BCMA x LY9

摘要：嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤治疗中表现出显著的疗效，目前已有9种CAR-T细胞产品上市。此外，CAR-T细胞在将治疗应用扩展到实体瘤、心肌纤维化以及自身免疫和传染性疾病等不同领域展现出了有希望的潜力。尽管因此，目前的研究工作集中在解决这些问题上，以提高CAR-T细胞的安全性和有效性，并降低复发率。取得了这些进展，但与治疗相关的毒性反应和复发方面的重大挑战仍然存在。本文提供了CAR-T细胞疗法当前状态的全面概述，包括它们的成就、现有挑战和潜在的未来发展方向。 1. 引言  嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法是一种绕过主要组织相容性复合体依赖的免疫耐受和肿瘤逃逸的过继细胞疗法；它针对广泛的抗原（蛋白质、碳水化合物和糖脂），并且比常规化疗具有更高的持久性，呈现出一种有希望的免疫疗法形式。它通过基因修饰来自患者或健康供者的T细胞来靶向癌细胞，满足当前精准和个性化医疗的趋势。CAR-T细胞在治疗B细胞恶性肿瘤方面显示出有希望的结果，目前已有9种针对B细胞恶性肿瘤或骨髓瘤的CAR-T细胞产品上市。CAR-T细胞具有不可忽视的毒性副作用，其中细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）最为常见。CAR-T细胞毒性的管理是CAR-T细胞疗法的一个重要方面。当前CAR-T细胞的发展继续减少毒性并提高疗效。 2. 现状  2.1 CAR-T细胞的结构和功能  CAR基本上由不同的部分构成：胞外、铰链、跨膜和胞内结构域。具体来说，胞外结构域，被称为抗原结合域，来源于单克隆抗体的可变重链（VH）和可变轻链（VL）。这些链通过柔性连接，形成一个单链可变片段（scFv），主要用于促进对肿瘤细胞表面的相关抗原的识别。VH和VL链之间的相互作用以及决定互补性的区域的相对位置可以影响CAR对目标抗原的亲和力和特异性。铰链或间隔区域是胞外结构的一部分，从跨膜域延伸到结合单元。其作用与CAR-T细胞的功能有关，除了连接胞外和跨膜结构域之外。Okuno等人发现，铰链区域长度的修改有助于区分正常细胞和肿瘤细胞。此外，降低铰链区域的灵活性可以减轻CAR-T细胞的过度激活，并在高肿瘤负荷下提高存活率。跨膜结构域作为胞内间隔的信号通道，通常来源于CD3-ζ、CD4、CD8或CD28分子。其主要功能是将CAR分子锚定到T细胞膜上，研究表明它通过控制CAR表达的水平和稳定性来调节CAR信号，这在信号或突触形成中起作用，并与内源性信号分子的二聚体形成相关。胞内结构域主要由共刺激域和信号转导区域组成。在CAR工程中，CAR共刺激的含义是一个重要的焦点，最终目标是制造优化胞内结构域功能的CAR架构（图1）。 图1. CAR的五代。第一代CAR-T细胞结构仅包含1个抗原识别域，scFv，一个铰链区，一个跨膜域和细胞内激活域，而第二代CAR-T细胞有额外的共刺激域，第三代CAR-T细胞有2种不同的共刺激域。第四代CAR-T细胞通过修改分泌细胞因子。第五代CAR-T细胞是CAR-T细胞的最新一代，具有更高的安全性和可控性。CAR = 嵌合抗原受体，IL = 干扰素。 2.2 CAR-T细胞的发展  不同代的CAR-T细胞具有相同的基本结构。它们主要在胞内结构域以及引入的细胞因子和配体方面有所不同。第一代CAR-T细胞具有最简单的结构，仅包含抗原识别域、scFv、铰链区、跨膜域和胞内CD3-ζ激活域。缺乏共刺激域导致在临床试验中存活时间显著缩短，限制了细胞毒性潜力。将诸如CD28或4-1BB等共刺激域整合到第一代CAR-T细胞中，构成了第二代CAR-T细胞的出现，增强了增殖能力和细胞因子分泌。目前，所有商业化的CAR-T细胞产品都是第二代的。第三代CAR-T细胞设计包含一个双重共刺激框架，结合了不同的分子，即CD28和4-1BB。理论上，这种配置与第二代相比具有更高的细胞毒性和更长的治疗有效性。然而，目前的证据并不支持它们与第二代产品相比在临床上的优越性能。第四代CAR-T细胞，通常被称为TRUCK或装甲CAR-T细胞，通过细胞因子分泌如白介素（IL）-12，或表达抗-PD-1抗体或自杀基因来增强治疗潜力。这种增强通过绕过抑制因素提高了CAR-T细胞的疗效。与其第二代对应物相比，第四代CAR-T细胞表现出增强的扩张动力学、提高的效力和对抑制影响的增加抵抗力。超越第四代，第五代CAR-T细胞在第二代CARs的基础上增加了IL-2受体β（IL-2Rβ）链在CD3-ζ和CD28或4-1BB之间，提供了一个STAT3结合位点，激活JAK-STAT信号传导。通用CAR-T（UCAR-T）细胞，来自健康供体，通过生物素结合免疫受体或分裂、通用、可编程CARs基因编辑来破坏T细胞受体（TCR）和人类白细胞抗原I类基因，能够识别广泛的抗原。新兴技术，如逻辑门控，越来越多地被应用于CAR-T细胞的设计，以克服传统CAR-T（C-CAR-T）细胞的缺陷并提高其安全性和有效性。 2.3 CAR-T细胞的制造  CAR-T细胞的生成涉及一系列的过程。最初步骤中，T细胞是从患者或供体的外周血中获取的。与造血干细胞移植（HSCT）中的外周血干细胞收集一样，自体CAR-T细胞的获取由于患者同时存在的细胞减少症和受损的T细胞功能而面临独特的障碍。这阻碍了T细胞的有效回收，并为CAR-T细胞的高效获取带来了重大挑战。孤立的单克隆经过基因修饰以表达CAR，然后进行扩增。随后，修饰后的产品被冷冻保存并运输到医院进行给药。患者通常接受淋巴细胞耗竭化疗，也称为调节化疗，这增强了有利的细胞因子环境，同时减少了免疫抑制细胞。调节化疗对淋巴细胞计数的影响与CAR-T细胞的最佳疗效相关且必要。然后重新输注CAR-T细胞，它们专门识别目标抗原并在体内迅速增殖以发挥抗肿瘤作用。在重新输注期间以及随后的2至3周内，必须对患者的生命体征进行持续监测，以便及时检测和干预任何潜在的毒性不良反应，包括CRS和ICANS。此外，应对CAR-T治疗的疗效进行全面的长期随访评估。 2.4 CAR-T细胞治疗的临床应用  目前，CAR-T细胞治疗主要用于国内外市场上的血液肿瘤。其中，6种产品使用抗CD19 CAR-T细胞，针对复发或难治性（R/R）B细胞淋巴瘤和B细胞急性淋巴细胞性白血病（B-ALL），其余三种产品采用抗B细胞成熟抗原（BCMA）CAR-T细胞治疗R/R多发性骨髓瘤（MM）（表1）。 2.4.1 弥漫性大B细胞淋巴瘤 （DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）中最常见的侵袭性类型，其一线治疗方案为R-CHOP（利妥昔单抗联合环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松的免疫化疗），实现了70%至80%的缓解率。然而，30%至40%的患者对治疗无反应或复发，导致预后不佳，2年总生存率（OS）仅为20%至40%。CAR-T细胞疗法的开发和应用为R/R DLBCL的治疗提供了新的希望。 抗CD19 CAR-T细胞疗法是第三线治疗的金标准，并且作为R-CHOP治疗后难治性或早期复发的第二线治疗正在迅速发展。目前，有3种CAR-T产品上市用于DLBCL治疗：axicabtagene ciloleucel（axi-cel）、tisagenlecleucel（tisa-cel）和lisocabtagene maraleucel（liso-cel）。美国食品药品监督管理局（FDA）分别在2017年和2018年批准了axi-cel和tisa-cel用于治疗高级别B细胞淋巴瘤或DLBCL，这些患者复发或之前已经接受过2种或更多化疗方案的治疗。Liso-cel在2021年获得批准。一系列临床试验和现实世界证据已经证明了CAR-T细胞疗法在治疗R/R DLBCL中的有效性。ZUMA-1试验显示，axi-cel的客观缓解率（ORR）为83%，完全缓解（CR）率为53%，在大量预处理的大B细胞淋巴瘤（LBCL）患者中，中位OS超过2年。5年随访结果显示，中位OS为25.8个月，5年OS率为42.6%。ZUMA-7试验使用axi-cel与标准护理（SOC）作为R/R LBCL患者的二线治疗，并显示axi-cel和SOC组的中位无事件生存期（EFS）分别为8.3个月和2.0个月，ORR分别为83%和50%，CR率分别为65%和32%。ZUMA-12是第一个评估axi-cel作为高风险LBCL一线方案的研究，ORR为89%，CR率为78%。美国淋巴瘤CAR-T联盟的研究报告了axi-cel在批准适应症的标准护理环境中的ORR为82%，CR率为64%。在美国，一项关于axi-cel治疗LBCL的研究报告显示，ORR为73%，CR率为56%。中位OS和无进展生存期（PFS）分别为21.8个月和8.6个月。 2.4.2 急性淋巴细胞白血病 （ALL）在儿童中表现出高治愈率，5年总生存（OS）率超过90%，但成人的长期生存率仅为35%至45%，大多数复发是由于化疗耐药性。对于复发/难治性（R/R）ALL亚型，预后比原发性ALL要差得多，长期OS率为15%至50%。近年来，CAR-T细胞疗法在治疗R/R ALL方面取得了良好进展，研究最多的靶点是CD19。2017年8月，FDA批准了首个CD19-CAR-T细胞产品，即tisa-cel，用于儿童和青少年ALL的治疗。在一项tisa-cel的单中心I-IIa期研究中，3个月时的总缓解率为81%，6个月时的无事件和OS率分别为73%和90%。 与CD19一样，CD22也是ALL中研究得非常充分的靶点。在患有B-ALL的成人和儿童中，90%表达CD22。一项CD22+ CAR-T细胞的I期研究显示了剂量依赖性的完全缓解（CR）率，接受较高剂量的患者中有73%达到了CR。一项更大型的研究表明，使用抗CD22 CAR-T细胞的安全性和可行性。CRS的发生率是86.2%，90%为1-2级CRS，轻度短暂的神经毒性症状，CR率为70%。中位OS率为13.4个月。 管理与CAR-T细胞治疗R/R B-ALL相关的毒性反应和复发仍然是一个挑战。此外，需要更长时间的随访以获取更多临床数据，以确认其长期疗效。 2.4.3 多发性骨髓瘤 MM在很大程度上是不治之症，几乎所有患者最终都会复发，随着治疗选择的使用，缓解时间缩短。CAR-T细胞治疗是针对R/R骨髓瘤患者的有希望的新治疗选择。最广泛研究的MM CAR-T细胞靶点是BCMA，肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF17)的成员，其在浆细胞中而非造血干细胞中的优先表达使其成为理想的抗原靶点。2021年3月和2022年2月，FDA批准了2种抗BCMA CAR-T细胞产品用于MM治疗：ide-cel/Abecma和cilta-cel。2023年6月，国家药品监督管理局批准了第三种CAR-T细胞产品CT103A用于MM治疗。II期研究显示，接受ide-cel治疗的患者中有73%的反应率，33%的CR率，中位PFS为8.8个月。在最新的III期试验中，中位PFS分别为13.3和4.4个月，反应率分别为71%和42%，在ide-cel和标准方案组中。 设计用于评估cilta-cel安全性和临床活性的Ib/II期试验显示，总反应率为97%，CR率为67%，常见不良事件，CRS的发生率为95%；仅有9%的严重CRS，大约60%的患者在2年内没有疾病进展。FUMANBA-1试验的CT103A显示，ORR为95%，部分反应为4%，具有良好的安全性。在2023年ASCO年会上提出的更新数据显示治疗疗效显著提高。总反应率飙升至96.0%，显著的严格CR（sCR）率为74.3%。令人印象深刻的是，之前接受过CAR-T细胞治疗的12名受试者中有9人实现了缓解，其中5人实现了sCR，其中4人维持sCR超过18个月。 需要进一步的研究来验证这些发现。除了BCMA，还发现了其他靶点，包括CD138、CD38、CD19、GPRC5D、SLAMF7(CS1)、APRIL、TACI、CD229、CD56、MUC1、NKG2D配体、整合素b7、κ轻链、FcRH5、CCR10和CD44v6。POLARIS是第一个针对GPRC5D靶向CAR-T细胞(OriCAR-017)的人类、单中心、单臂、第一臂试验，专门招募中国患者，结果显示总反应率为100%，CR率为60%，没有严重的不良反应。 O’Neal等人开发了针对CS1(SLAMF7)的CAR-T细胞，尽管CD8+ CS1表达的CAR-T细胞杀死了CD8+ CS1细胞，但在高肿瘤负荷的骨髓瘤模型中显示出疗效。一项针对BCMA和CD38的人类化双特异性BM38 CAR-T细胞的I期试验显示，反应率为87%，CR率为52%，中位PFS为17.2个月。 表1 九种CAR-T细胞产品 CAR-T生产 靶标 应用Kymriah（tisagenlecleucel，tisa-cel）CD19复发/难治性B-ALL，复发/难治性DLBCL Yescarta（axicabtagene ciloleucel，axi-cel）CD19复发/难治性DLBCL Tecartus（brexucabtagene autoleucel）CD19复发/难治性MCL，复发/难治性B-ALL Abecma（idecabtagene vicleucel，ide-cel）BCMA复发/难治性MM Breyanzi（lisocabtagene maraleucel，liso-cel）CD19复发/难治性DLBCL Axicabtagene ciloleucel CD19复发/难治性DLBCL Relmacabtagene autoleucel CD19复发/难治性DLBCL；Carvykti（ciltacabtagene autoleucel，cilta-cel）BCMA复发/难治性MM CT103A，IBI326 BCMA复发/难治性MM CAR = 嵌合抗原受体，R/R B-ALL = 复发/难治性B细胞急性淋巴细胞性白血病，R/R DLBCL = 复发/难治性弥漫大B细胞淋巴瘤，R/R MCL = 复发/难治性套细胞淋巴瘤，R/R MM = 复发/难治性多发性骨髓瘤。 目前CAR-T细胞治疗通常用于MM治疗的后期；制备过程缓慢且成本高，一些患者不可避免地会复发。探索新靶标以减少CAR-T细胞毒性并提高其安全性是未来发展的方向。 2.4.4 套细胞淋巴瘤 除了一些接受异体骨髓（BM）移植的患者外，套细胞淋巴瘤（MCL）的治愈性是不确定的。标准化疗后的预后较差，中位生存期约为3年，长期无病生存罕见。CAR-T细胞治疗是一种新的有价值的治疗方式。目前市场上针对R/R MCL的CAR-T细胞产品是brexucabtagene autoleucel。ZUMA-2，一项II期多中心临床研究，在所有68名接受治疗的患者中，客观反应率为91%，完全反应为68%，中位随访时间为35.6个月。TRANSCEND研究报告称，接受liso-cel治疗的R/R MCL患者中，ORR为84%，CR为59%。 2.5 不良反应和毒性  2.5.1 细胞因子释放综合征  CRS是CAR-T细胞治疗中最常见的不良反应，是由CAR-T细胞在结合相应靶抗原时释放的炎症细胞因子和趋化因子触发的炎症状态。 在接受CAR-T细胞治疗的血液系统恶性肿瘤患者中，CRS的发生率是55.3%。美国移植和细胞治疗学会（ASTCT）将CRS定义为“任何免疫治疗后，由于内源性或输注的T细胞和其他免疫效应细胞的激活或参与，而产生的超生理反应。”CRS的发病机制目前尚不清楚。IL-6和IL-1，由单核细胞、巨噬细胞和树突细胞产生，在其中起关键作用。研究发现CAR-T细胞激活了gasmdermin E（GSDME）来介导细胞焦化，并通过大量释放穿孔素和颗粒酶B，随后引发CRS。动物实验表明，敲除GSDME、破坏巨噬细胞或阻断GSDMD的激活可以防止CRS的发展。症状可能是渐进的，首先是发烧，这可能发生在细胞输注后的几小时或几天内， 以及低血压、毛细血管渗漏（缺氧）和终末器官功能障碍。 其他症状类似于流感，包括肌肉痛、头痛、僵硬、不适和食欲不振。低级别的CRS是自限性的，而其他患者可能会出现低血压、败血症和毛细血管渗漏综合征，这些症状会因休克、播散性血管内凝血（DIC）和多器官衰竭而进一步恶化。 其进展和严重程度通常被认为与疾病负担、CAR结构和剂量、淋巴耗竭调节方案等因素有关。CRS的持续时间不同，取决于干预措施，通常在CAR-T细胞输注后2至3周完全解决。 管理CRS最重要的一步是仅在能够忍受CRS的患者中使用CAR-T细胞治疗，并提供适当的支持性护理和干预措施，包括直接靶向和非特异性免疫抑制策略，基于患者和CAR-T细胞产品。托珠单抗，一种IL-6受体拮抗剂，是FDA批准的用于CAR-T细胞相关CRS的唯一治疗方法。一些研究表明，早期使用托珠单抗和/或皮质类固醇治疗可降低3级或更高级别 2.5.2 免疫效应细胞相关神经毒性综合征 （ICANS）是CAR-T细胞疗法中另一种常见的不良反应，它可以与CRS同时发生、在CRS之后发生或独立于CRS发生。在血液系统恶性肿瘤患者中，有37.2%在接受CAR-T细胞治疗后会发生神经毒性。ICANS被ASTCT定义为“一种疾病，其病理过程涉及中枢神经系统，导致内源性或输注的T细胞和其他免疫效应细胞在任何免疫疗法后的激活或参与。”早期表现可能包括表达性失语和书写变化，随后进展为意识水平改变、昏迷、癫痫发作、虚弱和脑水肿。这一发生的机制尚不清楚。研究表明，脑壁细胞中CD19的表达是CAR-T细胞治疗中发生的神经毒性的原因，这表明了针对CD19导向治疗中的神经毒性的靶向机制。ICANS的治疗选择包括禁食、保持水化、营养支持疗法和改进的神经系统检查。糖皮质激素被认为是ICANS快速缓解的首选一线治疗。对于类固醇难治性ICANS，可以使用阿那白介素。这在统计上显著且迅速减少了发热、炎症细胞因子和与ICANS/CRS相关的生物标志物。对于有癫痫发作或中枢神经系统（CNS）疾病史的患者，可以使用左乙拉西坦预防。苯二氮卓类药物和额外的抗癫痫药物（左乙拉西坦和苯巴比妥）被推荐用于治疗活动性癫痫发作。ICANS是CAR-T细胞疗法的常见并发症，症状逐渐进展，早期诊断和预防是其管理的重要工具。不断改进控制不良反应的措施可以进一步突出CAR-T细胞疗法的优势。 2.5.3 其他相关毒性  严重的靶向肿瘤外毒性（OTOT）经常发生在CAR-T细胞治疗实体瘤的临床试验中，其主要机制是CAR-T细胞介导的正常细胞的识别和裂解，这些细胞表达目标抗原。尽管CAR-T细胞目前针对实体瘤的主要靶标是肿瘤相关抗原（TAAs），但它们也在非恶性组织中表达。当前减轻OTOT的策略包括：（1）修改CAR组分，提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的特异性识别；（2）通过逻辑门控开关减少CAR-T细胞的毒性，提高细胞死亡的特异性；（3）使用药物通过调节其信号通路或CAR表达水平来限制CAR-T细胞的功能。由于针对正常细胞的抗CD19 CAR-T细胞的靶向非肿瘤效应，经常发生B细胞发育异常，导致低丙种球蛋白血症和随后的频繁感染表现。在接受针对B-ALL的抗CD19 CAR-T细胞治疗后，有报道称B细胞发育异常可长达5年。感染在接受CAR-T细胞治疗后非常常见，大多数发生在1至2年内，感染发生率约为55%。在CRS反应期间，合并感染的死亡率很高；因此，感染预防和控制是CAR-T细胞治疗的最高优先事项。血细胞减少症包括贫血、血小板减少症、白细胞减少症和中性粒细胞减少症。此外，CAR-T细胞治疗还会引起不良反应，包括播散性血管内凝血（DIC）、噬血细胞综合征、肿瘤溶解综合征和移植物抗宿主病（GVHD）。 2.6 复发  在接受CAR-T细胞治疗的B细胞恶性肿瘤患者中，复发被定义为通过T细胞输注实现CR后肿瘤细胞的持续存在。大约40%至60%的患者会发生复发；在R/R ALL中，30%至60%的患者在接受CAR-T细胞治疗后复发，其中10%至20%是CD19阴性复发。CAR-T细胞治疗失败最常归因于抗原逃逸，即抗原阴性复发；然而，抗原阳性复发也经常发生，这可能与CAR-T细胞的内在因素有关。因此，肿瘤细胞本身、肿瘤微环境（TME）和CAR-T细胞可能会影响复发。肿瘤细胞的固有异质性为肿瘤的克隆进化和恶性进展奠定了基础。在CAR-T细胞输注之前，表达低或阴性抗原的肿瘤细胞可能会逃逸并发生二次克隆扩张。输注后CAR-T细胞在体内的功能受损和持久性减少也可能导致复发。CD19外显子3中的点突变可以影响CD19 FMC63 CAR-T细胞识别的表位，并在患有高级别B细胞淋巴瘤的患者中诱导CD19阳性复发。大多数CAR中的单链可变片段（scFv）来源于小鼠，具有高抗原性、低持久性和高复发率。 3. 未来发展方向 3.1 应用扩展  针对血液恶性肿瘤，包括霍奇金淋巴瘤（HL）、T细胞淋巴瘤和急性髓系白血病（AML）的CAR-T细胞治疗仍处于探索阶段。尽管CAR-T细胞治疗的适用范围几乎涵盖所有肿瘤类型，但其临床应用仍受到肿瘤抗原多样性和TME异质性的挑战的制约。因此，将CAR-T细胞治疗转化为这些疾病的临床实践尚未实现。此外，CAR-T细胞的应用已经扩展到非肿瘤性疾病，如自身免疫性疾病、HIV等感染性疾病和心肌纤维化。 3.1.1 霍奇金淋巴瘤  HL是一种B细胞淋巴瘤，其特点是TME中恶性细胞数量少，免疫效应细胞数量多。HL的发病率较低，在英美两国大约为每10万人中有2.7到2.8例，男性发病率高于女性，最高发病率在年轻人和60岁以上的个体中。大多数经典HL患者可以通过一线治疗治愈；然而，大约15%的患者会在初次治疗反应后发展为原发性难治性疾病或复发。 对于一线治疗失败的患者，SOC是大剂量化疗后进行自体HSCT；大约50%的患者会在移植后复发，预后较差。针对HL的抗CD30 CAR-T细胞已进入临床试验，并且在一项I期研究中，7名复发HL患者中没有观察到任何毒性。一位患者在接受第二次输注后发展为完全反应（>2年）。Ramos等人进行了两项平行的I/II期临床试验，总体ORR为62%，没有剂量限制毒性，轻度血液学毒性，CRS发生率为24%。 3.1.2 T细胞恶性肿瘤 T细胞恶性肿瘤是一类异质性肿瘤的广泛谱系，包括前体T细胞恶性肿瘤，如T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤（T-ALL/LBL），以及成熟的T细胞恶性肿瘤，如T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、T细胞前淋巴细胞白血病和许多外周T细胞淋巴瘤（PTCLs）。T-ALL是一种淋巴系统的恶性肿瘤，占儿童ALL病例的10%至15%，成人病例的大约25%。T淋巴细胞性淋巴瘤（T细胞淋巴瘤）是一种NHL，其生物学特征与T-ALL相似，被归类为皮肤T细胞淋巴瘤或PTCL。在T细胞淋巴瘤中，预后较差，通常是由于药物抗性和患者对化疗方案的不耐受。与B细胞恶性肿瘤的情况不同，CAR-T细胞治疗在对抗恶性T细胞自我破坏、T细胞再生和产品污染方面面临挑战。 针对T细胞恶性肿瘤，有许多CAR-T细胞靶标，包括CD7、CD7、CD99和Vβ8，所有这些都目前处于研究阶段。CD7是一种跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，在T-ALL和T细胞淋巴瘤中高度表达。Lu等人报告了一项开放式、单臂I期临床试验，使用自然选择的CD7 CAR-T（NS7CAR）。在20名患有R/R T-ALL和T细胞淋巴瘤的患者中，19名在第28天的骨髓中实现了MRD阴性CR，14名在接受NS7CAR输注后接受了异体HSCT，并且至今没有复发。只有1名患者发生了3级CRS。89 2022年9月，Hu等人报告了一项使用CD7通用CAR-T细胞治疗T细胞恶性肿瘤的I期临床试验，11名可评估患者的总体反应率为81.8%，完全反应率为63.6%，没有剂量限制毒性、GVHD、ICANS或严重的CRS（≥3级）。Shi等人报告了在T-ALL中使用抗CD99 CAR-T细胞，并显示出体外和体内对肿瘤细胞的有效抑制增殖和诱导凋亡，同时对正常细胞没有细胞毒性。Li等人报告说，抗Vβ8 CAR-T细胞能够识别并杀死所有由克隆扩增产生的Vβ8+恶性T细胞，同时保留恶性或健康的Vβ8-T细胞，从而实现足够的T细胞介导的细胞免疫。 3.1.3 急性髓系白血病  AML是一种异质性的血液系统恶性肿瘤，是成人最常见的急性白血病形式。它的特点是髓母细胞在外周血、骨髓和/或其他组织中的克隆性扩张。93 在美国，AML的年发病率为每10万人中有4.3例，男性略高于女性。AML占所有亚型白血病死亡的高达62%。94 常规化疗后，年轻成人的复发率为10%至60%，老年人AML的复发率在年轻成人中为10%至60%，在60岁以上人群中为40%至60%，5年患者生存率约为27.4%。Jetani等人开发了一种针对Siglec-6的CAR-T细胞，在临床前模型研究中显示出对白血病有反应，并能在异种AML模型中诱导完全肿瘤缓解。Hebbar等人报告了一种GRP78-CAR-T细胞，在体内对AML有显著的抗白血病活性，且对造血祖细胞无毒性。CLL-1 CAR-T细胞的I期研究显示，完全缓解(CR)/不完全血液学恢复的完全缓解(CRi)率为70%，总生存(OS)率为60%。所有患者都经历了CRS，但没有神经毒性。Sugita等人评估了异基因基因编辑的CAR-T细胞对AML治疗的潜力。UCART123在体内外均有效消除AML，对正常细胞没有显著影响。一项针对自体抗CLL-1 CAR-T细胞的I/II期临床试验显示，在8名复发/难治性AML儿童中，有4人达到了无白血病的形态学状态，没有最小残留疾病，1人达到了CR。Wu等人报告了一项针对AML的抗CD70 CAR-T细胞的临床前研究，显示出与CD70+ AML细胞系共培养时的强细胞毒性和在小鼠模型中的强抗白血病活性。然而，这并没有在体内完全消除白血病。目前，尚未确定AML的理想CAR-T细胞靶标。最近的研究提出了使用单细胞转录组分析来预测在恶性细胞而非健康细胞（包括T细胞）上表达的靶抗原，以开发新的AML治疗CAR-T细胞。利用公开的RNA测序数据，包括来自15名AML患者的超过50万个单细胞和9名健康患者的组织，研究人员计算鉴定了2个潜在的新靶标，CSF1R和CD86。CSF1R-CAR-T和CD86-CAR-T细胞在AML细胞系和人源AML模型中的功能验证试验中显示出强大的疗效。 3.1.4 实体瘤  CAR-T细胞治疗的适应症多样，几乎涵盖了每种肿瘤类型。主要挑战可以概括为三个主要组成部分：识别、迁移和存活。实体瘤抗原异质性阻碍了肿瘤细胞特异性抗原的识别。相比之下，免疫抑制性TME干扰了T细胞的活性，包括分化和耗竭。之前的一项研究表明，抗GPC3-CAR-T细胞在原发性人类肝细胞异种移植模型中有效地抑制并消除了肿瘤。Cao等人开发了一种新型双特异性GPC3-BiTE CAR，与单靶点CAR-T细胞相比，在体外功能分析中显示出更好的抗肿瘤活性，并克服了由抗原异质性引起的肿瘤逃逸。Moghimi等人开发了一种GD2/B7H3 CAR-T细胞模型，证明了在抑制神经母细胞瘤生长和增加体内持久性方面的高特异性。CLDN18.2靶向CAR-T细胞（CT041）在胃肠道癌症中的I期中期试验显示，总响应率和疾病控制率分别为48.6%和73.0%。所有患者都经历了≥3级血液学毒性，没有观察到≥3级CRS或神经毒性。Meister等人开发了一种多功能mRNA基础的CAR-T细胞，显示出对胶质瘤的强烈抗肿瘤活性，在体内外试验中没有显示出毒性。Li等人开发了一种合成锌指转录调节因子，synZiFTR，通过编程药物依赖的、交付后控制体内T细胞抗肿瘤活性，调节CAR-T细胞在异种移植血液肿瘤模型中的体内疗效。他莫昔芬诱导的synZiFTR在体外以剂量和时间依赖性方式调节细胞因子的表达，包括IL-2和IL-12，安全且可控地增强了CAR-T的疗效。随后，Allen等人设计了一种增强型Notch受体包含CAR-T细胞，并表明工程化的synNotch诱导的IL-2电路在局部产生IL-2，推动CAR或TCR T细胞有效地渗透到胰腺癌和黑色素瘤的免疫排斥肿瘤模型中，增强免疫细胞渗透并减少系统毒性。一项临床前研究发现，局部注射靶向间皮素的CAR-T细胞在小鼠中清除了残留的肿瘤组织，没有显著的毒副作用。 3.1.5 心肌纤维化  心血管疾病约占全球所有死亡的31%，几乎所有与心力衰竭相关的心脏病都涉及心肌纤维化。以过量的细胞外基质蛋白沉积为特征的纤维化，是对慢性炎症的基本病理反应，在心血管疾病发展中具有重要的病理生理学意义。心肌纤维化的治疗策略仍处于研究阶段，CAR-T细胞治疗已取得显著进展。Rurik等人开发了一种在体内生成瞬时工程化CAR-T细胞的方法，该方法逆转了纤维化并在体外显著改善了心力衰竭。这不仅为心肌纤维化，也为其他纤维性疾病提供了可能性。然而，需要进一步的研究来验证安全性和有效性。 3.1.6 自身免疫疾病 自身免疫疾病源于免疫系统攻击身体自身的组织，通常被分类为器官特异性或系统性。目前的常规治疗包括非甾体抗炎药、糖皮质激素和疾病修饰性抗风湿药物；然而，彻底消除疾病已被证明是难以捉摸的。CAR修饰的T细胞可以杀死自身免疫疾病中的异常免疫细胞，如B细胞或分泌抗体的浆细胞，提供了潜在的治愈方法。Mougiakakos等人报告了使用自体CD19 CAR-T细胞成功治疗了一名患有严重难治性系统性红斑狼疮（SLE）的患者，该患者出现了活动性狼疮性肾炎，实现了血清学和临床缓解以及SLE疾病活动指数（DAI）评分从基线的16降至随访时的0，没有不良事件。随后，Mackensen等人报告了5名患有难治性SLE的患者接受了CAR-T细胞治疗。所有患者在3个月时实现了SLE缓解，中位SLE DAI评分为0，并实现了无药物缓解，在随访时没有观察到复发；他们也很好地耐受了CAR-T细胞治疗，没有或只有轻微的不良效应。这些数据表明，CD19+ CAR-T细胞移植是可行的、可容忍的，并有效治疗SLE。Müller等人报告了第二种自身免疫疾病通过CAR-T抗合成酶抗体综合征得到了治愈。经过6个月的CART细胞治疗，磁共振成像显示肌炎病变完全消退，肺炎消失，并实现了无药物缓解。目前，缺乏关于CAR-T细胞治疗在自身免疫疾病背景下有效性的全面长期数据。临床应用主要仍处于调查阶段，有限的病例正在进行临床试验，因此需要继续评估安全性和长期结果。尽管如此，这些有希望的结果突出了CAR-T细胞治疗作为自身免疫疾病治愈措施的潜力。 3.1.7 传染病  在传染病中，艾滋病是CAR-T细胞治疗研究的主要焦点。这种疾病没有治愈方法，患者需要终身服药。尽管抗逆转录病毒疗法的出现大大减少了与HIV感染相关的发病率和死亡率，但在潜伏感染的细胞中需要终身坚持治疗的稳定的HIV储库，中断抗逆转录病毒疗法可能导致病毒的快速重新激活。Liu等人开发了一种源自广泛中和抗体的CAR-T细胞治疗，产生针对HIV-1感染细胞的特异性细胞毒性活性，并有效地去除了HIV重新激活的感染CD4+ T淋巴细胞。最近的研究显示，通过外周静脉注射抗HIV duoCAR-T细胞可以定位到人源化小鼠脾脏中的活跃HIV感染部位，并消除了原发性HIV感染的细胞。 3.2 新靶标  目前，CAR-T细胞治疗在AML、HL、T细胞恶性肿瘤和实体瘤方面仍处于研究阶段，除了在B细胞恶性肿瘤方面的成功之外。人们希望新靶标的开发将有助于推进CAR-T细胞治疗在这些疾病治疗中的发展。例如，CD5+ CAR在针对各种T细胞癌症的临床前研究中已经显示出有效性。Feng等人开发了CD5-IL15/IL15sushi CAR-T细胞，这些细胞足以在几周内消除中枢神经系统淋巴细胞，并且患者只经历了短暂的T细胞发育不良事件。这些结果表明，这可能是T细胞恶性肿瘤的安全有效治疗方法，特别是那些涉及中枢神经系统的癌症。表皮生长因子受体（EGFR）在三阴性乳腺癌（TNBC）中高度表达，可能是相关的免疫治疗靶标；针对EGFR的CAR-T细胞在体内外对TNBC显示出强大且特异性的抗肿瘤活性。另一项研究表明，第二代针对EGFR的CAR-T细胞在小鼠中有效地根除了TNBC脑转移并提高了它们的生存率，进一步突出了EGFR作为TNBC治疗的有希望的靶标。单靶点CAR-T细胞通常会遇到诸如抗原逃逸和克隆阴性复发等问题。针对两个或更多肿瘤相关分子的靶向不仅可以防止肿瘤细胞的免疫逃逸，还可以克服实体瘤中的抗原异质性。针对CD19和CD22的双价CD19/CD22-4-1BB CAR-T细胞在20名R/R B-ALL患者的I期剂量递增试验中显示出60%的CR率和80%的骨髓CR率 双特异性CAR-T细胞，靶向BCMA和CD38，在临床试验中显示出87.5%的响应率和81.3%的严格完全缓解率，复发率低且CRS可控。田等人开发了一种BiCisCAR-T细胞系，同时靶向GPC2和CD276，能够通过靶向多种肿瘤相关抗原（TAAs）和实体肿瘤中的抗原异质性来克服神经母细胞瘤中的神经抗原异质性。戴等人表明，CD5/CD7双特异性CAR-T细胞在体外展现出良好的肿瘤杀伤能力和在持续抗原刺激下的增殖。此外，串联双靶向CAR比并行双靶向CAR在活性和防止肿瘤逃逸方面更有效（见图2）。 3.3 新的CAR设计 自杀基因切换可以消除体内的CAR-T细胞并防止潜在的危及生命的不良事件。基因组编辑技术是推动CAR-T细胞治疗进展的重要驱动力。诱导型半胱氨酸蛋白酶9（iC9）是一种自杀基因，可被一种惰性小生物分子AP1903激活。在CAR构建设计中包含iC9可以作为一个有效的安全开关来控制恶性CAR+ B细胞。布尔逻辑门控开关是数学运算符“如果/那么”，“和”，“或”和“非”。在CAR-T细胞设计中使用逻辑门控开关可以进一步控制它们的激活，提高细胞杀伤的特异性，并减少毒性副作用。针对癌胚抗原和间皮素的逻辑门控CAR-T细胞显示出对同时表达两种抗原的肿瘤细胞的特异性毒性，而不会影响单一抗原阳性肿瘤细胞的生长。 图2. CAR-T领域的发展方向（A）B细胞白血病/淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、AML、HL、MM和实体瘤的CAR-T细胞治疗的新靶标；（B）利用自杀或逻辑门控开关改进CAR-T细胞设计，提高其安全性和可控性；（C）CAR-T细胞与免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒或放疗的联合应用；（D）下一代CAR-T细胞，包括通用CAR-T、CAR-NK、CAR-MΦ和CAR-γδ T。AML = 急性髓系白血病，CAR = 嵌合抗原受体，CAR-MΦ = CAR巨噬细胞，HL = 霍奇金淋巴瘤，MM = 多发性骨髓瘤，NK = 自然杀伤细胞，UCAR-T = 通用CAR-T。 3.4 下一代CAR  3.4.1 通用CAR-T  自体CAR-T细胞生产成本高且生产周期长，患者淋巴细胞数量少且功能差；来自健康供体的通用CAR-T（UCAR-T）细胞似乎克服了这些限制，但可能引发移植物抗宿主病（GVHD），并且它们的持久性会被宿主免疫系统干扰。多重基因组CRISPR/Cas9编辑的UCAR-T细胞在体外和动物模型中展现出强大的抗肿瘤活性，与非基因编辑CAR-T细胞相似。CRISPR/Cas9设计的通用CD19/CD22 CAR-T细胞展现出可控的安全特性和卓越的无血细胞减少活性。通用双靶标CAR-T细胞治疗可能为R/R ALL患者提供替代治疗。通过TALEN介导的基因编辑产生的产品可以避免自然杀伤细胞和异体反应T细胞的攻击，并在体外和体内在NK细胞中延长它们的持久性和抗肿瘤活性。 3.4.2 其他可替代细胞  由于以下因素——它们的天然杀伤功能；丰富的来源，如NK92细胞系、脐带血、外周血和诱导多能干细胞；以及不引发GVHD——CAR-NK细胞目前正在被探索。刘等人在11名复发或难治性CD19阳性癌症患者中使用抗CD19 CAR-NK细胞，显示出73%的缓解率和64%的CR率。对于不适合单细胞分离的患者，使用原始人类造血干/祖细胞在体外产生功能性CAR巨噬细胞（CAR-MΦs），具有与CAR-T细胞相同的靶向激活。陈等人随后使用靶向胶质瘤干细胞的CAR-MΦs的局部注射有效地消除肿瘤细胞并抑制术后胶质母细胞瘤复发。γδ T细胞缺乏同种型，可以安全地用于半相合移植，并介导天然的抗肿瘤反应。Rozenbaum等人发现，γδ T细胞的CAR转导效率与标准CAR-T细胞在生产中一样高；在抗肿瘤效果方面，CD19导向的γδ T细胞对CD19阳性和阴性的白血病细胞都有效。 3.5 改变CAR-T细胞的给药计划 3.5.1 优化药物递送  增加单次或多次CAR-T细胞输注的作用持续时间是提高它们持久性的有效方法。李等人开发了一种具有可回收能力的CAR（CARKR-T），并显示出显著抑制CAR下调和增强内化CAR循环至细胞表面，促进长期杀伤能力。CD19 CAR-T细胞治疗在R/R B细胞恶性肿瘤中非常有效，但大多数情况下未能诱导持久反应。第二次输注（CART2）可能会改善结果。与第一次输注相比，第二次输注观察到更高的总响应率、更长的PFS和更低的严重毒性发生率。在R/R B-ALL患者中第二次CAR-T细胞输注对一些患者有益，而在其他患者中，CAR-T细胞扩张减少和抗原下调阻碍了对CART2的有力反应。静脉注射是CAR-T细胞给药的主要方式；然而，这对于治疗实体瘤并不理想。鞘内注射CAR-T细胞可以局部治疗复发性髓母细胞瘤和脑室内脑膜瘤，绕过血脑屏障，在小鼠模型中显示出优越的抗肿瘤效果。Grosskopf等人制造了一种可注射的水凝胶，控制了CAR-T细胞和刺激性细胞因子的共同递送，有效地消除了肿瘤，达到了100%的响应率；它没有引起不良的炎症反应，并且在几周内完全在体内降解。 3.5.2 联合疗法  CAR-T联合疗法将CAR-T细胞治疗与其他选项结合起来，如放疗、化疗、免疫检查点抑制剂和溶瘤病毒，这可以提高其安全性和有效性。放疗和化疗是传统的肿瘤治疗方式。周等人发现，将针对EGFR的CAR-T细胞与放疗相结合，在免疫缺陷的原位TNBC小鼠中有效地增强了免疫功能和抗肿瘤效果。有效的化疗减少改善了高肿瘤负荷的R/R DLBCL患者CAR-T细胞治疗的短期ORR和长期OS，使结果与低肿瘤负荷患者相当。PD-1抑制T细胞在TME中的功能通过PD-1抗体检查点阻断、细胞内PD-1 shRNA阻断或PD-1显性负性受体恢复了CD28 CAR-T细胞的效应功能。同时下调3个抑制性免疫检查点受体——PD-1、Tim-3和Lag-3——在CAR-T细胞中增强了肿瘤浸润和抑制肿瘤生长。地西他滨处理的CAR-T细胞在体内外都表现出增强的抗肿瘤活性和更持久的抗肿瘤潜力。布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）是B细胞受体依赖性细胞生长的关键介导因子，在多种B细胞恶性肿瘤中上调。BTK抑制剂（BTKis）在治疗MCL和慢性淋巴细胞性白血病中非常有效。伊布替尼是市场上第一种BKTi产品，与抗CD19 CAR-T细胞联合使用增强了疗效。同时给予CAR-T细胞治疗和伊布替尼导致了比单独CAR-T细胞治疗更高的ORR（83%对56%）。在小鼠实验中，伊布替尼与CD19 CAR-T细胞联合使用有协同效应；小鼠中的CAR-T细胞显著扩张，扩张比例高于单独CAR-T细胞治疗，显著减少了肿瘤负荷。溶瘤病毒疗法是一种新型的癌症治疗方式，使用裂解病毒直接攻击或在感染的癌细胞中表达病毒抗原，导致细胞毒性T细胞的识别和破坏。Evgin等人将CAR-T细胞装载了囊泡性口炎或真兽病毒，用于治疗小鼠模型中的实体瘤。系统递送大大增强了CAR-T细胞治疗黑色素瘤和胶质瘤肿瘤的疗效，并提高了生存率。 4. 结论  总之，CAR-T细胞治疗在血液系统恶性肿瘤中的成功已有充分记录，其在其他疾病领域的潜力也很明显。然而，与治疗相关的毒性反应和复发所带来的挑战需要进一步研究。旨在识别新靶标、改进或设计新的CAR结构、改变给药方法以及探索联合疗法的策略有潜力提高CAR-T细胞的安全性和有效性，同时减少毒性和降低复发率。此外，正在开展对其他免疫细胞疗法的调查，如CAR-NK细胞。未来有望开发出可定制的CAR细胞疗法，用于精确和个性化治疗一系列疾病。 识别微信二维码，添加细胞基因研究圈小编 请注明：姓名+研究方向！ 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(wibplib@126.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要Abstract在过去几十年，随着新型治疗药物的出现，如蛋白酶抑制剂、免疫调节药物、抗CD38单克隆抗体、选择性核输出抑制剂（SINEs）和T细胞重定向双特异性抗体，多发性骨髓瘤（MM）患者的生存结果已有大幅度提升。然而，MM仍是一种不可治疗的带瘤血浆细胞失调，几乎全部MM患者不可避免地因耐药性而旧病复发。令人鼓舞人心的是，近几年B细胞成熟抗原（BCMA）-靶向嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法在治疗复发性/难治性（R/R）MM方面已经获得了令人印象深刻的成功，这给R/R MM患者带来了新的希望。由于抗原逃逸、CAR-T细胞的持久性弱和复杂的肿瘤微环境，相当数量的MM患者在接受抗BCMA CAR-T细胞疗法后仍经历复发。另一方面，高昂的生产成本和因个性化生产步骤而费时的生产工艺也限制扩大CAR-T细胞疗法的临床应用。因此，在这篇综述中我们讨论了CAR-T细胞疗法在MM的当今局限性，如CAR-T细胞疗法的阻力和CAR-T细胞疗法受限的可行性，以及总结了一些优化策略去克服这些挑战，包括优化CAR结构如利用重定向/多定向CAR-T细胞和装甲CAR-T细胞、优化生产工艺、联合CAR-T细胞疗法和现有的或新兴的治疗方法、以及在CAR-T细胞疗法后进行抗骨髓瘤疗法来抢救治疗或维持/巩固治疗。01引言多发性骨髓瘤（MM）是一种血浆细胞肿瘤化，恶性的血浆细胞在骨髓里无性增殖，伴随着单克隆免疫球蛋白（称M蛋白）的过表达，随后终末器官损伤，这占了血液学恶性血液病的10%。随着对MM发病原理的了解越来越多，以及新颖治疗药物的应用如蛋白酶抑制剂（硼替佐米、伊沙佐米和卡非佐米）、免疫调节药物（沙丽度胺、来那度胺和泊马度胺）、单克隆抗体（达雷木单抗、 伊莎妥昔单抗和艾洛珠单抗），还有选择性核输出抑制剂（塞利尼索），MM患者的生存结果已有很大的改善。然而，几乎所有MM患者最终会复发，尤其是那些复发性或难治性（R/R）患者携带髓外疾病（EMD）或高风险细胞遗传学的异常情况如t(4;14)、t(14;16)、t(14;20)、gain(1q)、del(17p)和TP53突变，还有双/三重打击，通常有不良预后。另外，MM细胞在选择性的压力处理下频繁出现克隆演变，这导致疾病恶化和对常规疗法免疫。因此，急切需要治疗R/R MM的新型治疗方法。近年来，嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法已成为一种非常有前景的免疫疗法，它极大的改变了血液学恶性血液病的治疗蓝图。为了产生能特异性识别肿瘤表面抗原的CAR-T细胞，患者或健康捐赠者的T细胞含有特异性肿瘤靶点受体的基因修饰，这就是嵌合抗原受体(CAR)。CAR的结构含有单链可变区片段(svFv)，这使在没有MHC限制性抗原表达的条件下特异性识别肿瘤表面抗原。与效应T细胞类似，CAR-T细胞也可以通过几种方式介导肿瘤死亡，包括分泌含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒素颗粒、产生促炎症细胞因子如IFN-γ和TNF-α、以及激活Fas/Fas配体（Fas/FasL）通路。目前，B细胞成熟抗原（BCMA）是MM CAR-T细胞疗法最为成功的靶点，抗BCMA CAR-T细胞疗法已在R/R患者中获得前所未有的响应，给这些R/R MM患者带来了新的希望。另外，带EMD的R/R MM患者也可以从抗BCMA CAR-T细胞疗法中获益，但相对与非EMD患者来说，这些患者通常有短暂的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。到目前为止，两种抗BCMA CAR-T细胞产品，idecabtagene vicleucel (ide-cel) 和 ciltacabtagene autoleucel (ciltacel)，已被美国食品药品管理局（FDA）批准用于治疗R/R MM。随着近年来开展越来越多的CAR-T细胞临床试验，CAR-T相关副作用已逐渐被识别和控制，如细胞因子释放综合征、CAR-T细胞相关脑病症候群、血细胞减少和感染。尤其是因MM患者体液免疫缺陷随后淋巴细胞清除和抗BCMA CAR-T细胞疗法介导B细胞发育不全，这些患者对感染特别是细菌感染高度敏感。因此，这些免疫缺乏患者极度需要免疫球蛋白补充剂和预防性抗感染治疗。然而，仍有几个重大挑战，如抗BCMA CAR-T细胞疗法的阻力、CAR-T细胞疗法受限的可行性。因此，为开发出有效的策略在进行许多研究工作。02抗BCMA CAR-T细胞疗法在多发性骨髓瘤的阻力和潜在策略尽管抗BCMA CAR-T细胞疗法在R/R MM有着振奋人心的成果，但它的效力较短，许多MM患者仍遭遇肿瘤复发或恶化。这种阻力机制与抗BCMA CAR-T细胞、肿瘤细胞和复杂的肿瘤微环境之间的相互作用密切相关，设计抗原逃逸和CAR-T细胞衰竭。有几种潜在策略可以克服CAR-T细胞疗法的困难，包括利用双靶点CAR-T细胞和装甲CAR-T细胞，通过小分子药物和基因修饰抑制细胞内部衰竭香港的信号，和利用桥接疗法，还有在疾病早期收集选择性T细胞用于生产CAR-T细胞。2.1 克服抗原逃逸的困难目前BCMA是治疗MM最广泛研究的靶点，包括抗BCMA CAR-T细胞疗法和靶向BCMA和CD3的双特异性抗体，如teclistamab。然而，大部分MM患者在接受抗BCMA CAR-T细胞疗法后仍遭遇肿瘤复发。主要机制之一为在治疗压力下抗原下调或抗原损失。因此，靶向不同表面抗原是预防不良抗原逃逸的一种有效策略，现在多种可选择的靶点正持续被识别，包括CD138、CD38、CD19、GPRC5D、SLAMF7(CS1)、APRIL、TACI、CD229、CD56、MUCI、NKG2D配体、整合蛋白β7、Kappa轻链、FcRH5、CCR10和CD44v6 （图1）。以上大部分靶点仍在临床前阶段 (NCT03778346). 其中，GPRC5D是目前R/R MM患者CAR-T细胞疗法最有潜质的靶点。现在抗GPRC5D CAR-T细胞疗法有两个临床1期试验已发布了令人振奋人心的功效。在临床1期剂量爬坡试验种，17名R/R MM患者接受了4个剂量水平的抗GPRC5D CAR-T细胞输注，71%的患者获得了临床应答。在另一个临床1期试验独立中心，10名R/R MM患者接受了抗GPRC5D CAR-T细胞治疗(OriCAR-017), 100%患者显示临床应答，60%患者达到严格的完全应答（sCR）。更重要的是，这些抗GPRC5D CAR-T细胞对先前抗BCMA CAR-T细胞疗法难治的R/R MM患者也有效果。然而，由于中间跟进时间相对较短，R/R MM采用抗GPRC5D CAR-T细胞疗法的有效性和安全性仍需要在大规模多中心试验评价。另外，在2022美国血液学会（ASH）的年会上展示了一个关于GPRC5D靶点CAR-T细胞产品BMS-986393在R/R MM患者的1期临床试验结果(NCT04674813)。在该临床试验中，10名没有接受过先前抗BCMA疗法的患者全部达到缓解，7名在先前抗BCMA疗法中失败的患者也在抗GPRC5D CAR-T细胞疗法中获益。此外，BCMA/GPRC5D 双特异性CAR-T细胞疗法正积极进行临床研究(NCT05431608)。另外，SLAMF7靶向和整合素β7靶向的CAR-T细胞临床试验也正在进行中(NCT03778346)。然而，SLAMF7和CCR10也在活化T细胞中表达，可能会杀害CAR-T细胞。在临床前和临床研究中也有双靶点CAR-T细胞疗法，他们可以有多种形式，包括2种单靶点CAR-T细胞联合输注，还有同时整合单独两个不同scFvs至两种CARs或单CAR结构的双特异性CAR-T细胞，后者也称为串联CAR-T细胞。在几种临床试验中，CD38和CD19被应用于整合BCMA来开发双靶点CAR-T细胞，用于治疗R/R MM (表1)。在1期临床试验中，23名 R/R MM患者接受BCMA/CD38双特异性CAR-T细胞，87%的患者获得临床应答，52%的患者获得有随后中位数9.0个月的完全应答（CR）。在另一个临床试验中，16名R/R MM患者接受BCMA/CD38双特异性CAR-T细胞疗法，其中14名患者有临床应答，13名患者获得随后中位数11.5个月的CR。除了BCMA/CD38双特异性CAR-T细胞以外，也进行了整合抗CD38和抗BCMA CAR-T细胞疗法。在一项2期单臂单中心临床试验中，22名R/R MM患者接受了人源化抗BCMA细胞于鼠源抗CD38 CART细胞的联合输注。在另一项单臂2期临床试验中，21名患者接受抗BCMA和抗CD19 CAR-T细胞的联合输注，20名患者获得了临床响应，其中3名患者获得随后中位数179天的CR。这次试验随着患者数量陆续增多，62名R/R MM患者获得了抗BCMA和抗CD19 CAR-T细胞的联合输注。在这次临床试验中，92%的患者获得临床应答，60%的患者获得随后中位数21.3个月的CR。另外，近来研究已经发现抗CD19和抗BCMA CAR-T细胞疗法联合输注在10名最新诊断的高风险MM患者中的有效性和安全性，全部患者获得了临床应答。在临床前研究中，BCMA/GPRC5D和BCMA/CS1双特异性CAR-T细胞显示大量对抗MM细胞的抗肿瘤活动，他们可以克服BCMA负面抗原逃逸。同样的，BCMA/CS1双特异性CAR-T细胞在R//R MM患者中也有效果，可以预防BCMA负面释放。有趣的是，一些自然配体可以结合两个或多个MM细胞的表面抗原，所以生产携带这些配体抗原识别区域的CAR-T细胞可以识别几个在恶性细胞上的目标靶点，从而获得重抗原或多抗原靶点。在临床前研究已测试几种配体相关的CAR-T细胞，目前获得了令人满意的结果。例如，APRIL相关CAR-T细胞能靶向MM细胞的BCMA和TACI，BAFF配体相关的CAR-T细胞能特异性识别MM细胞上的三种不同受体，包括BAFF-R、BCMA和TACI。除了靶向不同抗原以外，提高MM细胞的目标抗原密度也是一种吸引人的策略。一些研究已证实γ-分泌酶抑制剂和全反式维甲酸（ATRA）可以上调MM细胞的BCMA表达，促使被抗BCMA CAR-T细胞识别。另外，ATRA可以促使MM细胞表达CD38。图1 多发性骨髓瘤的潜在治疗靶点，包括 BCMA、CD138、CD38、CD19、GPRC5D、SLAMF7、APRIL、TACI、CD229、CD56、CD44v6、整合蛋白β7、MUCI、FcRH5、Kappa轻链、CCR10和NKG2D配体表1 MM双靶向CAR-T细胞疗法的临床试验 2.2 预防CAR-T细胞衰竭R/R MM患者在接受抗BCMA CAR-T细胞疗法后得到短期临床缓解部分归因于CAR-T细胞衰竭，表现出CAR-T细胞不良的持久性和功能紊乱。目前，被认为涉及CAR-T细胞衰竭的多个因素包括持续性抗原刺激、免疫抑制肿瘤微环境和先前抗骨髓瘤治疗引起的T细胞的受损功能。改善CAR-T细胞功能障碍有几种潜在策略，如优化CAR-T细胞结构、利用早期记忆T细胞和通过基因修饰或抑制剂来抑制细胞内衰竭相关的信号。另外，考虑到在多线抗骨髓瘤治疗后T细胞受损的细胞毒性，在病程早期收集T细胞来生产CAR-T细胞可能也是一种有效策略。2.2.1 优化CAR-T细胞结构目前，CD28、4-1BB、ICOS和OX40是在CAR-T细胞生产中最常使用的协同刺激分子。CD28协同刺激引起大量T细胞的激活，因此它能加速CAR-T细胞衰竭。相比之下，4-1BB协同刺激可以促使干细胞记忆T细胞扩展，改善CAR-T细胞衰竭。ICOS是CD28家族中的一个成员，ICOS和4-1BB组合协同刺激可以显著提高CAR-T细胞的持久性。作为TNF-R超家族中的一员，OX40显示可以促进T细胞增殖和产生记忆。最新的研究已证实在重复刺激BCMA条件下，相对于4-1BB介导的BCMA靶向CAR-T细胞，OX40介导的BCMA靶向CAR-T细胞展示出强烈的增殖能力和更持久的抗肿瘤活性。另外，全人源CAR结构可减少抗BCMA CAR-T细胞的免疫原性，避免宿主免疫系统的免疫介导排斥。更重要的是，一项1期临床试验已证实R/R MM在接受先前鼠源抗BCMA CAR-T细胞疗法后复发的患者也可以在全人源抗BCMA CAR-T细胞中获得临床应答。2.2.2 利用记忆表型CAR-T细胞早期记忆T细胞展现出更强的扩张和持久性。相似的，一项最新的研究报道在CAR-T生产工艺中利用原始的或中心记忆T细胞不仅可以改善CAR-T细胞衰竭，也可以减少严重细胞因子释放综合征的风险。另外，最近已被证实JQ1， bromodomain and extra-terminal motif (BET)家族的一种抑制剂，可以维持带中心记忆T细胞特性的效应T细胞，也可以提高采用的CAR-T细胞的持久性和功能性。2.2.3 抑制衰竭相关信号BATF是涉及上调CAR-T细胞衰竭相关基因组的一个关键因子，已证实BATF的损耗可以提高CAR-T细胞的抗肿瘤活性，提高中心记忆CAR-T细胞。相似的，CAR-T细胞内源性TGF-β受体II （TGFBR2）不仅可以预防CAR-T细胞衰竭，也可以促使中心记忆CAR-T细胞的增殖。抑制细胞内钙信号和PD-1信号也显示出可有效防止CAR-T细胞衰竭。另外，PI3K/AKT通路参与T细胞增殖和分化，是CAR-T细胞衰竭的重要角色。目前，体内实验已证实PI3K抑制剂可调节CAR-T细胞分化，提高CAR-T细胞的持久。有趣的是，一项最新研究发现第二代酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼可以通过提高记忆相关基因的表达逆转CAR-T细胞的衰竭表型，如TCF7和CCR7，减少免疫检查点分子PD1和衰竭相关调节因子的表达，如NR4A1、BATF3, ATF4, 和FOS。相似的，panobinosta也可能可以上调记忆相关基因和下调衰竭相关基因。此外，一项最新研究证实SOX4和ID3是关键的衰减相关调节因子，因此抑制SOX4和ID3表达也可以防止CAR-T细胞衰竭。2.2.4 改善CAR-T细胞效应器功能CART细胞的衰竭表型表现出抗肿瘤功能受损。CAR-T细胞抗肿瘤活性可通过基因修饰改善，包括增加免疫刺激受体和特异性敲除介导CAR-T细胞失能的基因。目前，多种研究证实分泌细胞因子或表达促炎症配体的装甲CAR-T细胞，如IL-7、IL-12、IL-15、IL-18和CD40L，可以改造肿瘤微环境。另外，多个研究已证实额外嵌合的协同刺激受体（CCRs）可持续提高CAR-T细胞的杀伤作用和持久性。另外，另一个研究证实敲除CAR-T细胞中介导混合物亚单位12和周期蛋白C可以改善CAR-T细胞的抗肿瘤活性。为了改善CAR-T细胞抗肿瘤活性，CAR-T细胞和小分子药物尤其是抗骨髓瘤物质的联合治疗可能也是一种有前景的策略。在临床试验中，来那度胺在很长一段时间被用于治疗MM。有趣的是，来那度胺和CAR-T细胞的联合治疗可以获得良好的效果，改善CAR-T细胞的细胞毒性，一个案例显示抗BCMA CAR-T细胞联合来那度胺在先前抗BCMA CAR-T细胞疗法中难治的MM患者中也有效。另外，阻断PD-1 已被证实也可提高CAR-T细胞对MM细胞的杀伤活性。然而，CAR-T细胞疗法联合小分子药物仍在初步阶段，许多联合疗法仍在研究中。2.2.5 克服免疫抑制肿瘤微环境的困难MM的骨髓微环境很复杂，涉及促肿瘤生长、免疫逃逸和药物阻力。MM骨髓微环境中有多个免疫抑制细胞的累积，有着支持肿瘤的特性，如破骨细胞（OCs）、骨髓源抑制剂细胞（MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞、调节T细胞（Tregs）、调节B细胞（Bregs）、肿瘤相关中性粒细胞（TANs）还有骨髓基质细胞（BMSCs）。另一方面，这些细胞串扰MM细胞可促进MM细胞的存活和增殖（图2）。另一方面，他们通过直接细胞间联系或释放可溶性因子来损害效应T细胞的细胞毒性，然而促使MM细胞从免疫监视中逃脱。OCs是造血干细胞衍生的多核细胞，负责骨吸收，在骨髓瘤发生和进展中会显著性的提高OCs和分泌RANKL。而且，他们释放APRIL、BAFF和IL-6，促使MM细胞的增殖和存活。更重要的是，OCs也作为抗原呈递细胞（APCs）驻留在骨髓中，通过上调免疫检查点分子如PD-L1、CD38和半乳凝素9的表达展现免疫抑制功能。反过来，MM细胞产生IL-6和RANKL，可提高OCs骨再吸收活性。在MM患者中，表现M2相似特性的TAMs明显渗入骨髓，大量激活BAFF促增殖信号，参与促血管新生和肿瘤抵抗。而且，大规模MDSCs在MM患者的骨髓微环境中累积。他们可产生免疫抑制分子IL-10和TGF-β，然后促使Treg细胞的产生和MM细胞的免疫逃逸，还有血管新生。中性粒细胞在骨髓中是一种重要的细胞亚型，是预防病原体的第一线。他们可以产生中性粒细胞胞外综合征（NETs），在预防病原体中有着重要的角色。然而，源于TANs的NETs在MM骨髓微环境中起免疫抑制的作用。一项最新的研究中显示MM细胞以依赖PAD4的方式诱导NET的形成，促使肿瘤相关血栓形成和肿瘤转移。而且，在MM微环境中随着NF-kB信号的激活，BMSCs显示出一种炎症性表型。他们不仅分泌几种细胞因子，如APRIL、BAFF、IL-6和RANKL，在促MM细胞增殖中有着重要角色，也引发MM细胞中抗凋亡蛋白的表达，包括生存素和Mcl-1。免疫抑制的Tregs和Bregs在MM骨髓瘤微环境中也有显著的提高，通过分泌免疫抑制的细胞因子如TGF-β和IL-10还有表达免疫抑制分子如PD1、TIM3和CD38来维持免疫耐受。而且，NK细胞表现出衰竭的表型，主要被证实通过下调多个活化受体和细胞溶解分子如NKG2D、SLAMF7、CD69和GZMA来减少的抗骨髓瘤活性，类浆细胞树突细胞（pDCs）功能失调会上调PD-L1的表达。此外，NKT细胞在R/R MM患者中会减少。更多的是，包括MM细胞、免疫抑制细胞和BMSCs的MM微环境，还有多个与CAR-T细胞互动的可溶性细胞因子，可导致CAR-T细胞功能失调，抑制CAR-T细胞转移，最终在CAR-T细胞输注后促进MM细胞的抵抗力（图3）。在一方面，骨髓微环境中的肿瘤细胞和免疫抑制细胞通过直接细胞间作用引起CAR-T细胞衰竭，如PD-1/PDL-1通路和Fas/FasL通路。在另一方面，免疫抑制的细胞也可以释放免疫抑制因子IL-10和TGF-β去损伤CAR-T细胞的细胞毒性，促进Treg细胞生成。另外，BMSCs可通过在MM细胞里上调抗细胞凋亡蛋白保护MM细胞对抗CAR-T细胞。因此，克服免疫抑制肿瘤微环境的困难可能是一种有前景的治疗策略。现在，可原位释放免疫激活的细胞因子的装甲CAR-T细胞被发现可以克服敌对的免疫抑制肿瘤微环境。因CD38在MM骨髓微环境多种免疫调节细胞中表达，如Tregs、MDSCs，抗CD38 CAR-T细胞也对CD38阳性免疫调节细胞有轻微细胞毒性。CAR-T细胞疗法联合溶瘤细胞病毒也是一种克服免疫抑制肿瘤微环境的潜在策略。另外，CAR-T细胞疗法联合抗凋亡蛋白抑制剂FL118也被证实可以克服BMSCs引起的阻力。 图3  CAR-T细胞、肿瘤细胞和免疫抑制肿瘤微环境的相互作用。一方面，骨髓微环境的肿瘤细胞和免疫抑制细胞通过直接细胞间作用引起CAR-T细胞衰竭，如PD-1/PDL-1通路和Fas/FasL通路。免疫抑制细胞也能释放免疫抑制细胞因子如IL-10和TGF-β来影响CAR-T细胞的细胞毒性，促使Treg细胞的生成。另外，BMSCs能通过在MM细胞中上调抗凋亡蛋白来保护MM细胞对抗CAR-T细胞。03改善CAR-T细胞疗法可行性的策略3.1 开发通用的CAR-T细胞产品目前，所有商业化CAR-T细胞产品采用自身T淋巴细胞生产。个性化的生产工艺需要近3~4周，也导致生产费用昂贵。尤其是，一部分R/R MM患者在CAR-T细胞生产期间疾病急速恶化，所以他们不能接受时下的自身CAR-T细胞疗法，甚至失去了接受CAR-T细胞疗法的机会。自身CAR-T细胞产品相对较长的生产时间和昂贵的生产费用限制了他们的可行性，因此现在正开发容易获得的“下架”自身CAR-T细胞产品来克服这些限制，如通用的CAR-T（UCAR-T）细胞和CAR-γδT细胞。因为UCAR-T细胞源于健康的捐赠者，他们有多种优势，如更强的细胞毒性和没有恶性肿瘤细胞污染。更多的是，由于这些UCAR-T细胞大规模生产，生产费用可显著性降低。不幸的是，这些同种异体的UCAR-T细胞也许会导致移植物抗宿主病（GVHD），被宿主免疫系统排斥。在一项最新的1期临床试验种，43名R/R MM患者接受同种异体的抗BCMA CAR-T细胞疗法，55.8%的患者出现临床应答，其中25%获得随后中位数为10.2个月的sCR。更重要的是，这些同种异体的CAR-T细胞从病人招募到CAR-T细胞输注成功输注时间的中位数为5天，这显著缩短了CAR-T细胞输注的等待时间。然而，这些同种异体的CAR-T细胞完全应答率（ORR）显著低于两个FDA批准的抗BCMA CAR-T细胞产品。另外，γδT细胞可用于生产UCAR-T细胞。他们是少量含有T细胞受体和自然杀伤细胞受体表达的效应T细胞。尤其是，γδT细胞表达的NKRs在MHC依赖的方式介导肿瘤识别。因此，CAR-γδT细胞可通过NKRs和CARs持续介导固有的和适配的抗肿瘤免疫应答。更重要的是，γδT细胞在同种异体的造血干细胞移植中不会引起GVHD。而且，与CAR-T细胞相比，CAR-γδT细胞显著减少细胞因子的生成，显示出更好的有效性。目前，由于NK细胞的广泛来源和不会引发GVHD，CAR-NK细胞疗法已被认为是有前景的采用性细胞疗法，在临床前被开发用于治疗R/R MM。3.2 搭桥疗法为了预防在生产期间疾病急速恶化，减少基准肿瘤负荷，在CAR-T细胞疗法前的搭桥疗法很关键。搭桥疗法通常根据每位患者治疗前和疾病特点进行个性化治疗。一般来说，搭桥疗法考虑先前有效治疗药物联用，如地塞米松、达雷木单抗、卡非佐米、硼替佐米和泊马度胺。搭桥疗法选项有多种，如化学疗法、靶向治疗、自身造血干细胞移植（auto-HSCT）和局部放射治疗、还有局部冷冻疗法。使用BCMA靶向药物可能引起BCMA表达减少，然后影响抗BCMA CAR-T细胞疗法的有效性，一般在搭桥疗法中排除他们。Auto-HSCT是适合移植MM患者的标准疗法，可在CAR-T细胞疗法前作为一种有效的搭桥疗法。一项最新的研究证实相对于单独的CAR-T细胞疗法，auto-HSCT联合CAR-T细胞疗法获得较高的ORR、PFS和OS，说明搭桥auto-HSCT可促进持久的和深度的缓解。另一项临床试验已比较auto-HSCT联合CAR-T细胞疗法和单独auto-HSCT的有效性，结果显示联合疗法组的CR率较高、有3年PFS，而auto-HSCT组较低的3年释放率以上研究指明auto-HSCT联合CAR-T细胞疗法在缓解方面有协同作用。另外，局部放射疗法和冷冻疗法是对R/R MM患者来说有效的搭桥疗法。局部放射疗法和冷冻疗法联合抗BCMA CAR-T细胞疗法可能会产生协同的抗肿瘤效果。另一方面，放射疗法和冷冻疗法可直接杀死肿瘤细胞，另一方面，他们可以使CAR-T细胞敏感，通过远位效应激活内源性效应T细胞，这可能与上调肿瘤内趋化因子和细胞因子有关，并释放新抗原尤其是，放射疗法也可以通过免疫原性的细胞死亡激活CAR-T细胞。3.3 应用快速的CAR-T细胞生产平台快速的CAR-T细胞生产也可以缩短患者招募到CAR-T细胞输注期间的间隔。令人振奋人心的是，有报道，第二天生产并含近7天的质量控制测试的FasT Car-T细胞在B细胞急性的淋巴母细胞白血病临床前和临床研究有良好的有效性。因其显著缩短了生产时间，他们更适合疾病进展的患者，可以减少患者的临床住院日，最终改善CAR-T细胞治疗的可行性。另外，因其在体外试验中短时间培养，FasT CAR-T细胞相对于传统CAR-T细胞有着较少的衰竭表型和更强的杀伤活性。在2022 ASH年会中宣布一项BCMA/CD19双靶点FasT CAR-T细胞(GC012F)在NDMM患者中的1期临床试验s(NCT04935580)，这些FasT CAR-T细胞准备需要22~26小时。另外，在2022 ASH年会中也提到另一个正在进行的关于BCMA Nex T CAR-T细胞疗法BMS-986354在R/R MM患者的研究(NCT04394650)。在这个1期临床试验中，这些CAR-T细胞采用NEX-T工艺生产需要5-6天，有着强大的杀伤活性。然而，这些CAR-T细胞的有效性仍在多个研究中进行确认。3.4 采用非病毒载体转染另外，非病毒载体转染也能减少生产成本，提高CAR-T细胞疗法的可行性。转染CAR基因至T细胞是在CAR-T细胞生产工艺中一项至关重要的步骤。目前，采用病毒载体可频繁获得CAR转染，如伽马逆转录和慢病毒载体。然而，病毒载体的生产通常需要2到3周，需要良好的生产规范（cGMP）级别的厂房设施和培训过的操作人员，这使得CAR-T细胞生产耗费时间和成本。而且，通过病毒载体转导的序列是受限的。因此，正积极开发无病毒的基因修饰方法。现在，包括piggyBac(PB)和Sleeping Beauty(PB)系统的转位子系统已经证明在临床前和临床研究的CAR-T细胞生产中基因转换效率的稳定性。因生产工艺的复杂性降低和货物容量较好，转位子系统减少了生产成本，比病毒转染更适合于多靶点CAR-T细胞生产。而且，转位子系统可用于自动的工艺平台去生产CAR-T细胞临床治疗剂量，这将会促使CAR-T细胞生产的放大，提高R/R患者接受CAR-T细胞疗法的可行性。另外，基于转位子的CAR-T细胞显示出早期记忆T细胞表型。令人振奋人心的是，一项最新研究证实CRISPR-Cas9介导的非病毒特异性靶向CAR-T细胞在R/R 非霍奇金淋巴瘤（NHL）的安全性和有效性，指明CRISPR-Cas9是一个CAR-T细胞生产中精确基因编辑的新工具，促使未来更多特定基因靶向CAR-T细胞的发展。3.5 高风险MM患者在早一线治疗开始CAR-T细胞疗法高风险新诊断的MM（NDMM）患者通常有着较差的标准一线治疗预后，因此对于高风险MM患者非常需要额外治疗选项。CAR-T细胞疗法也许可以提供一个潜在解决方式，作为这些高风险NDMM患者的一线疗法。在2022 ASH年会中发表了一项正在进行的关于NDMM患者BCMA/CD19双靶向FasT CAR-T细胞的多中心研究(NCT04935580)。在这次临床试验中，13名高风险NDMM患者接受BCMA/CD19双靶点FasT CAR-T细胞疗法，100%的患者获得临床应答，69%的患者获得随后中位数是5.3个月的sCR。这些结果揭示了CAR-T细胞疗法在早期治疗的安全性，可能在高风险MM患者中获得较深的应答，最终为高风险MM患者提高可行性。04CAR-T疗法后的抗骨髓瘤疗法目前，抗BCMA CAR-T细胞疗法后尤其是高风险MM患者频繁出现复发。然而，现在对于R/R MM患者在CAR-T细胞疗法中复发后缺少推荐的救援方法。因此，抗BCMA CAR-T细胞疗法难治性的R/R MM患者急切需要开发合适的后续治疗。除了优化的CAR-T疗法和先前化疗方案还有auto-HSCT以外，新型的抗骨髓瘤药物为抗BCMA CAR-T细胞疗法后复发的R/R MM患者提供了额外的救援选择，包括塞利尼索、卡非佐米、泊马度胺、单克隆抗体和T细胞重定向双特异性抗体。而且，几项研究表明经历抗BCMA CAR-T疗法后复发的R/R MM患者也可以在卡非佐米疗法、维奈托克疗法和塞利尼索疗法中获益。另外，T细胞重定向双特异性抗体如Cevostamab和Talquetamab也被证明是在抗BCMA CAR-T细胞疗法后可行的救援治疗，可以引起持久的应答。而且，磷脂药物混合Iopofosine I-131可以在先前抗BCMA疗法中失败的R/R MM患者中获得临床应答。而且，在CAR-T细胞输注后有几项维持/巩固疗法的建议措施，但CAR-T疗法后的维持治疗可能可以为高风险MM患者提供潜在的临床获益。最近研究证实采用来那度胺和泊马度胺的维持疗法可以促使高风险MM患者的CAR-T细胞重复扩张。此外，在1期临床试验，塞利尼索在EMD R/R MM患者接受全人源抗BCMA CAR-T疗法后的有效性和安全性正在测试中(NCT05201118)。结论近年来，抗BCMA CAR-T细胞疗法已在R/R患者获得给人印象深刻的效果，其副作用一般可控，但仍存在几个需要解决的挑战。例如，在抗BCMA CAR-T细胞疗法后继续出现复发，自身CAR-T细胞产品昂贵的生产费用和长时间的生产周期限制了他们的可行性。因此，未来需要改进。目前，正在探索潜在的机制和治疗策略，如新型治疗靶点的鉴别、优化CAR结构和基因修饰方法、双靶向CAR-T细胞疗法的应用和CAR-T细胞疗法与其他方法的联合。然而，由于CAR-T细胞疗法的阻力和反复出现的高风险因素，后续抗骨髓瘤治疗也是一个巨大的临床意义。来源：Zhang, X., Zhang, H., Lan, H., Wu, J., & Xiao, Y. (2023). CAR-T cell therapy in multiple myeloma: Current limitations and potential strategies. Frontiers in Immunology, 14, 1101495.END

中文摘要      多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是由浆细胞恶性增殖引起的恶性肿瘤，可在骨髓中积累导致骨髓衰竭。MM的治疗通常包括免疫调节剂和造血干细胞移植等方式，但是疗效并不理想。嵌合抗原受体T细胞疗法是近年来出现的一种新型免疫疗法，通过体外基因编辑技术改造患者的T细胞，使其能够特异性识别肿瘤细胞的表面抗原，从而达到靶向杀伤肿瘤细胞的目的。此文主要就嵌合抗原受体T细胞在MM治疗中的应用及靶点作一介绍。正文      近年来，肿瘤逐渐成为人类健康的最大威胁，其中血液肿瘤占病例数的5%，包括各类白血病、多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）以及恶性淋巴瘤等[1]。MM是一种分泌单克隆免疫球蛋白的浆细胞恶性增殖疾病，占血液系统恶性肿瘤的10%以上。我国MM患者约有20万并且每年新增至少6万例，发病中位年龄为59岁[2]。尽管对MM的研究已有数十年，治疗方法包括蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂和造血干细胞移植技术，但完全缓解率不到5%，大多数患者的中位生存期不到5年[3]。近年来，改造自体免疫细胞成为治疗肿瘤的一种新型方法，这种细胞能直接靶向抗原发挥作用，而且利用自体细胞改造避免了移植物抗宿主病产生的不良反应[3]。嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）T细胞治疗是将患者的T细胞通过体外基因编辑后回输至患者体内，使其能够靶向表达特定抗原的肿瘤细胞并发挥杀伤作用，从而清除肿瘤细胞。1CAR-T细胞疗法1.1CAR结构      CAR是一种人工融合蛋白，融合了靶向肿瘤表面抗原识别域和T细胞信号域[4]。CAR由3个部分组成，包括直接靶向肿瘤表面特异性抗原受体的胞外区、由跨膜蛋白组成的跨膜区以及为T细胞提供刺激信号的胞内区。胞外区一般为单链抗体区域，胞内区由CD3ζ转录因子信号链组成[5]。根据胞内信号区的不同，CAR结构已有5代。第1代CAR-T细胞中，胞内区只有1个单一信号转导区，由于缺乏诱导T细胞活化的第二信号，因此T细胞只能进行短暂的增殖和少量的细胞因子分泌，限制了抗肿瘤活性[6]。第2代和第3代CAR-T细胞在第1代的基础上加入了如CD28、OX40或4-1BB等共刺激因子作为激活T细胞的第二信号，增强细胞杀伤肿瘤的能力。第3代CAR-T细胞包含多个互相组合的共刺激因子，对于T细胞的增殖以及细胞因子如IL-2、TNF以及IFN的产生具有重要作用。第4代CAR-T细胞中额外表达了其他分子来增强CAR-T细胞，例如表达IL-15增强T细胞活性或者表达自杀基因避免T细胞过量增殖而带来的不良反应[7]。第5代CAR-T细胞为通用型，通过基因编辑技术敲除了人体排异反应基因，从而可以进行异体CAR-T细胞的制备[8]。1.2CAR-T细胞免疫治疗原理CAR-T细胞疗法是基于T细胞介导的细胞免疫杀伤作用的一种新型细胞疗法。T细胞需要双信号共同刺激才能活化、增殖和分化为具有细胞毒性的效应T细胞。第一信号是抗原特异性信号，由T细胞受体和MHC-抗原肽的结构组成。第二信号是抗原非特异信号，由T细胞与APC表面的协同刺激分子相结合构成。2种信号共同参与诱导T细胞发生级联反应，最终活化为CTL。CTL接触具有相同MHC-抗原肽的肿瘤细胞后，释放穿孔素杀伤肿瘤细胞并分泌细胞因子抑制肿瘤细胞的生长[9]。CAR-T细胞疗法从患者体内分离治疗使用的T细胞，通过基因工程技术使T细胞表达CAR结构后，回输到患者体内，以达到精准靶向并杀伤肿瘤细胞的效果。2靶点的选取2.1B细胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）        BCMA仅表达在成熟B细胞表面，是一种重要的B细胞生物标记物。BCMA特异性结合TNF配体超家族成员13b和增殖诱导配体（a proliferation inducing ligand，APRIL），并导致核因子κB和丝裂原激活蛋白激酶8/Jun激酶通路活化。在MM中BCMA的表达增加，促增殖信号增强，最终导致细胞癌变[10]。临床研究证明BCMA在MM细胞表面的表达率为60%~70%[11]。有研究证明，表达BCMA的CAR-T细胞可以有效识别并杀伤小鼠体内的骨髓瘤细胞[12]。2019年，美国百时美施贵宝公司和美国Bluebird Bio公司共同开发的靶向BCMA CAR-T细胞bb2121的I期临床试验结果显示，bb2121在治疗复发/难治性MM患者时，客观缓解率为85%[13]。美国国家癌症研究所以γ-逆转录病毒作为载体构建靶向BCMA的CAR-T细胞[14]。1项临床试验中，12例曾接受环磷酰胺和氟达拉滨化学治疗的MM患者接受了靶向BCMA CAR-T细胞治疗，试验通过消耗内源性白细胞以及Treg从而增强CAR-T细胞抗肿瘤活性。低剂量组10例中有8例病情稳定，1例获得很好的部分缓解，1例获得部分缓解；高剂量组2例中有1例获得持续性完全应答，1例在66周获得很好的部分缓解，但由于治疗后期肿瘤细胞表面BCMA抗原表达量下调产生免疫逃逸，试验以失败告终[15]。1项I期临床试验（NCT02546167）评价了靶向 BCMA 的 CAR-T细胞疗法治疗复发性MM的安全性及有效性。患者分为3组，第1组输注（1~5）x108 kg-1CAR-T细胞，第2、3组分别在环磷酰胺预处理后输注（1~5）x107 kg-1和（1~5）x108 kg-1CAR-T 细胞，客观缓解率分别为44%、20%、64%，其中25例患者出现细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS），15例完全缓解，总缓解率为85%[16]。以上数据说明BCMA有可能成为治疗MM的理想靶点。2.2CD138       CD138又称多配体蛋白聚糖1，属于I型跨膜蛋白多糖家族。CD138在造血系统中的正常细胞和肿瘤浆细胞表面表达，也在各类上皮细胞中表达，参与细胞黏附作用[17]。CD138在MM细胞上高表达，且与疾病的进展有直接的关系。研究发现CD138在2例MM II期患者中的表达率分别为（77.00±0.60）%和（90.00±0.35）%[18]。目前只有1项自体CD138 CAR-T细胞治疗复发/难治性MM患者的临床研究。5例患者接受了单次平均剂量 7.56x106 kg-1的CD138 CAR-T细胞治疗。所有患者在输注后的4周均能检测到较高水平的CAR表达。所有患者除了发热和恶心呕吐外，均未观察到严重不良反应。4例患者在输注CAR-T细胞3~7个月后出现骨髓瘤消退，1例患者虽然能检测到CAR表达，但是直到输注90 d后病情仍有进展[19]。这表明，靶向CD138 CAR-T细胞具有杀伤肿瘤的效果，但肿瘤复发的风险仍然存在。2.3CD19       CD19是一种B细胞特异性表面蛋白，是B细胞共受体复合物的组成部分，属于免疫球蛋白超家族，在整个B细胞分化的过程中表达[20]。虽然CD19在浆细胞中很少表达，但有一小部分CD19+ MM细胞被发现更早成熟，可能属于骨髓起始细胞或骨髓干细胞，并且与高危疾病、不良预后、复发和生存率降低有关。1项研究发现116例检测了 MM免疫表型的患者中，骨髓瘤细胞表面CD19阳性者占16.38%[21]。Garfall等[22]进行了靶向CD19治疗MM的临床研究，对先前接受过自体干细胞移植（autologous stem cell transplantation，ASCT）但无进展生存期不到1年的复发/难治性MM患者给予大剂量美法仑并进行ASCT后，注入（1~5）×107 kg-1的CD19 CAR-T细胞，结果发现该疗法安全可行，且多数毒性反应都归因于ASCT，没有严重的CRS。与先前的ASCT相比，10例受试者中有2例无进展生存期显著延长（479 d比181 d；249 d比127 d）。尽管大多数的MM患者没有CD19表达，但病情持续完全缓解至少12个月，其中有6例在移植后第100天获得了部分缓解。有学者推测CD19+ MM细胞亚群是一群增殖能力强且对常规治疗MM药物耐药的细胞，正是这群细胞造成MM耐药与复发。CD19联合治疗可能成为治疗MM的理想方案。2.4免疫球蛋白轻链      本周蛋白是免疫球蛋白轻链的单体或二聚体，属于不完全抗体球蛋白，分为κ型和λ型。MM细胞在表达免疫球蛋白的过程中，产生过多的轻链且未与重链装配就从细胞内分泌，经血液循环由肾脏排至尿中，约有35%~65%的MM患者本周蛋白尿阳性[23]。正常的B淋巴细胞表面可以同时表达免疫球蛋白κ和λ轻链，但MM细胞对免疫球蛋白轻链具有限制性，患者的肿瘤细胞仅能表达κ或λ轻链中的一种。因此，靶向免疫球蛋白κ轻链CAR-T可能是一种新型的MM治疗策略。有研究发现87例MM患者经免疫固定电泳均检出单克隆免疫球蛋白，检出阳性率为100%，经血清蛋白电泳检出77例，检出阳性率为88.5%[24]。基于此，Ramos等[25]设计了一种仅靶向k轻链的CAR-T细胞，在治疗慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和MM的临床试验（NCT00881920）中对其安全性和有效性进行了评价。7例难治性MM患者在环磷酰胺预处理后输注（0.92~1.92）×108 kg-1的CAR-T细胞，结果除1例患者的淋巴细胞减少外，未有严重的CAR相关不良反应。7例患者中有4例在6一24个月期间达到病情稳定，另外3例对治疗无应答。结果表明这种治疗方法无严重不良反应，耐受性高，但免疫球蛋白轻链在MM细胞表面的抗原表达能力不强，抗骨髓瘤效果欠佳。2.5CD38      CD38是一种跨膜糖蛋白，参与钙离子调控、信号转导和细胞黏附。在血液细胞中，CD38高表达于B前体细胞、浆细胞、自然杀伤细胞和骨髓前体细胞，也在肠道细胞、前列腺细胞、胰腺、神经细胞、肌肉细胞和破骨细胞中表达[26]。自从2015年美国FDA批准了几种可用于治疗MM的抗CD38单克隆抗体以来，抗CD38 CAR-T细胞受到了广泛的关注[27]。但由于CD38在造血细胞中的广泛表达导致CD38 CAR-T细胞具有很大的非肿瘤毒性，使得其临床应用非常困难。目前，靶向CD38 CAR-T细胞已有数项临床研究，但结果均尚未发表。1项临床研究（NCT03464916）评价了1种靶向CD38 CAR-T细胞治疗复发性MM的有效性以及安全性。此外，CD38与其他肿瘤表面抗原共同靶向肿瘤细胞的临床试验也在评估中，包括双特异性CD38和BCMA CAR-T细胞（NCT03767751）以及CD38 CAR-T细胞与CD19 CAR-T细胞联用（NCT03125577）治疗复发性 MM。第 4 代CAR-T细胞靶向CD38并表达IL-7和趋化因子用于治疗复发性MM的临床研究（NCT03778346）也在进行中。2.6CD44 V6      CD44是透明质酸主要受体，在血液瘤中表达，并被认为在癌症启动中发挥作用，但也在正常细胞表面表达[28]。由于CD44 V6亚型表达较为局限，多数表达在晚期MM细胞上，因此Casucci等[29]设计了1种靶向CD44 V6 CAR-T细胞，用于治疗急性髓系白血病和MM。动物实验中该CAR-T细胞对MM细胞表现出较强的细胞毒性，对于正常的造血干细胞无影响，并且CD44 V6 CAR-T细胞会引起可逆的单核细胞减少症，使可能引起细胞因子风暴的单核细胞可逆性下降。为了将细胞毒性风险降到最低，该疗法还引入了类似自杀基因等形式的安全开关。目前，1项评估CD44 V6 CAR-T细胞治疗急性髓系白血病和MM安全性和有效性的Ⅰ/Ⅱ期临床试验正在进行[30]。2.7跨膜激活剂及钙调亲环素配基相互作用因子（transmembrane activator and CAML interactor，TACI）        TACI是恶性浆细胞上表达的TNF受体超家族成员，表达水平较低，但是与BCMA一样，TACI的天然配体也是APRIL。APRIL CAR-T细胞已经被开发用于靶向表达BCMA和TACI的骨髓瘤细胞。Lee等[31]的临床前研究表明，APRIL CAR-T细胞可以杀伤BCMA、TACI双阳性和BCMA- TACI+的骨髓瘤细胞。这表明APRIL CAR-T细胞可以在BCMA下调的情况下维持肿瘤控制，可以很好地避免BCMA丢失导致的肿瘤逃逸。此外，最近有研究表明，TACI也在MM患者的Treg中表达[32]。因此，APRIL CAR-T细胞不仅可以直接靶向MM细胞，还可以通过抑制Treg间接增强CAR-T细胞杀伤MM细胞的能力。2.8CD229       CD229是信号淋巴细胞激活分子家族的另一种受体，在MM细胞上稳定表达，对于MM细胞的存活起重要作用，并且在CD19-和CD138-的MM细胞上高表达。有研究设计了 1种靶向CD229 CAR-T细胞，对CD229 + MM细胞表现出了很强的细胞毒性。并且通过对小鼠移植表达荧光素酶U226的MM细胞构建动物模型，结果用CD19 CAR-T细胞或者PBS处理的小鼠仍有明显的生物荧光，而CD229 CAR-T细胞处理后的小鼠没有荧光[33]。联合应用靶向CD229 CAR-T细胞可能成为治疗MM的理想方法。2.9多靶点联合应用       为了解决抗原丢失和对CAR-T细胞治疗的耐受性，一些学者使用多个靶点共同靶向MM细胞，来提升缓解率和延长生存期。Yan等[34]通过构建BCMA和CD19双特异性CAR-T治疗MM，在5例患者中有1例获得完全缓解，3例获得非常好的部分缓解，1例获得部分缓解。有研究构建了 BCMA和CD38双特异性CAR-T细胞，进行治疗复发/难治性MM的I期临床研究，16例患者中有14例获得治疗反应，其中8例达到完全缓解，2例获得非常好的部分缓解，4例达到部分缓解，并且14例全部达到骨髓微小残留病阴性，5例髓外病变得到消除。这表明这种CAR-T细胞疗法除在复发/难治性MM患者中具有较高的清除效率外，还可以清除髓外病灶[35]。有研究构建BCMA和TACI双特异性CAR-T细胞靶向杀伤表达BCMA或TACI的肿瘤细胞，小鼠模型输注CAR-T细胞后48 h内就可以诱导肿瘤细胞消退[36]。3CAR-T细胞在MM治疗中的限制及应对方法        随着CAR-T细胞疗法在临床的不断深入研究，治疗产生的相关毒性和肿瘤复发等局限性也随之显现，其中在血液瘤治疗方面的关键挑战包括细胞相关毒性、可溶性蛋白和免疫逃逸等。3.1细胞相关毒性       CAR-T细胞的相关毒性是影响治疗效果最重要的因素之一。CAR-T细胞的激活是通过识别肿瘤细胞表面抗原，而正常细胞表面特异性抗原也会激活CAR-T细胞，从而产生脱靶效应。CAR-T细胞在持续性应答后会释放包括IFN-γ、IL-6等炎症细胞因子，导致CRS，造成严重不良反应[37]，临床表现从轻度发热和流感样症状到严重发热、低血压、低血氧，导致器官功能障碍和凝血功能失活等[38]。目前最常用于降低CRS的药物例如托珠单抗，是抗IL-6受体抗体。伴随CRS出现的还有神经毒性作用，一般表现为轻度混乱和嗜睡等，但严重的神经毒性相比CRS出现更为迅速[39]。3.2可溶性蛋白      CAR-T细胞疗法的一个临床潜在限制是患者血清中含有可溶性蛋白抗原。有研究发现，CD138外结构域会从细胞表面脱落，与CAR-T细胞结合限制CAR-T细胞治疗作用[40]。BCMA也会从骨髓瘤释放到患者血液里，骨髓瘤细胞表面的BCMA表达可被分泌酶修饰，导致BCMA在跨膜结构域内的脱落，产生可溶性BCMA片段[41]。Pont等[41]发现利用分泌酶抑制剂能有效地阻止骨髓瘤细胞释放可溶性BCMA片段。在动物模型中，分泌酶抑制剂使MM细胞表面的BCMA表达增加，从而提高了CAR-T细胞的疗效。但是为了避免对CAR-T细胞功能的不良影响，应确定抑制剂的最佳剂量。3.3抗原逃逸      对于CAR-T细胞治疗后肿瘤复发，最常见的原因就是肿瘤细胞出现靶抗原的表达缺失或下调，这可能是肿瘤细胞进行了选择性剪切。在1项临床试验中，1例患者输注BCMA CAR-T细胞后56周发现体内仍有大量不表达BCMA的骨髓瘤细胞[42]。并且有临床试验报道，在BCMA CAR-T治疗后抗原逃逸非常普遍，患者体内在治疗期间存在的低表达或不表达BCMA的肿瘤细胞有复发的可能[13]。对于抗原逃逸，可以通过针对同一肿瘤细胞不同抗原生产CAR-T细胞进行联合输注，也可以构建双特异性CAR-T细胞来靶向肿瘤细胞，从而降低免疫逃逸带来的影响。4总结与展望       CAR-T细胞疗法是MM治疗的突破性进展，然而为了达到最佳的治疗效果还需要克服诸多困难，如脱靶现象、高水平的细胞因子释放带来的不良反应等。此外，抗CAR-T细胞抗体的产生、CAR-T细胞的持久性不足以及T细胞的衰竭，都是需要解决的关键问题。目前研究者尝试通过联合策略、双特异性抗体以及可调控的CAR结构等方法来优化CAR-T细胞治疗。对复发机制的深入了解以及对新型靶抗原的发现，都会推动CAR-T细胞治疗不断完善，从而促进肿瘤细胞免疫治疗的发展。作者刘冰1 综述    罗剑1  周旭2 审校1上海生物制品研究所有限责任公司第四研究室，上海 200051；2上海生物制品研究所有限责任公司，上海 201403通信作者：周旭，Email：kathzhou@sina. com引用本文：刘冰, 罗剑, 周旭. 嵌合抗原受体T细胞疗法治疗多发性骨髓瘤的研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(3): 165-170.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20210405-00016识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。