幸运的是，PROTAC 诱导的蛋白质降解有可能解决这些问题。与传统的小分子抑制剂不同，PROTAC不需要对配体的高亲和力和持久的占据，即使是低亲和力的配体也可以诱导靶蛋白的有效降解。对于这些具有挑战性的不可成药靶点，PROTAC 可以在不存在活性口袋的情况下与靶蛋白结合，从而导致蛋白酶体介导的降解并完全抑制靶蛋白的生物学功能。例如，RAS 蛋白是肺癌、结直肠癌和胰腺癌中最常见突变的癌蛋白。RAS 蛋白包含三种亚型：KRAS、NRAS 和 HRAS。其中，KRAS突变是癌症的致命驱动因素。由于之前缺乏明确的结合袋，KRAS 多年来一直被视为不可成药的蛋白质。然而，FDA 快速跟踪了两种共价抑制剂的指定，即 AMGEN 的 sotorasib (AMG 510) 和 Mirati Therapeutics 的 adagrasib (MRTX849)（图 2c)，两者均在临床试验中证明了对 KRASG12C 的有效抑制作用。不幸的是，长期和长时间的使用不可避免地导致亲和力严重下降和获得性耐药性。2020 年，通过将 MRTX849 与 VHL 配体连接，设计并合成了一系列 KRAS G12C PROTAC。经过降解活性筛选后，他们确定了一种最有效的 PROTAC，它可以快速诱导 KRAS G12C蛋白的降解（DC 50  = 0.59 μM，NCI-H2030 细胞），并且在其他细胞中也表现出降解活性。2.2 提高选择性和特异性药物化学研究人员的主要目标是发现具有高选择性的分子，以最大限度地减少脱靶效应带来的副作用和毒性。然而，由于同一家族的蛋白质之间的差异有限，因此很难实现。相同家族蛋白质之间氨基酸残基的细微差异不足以为小分子抑制剂提供足够的分辨率。PROTAC独特的机制赋予其双选择性底物识别的特性。也就是说，除了目标蛋白配体的底物选择性外，降解前形成稳定的POI-PROTAC-E3三元复合物还需要E3连接酶和目标蛋白之间适当的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。因此，E3连接酶从整个蛋白质水平选择性识别靶蛋白提高了PROTAC的选择性和特异性。激酶亚型选择性的一个典型例子是针对血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶 (SGK)，SGK 家族包含三种亚型：SGK-1、SGK-2 和 SGK-3。据报道，突变的PI3K可以通过SGK3依赖性机制诱导肿瘤发生。一些证据表明，各种 ATP 竞争性抑制剂对所有 SGK 异构体缺乏选择性，因为它们对不同异构体具有相似的亲和力 。然而，同一家族成员的相似催化结构域阻止了研究人员开发异构体特异性抑制剂。为了解决这个问题，高度特异性的SGK3-PROTAC1（图 2d) 已开发出来。这种PROTAC是基于非SGK3选择性抑制剂308-R设计的，用于特异性降解SGK3。在低微摩尔浓度的 SGK3-PROTAC1 下，可以显着降低细胞内 SGK3 水平，而不影响 SGK1 和 SGK2。可以推测，SGK3-PROTAC1的选择性和特异性源自SGK3-PROTAC1诱导三元复合物形成过程中VHL对SGK3的选择性识别。2.3 作用机制 (MOA)传统的小分子抑制剂以剂量依赖性方式发挥作用，通过最大化药物受体占据来达到临床效果。药物浓度过高会导致不良副作用和脱靶效应。PROTACs可以启动催化靶蛋白的降解并从蛋白酶体中逃逸。理论上，PROTAC 可以以更低的剂量、更长的给药间隔进行递送，并且比小分子抑制剂具有更低的毒性，因为它们的低浓度足以降解蛋白质并且不受平衡占用的限制。由于其催化性质，低剂量的 PROTAC 可能会降低发生脱靶效应的可能性。2.4 消除药物靶点的积累小分子抑制剂与靶蛋白的结合即使在相对较短的时间内也可以增加蛋白质的积累。可以归因于两个原因：1）药物与靶蛋白结合可以稳定蛋白质结构，从而延长其半衰期；2)长期抑制会导致其代偿性表达上调。一般来说，靶蛋白的积累可能不利于药物的功效。因此，对于这些对抑制剂不敏感的蛋白质，采取PROTAC介导的蛋白质降解是极其合适的。例如，BRD4，作为重要的溴结构域和末端结构域（BET）家族成员之一。研究人员证明，靶向 BRD4 是抑制 MYC 驱动的癌症的有效手段。然而，小分子 BRD4 抑制剂 JQ1（图  2e) 和 OTX015 导致大量蛋白质积累，需要高浓度的抑制剂来抑制下游 c-MYC。2015 年，Lu 等人通过劫持 CRBN E3 连接酶设计了一种有效的 BRD4 PROTAC (ARV-825)，它诱导所有 BL 细胞系中 BRD4 蛋白快速持续的降解。这凸显了 PROTAC 相对于小分子抑制剂的优势。2.5 其他的优势除了上述几点之外，PROTAC 还具有其他优点。获得性耐药的发生往往与点突变密切相关，点突变会降低抑制剂与靶蛋白的亲和力。PROTAC 能够通过完全消除靶标机制来克服耐药性问题。此外，PROTAC的事件驱动模型不需要高药物暴露来降低脱靶效应的风险。与其他 DNA 水平蛋白质敲除技术不同，PROTAC 能够在翻译后水平在体内快速降解目标蛋白质。在靶向蛋白降解（TPD）领域，除了基于UPS的PROTAC之外，靶向溶酶体的嵌合体（LYTAC）、靶向自噬的嵌合体（AUTAC）和基于抗体的PROTAC（AbTAC）通过溶酶体降解靶蛋白。PROTAC 不能降解细胞外蛋白和膜蛋白。因此，溶酶体诱导的蛋白质降解可以弥补 PROTAC 的缺乏。LYTACs首先由Banik等人提出，并由结合溶酶体靶向受体（LTR）的配体和结合细胞外或膜蛋白的配体组成。目前，只有聚丝氨酸-O-甘露糖-6-膦酸酯（M6Pn）和N-乙酰半乳糖胺（Tri-GalNAC）是可用的LTR配体。LYTAC 已被用于成功降解载脂蛋白 E4、表皮生长因子受体 (EGFR)、程序性死亡蛋白配体 1 (PD-L1) 和 CD71 。但由于其分子量大、细胞通透性差、体内可能出现免疫反应，还需要进一步研究。2019 年，高桥等人开发了基于自噬过程的 AUTAC，用于内源性蛋白质的降解。AUTAC 是一种双功能分子，具有连接 POI 配体和自噬招募标签。然而，由于缺乏有效的自噬途径招募配体，目前发表的 AUTAC 效率低下。自噬过程极其复杂，可能对自然自噬产生影响，AUTACs的作用机制尚不清楚，因此需要深入研究。AbTAC 利用双特异性抗体，其中一只臂针对 POI，另一只臂针对 RNF43 E3 连接酶。AbTACs 可以诱导 POIs 内化和随后的溶酶体降解，但确切的降解机制仍有待证实。3. PROTAC靶向多种蛋白质的典型应用理论上，如果有合适的小分子与那些 POI 特异性结合，PROTAC 可以降解几乎所有的细胞内蛋白质，但并非所有降解剂都优于小分子抑制剂。在这里，我们总结了一些具有明显抑制活性的典型PROTAC分子，其中一些已经进入临床试验阶段。3.1 用于靶向蛋白激酶的 PROTAC人类基因组编码超过 500 种蛋白激酶，使其成为最大的蛋白质家族。目前，传统的小分子抑制剂是蛋白激酶相关疾病的主要治疗选择。大多数激酶抑制剂集中于抑制受体酪氨酸激酶（RTK）。然而，耐药性的出现损害了临床获益，因此迫切需要应用新的治疗策略来克服这一挑战。2013年，Crews团队报道了最早的激酶PROTAC，用于靶向PI3K，阻断人表皮生长因子受体3（ErbB3）–PI3K-Akt（蛋白激酶B）信号通路。该 PROTAC 由两个招募 POI 和 E3 连接酶的异特异性肽序列组成。ErbB3 衍生序列，磷酸化后可与 PI3K 结合。另一个源自HIF1α 的序列可以通过 VHL 进行鉴定。两个部分通过 PEG 连接体结合，并掺入细胞穿透序列以改善细胞通透性。然而，由于渗透性差和连接体不稳定，该 PROTAC 仅显示出中等效力。FAK 是一种酪氨酸激酶，调节肿瘤进展的许多方面（例如侵袭、转移和血管生成）。FAK 激酶抑制剂 defactinib 在治疗恶性胸膜间皮瘤干癌的临床试验中因缺乏疗效而失败。FAK 还具有除激酶以外的支架作用，但激酶抑制剂不能抑制激酶独立的功能。因此，设计了PROTAC-3（图 2f) 可有效诱导 FAK 降解，IC 50为 6.5 nM 。PROTAC-3是一种由defactinib和VHL配体组成的双功能分子。它通过有效诱导降解，有效抑制 FAK 激酶依赖性信号传导和激酶依赖性信号传导。布鲁顿酪氨酸激酶 (BTK) 是 TEC 家族非受体胞质酪氨酸激酶的成员，也是 B 细胞受体 (BCR) 信号通路的关键调节因子，在 B 细胞的生命活动中发挥着关键作用，例如增殖、存活和分化。BTK在B细胞肿瘤中广泛表达，临床干预一般通过抑制BTK的激酶活性来进行。2013年，FDA批准了首创的共价抑制剂伊布替尼用于治疗多种B细胞恶性肿瘤。Ibrutinib 与 BTK 的半胱氨酸 481 (C481) 共价结合，IC 50为 0.5 nM 。然而，已经发现 BTK (C481S) 481 位的半胱氨酸到丝氨酸突变是导致伊布替尼获得性耐药的原因。因此，使用 PROTAC 技术诱导 BTK 蛋白降解已成为一种有前途的替代方法。迄今为止，四种 BTK 降解剂已进入临床试验。它们分别是来自Nurix Therapeutics的NX-2127（NCT04830137）和NX-5948（NCT05131022 ），来自海思科和百济神州的HSK-29116（ NCT04861779）和BGB-16673（NCT05006716）。NX-2127具有BTK降解剂和IMiD新底物降解剂活性。目前正在进行 NX-2127 治疗复发或难治性 B 细胞恶性肿瘤的临床试验。临床前数据表明，NX-2127 可有效诱导多种癌细胞系和人外周血单核细胞 (PBMC) 中ibrutinib敏感的 BTK WT（野生型）和ibrutinib耐药的 BTK C481S降解，DC 50  < 5nM。此外，NX-2127比ibrutinib更有效地抑制 TMD8 细胞中BTK C481S的细胞增殖。NX-2127 由沙利度胺 IMiD 组成，具有免疫调节活性。揭示来那度胺导致 CRBN 新底物 Aiolos (IKZF3) 和 Ikaros (IKZF1) 选择性泛素化和降解。已表明 IKZF3 的过度表达是慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 中 BTK 抑制剂耐药性的驱动因素。因此，NX-2127将BTK降解与IKZF降解相结合有望增强其抗肿瘤活性。NX-5948 是 Nurix Therapeutics 设计的另一种 BTK 降解剂。与 NX-2127 不同，NX-5948 缺乏免疫调节活性，并且在动物模型中具有穿过血脑屏障 (BBB) 的能力。NX-5948 显示出与临床前数据相似的性能，临床前数据表明 NX-5948 在淋巴瘤细胞系和 PBMC 中诱导 BTK 降解（< 1 nM 时降解效率为 50%）。3.2 用于靶向核受体的 PROTAC核受体（NR）属于转录因子家族。与其他传统转录因子不同，其主要功能是将外部信号转换为转录输出。典型的 NR 包括三个结构域：两个分别结合 DNA 和配体的结构域，以及一个在序列和大小方面高度可变的非结构化 N 末端调节结构域。配体激动剂结合会产生构象变化，导致核定位信号 (NLS) 暴露，从而使 NR 易位至细胞核并结合响应元件。与配体结合域结合的小分子抑制剂被设计用来激活或阻断核受体的信号转导功能。然而，小分子抑制剂有几个缺点。例如，目前对抑制剂概念的理解尚不清楚，因为当 AR 基因过度表达或突变时，持续的 AR 拮抗剂被证明是激动剂。此外，孤儿NRs的一些配体尚未确定，从而使得靶向NRs治疗疾病变得更加复杂。PROTAC 技术的出现使得针对更广泛的 NR 成为可能。AR、ER等NRs参与体内各种重要的生理进程，与前列腺癌、乳腺癌密切相关。因此，一系列针对ER或AR的PROTAC被开发出来。AR信号传导对于前列腺正常功能的发育和维持至关重要。AR不仅在维持肌肉骨骼和男性性相关功能中发挥着关键作用，而且在前列腺癌的进展中也发挥着关键作用。使用恩杂鲁胺和阿帕鲁胺等 AR 拮抗剂抑制 AR 功能是治疗前列腺癌的常见策略。不幸的是，接受抗雄激素治疗的患者最终会出现去势抵抗。PROTACs 作为一种替代的潜在治疗方法出现，以弥补 AR 抑制剂的缺点。由此，合成了一种有效的 AR PROTAC ARCC-4（图 2g)，其由恩杂鲁胺衍生物和招募VHL的E3配体组成。与其母体抑制剂恩杂鲁胺相比，ARCC-4可以有效降解AR和长期使用临床抑制剂引起的AR突变体，且不会导致耐药性的存在。众所周知，ARV-110（图 2g)是第一个处于临床试验中的AR靶向PROTAC。最新的临床试验数据表明ARV-110具有可接受的安全性。最大耐受剂量 (MTD) 尚未确定，推荐的 2 期剂量 (RP2D) 的确定仍在继续。此外，ARV-110 已在转移性去势抵抗性前列腺癌 (mCRPC) 患者服用恩杂鲁胺和/或阿比特龙后表现出抗肿瘤活性 。最近，王的团队报道了两种高效且可口服生物利用的 AR PROTAC，ARD-2128 和 ARD-2585（图 2g）。ARD-2128 是一种优化的 AR 拮抗剂，通过刚性接头与沙利度胺连接，在小鼠中实现了 67% 的口服生物利用度和比恩杂鲁胺更好的抗肿瘤活性。ARD-2585 包含与 ARD-2128 相同的 CRBN 配体，在 VCaP 细胞系中达到 ≤ 0.1 nM 的 DC50值，在小鼠中达到 51% 的口服生物利用度。乳腺癌是一种乳腺组织发生癌变的恶性肿瘤，患者通常是女性群体。根据肿瘤受体的状态，乳腺癌可分为三种类型：雌激素受体阳性（ER+）、人表皮生长因子受体2阳性（HER2+）和三阴性亚型（ER-、PR-、HER2） -）。其中，ER+乳腺癌最常被诊断出。ER是核受体家族的成员，ERα和ERβ调节雌激素的基因表达。然而，ERα 已被证实主要负责女性生殖系统和乳腺组织中雌激素信号的转换。大多数选择性雌激素受体降解剂（SERD）旨在靶向 ERα 来治疗 ER + 乳腺癌。SERD 是一类与 ERα 结合并随后被蛋白酶体降解的小分子。氟维司群(Fulvestrant)是唯一被批准并通过每月肌肉注射用于治疗绝经后女性乳腺癌的 SERD。针对氟维司群口服生物利用度差的缺点，一系列SERD分子被开发出来。但SERD分子不能完全降解ER，长期使用会导致耐药性。PROTAC技术提供了另一种治疗选择。Arvinas 开发了一种针对 ER 的 PROTAC，ARV-471（图 2h)，经FDA批准进入临床试验，用于治疗局部晚期或转移性ER阳性/HER2阴性乳腺癌患者。中期试验结果显示，ARV-471可显着降低肿瘤组织中ER的表达水平，平均降低62%，最高可达90%。此外，ARV-471 可以在多种 ER 阳性乳腺癌细胞系中降解野生型和临床相关的 ERα 突变体（Y537S 和 D538G），其DC 50值约为 2 nM。3.3 用于靶向转录因子的 PROTAC转录因子（TF）是一类与DNA特定序列结合以调节基因转录过程的蛋白质。转录因子在增殖、分化和死亡等多种细胞功能中发挥着关键作用。除核受体外，直接靶向转录因子对于小分子抑制剂来说尤其具有挑战性，因此几十年来它们一直被认为是“不可成药的蛋白质” 。因此，诱导蛋白质降解成为转录因子的一种潜在方式。根据DNA结合域的具体结构，转录因子可分为数十个家族。值得注意的是，C2H2锌指、同源域和螺旋-环-螺旋家族占转录因子总数的80%以上。信号转导和转录激活因子 3 (STAT3) 是一种关键的核转录因子，在酪氨酸 705 上被磷酸化，并整合细胞因子和生长因子信号传导以调节一系列细胞过程。STAT家族由7种蛋白组成，其中STAT3已被证明在多种癌症中过度表达，尤其是乳腺癌。靶向 STAT3 是治疗各种癌症、炎症和自身免疫性疾病的普遍策略。STAT3在Tyr705位点的磷酸化可以触发其二聚化，并且与靶基因的转录调控密切相关。STAT3二聚化依赖于两个单体的Src同源2(SH2)结构域之间的相互作用。基于这一机制，研究人员热衷于寻找作用于SH2结构域的小分子抑制剂，以阻断STAT3二聚化和转录活性。然而，由于STAT家族成员之间存在结构同源性，一些作用于STAT3 SH2结构域的抑制剂已表现出有限的临床价值，这为特定STAT3抑制剂的开发带来了障碍。另一个突出的问题是，单个 STAT3 蛋白仍然具有转录活性，因此开发 STAT3 SH2 结构域的抑制剂并不是完全抑制 STAT3 活性的可行方法。PROTAC 作为靶向蛋白降解的新型疗法具有广阔的前景。在这里，我们介绍了一种特定且有效的 STAT3 PROTAC。白等人。报道了第一个STAT3 PROTAC SD-36（图 2i)不仅能有效、特异性地降解STAT3，而且具有抗白血病和淋巴瘤细胞系增殖活性。SD-36 由选择性 STAT3 抑制剂 SI-109 和来那度胺组成，是 PROTAC 如何应用于靶向转录因子等挑战性蛋白质的典型成功范例。4. PROTAC的设计和开发PROTACs的降解活性不仅取决于两端与其各自靶标的亲和力，还依赖于能够形成稳定PPI的三元复合物的形成。目前，PROTAC的构建很大程度上依赖于经验分析(empirical analyses)和构效关系（SAR）研究。然而，合成难度对快速合成大量 PROTAC 化合物库提出了重大限制。通过分析和总结已发表的PROTAC结构，我们将提供PROTAC设计的常规策略，以加速PROTAC的发现。此外，还列出了一些最近报道的 PROTAC，它们招募具有相应降解活性的传统 E3 连接酶（表 4）。表 4. 2019年以来报道的PROTAC代表性化合物4.1 E3连接酶及其配体在已鉴定的 600 多种连接酶中，只有少数具有小分子配体的连接酶已用于 PROTAC 靶向。我们列出了常用的 E3 连接酶及其配体（图 3）。总结分析了近 20 年来发表的高活性 PROTAC 的结构，发现最常用的是 CRBN、VHL 和 cIAP 配体，其中 CRBN 占 60.1%，VHL 占 30.1%，cIAP 占 5.5%。主要原因是CRBN在高丰度的组织中广泛表达，并且基于CRBN的PROTAC具有更好的降解效率。此外，与VHL配体相比，CRBN配体具有更好的类药特性。招募 MDM2 和 cIAP 的 PROTAC 通常具有较高的分子量和较差的组织渗透性，表明口服生物利用度可能是一个潜在的问题。其他一些E3连接酶如DCAF11、DCAF15、DCAF16、KEAP1和RNF114等较少使用，原因如下：它们的配体来源于天然产物， E3连接酶亲和力差，合成困难，且大多数E3连接酶是由不可逆的PROTACs招募的，其降解活性较差，并具有一定的潜在毒性。值得注意的是，不同的招募 E3 连接酶已被证明可诱导不同程度的蛋白质降解。主要原因是：不同细胞中E3连接酶的表达水平不同，可能导致降解效率不同。并且有些蛋白质对于不同的E3连接酶具有不同程度的选择性。因此，在设计PROTAC的过程中，应优先选择针对CRBN或VHL的配体，因为这两种E3连接酶的应用范围最广。作为说明性实例，ARV-110和ARV-471都选择CRBN连接酶作为E3配体。在这里，我们回顾了 PROTAC 设计中使用的传统 E3 连接酶及其配体。图3 用于 PROTAC 的 E3 连接酶的代表性小分子配体。蓝点表示适当的链接子结合位点4.2 PROTAC的链接子设计策略1. 连接子类型Maple 研究组建立了一个包含 400 多个已发表的 PROTAC 的数据库，以找到已应用于 PROTAC 的一般原理。数据库中链接子结构的摘要（表 5）揭示了迄今为止 PROTAC 设计中常用的连接体是 PEG 和不同长度的（不）饱和烷烃链。由于化学合成简便的特点，烷基接头通常用于合成 PROTAC 分子，以确定最佳接头长度。然而，由于 PROTAC 的高疏水性，烷基连接子的引入可能会降低 PROTAC 的细胞渗透性。含有杂原子（氧原子或氮原子）的烷基链比单独的烷基链具有改善的亲水性。此外，掺入PEG链可以增强PROTAC的溶解度和细胞对PROTAC的吸收。超过一半已发表的 PROTAC 结构包含烷基和 PEG 基序。PROTAC 中加入了烷基、PEG 和乙二醇链以提高灵活性。然而，它们的引入会影响 PROTAC 的药代动力学 (PK) 特性。近年来，线性连接基逐渐被刚性连接基取代，例如炔烃和饱和杂环（哌嗪和哌啶）。芳环或炔链的引入赋予了一定的刚性并促进稳定的三元络合物的形成。它还促进 PROTAC 的溶解度和细胞渗透性。因此，使其具有口服生物利用度和临床效果，例如 ARV-110、ARV-471 和 BTK PROTAC。点击化学通常用于体内构建PROTAC分子，因此选择三唑基团来连接POI和E3连接酶配体。三唑在体内很难代谢，因此，引入三唑可能有助于增强代谢稳定性并延长PROTAC的耐久性。ARV-110的发现过程是PROTACs开发中极具参考价值的例子。在早期的研究中，AR拮抗剂和基于VH032的ARCC-4被发现具有有效的降解活性。鉴于ARCC-4缺乏口服生物利用度，将VHL配体替换为CRBN配体，并对接头进行相应优化以提高生物利用度。然后对弹头进行进一步改造，得到两种体内外活性均优于ARCC-4的PROTAC，但两种化合物均具有较高的清除率。改用刚性接头后，活性和生物利用度得到改善，剂量递增暴露的进一步优化最终导致了 ARV-110 的发现。表5 已发表的 PROTAC 结构的 Maple 数据库中选定的连接基序的出现情况 2. 连接子长度连接体的长度对 PROTAC 的降解活性也有显着影响。最近，Bemis 等提出了线性接头长度 SAR 研究模型，表明具有较长接头的降解剂更有可能在 PROTAC 的初步设计中取得成功。一旦确定了有效的PROTAC，将逐步缩短连接子的长度，以确定最佳连接子长度。当接头太短时，由于空间位阻效应，2个配体很难同时结合到各自的靶标上，从而阻碍了三元复合物的形成。但如果接头过长，则会阻碍PPI，导致靶蛋白泛素化失败。此外，较长的连接体具有较大的分子量，这使得 PROTAC 穿过细胞膜的可能性较小。因此，将刚性连接体（例如炔、哌嗪和哌啶）掺入连接体中可以有效改善PROTAC的药代动力学特征和功效。#3. 选择合适的链接子附着位点PROTAC 具有三个必要的组件：弹头、E3 连接酶配体和连接它们的连接体。一旦弹头和E3连接酶配体固定，连接子组成、长度和附着位点的选择和优化是构建PROTAC的重要因素。具有合适连接基的 PROTAC 分子对 POI 降解的活性和选择性具有显着影响。一般来说，最好从靶标蛋白暴露于溶剂的位置连接接头，这样不会影响其配体的结合亲和力。在大多数情况下，研究人员已经通过共晶结构和SAR研究确定了合适的连接位置。对于弹头和E3连接酶配体，连接体附着位点的选择需要考虑不影响其受体原有的亲和力。最重要的是，不要从配体的关键活性基团衍生连接子。4. 光控连接器尽管与传统的小分子抑制剂相比，催化 MOA 为 PROTAC 带来的副作用更少。然而，PROTAC 独特的催化特性也不可避免地会因正常细胞和癌细胞中的强烈降解而产生不利影响。为了克服这个问题，光控连接器的引入使得 POI 以时空方式降解。将光可切换的偶氮苯基团纳入连接体中是一种利用光控制降解活性的可逆方法。在不同给定波长的照射下，PROTAC会在“顺式”和“反式”之间可逆地转换，从而产生相应的非活性或活性PROTAC的构象。在一定波长的照射下，非活性PROTAC将转化为活性亚型。只有活性的PROTAC才有能力与靶蛋白形成稳定的三元复合物，引发后续的泛素化和蛋白酶体降解。此外，在某些波长的光下，也可以通过切换回非活性形式来中断降解。研究人员设计了一种双稳态 photoPROTAC，使用四氟偶氮苯基团来光学控制 BET 的降解。photoPROTAC 通过光可切换四氟偶氮苯连接体将 VHL 配体和 JQ1 连接在一起（图 4a)。有研究小组开发了一种不同的方法，通过将光笼基团(photocaging moiety)掺入弹头或 E3 配体来阻碍稳定 POI-PROTAC-E3 连接酶复合物的形成，从而光学控制靶蛋白的降解。在指定波长的光照射下，一旦光笼部分被释放，它就可以恢复到活性构象。2019年，PROTAC首次使用了光笼策略。光笼部分与 dBET1 中的弹头侧缀合，产生 pcPROTAC1（图 4b)。在365 nm波长照射下，4,5-二甲氧基-2-硝基苯甲基（DMNB）被释放，从而形成活性dBET1。此外，光笼的PROTAC-3将光笼基团引入CRBN配体侧以阻碍CRBN募集，在365 nm波长照射下，未笼的pcPROTAC-3诱导BTK降解（图 4C）。这些研究证明了将光笼组引入任一侧的可能性。然而，与 POI 配体缀合会比 E3 配体更好，因为它排除了目标蛋白在没有光照的情况下具有的抑制活性的影响。图4 a,  photoPROTAC -1，包含 BRD 靶向 JQ1 和通过光可切换四氟偶氮苯部分连接的 VHL 配体。光照射将非活性顺式-photoPROTAC-1 转化为其活性反式异构体，反之亦然，b DMNB 保护的 PROTAC 在 365 nm 处照射会释放有效的 BET 降解剂 dBET1，c在 365 nm 处照射 NVOC 保护的 PROTAC 会释放有效的 BTK 降解剂。5. 可点击的链接器点击反应是PROTAC在细胞中自组装的有效生物正交工具，并改善了PROTAC较差的渗透性。Astex Pharmaceuticals 开发了更小的基于前体的细胞内 CLIPTAC（细胞内点击形成的蛋白水解靶向嵌合体，CLIPTAC）系统。该系统中的小分子前体具有较小的分子量，例如四嗪 (Tz) 标记的沙利度胺衍生物 (~ 572 Da) 和反式环辛烯 (TCO) 标记的 JQ-1 衍生物 (~ 609 Da)。Heightman研究组开发了两种 CLIPTAC 模型，它们可以通过反式环辛烯和四嗪前体分子的点击反应在细胞内合成。结果表明，CLIPTACs能够成功诱导HeLa、A375和HCT116等三种细胞系中BRD4和ERK1/2（细胞外调节蛋白激酶）的降解。这一开创性的策略不仅提高了PROTAC的细胞通透性和溶解度，而且无需进行连接子优化，对于不同的目标蛋白降解只需改变蛋白配体部分，更加灵活方便。4.3 计算机仿真加速 PROTAC 设计PROTACs的合理设计包括三个组成部分：弹头、E3配体和连接体。虽然弹头和E3配体的发现过程本质上与小分子相似，但连接体的设计有些挑战性，因为POI和E3连接酶在没有有效PROTAC的情况下无法相互作用。随着人们更好地理解连接子对 PROTAC 的理化性质和降解活性的重要性，当前的研究集中在从头 PROTAC 设计上。连接子的长度、组成、灵活性和连接位点都对降解效率产生巨大影响。此外，另一个设计挑战来自于PROTAC分子往往溶解性差、渗透性差、生物利用度低和不可预测的钩状效应，这阻碍了PROTAC的临床转化。因此，迫切需要寻找新的方法来提高PROTAC的发现效率。为了加速合理 PROTAC 的设计进度。Zheng 等人创建了一种新颖的深度生成模型（PROTAC-RL）。将一对E3配体和弹头输入到模型中，在强化学习（RL，Reinforcement Learning）的指导下，输出设计的接头以及具有特定性质的化学上可行的PROTAC。具体来说，他们首先预训练了一个基于transformer神经网络的链接子生成模型（Proformer）。为了克服PROTAC训练数据量低的挑战，首先通过许多与PROTAC大小相似的准PROTAC小分子对模型进行预训练，然后用真实的PROTAC集和增强数据对模型进行微调。Proformer 随后被输入基于记忆的强化学习框架 PROTAC-RL，并获得经验奖励以获得具有理想 PK 属性的 PROTAC。为了证明有效性，研究团队将BRD4识别为POI并生成了5000个PROTAC。依靠超级计算能力，他们进一步对这些虚拟分子进行聚类和筛选。研究人员最终选择、合成并实验测试了六种PROTAC，其中三种表现出抑制活性，一种先导化合物表现出针对肿瘤细胞系的高抗增殖活性和良好的药代动力学。Western blot 检测结果显示化合物 1-3（图 2j) 低微摩尔浓度降解细胞内 BRD4。所有这些化合物在微摩尔浓度下均表现出针对 Molt4 细胞系的抗增殖活性。整个研究工作仅耗时49天，表明计算机模型的应用可以促进高效合理的PROTAC设计和优化。5. PROTACs在疾病中的应用在过去的二十年中，PROTAC 在解决疾病相关蛋白方面表现出了独特的优势。目前，一些具有代表性的PROTAC已进入治疗癌症的临床试验。除了癌症之外，PROTACs在治疗其他疾病方面也具有巨大优势，例如神经退行性疾病、免疫系统疾病或病毒感染。在这里，我们总结了这些疾病的一些 PROTAC 靶标（表 6）。表6 针对不同疾病的多种 PROTAC疾病领域目标癌症激酶：BTK、FAK、MEK、IRAK4、BCR-ABL、EGFR、CDK、Aurora A转录因子：AR、ER、STAT3表观遗传蛋白：EZH2、BRD、HDAC、KDM5C、Sirt2、EDR5、PRMT5、NSD3、NAMPT、ENL、p300/CBP神经退行性疾病GSK-3β、LRRK2、α-Synuclein、Tau、TRKA、TRKC、mHtt免疫失调HDAC3、H-PGDS、IRAK1、IRAK3、IRAK4病毒性疾病PEGS-2、NS3/4A、Mpro其他的HMGCR、VEGFR25.1 PROTAC 靶向癌症相关靶点致癌蛋白在癌症进展中不可或缺，这使得 PROTAC 特别适合治疗癌症。目前大多数 PROTAC 的研究都集中在与癌症相关的靶点上。在已报道的研究中，研究人员首选激酶作为降解靶标。据统计，激酶占PROTAC降解靶标总数的45%，其中一半以上的PROTAC靶向RTK和CMGC激酶组(CMGCs)。BTK PROTAC 已进入临床试验，多种化合物已显示出良好的临床效益。文献中也对针对 ALK、MEK 和 CDK 等激酶的 PROTAC 进行了广泛的研究和调查。除了基于激酶的PROTAC之外，还有大量的PROTAC专注于靶向核受体和表观遗传蛋白。到目前为止，PROTAC 应用最成功的目标是 AR 和 ER。与激酶小分子抑制剂相比，AR和ER的耐药性非常复杂和棘手。由于AR突变的多样性，AR的原始抑制剂恩杂鲁胺可能会失去抑制功效，甚至成为部分激动剂。因此，PROTAC特别适合治疗AR相关癌症，尤其是转移性去势抵抗性前列腺癌。5.2 PROTAC 用于治疗神经退行性疾病最常见的神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病。它们经常发生在老年人群中，是一类导致认知障碍的疾病。错误折叠蛋白的聚集是神经退行性疾病的主要原因之一，常见的错误折叠蛋白是β-淀粉样蛋白、tau、α-突触核蛋白和polyglutamates。Tau 是阿尔茨海默病的重要微管相关病理蛋白，由于缺乏活性口袋，它像许多非酶蛋白一样难以调节。AD 和其他神经退行性疾病最显着的特征之一是 Tau 蛋白的积累。AD 患者大脑中的 tau 蛋白水平高于健康人。高Tau水平可以促进其聚集，并影响β淀粉样蛋白（Aβ）的毒性。因此，最大限度地减少 Tau 聚集被认为是治疗 AD 的潜在方法。由此，设计合成了一种带有Keap1 E3连接酶配体的肽基PROTAC，用于降解细胞内Tau，在体外表现出与tau和keap1的高亲和力，并诱导Tau的适度降解。亨廷顿病（HD）是由亨廷顿基因变异引起的，变异产生的异常突变型亨廷顿蛋白（mHtt）在大脑中积累，会影响神经和神经细胞功能。因此，抑制或清除有毒 mHtt 聚集被认为是一种潜在的治疗方式。此前的研究主要集中在开发对 mHtt 聚集体具有抑制作用的化学小分子。不幸的是，由于化学聚集调节剂的机制尚不清楚，因此没有适用的临床结果。有设计了 PROTAC，将 mHtt 聚集体探针与泛素连接酶 cIAP1 的配体结合在一起。实验数据表明，这两种化合物能够诱导活细胞中mHtt的降解。这种效果在 HD 患者和具有更长多聚谷氨酰胺重复序列 (145Q) 的 mHtt 患者中尤其明显。5.3 PROTAC 用于治疗免疫相关疾病IRAK4白细胞介素 1 受体相关激酶 4 (IRAK4) 在 Toll 样受体 (TLR) 和白细胞介素 1 受体 (1L-1R) 信号通路中发挥重要作用。IRAK4 属于四个激酶家族（IRAK4、IRAK1、IRAK2 和 IRAK-M）。IRAK4接收来自上游TLR和1L-1R的信号并激活其下游NF-κB和JNK信号通路，这些信号通路与人类炎症反应和癌症密切相关。TLR或1L-1R受体被激活后，IRAK4通过共享死亡结构域(DD)与MyD88和IRAK2结合，形成myddosome复合物。myddosome 复合物发挥其磷酸化功能并激活下游 IRAK1 和相关因子 6 (TRAF6)，从而激活下游 NF-κB 和 JNK 信号通路，转录与炎症和细胞增殖相关的基因。IRAK4的过度激活或功能障碍会相应地导致不同的问题。除了激酶活性外，IRAK4 还具有支架信号传导。因此，传统的小分子抑制剂无法阻断IRAK4的全部功能。作为一项有前途的技术，PROTACs可以消除蛋白质的所有功能。2020 年，报道了几种可以选择性降解 IRAK4 的 PROTAC。组蛋白去乙酰化酶3组蛋白脱乙酰酶 (HDAC) 家族是一类染色质修饰酶，可通过组蛋白修饰来沉默转录。HDACs家族由18种同工酶组成，可分为四种类型。其中，HDAC1-3和8属于I类HDAC，在细胞运动、免疫调节和增殖中发挥关键作用。然而，HDAC3 的结构包含一个高度保守的催化结构域，这使得 HDAC3 的选择性靶向具有挑战性。2020 年，报道了一种新型的 HDAC3 PROTAC HD-TAC7（图2k)，由 CRBN 配体泊马度胺和选择性 I 类 HDAC 抑制剂邻氨基苯胺组成。HD-TAC7具有中等降解效力，但对HDAC1和HDAC 2没有影响。Liao等人开发了基于 VHL 的 PROTAC XZ9002（图 2k) 可以特异性降解 HDAC3 并抑制肿瘤细胞活性 。5.4 针对病毒相关目标的 PROTAC人们认为PROTAC也可以应用于抗病毒领域，以降低对耐药突变的敏感性。随着常规抗病毒药物的耐药性，临床治疗效果开始逐渐恶化。最近的研究利用 PROTAC 开发了一种化学降解抗病毒药物，以诱导病毒蛋白降解。设计了一种 PROTAC，它由与丙型肝炎病毒 (HCV) 蛋白酶活性位点结合的可逆共价抑制剂特拉匹韦和 CRBN 连接酶的配体组成。化合物DGY-08-097（图 2l)，不仅抑制而且降解 HCV NS3/4A 蛋白酶，在细胞感染模型中表现出效率。严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）自2019年爆发以来对全世界人民的生命和健康构成严重威胁。尽管世界范围内已经设计了多种针对 COVID-19 的疫苗，但该病毒的高致突变性限制了疫苗的有效性。2021 年，Desantis 等人设计了一系列基于吲哚美辛的PROTACs泛冠状病毒抗病毒药物。吲哚美辛（INM）具有抗病毒活性，但其背后的机制尚不清楚。INM 针对 SARS-CoV-2 的抗病毒活性可能来自其对人前列腺素 E 合酶 2 型 (PGES-2) 的抑制活性。先前的研究报道INM在纳摩尔浓度下具有抑制PGES-2的活性。PGES-2 已被证明与 SARS-CoV-2 的 NSP7 蛋白存在相互作用 。NSP7 与 PGES-2 的相互作用也存在于其他冠状病毒中，这表明靶向 PGES-2 可能是基于 INM 的抗病毒 PROTAC 设计的潜在方法。德桑蒂斯等人。设计了四种基于 INM 的 PROTAC，但生物学评价结果显示，只有两种化合物的效力比 INM 强约 4.5 倍，并且对 β-冠状病毒 HCoV-OC43 和 α-冠状病毒 HCoV-229E 具有广谱抗病毒活性。5.5 其他 PROTAC2020 年，Rao 等人报道了 HMG-CoA 还原酶 (HMGCR) 的第一个 PROTAC，HMGCR 是胆固醇生物合成途径中的限速酶。他们通过结合阿托伐他汀(Atorvastatin)和 CRBN 配体合成了一系列 PROTAC。经过优化和筛选，他们最终找到了最有效的降解剂P22A（图 2m) DC 50为 0.1 μM。该PROTAC强调了治疗高胆固醇血症和心血管疾病的潜在应用。此外，PROTAC 是其他非癌蛋白的一种有前途的治疗方法。有报道了第一个诱导α1A-肾上腺素受体（α1A - AR）降解的PROTAC ，也是第一个针对G蛋白偶联受体（GPCR）的PROTAC。他们通过不同的连接体将α1A -AR抑制剂哌唑嗪与泊马度胺连接起来，最终发现了有效的化合物9c（图 2m）。9c可以抑制PC-3细胞的增殖并导致肿瘤生长减慢，这为前列腺癌的治疗提供了新的策略。Hu等人提出了吲哚胺 2,3-双加氧酶 1 (IDO1) 的第一个 PROTAC。IDO1 已被广泛报道为关键的免疫检查点，在多种癌症中过度表达。Hu等人发现了一个 PROTAC 2c（图 2m) 诱导 IDO1 显着且持续的降解。研究表明，造血祖细胞激酶1（HPK1）的PROTAC有助于改善基于CAR-T细胞的免疫疗法。PROTAC 技术在疾病治疗领域如此广泛，使其成为药物发现的强大工具。6. PROTAC的缺点和未来的挑战PROTAC作为一项新兴技术，引起了学术界和制药行业的高度关注。任何新技术的发展都会伴随着各种机遇和挑战，PROTAC也不例外。PROTAC潜在机遇和挑战的前景将有助于靶向蛋白质降解药物的研发。尽管PROTAC相对于其他药物发现范式具有独特的优势，但它也有一些缺点，带来了不可忽视的问题和挑战：药物特性：PROTAC分子比传统小分子药物更加复杂，具有更多的潜在代谢位点，这影响了PROTAC分子的代谢稳定性。同时，传统的小分子抑制剂普遍遵循“五法则”，但大多数报道的PROTAC的分子量往往大于700，导致渗透性差、溶解度低、口服生物利用度不理想。因此，如果不满足“五法则”，如何改善PROTAC分子的理化性质将是其成功成药的关键。耐药性：首先，PROTACs可以通过E3连接酶复合物核心成分基因组的改变而引起耐药性。CRBN 基因或 CUL2 基因表达的显着降低也会导致对 PROTAC 的耐药性 [ 10.1158/1535-7163.MCT-18-1129 ,  10.1021/acschembio.9b00525 ]。研究表明CRBN基因组的缺失是骨髓瘤细胞对IMiD产生耐药性的主要原因。其次，PROTAC的作用取决于特定的E3连接酶亚型，特定E3连接酶的表达限制了PROTAC在不同细胞类型中的应用。尽管人类基因组编码数百种 E3 泛素连接酶，但只有少数 E3 连接酶和小分子配体已用于PROTAC。因此，寻找更多种类的E3连接酶用于PROTAC药物的研发可能是解决耐药性的出路。“钩状效应(Hook)”和“脱靶效应”：如何避免Hook效应和脱靶效应也是PROTAC药物研发的一大挑战。PROTACs并不一定药物浓度越高，降解效果就越好，这就是人们常说的“Hook效应”。在PROTACs的研究中，发现显着高于DC50 的浓度会产生自抑制效应以补偿降解效率，称为“Hook效应”。此外，PROTACs分子的脱靶效应机制尚未完全了解。PROTACs可以完全降解靶蛋白，从而抑制靶蛋白的所有功能。然而，在这个过程中，正常蛋白质可能会被意外伤害，脱靶效应和毒性也是最大的挑战之一。例如，研究表明沙利度胺衍生物可引起IKZF1、IKZF3和GSTP1等转录因子的降解。进一步研究发现，沙利度胺衍生物对GSPT1等转录因子的降解是由于其“分子胶”效应。靶点选择：迄今为止，PROTAC技术适合哪些靶点才能获得比小分子抑制剂更好的益处尚不完全清楚，而且PROTAC的大多数靶蛋白都是“可成药”蛋白的一部分。事实上，PROTAC 技术的最大优势之一是其处理“不可成药”目标的潜力。由于PROTAC技术只需要暂时介导三元复合物的形成，因此可以将低亲和力POI配体掺入PROTAC分子中。不幸的是，迄今为止，针对“不可成药”蛋白质的 PROTAC 分子很少。因此，PROTAC的另一个挑战是需要开发更多针对“不可成药”蛋白质的分子，从而体现PROTAC技术的优势。7. 讨论与结论作为一种新兴的药物发现范式，PROTAC 引起了学术界和工业界的高度关注。尽管PROTAC技术在药物研发方面具有诸多优势，但在发现和临床应用过程中仍存在诸多障碍和挑战，如脱靶、细胞通透性、稳定性、大分子量等。口服生物利用度和药物完整性也是 PROTAC 药物开发持续面临的挑战。值得注意的是，与其他传统小分子抑制剂相比，PROTAC在临床应用中仍具有诸多优势。首先，PROTAC通过诱导致病蛋白降解发挥作用，因此可以促进多轮靶蛋白的降解，协助消除脱靶效应和药物靶点的积累。PROTAC 还可以降解一些被认为“不可成药”的蛋白质，例如转录因子。其次，PROTAC具有提高选择性和特异性、克服耐药性的优点。总之，目前PROTAC药物研发的现状是优点与缺点并存，但如何解决这些问题将是PROTAC药物研发成功的关键。高效PROTAC分子的发现是一个耗时且具有挑战性的过程，例如接头长度和结构的优化。迫切需要总结一种设计高效PROTAC分子的通用方法。目前PROTAC的设计和优化主要集中在POI配体和连接体的构效关系研究上。其中，连接子不仅对PROTACs的降解活性至关重要，而且极大地影响膜的通透性、代谢稳定性和药物利用度。因此，如何有效设计并连接POI和E3配体是PROTACs分子设计的关键。到目前为止，指导连接子设计的原则，包括长度和组成，尚未被完全理解。另一方面，基于“光控连接体”设计的photo-PROTAC也比传统药物具有一些优势，这也是本文所介绍的。预计新兴的photo-PRTOAC能够成为PROTAC药物中的领军者。本文总结了PROTAC设计的一般原则，为PROTAC的研究和设计提供了系统的认识。此外，E3连接酶对于三元复合物的组成也至关重要。然而，在人类基因组编码的数百种E3连接酶中，只有少数E3连接酶被用于PROTAC中，并且发现新的E3连接酶及其配体的进展远远落后于PROTAC的研究。迄今为止，大多数PROTACs通过招募E3连接酶CRBN、VHL、MDM2和IAP来诱导靶蛋白降解，仅通过这些E3连接酶对PROTACs的研究还远远不够。因此，有必要探索更多新型E3连接酶来加速PROTAC的发展。但可以预见，未来E3配体的数量可能会大幅增加，这将为PROTAC的设计提供更多选择。PROTAC技术已经发展了近20年，部分分子已进入临床试验，这揭示了PROTAC在肿瘤、免疫疾病、神经退行性疾病、心血管疾病和病毒感染方面的巨大治疗潜力。世界各地也有研究使用该技术来治疗 COVID-19。目前，已有PROTAC药物已进入III期临床试验。尽管已有十余种药物正在进行临床试验，但临床研究数据仍不足，还需要更多的临床研究来证明PROTAC技术的前景。随着研究的深入，这些障碍将在不久的将来基本得到解决。一旦更多的药物进入临床应用，将开启药物研发的新时代。尽管仍有许多障碍和挑战需要克服，但PROTACs以其独特的优势具有巨大的治疗潜力。相信未来，随着技术的发展和研究的深入，PROTACs的设计和合成将逐步优化，最终将为多种疾病的治疗开辟一条康庄大道，有望为多种疾病的治疗提供广阔的前景。在不久的将来会产生临床治疗效果。总之，PROTAC技术不仅为药物化学领域的研究提供了有力的工具，也为未来临床药物的发展带来了巨大的希望。参考文献:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9763089/声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

2023年7月26日，北京百普赛斯生物科技股份有限公司（“ACROBiosystems百普赛斯”）与和元生物技术（上海）股份有限公司（“和元生物”）在上海和元生物总部举行了战略合作签约仪式。ACROBiosystems百普赛斯企业发展与战略副总裁Rosanna Zhang女士、产品研发总监张天赋先生、Aneuro商务主管柯可女士，和元生物董事、副总经理、CRO事业部负责人王富杰先生、市场总监王耀先生、科研产品生产总监彭娟女士以及双方产品经理代表、销售代表等出席签约仪式。随着生物医药行业近年来的蓬勃发展，越来越多的生物制品被用于疾病的预防与治疗，细胞与基因治疗（CGT）领域、基于病毒载体改造的疫苗等技术逐渐被广泛使用。在对新技术的效果充满期待的同时，市场对于商业化生物制品的质量和安全性也提出了更高的要求，在其研发及生产过程中需要对工艺相关杂质（包括核酸酶）进行控制。本次战略合作将统筹ACROBiosystems百普赛斯与和元生物双方的优势资源，将ACROBiosystems百普赛斯的重组蛋白和GMP级细胞因子等CGT核心试剂应用于和元生物的生物制剂生产与临床阶段，并采用ACROBiosystems百普赛斯的核酸工具酶及其残留检测试剂盒等解决和元生物的生物制剂生产阶段的核酸残留，同时帮助和元生物全球推广、销售其神经研究用工具病毒、科研服务。上下游贯通联动，向全球的细胞与基因治疗与神经领域客户提供具有竞争力的技术服务和解决方案，加速细胞与基因治疗进入应用阶段，助力神经疾病机制、创新药物科学研究，早日造福患者。ACROBiosystems百普赛斯企业发展与战略副总裁Rosanna Zhang女士表示，“细胞与基因治疗作为生物医药领域新兴的治疗方式，近年来帮助了越来越多神经疾病与其他罕见病患者。CGT高速发展离不开成熟的原材料供应链与优异CRO、CDMO的服务支持。很高兴能与专注于CGT领域的，提供专业服务的和元生物达成战略合作协议，ACROBiosystems百普赛斯将充分发挥我们在核心试剂方面的技术与产品服务优势，以及我们在全球横跨亚、美、欧三大洲辐射8000余客户的供应链优势，为和元生物全面、先进的细胞治疗载体开发等CRO、CDMO服务提供支持；双方也将携手开展研发工作，助力细胞与基因治疗技术发展迭代，揭示神经疾病机制的深奥秘密，共同服务全球生物医药企业，满足更多现有和潜在的临床需求。”和元生物董事、副总经理王富杰先生表示，“ACROBiosystems百普赛斯在全球有广泛的客户基础，广受行业认可及信任。我们十分高兴能与ACROBiosystems百普赛斯这样专业、可靠的国际化生物医药行业基石企业合作。以‘赋能基因治疗，共守生命健康’为使命，和元生物始终关注全球基因治疗领域的创新进展，持续投入研发力量，致力于开发更好的基因治疗载体。相信在此次优势互补、产研结合的密切合作下，双方将推动资源优势转变成发展优势，链接更多行业生态，将更好的产品、技术和供应链能力带向全球生物医药产业。”ACROBiosystems百普赛斯简介ACROBiosystems百普赛斯是百普赛斯集团ACROBiosystems Group（股票代码：301080）旗下品牌。集团是成立于2010年的跨国生物科技公司，是为全球生物医药、健康产业领域提供关键生物试剂产品及解决方案的行业平台型基石企业。2021年在创业板上市。百普赛斯集团业务遍布全球，横跨亚洲、北美洲、欧洲，在中国、美国、瑞士等国家的12个城市设有办公室、研发中心及生产基地。目前累计服务客户超8000家，与全球Top 20医药企业均建立了长期、稳定的合作伙伴关系。集团旗下拥有品牌ACROBiosystems百普赛斯、bioSeedin柏思荟、Condense Capital垦拓资本和ACRODiagnostics百斯医学等。ACROBiosystems百普赛斯旗下拥有子品牌Aneuro。Aneuro服务于脑神经领域生物药研发与上市。其代表产品有Tau，APP，BACE1，Alpha-Synuclein，LRRK2，DDC，HTT，SOD1，CD20，mTORC1、BDNF、CDNF、NT-4等靶点蛋白、神经因子和预制前体纤维（PFFs），覆盖多通道电极、采集系统、和基于AI和云端数据分析软件的神经科学在体电生理实验解决方案，可用于阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症、多发性硬化、脑肿瘤等脑神经相关疾病的机制研究和药物开发；在CGT领域，ACROBiosystems百普赛斯为客户提供“早期药物发现-生产、质量控制-非临床研究-临床研究”整体解决方案，提供更简便快速的药物开发过程，陪伴客户从药物早期发现到临床研究的每一个阶段。百普赛斯集团ACROBiosystems Group以加速生物药研发上市进程和服务于更好的临床应用为使命，愿通过自己的努力，从为客户带来价值开始，到为全球市场整个行业创造价值，公司不断通过更新技术、产品、服务，积极为合作伙伴赋能，来加速包括靶点药物和免疫治疗药物在内的，各种生物医药的研发上市进程和临床上更好的应用，最终为人类健康事业做出贡献。和元生物简介和元生物（股票代码：688238）成立于2013年，是一家聚焦基因治疗领域的生物科技公司，专注于为基因治疗的基础研究提供基因治疗载体研制、基因功能研究等CRO服务；为基因治疗药物，包括重组病毒载体药物、溶瘤病毒、CAR-T细胞治疗产品等的研发提供工艺开发及测试、IND-CMC药学研究、临床样品GMP生产等CDMO服务。以"赋能基因治疗，共守生命健康"为使命，以基因治疗载体研发、生产为核心，公司将坚持以客户为中心、以提供专业服务为己任，打造国际领先的基因和细胞治疗CXO集团企业，加快基因治疗的基础研究、药物发现、药学研究、临床和商业化进程，推动基因治疗行业发展，造福人类健康！ACROBiosystemsinquiry@acrobiosystems.com15117918562（备注：姓名+公司）